JPH05501919A - リウマチ因子の検出用の混合免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リウマチ因子の検出用の混合免疫グロブリン本発明の分野はリウマチ因子の検出 である。

背景 リウマチ因子は、ＩｇＧ免疫グロブリンの結晶性断片（Ｆｃ）上の異種決定基に 結合する抗グロブリン抗体であり、そしてほとんどの慢性関節リウマチ患者の血 清および滑液中に認められる。慢性関節リウマチの病原論におけるリウマチ因子 の役割は、それらが様々な他の慢性病患者においても存在しその存在が非特異的 であることを示唆するので、疑問である。

しかしながら、リウマチ因子の結合特異性は多様であり、ヒトＩｇＧ上のアロタ イプ抗原（Ｇｍ）　、免疫複合体の形成によりＩｇＧ内で造成される新抗原、お よび他の哺乳類［ｇＧ免疫グ０プリンと共有する交差反応性抗原を包含する。

同種抗原に結合するりウマチ因子は輸血や妊娠の結果として生じ得るが、それら が自己の決定基に結合しない限り、それらは真の自己抗体ではない。新抗原に結 合するリウマチ因子もまた、免疫複合体中に形成される新規決定基に対して向け られるので真の自己抗体ではない。対照的に、リウマチ血清において自己由来の 反応性リウマチ因子特異性Ｇａの存在か証明されている。

慢性関節リウマチ患者からの循環している免疫複合体中の自己反応性リウマチ因 子の存在は、それらの自己抗体に対する潜在的な病原的役割を暗示する。しかし ながら、リウマチ因子を検出するための現在使用されている方法は、自己反応性 抗体の存在のみを同定するものではない。更に、病気に関連するリウマチ因子自 己抗体を測定する技術は、複雑すぎて慢性関節リウマチに対するそれらの特異性 を評価することが不可能である。従って、慢性関節リウマチに有意な特異性を有 する技術を開発できることは非常に興味深い。

関連文献 リウマチ様関節炎を有する患者の滑液組織から単離された、多数の哺乳類［ｇＧ 免疫グロブリンと結合するモノクローナル抗体ｈＲＦ−１かＷｅｉＳｂａｒｔら 、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９８７；１３９：２９２５−２９２８により記載 されている。リウマチ血清中の自己反応性リウマチ因子特異性Ｇａの存在は、Ａ １１ｅｎおよびＫｕｎｋｅｌ、　Ａｒｔｈ。

Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　１９６６：　９ニア５８−７６８により報告されている 。リウマチ因子の一般的記載は、Ｗａｌｌｅｒ、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

５ｃａｎｄ、１９４０；　１７：１７２−１８８　：　Ｒｏｓｅ　ら、Ｐｒｏｃ 、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ。

Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、１９４８；　６８：１−６およびＮａｔＶｉｇら、Ｃｌ１ ｎ、　Ｅｘｐ。

［ｍｍｕｎｏｌ、　１９７２；　１２：１７７−１８３において見つけることが できる。

Ｃｏｈｅｎ　ら、Ｊ、ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９８７；　１３９：１４６６は 、ＩｇＧ　ＲＦがＲＡ患者におけるＩｇＧ、抗体優勢を示すことを報告している 。Ｃａｒｓｅｎ。

“Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　Ｆａｃｔｏｒ″Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍ ａｔｏｌｏｇｙ　（Ｋｅｌｌｙら編）　Ｗ、Ｂ、　５ａｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、、　 Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ、　１９８１．６８５頁。

並びにＰｏｐｅおよびＭｃＤｕｆｆｙ、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｅｄ 、　１９８１：　９７８４２−８５３は、異種哺乳類１ｇＧへのＲＡ血清中のＲ Ｆの結合を論じている。後者の文献は、ウマＩｇＧか慢性関節リウマチ患者の血 清中のＲＦを検出するためのより高感度のアッセイを提供することも報告してい る。ＢｕｔｌｅｒおよびＶａｕｇｈａｎは踊ｍｕｎｏｌｏｇｙ１９６５；　８・ １４４−１５９において動物のガンマグロブリンとリウマチ因子との反応を記載 している。

発明の要約 リウマチ因子に対するリガンドとしてヒト［ｇＧおよびヤギＩｇＧを使用するサ ンドイッチアッセイにおいてリウマチ因子をアッセイする。特に、活性疾患を存 する慢性関節リウマチ患者と関係づけられるリウマチ因子の検出にＩＥＬＩＳＡ を使用する。

特定の実施態様の記載 特に活性形態の疾患を有するヒト患者におけるリウマチ因子の検出のための改良 された感受性アッセイが提供される。

この方法は、ヒトＩｇＧとヒツジ様１ｇＧ特にはヒツジＩｇＧとの間に架橋を提 供するヒト血清中の成分の存在の検出を提供する。前記［ｇＧリガンドのうちの 一方か固体支持体に結合されており、そして他方のリガンドが溶液中遊離状態で あるように用意することにより、特に支持体に結合しているヒツジ［ｇＧを用意 することにより、感受性アッセイが達成される。

特に、該アッセイは偽陽性を与える発生率が低く、一方で活性形態の慢性関節リ ウマチと陽性結果との間に高い相関関係がある。

ヒツジ様１ｇＧはいずれの便利な源から入手してもよく、市販されている。哺乳 類の血液からＩｇＧを単離する常法は文献中に詳細に記載されている。ヒツジ様 ＩｇＧは、例えば叶ｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、 　ＰＡから入手することができる。ヒ）ＩｇＧは任意の便利な手段により、商業 源からまたはＩｇＧ単離の常法を使うことにより得ることができる。

試料として使用する血清は、少なくとも１：２０、より普通には少なくとも約ｌ ：８０であって少なくとも１　：　１００であってもよい希釈度で単に希釈され るだろう。望ましくは、陽性結果のカットオフは少なくとも約１＝ｌＯＯ１また は少なくとも約１：１５０の希釈度においてであろう。

非結合形のリガンドＩｇＧは、検出可能なシグナルに備える標識で直接的にまた は間接的のいずれかで標識されるだろう。

種々様々な標識、例えば酵素、放射能同位体、蛍光団、化学発光団、粒子当が既 知である。それらの標識は、ＩｇＧリガンドまたはＩｇＧリガンドに結合するで あろう別の分子に共有結合により接合され得る。例えば、非結合形のＩｇＧはビ オチンのような小分子、およびストレプトアビジンまたはアビジン（以後アビジ ンと称する）に結合した検出可能な標識と接合することができる。試料を２つの 異なるＩｇＧリガンドと混合し、次いで標識アビジンを添加する２段階アッセイ を行うことにより、支持体へのヒトまたはヒツジＩｇＧリガンドの特異的結合の 存在を決定することができる。

該アッセイは、サンドイッチアッセイのような任意の便利な形態で実施すること ができる。即ち、結合形リガンドは表面（これは容器の壁であることができる） 、例えばミクロタイタープレートウェル、ビーズ、例えば同一孔ガラスビーズ、 パイレックスビーズ等、毛管ウェルなどに共有的または非共有的に結合させるこ とができる。タンパク質を表面に結合させる方法は周知であり、本明細書に記載 する必要はない。表面は、該表面上の官能基とタンパク質との間で共有結合反応 が起こるような活性表面であることができ、または特に加熱後にタンパク質が非 特異的に結合しそしてアッセイの過程中保持されるような表面であることができ る。タンパク質に結合するであろう官能基を有する様々な活性化表面が利用可能 である。官能基としては、活性化カルボキシル基、イミノ基、アルデヒド基等が 挙げられる。

着目の特異的標識としては、酵素、例えばヒドロラーゼおよびオキシドレダクタ ーゼ、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリセリル−３ −リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン 酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、 ウリカーゼ、キサンチンオキシダーセ°等か挙げられる。使用することができる 蛍光団としては、藻類色素タンパク質、フルオレセイン、ダンシル、ローダミン 、ブムベリフエロン等が挙げられる。

アッセイを行う際、試料は支持体に結合されたＩｇＧリガンドと接触される。血 液試料は前処理、例えば血清もしくは血漿を用意するための赤血球の除去、クエ ン酸処理、特に緩衝液での希釈等を行うことができる。通常、血清は偽陽性の実 質的不在を確証する適当なカットオフに備えるために希釈されるだろう。

様々な緩衝液を使用することができ、それはアッセイと適合できるように選択さ れる。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ、　ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸 塩、炭酸塩等が挙げられる。特定の緩衝液は本来任意選択できるが、特定の標識 に関係する特定のアッセイプロトコールにおいて成る緩衝液が他のものに比へて 好ましいことがある。一般に、緩衝液濃度は約１０〜４００　ｍＭの範囲であり 、そしてｐＨは普通的５〜１１、より普通には約６〜１０の範囲であろう。非特 異的結合を減らすために他の成分、例えば、不活性タンパク質、例えばウシ血清 アルブミンまたはオボアルブミンを含めることができ、追加のタンパク質は通常 約２％以下で存在するだろう。

試料と非結合形ＩｇＧ　ＩＪガントの添加の順序は重要でないが、好ましくは試 料と標識ＩｇＧリガンドが同時に結合形１ｇＧリガンドに添加される。次いでア ッセイ混合物は少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも１時間、より好まし くは少なくとも約６時間インキュベートされ、標識ＩｇＧリガンドが検出可能な 標識を有するかまたは検出可能な標識の結合を必要とするかに応じて、適宜に決 定される。血清中のＲＦの利用可能な部位の飽和までの最適結合を保証するため に、実質的に過剰の標識リガンドを使用することができる。

インキュベーション後、上清を除去し、緩衝溶液、例えば試料を希釈するのに使 用した緩衝液で表面を徹底的に洗浄し、そして適当な時、特異的に結合した標識 の存在を検出する。

標識がＩｇＧリガンドに結合している場合、直接読み取ることができる標識、例 えば放射性同位体または蛍光団を測定することができる。検出可能な標識物、例 えば標識アビジンか必要とされる場合、基質上に存在する相補的特異的結合メン バーのいずれかへの完全な結合を保証するように標識物か添加される。適当な時 、該標識を直接的にまたは酵素を使って検出し、基質を添加し、そして検出可能 な分子の存在を測定することができる。大部分については、酵素基質は、着色色 素または蛍光物質を生じるロイコ色素を含むだろう。

当該方法論は容易に自動化することができ、この場合、添加、インキュベーショ ン等を制御し、洗浄を提供しそして結果を読み取ることができる。

当該試薬は便利にはキットとして提供することができ、キットには、表面結合形 ＩｇＧリガンド、単独でまたは標識された特異的結合性分子と組み合わされた標 識リガンドが、当該アッセイにおいて使用するのに適当な量で提供される。便利 には、酵素標識については、基質を含めることができ、他の試薬、例えば緩衝液 、不活性タンパク質、例えばオボアルブミン等も含めることができる。

次の実施例は例示目的で提供され、限定のためではない。

９６ウエルのミクロタイタープレートを精製ヒツジｔｇＧでコーティングした。

０．０６Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中の［ｇＧ　（ｔ。

μｇ／ｍＡ’）を９６ウエルプレート中で４°Ｃにて一晩インキユベートした。

血清を１　：１６０の希釈度でアッセイし、ＮＨ３−ＬＣ−Ｂ　ＩＯＴ　ＩＮ（ Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使ってビオチニル化されたヒト［ ｇＧを用いてＩｇＧリウマチ因子を検出した。インキュベーション溶液は０．６ ２５μｇのビオチニル化ヒトＩｇＧを含んだ。インキュベーション後、過剰の西 洋ワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジン（０，１μｇｏｄ、　１ｏｏ μｌ）を添加し、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、そして２，２′−アジノージ− １゜３−エチルベンズチアゾリンスルホネートから４１４止に最大光学濃度（吸 光度）を有する発色団への変換をモニタリングした。各アッセイにおいてオボア ルブミンのみでコーティングされたプレートへの結合を測定することにより、負 の対照を含めた。慢性関節リウマチ患者からの既知の陽性血清を各アッセイにお いて正の対照として使用し、結果を正の対照の百分率として表した。

７０４人の被検者の血清を、自己由来結合および／またはヒ）１ｇＧとヒツジＩ ｇＧへの同時結合を有するリウマチ因子についてアッセイした。ヒト血清を添加 し、ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝化塩溶液）中のオボアルブミンで１：１００希釈し た。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　（Ａｒｎ ｅｔｔ　ら、Ａｒｔｈ。

Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　１９８８　；　３１：３１５−３２４）の修正基準によ り定義された典型的慢性関節リウマチを有する１０８人を含む、７０４人の患者 から血清を得た。全身性紅斑性狼癒を有する１９０人、進行性全身性硬化症を有 する３１人、多発性筋炎を有する３人、側頭動脈炎を有する４人および結節性多 発性動脈炎を有する３人を含む、慢性関節リウマチ以外の結合組織疾患を有する ２３１人の患者を実験した。また、非リウマチ性疾患を有する３１７人の入院患 者からの血清に加えて、４８人の健康個体からの血清に関しても実験を行った。

アッセイまで一２０°Ｃで血清を保存した。

リウマチ因子と慢性関節リウマチとの関係を評価するため試実験を行った。４０ 人の患者において血清の獲得時に医者により慢性関節リウマチ病活性を評価した 。病気活性の指数は、腫大または敏感性関節の数、患者の痛みの主観的評価、お よび朝のこわばりの持続期間の定量的評価に基づいた。各パラメーターにＯ（不 活性）〜５（最も活性）の数値を与え、そして３つの値の合計として活性指数を 記録した。病気活性の追加の客観的尺度として、それら患者のうちの２３人にお いてヴエステルグレン赤血球沈降速度を得た。

ラテックス粒子の凝集により測定されるリウマチ因子熱凝集形ヒト［ｇＧがコー ティングされたラテックスビーズの凝集によりリウマチ因子について全ての血清 をアッセイした（ＲＦ試験、　Ｄｉｒｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）　ｏ　 １：２０で始まる２倍連続希釈において血清をアッセイし、１：１６０またはそ れ以上の力価を有するものとして陽性試験を選択した。１：１６０の力価を選択 することにより、非−慢性関節リウマチ患者において一層頻繁に起こる低力価応 答を除外した。更に、１：１６０またはそれ以上の力価では、非−慢性関節リウ マチ患者における陽性リウマチ因子試験は慢性関節リウマチ患者において認めら れるものに匹敵した。

ＥＬｒＳＡにより測定されるリウマチ因子ラテックス粒子を凝集した血清を、１ ０μｇ／ｒＩＬｌの未変性の精製ヒトＩｇＧ　、６３°Ｃに３０分間加熱するこ とにより凝集したヒト［ｇＧ　、並びにヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、モルモ ットおよびヤギＩｇＧを含む精製哺乳類［ｇＧ免疫グロブリンにより４℃にて一 層コーティングした９６ウエルのミクロタイタープレートを使ったＥＬＩＳＡに よってもアッセイした。該プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２を含むリン酸塩 緩衝化塩溶液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、そして１％オボアルブミンでｔ　：　 ｉｏｏ希釈したヒト血清（０，１ｒｎＩ）をウェル中で４°Ｃで一層インキユベ ートした。

プレートをＰＢＳＴで洗浄し、そしてヒトＩｇＭ　Ｆｃに特異的なアフィニティ ー精製したアルカリホルファターゼ接合ヤギ抗体を添加し、室温で１時間インキ ュベートした。予備試験は、使用した接合抗血清がリウマチ因子アッセイを競合 的に阻害しないことを示した。該ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、ｐ−ニトロフ ェニルホスフェートからｐ−ニトロフェノールへの変換による４０５　ｎｍでの 吸光度により、アルカリホスファターゼを測定した。

統計的分析 バッチ内およびバッチ間比較によりリウマチ因子についての二重結合試験の精度 を評価し、そして変動係数Ｖ〔ここてＶ；標準偏差（σ）／平均（μ）〕として 表した。

結果 ラテックス粒子の凝集により測定されるリウマチ因子血清を１＝２０で始まる２ 倍連続希釈においてアッセイした。

慢性関節リウマチを有するかまたは有しない患者において比較可能なレベルのり ウマ千図子を有する血清を比較するために、ｌ：１６０の血清希釈度を陽性試験 として包含するために選択した。１：１６０の希釈度では、慢性関節リウマチを 有する患者の４１／１０８人（３８，０％）の血清がラテックス粒子を凝集した 。

対比して、他の結合組織疾患、主として全身性紅斑性狼癒を有する患者の１４／ ２３１人（６，１％）、および非リウマチ性疾患を有する患者の１９／３１７人 （６，０％）が陽性リウマチ因子試験を有した（全陽性試験＝　３３１５４８　 、６．０％）。慢性関節リウマチ患者および非−慢性関節リウマチ患者における 陽性反応のメジアンカ価はｌ　：　３２０であった。従って、ラテックス凝集試 験は、血清を１：１６０またはそれ以上の希釈度においてアッセイした時、慢性 関節リウマチに３８．０％感受性および９４．０％特異的であった。

ヒトｔｇＧとヒツジ［ｇＧを架橋する、ＥＬＩＳＡにより測定されるリウマチ因 子 ヒトＩｇＧとヒツジ［ｇＧを架橋するリウマチ因子を７０４人の被検者からの血 清においてアッセイした。陽性試験は、標準的正の対照の２８％より大きい結合 として定義した。というのは、２８％は慢性関節リウマチを持たない患者５４８ 人の対照グループの平均応答よりも２Ｓ、Ｄ、上に相当するからである。架橋ア ッセイの結果は、それかラテックス凝集試験（４１，／１０８゜３８．０％）と 同等の感度（３９／１０８．３６．１％）であることを示した。ラテックス凝集 試験とは異なり、非リウマチ性疾患を有する患者のわずか２／３１７人（０，６ ％）、慢性関節リウマチ以外のりウマチ性疾患を有する患者の３／２３１人（１ ，３％）、および健康な個体の０７４８人において陽性試験が起こったため、ヒ トＩｇＧとヒツジ［ｇＧの架橋はかなり特異的であった。慢性関節リウマチを持 たない被検者における陽性試験の総数は５１５９６　、即ちわずか０．８％であ った。従って、ヒトＩｇＧとヒツジＩｇＧを架橋するリウマチ因子についてのこ のＥＬＩＳＡは、ラテックス凝集試験での９４．０％に比べて、９９．２％慢性 関節リウマチに特異的であった（χ２＝２４．２．　ｐ　＜０．００１　）。慢 性関節リウマチについての１，０％の罹患率に基づいて、１：１６０希釈された 血清についてのラテックス凝集試験の陽性予想値は、ヒトｆｇＧとヒツジＩｇＧ を架橋するリウマチ因子についての３１．３％に比べて６．０％である。架橋ア ッセイは、１：１６０より低いラテックス凝集力価を有する非−慢性関節リウマ チ患者のいずれにおいても陽性でなかった。

１月つマチ疾患を持たない患者におけるリウマチ因子ラテックス凝集で陽性のリ ウマチ因子を有し且つ慢性関節リウマチ患者と同等である力価を有する非−慢性 関節リウマチ患者の１９／３１７人の血清を、ＥＬｒＳＡにより［ｇＭリウマチ 因子についてアッセイした。それらの患者の多く　（７／１９人）は肝疾患を有 した。熱凝集形のヒトＩｇＧ　、未変性のヒトＩｇＧおよびヒツジＩｇＧへのそ れらの結合、並びにヒツジＩｇＧとヒト［ｇＧへの同時結合を比較することによ り、リウマチ因子の結合特異性を特徴づけた。ＥＬｒＳＡによりアッセイした時 、１８／１９人の患者がヒト熱凝集形ＴｇＧを結合するＩｇＭ抗体を含んでいた 。その結果は、凝集形ｔｇＧを使ったラテックス凝集試験と同等であった。対照 的に、未変性のヒトＩｇＧ　（９／１９゜χ２＝８．２．　ｐ＜Ｑ、０１）、ヒ ツジＩｇＧ　（１２／１９．χ２＝４．８．９＝０．０２８　）およびヒト／ヒ ツジ［ｇＧ　（２／１９．　χ２＝２３．８．９　＜Ｑ、ＯＯｌ　）を使うと陽 性試験はより少なかった。更に、ヒツジ［ｇＧとヒト［ｇＧの架橋により測定さ れるリウマチ因子は、単独のヒト［ｇＧまたはヒツジＩｇＧ　（それぞれχ２＝ ４．６．　ｐ＝０、０３２およびχ２＝８．３．９＜０．０１）よりも少ない陽 性試験を生じた。架橋アッセイは細菌性心内膜炎を有する１人の患者および肝疾 患を存する１人の患者において陽性であった。凝集形［ｇＧを使ったリウマチ因 子ＥＬＩＳＡと架橋アッセイとの間に相関関係はなかった（　ｒ　＝０．３９） 。このことは、それらの試験間の結果の違いが単にアッセイ感度の変化によるも のではないことを示す。

慢性関節リウマチ病活性とリウマチ因子との関係慢性関節リウマチ以外の結合組 織疾患を有する患者におけるリウマチ因子 ラテックス凝集で陽性のリウマチ因子を有し且つ慢性関節リウマチ患者に匹敵す る力価を有する慢性関節リウマチ以外の結合組織疾患を有する患者の１４／２３ １人の血清を、ＥＬＩＳＡによりリウマチ因子について試験した。陽性リウマチ 因子試験のほとんどが全身性紅斑性狼瘉を有する患者において起こった（１２／ １４）。結合組織疾患を持たない患者とは異なり、それらのリウマチ性疾患を有 する患者は熱凝集形ヒトＩｇＧ　、未変性ヒトＩｇＧおよびヒツジ［ｇＧに等し く良好に結合するＩｇＭ抗体を産生した。凝集形ＩｇＧへのＥＬＩＳＡ応答（１ ８／１９陽性）は、凝集形［ｇＧを使ったラテックス凝集試験と同等であった。

しかしながら、それらの狼癒患者におけるリウマチ因子は、ヒツジＩｇＧとヒト （ｇＧとを同時に結合および架橋することができないこと、またはヒツジ■ｇＧ に結合する自己由来のｒｇＧを結合できないことにより、慢性関節リウマチ患者 のものと区別することができる。例えば、架橋アッセイは凝集形［ｇＧ（１３／ １４．　χ２＝１１．８．　ｐ　＜０．００１）、未変性のヒトＩｇＧ　（１２ ／１４゜χ２＝９．２．　ｐ＜０．０１）またはヒツジＩｇＧ　（１１／１４． 　χ２＝７．０゜ｐ　＜０．０１）を使った試験よりも少数の狼癒患者において （３／１４）陽性であった。それらの結果は、慢性関節リウマチを持たない多く の患者がヒツジ＋ｇＧに対する抗体を産生ずるが、それらの抗体がヒト［ｇＧと 共有する決定基と交差反応する決定基に結合しないことを指摘する。

ヒトＩｇＧとヒツジ［ｇＧを架橋するリウマチ因子に対するアラ慢性関節リウマ チ因子性を４０人の患者において評価し、血清リウマチ因子レベルと比較した。

広域スペクトルの病気活性を示す患者を選択した。男性優勢は、一部は、退役軍 人管理局（ｔｈｅ　Ｖｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の集団 を反映した。ラテックス凝集試験により連続希釈度において血清リウマチ因子力 価をアッセイすると、それらのリウマチ因子力価はリウマチ病活性とよく相関し なかった（　ｒ　＝０．３１）。対照的に、架橋アッセイにおいてＥＬｒＳＡに より測定されたリウマチ因子のレベルは、リウマチ病活性と良く相関した（ｒ＝ ０．６８）。

このことは、ヒトＩｇＧとヒツジＩｇＧを架橋するリウマチ因子は主として活性 な病気を有する慢性関節リウマチ患者に存在することを示す。例えば、中〜重度 の病気（活性指数６）を有する患者の１４／１６人（８７，５％）が陽性であっ たのに比べて、最低の病気活性（活性指数〈４）を有する患者の０／１１人か陽 性であった。陽性試験は、正の対照の２８％より大きいものとして定義した。２ ８％は慢性関節リウマチを持たない患者５４８人の平均よりも２Ｓ、Ｄ、上に相 当する。ヒトＩｇＧとヒツジＩｇＧとの架橋により測定されたリウマチ因子は、 沈降速度を測定した慢性関節リウマチ患者の２３人におけるヴエステルグレン赤 血球沈降速度ともよく相関した（　ｒ　＝０．７０）。それらの結果は、ヒトＩ ｇＧとヒツジＩｇＧの架橋により測定されるリウマチ因子と活性慢性関節リウマ チとの関連性を更に支持する。

セイの精度 このＥＬＩＳＡ法の精度を評価するために、架橋アッセイを使ってリウマチ因子 についての反復試験を行った。各６つの複製物において低、中および高応答を有 する血清を試験するこは、陽性結果は活性な慢性関節リウマチであって他の変性 病ではないことを指摘するずっと大きな確信を有する。かくして、病気が存在す る強力な確信を伴って慢性関節リウマチの処置に向けることができる。

本明細書中に言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者 の技術水準を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の 刊行物または特許出願が明確に且つ個別的に参考として組み込まれると指摘され たかのように参考として本明細書中に組み込まれる。

今まで本発明を詳細に記載してきたけれども、添付された請求の範囲の精神また は範囲から逸脱することなく多数の変更および改良を行い得ることは当業者にと って容易に明らかであろう。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．慢性関節リウマチを有する疑いのあるヒト宿主におけるリウマチ因子の存在 を検出する方法であって、前記宿主からの生理学的試料をヒツジ様ＩｇＧ免疫グ ロブリンおよびヒトＩｇＧ免疫グロブリンと接触せしめ、ここで前記免疫グロブ リンのうちの一方が支持体に結合しており、そして他方が溶液中に分散しており ；そして前記生理学的試料中のリウマチ因子の存在の指標として、前記支持体に 結合した前記分散した免疫グロブリンの結合の存在を検出する、 ことを含んで成る方法。
2. ２．前記ヒツジ様免疫グロブリンがヒツジ免疫グロブリンでありそして前記支持 体に結合している、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記検出が酵素標識によるものであり、ここで前記酵素標識は前記ヒト免疫 グロブリンまたは前記ヒト免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に結合 している、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記ヒト免疫グロブリンが分散しておりそしてビオチンに接合されており、 そして前記検出が酵素接合アビジンまたはストレプトアビジンによるものである 、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記試料が少なくとも約１：１００で希釈された血液である、請求項１に記 載の方法。
7. ７．慢性関節リウマチを有する疑いのあるヒト宿主におけるリウマチ因子の存在 を検出する方法であって、前記宿主からの希釈血液試料をヒツジＩｇＧ免疫グロ ブリンおよびヒＩｇＧ免疫グロブリンと接触せしめ、ここで前記ヒツジ免疫グロ ブリンが支持体に結合しており、そして前記ヒト免疫グロブリンが検出可能なシ グナルに備える標識に接合されており；そして 前記血液試料中のリウマチ因子の存在の指標として、前記支持体に結合したヒト 免疫グロブリンの結合の存在を前記標識により検出する、 ことを含んで成る方法。
8. ８．前記試料が少なくとも約１：１００で希釈され、そして前記検出が酵素によ るものである、請求項７に記載の方法。
9. ９．前記標識がビオチンであり、そして前記酵素がアビジンまたはストレプトア ビジンと接合している、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項９に記載の方法。