JPH0765998B2 - 特異的に結合性の物質の測定法及び測定試薬 - Google Patents
特異的に結合性の物質の測定法及び測定試薬Info
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- JPH0765998B2 JPH0765998B2 JP1220526A JP22052689A JPH0765998B2 JP H0765998 B2 JPH0765998 B2 JP H0765998B2 JP 1220526 A JP1220526 A JP 1220526A JP 22052689 A JP22052689 A JP 22052689A JP H0765998 B2 JPH0765998 B2 JP H0765998B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は試薬溶液と少なくとも２種のレセプターR1及び
R2、ここでR1とR2とは相互に結合性であり、かつR1は測
定すべき物質と結合性である、との恒温保持及び反応に
おいて生じる凝集の測定により特異的に結合性の物質を
測定するための方法及び試薬に関する。
R2、ここでR1とR2とは相互に結合性であり、かつR1は測
定すべき物質と結合性である、との恒温保持及び反応に
おいて生じる凝集の測定により特異的に結合性の物質を
測定するための方法及び試薬に関する。
従来の技術 体液及び組織中には、特異的な結合成分と結合性であ
り、人体の一定の疾患又は健康状態に関するパラメータ
ーとして働らく非常に多くの物質が存在する。これには
特にハプテン、例えばホルモン、蛋白質例えば腫瘍マー
カー、蛋白質ホルモン及びウイルス蛋白質並びに抗体を
挙げることができる。薬剤による治療を監視するために
もしばしば血液中の薬剤の測定が必要である。しばしば
この物質は非常にわずかな量で存在するので、その検出
のためにイムノアツセイ原理による方法を使用する。こ
のためには多くの方法がある。多くの免疫学的測定法は
均一系法と不均一系法とに分類される。不均一系法にお
いては、標識化成分の結合した部分を結合していない部
分から分離するために、固相反応が常に関与する。この
方法においては、標識化したものを良好に測定すること
ができることであるが、欠点は不均一系反応が長く続く
ことである。
り、人体の一定の疾患又は健康状態に関するパラメータ
ーとして働らく非常に多くの物質が存在する。これには
特にハプテン、例えばホルモン、蛋白質例えば腫瘍マー
カー、蛋白質ホルモン及びウイルス蛋白質並びに抗体を
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もしばしば血液中の薬剤の測定が必要である。しばしば
この物質は非常にわずかな量で存在するので、その検出
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均一系法と不均一系法とに分類される。不均一系法にお
いては、標識化成分の結合した部分を結合していない部
分から分離するために、固相反応が常に関与する。この
方法においては、標識化したものを良好に測定すること
ができることであるが、欠点は不均一系反応が長く続く
ことである。
均一系法においては、結合した標識化物質と結合してい
ない標識化物質との分離が行なわれず、結合した及び結
合していない標識化物質の差異を他の方法によりつけな
ければならない。
ない標識化物質との分離が行なわれず、結合した及び結
合していない標識化物質の差異を他の方法によりつけな
ければならない。
このためには種々の可能性がある。こうして、例えば測
定すべきハプテン又は抗原に結合する時又は測定すべき
物質により活性化される時だけその酵素活性が得られ
る、結合酵素を標識として使用することができる。もう
１つの可能性は、標識として測定すべき物質に結合する
ことによりその螢光が他の波長範囲に移動するか又はそ
の偏光か変わる螢光物質を使用することである。
定すべきハプテン又は抗原に結合する時又は測定すべき
物質により活性化される時だけその酵素活性が得られ
る、結合酵素を標識として使用することができる。もう
１つの可能性は、標識として測定すべき物質に結合する
ことによりその螢光が他の波長範囲に移動するか又はそ
の偏光か変わる螢光物質を使用することである。
この公知法の欠点は、試料がしばしばこのテストを妨害
する成分を含有し、このことはこの妨害成分を除去する
ために試料前処置を必要とするというにある。更に、各
パラメーターに関する費用のかかる最適化が必要であ
る。例えば、酵素はパラメーターに依存して変えなけれ
ばならない。
する成分を含有し、このことはこの妨害成分を除去する
ために試料前処置を必要とするというにある。更に、各
パラメーターに関する費用のかかる最適化が必要であ
る。例えば、酵素はパラメーターに依存して変えなけれ
ばならない。
更に、ヨーロッパ特許公開第79962号公報から測定すべ
きハプテンを含有する溶液をハプテンを被覆したラテツ
クス粒子又はハプテンを被覆したアルブミンと接触させ
る方法が公知である。ハプテンと結合性の抗体添加によ
り凝集反応が行なわれる。ラテツクス粒子に、もしくは
アルブミンに結合したハプテンは試料中に含有されるハ
プテンと競合するので試料中にハプテンが多く含有され
ている程凝集反応は小さい。この方法の欠点はそれぞれ
の測定すべき物質に関し特異的な粒子を提供しなければ
ならず、それぞれのパラメーターを個々に最適化しなけ
ればならないということにある。
きハプテンを含有する溶液をハプテンを被覆したラテツ
クス粒子又はハプテンを被覆したアルブミンと接触させ
る方法が公知である。ハプテンと結合性の抗体添加によ
り凝集反応が行なわれる。ラテツクス粒子に、もしくは
アルブミンに結合したハプテンは試料中に含有されるハ
プテンと競合するので試料中にハプテンが多く含有され
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の測定すべき物質に関し特異的な粒子を提供しなければ
ならず、それぞれのパラメーターを個々に最適化しなけ
ればならないということにある。
凝集反応の評価による蛋白質のもう１つの検出法は西ド
イツ国特許公開第2749956号公報から公知である。この
際、測定すべき物質に対する抗体は直接凝集性粒子に結
合する。しかしながら、この結合により抗体の反応性は
影響を受ける。更に、この種の測定法はリウマチ因子に
より妨害される。
イツ国特許公開第2749956号公報から公知である。この
際、測定すべき物質に対する抗体は直接凝集性粒子に結
合する。しかしながら、この結合により抗体の反応性は
影響を受ける。更に、この種の測定法はリウマチ因子に
より妨害される。
すべての公知の競合均一系凝集イムノアツセイの欠点
は、原料を著しく費用をかけてパラメーター特異的に最
適化しなければならないということである。これらのす
べてのテストにおいて、一方では試料との競合反応を意
味のあるものとするために粒状試薬の濃度を制限しなけ
ればならず、他方では単位時間あたり十分なシグナル変
化を達成するために粒状試薬が高濃度でかつ高く標織化
されているべきであるので、最適な識別と最適な感度に
関して相互に反対の要求がある。これらの要求の調整は
制限された感度と妨害の受けやすさに導びき、これらは
しばしば特異的な試料前処置によつてのみ回避される。
は、原料を著しく費用をかけてパラメーター特異的に最
適化しなければならないということである。これらのす
べてのテストにおいて、一方では試料との競合反応を意
味のあるものとするために粒状試薬の濃度を制限しなけ
ればならず、他方では単位時間あたり十分なシグナル変
化を達成するために粒状試薬が高濃度でかつ高く標織化
されているべきであるので、最適な識別と最適な感度に
関して相互に反対の要求がある。これらの要求の調整は
制限された感度と妨害の受けやすさに導びき、これらは
しばしば特異的な試料前処置によつてのみ回避される。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は高い感度と精確さで物質の検出
を可能とし、前記の欠点を有さない均一系測定法を提供
することである。
を可能とし、前記の欠点を有さない均一系測定法を提供
することである。
課題を解決するための手段 この課題は試料溶液と少なくとも２種のレセプターR1及
びR2、ここでR1とR2とは相互に結合性であり、かつR1は
測定すべき物質と特異的に結合性である、との恒温保持
及び反応において生じる凝集の測定により特異的に結合
性の物質を測定するための方法において、レセプターR1
として、R2に関する結合位１つだけを有する特異的に結
合するペアの片側成分Ｐと測定すべき物質と特異的に結
合性の成分Ｋとからなる結合体を、R2として少なくとも
Ｐに関する結合位２つを有し、試料溶液中に天然に存在
しないレセプターを使用することを特徴とする特異的に
結合性の物質の測定法により解決する。
びR2、ここでR1とR2とは相互に結合性であり、かつR1は
測定すべき物質と特異的に結合性である、との恒温保持
及び反応において生じる凝集の測定により特異的に結合
性の物質を測定するための方法において、レセプターR1
として、R2に関する結合位１つだけを有する特異的に結
合するペアの片側成分Ｐと測定すべき物質と特異的に結
合性の成分Ｋとからなる結合体を、R2として少なくとも
Ｐに関する結合位２つを有し、試料溶液中に天然に存在
しないレセプターを使用することを特徴とする特異的に
結合性の物質の測定法により解決する。
本発明方法は体液又は組織抽出物中で検出すべき特異的
な結合能力のある実質的にすべての物質に好適であり、
この際低濃度の物質も、高濃度の物質と同じように良好
に検出可能である。この方法の感度及び精確さは従来公
知の方法に対して改良されている。本発明は簡単な試薬
を用いて迅速で信頼性のある測定を実施する可能性を提
供する。
な結合能力のある実質的にすべての物質に好適であり、
この際低濃度の物質も、高濃度の物質と同じように良好
に検出可能である。この方法の感度及び精確さは従来公
知の方法に対して改良されている。本発明は簡単な試薬
を用いて迅速で信頼性のある測定を実施する可能性を提
供する。
この方法は１価の特異的結合性物質の測定にも２価又は
多価の特異的結合性物質の測定にも好適である。この
際、１価の特異的結合性物質とは特異的に結合性の片側
成分に対して１つの結合位のみを有する物質である。例
としてはハプテン、例えば薬剤を挙げることができる。
２価又は多価の特異的結合性物質とは特異的に結合性の
片側成分に対して２つ又はそれ以上の結合位を有する物
質、例えば蛋白質ホルモン、例えばHCG又はTSH、抗原及
び蛋白質、腫瘍マーカー、例えばCEA、ビールス蛋白質
及び抗体である。
多価の特異的結合性物質の測定にも好適である。この
際、１価の特異的結合性物質とは特異的に結合性の片側
成分に対して１つの結合位のみを有する物質である。例
としてはハプテン、例えば薬剤を挙げることができる。
２価又は多価の特異的結合性物質とは特異的に結合性の
片側成分に対して２つ又はそれ以上の結合位を有する物
質、例えば蛋白質ホルモン、例えばHCG又はTSH、抗原及
び蛋白質、腫瘍マーカー、例えばCEA、ビールス蛋白質
及び抗体である。
エピトープとはここでは他の物質と特異的結合すること
のできる結合位である。エピトープの例は抗原及びハプ
テンの抗原決定基又は蛋白質の特異的な結合位である。
のできる結合位である。エピトープの例は抗原及びハプ
テンの抗原決定基又は蛋白質の特異的な結合位である。
測定のためには試料溶液を少なくとも二種のレセプター
R1及びR2と恒温保持する。レセプターR1及びR2はこの際
相互に結合性であり、更にR1は測定すべき物質と特異的
に結合性である。本発明方法を用いて種々の反応原理を
実施することができる。第１図には二価もしくは多価物
質を検出するために好適である二つの方法が図示されて
いる。
R1及びR2と恒温保持する。レセプターR1及びR2はこの際
相互に結合性であり、更にR1は測定すべき物質と特異的
に結合性である。本発明方法を用いて種々の反応原理を
実施することができる。第１図には二価もしくは多価物
質を検出するために好適である二つの方法が図示されて
いる。
第１図のａ）に図示された実施形においては試料溶液
に、特異的に相互に結合するペアの片側成分Ｐと測定す
べき物質と特異的に結合性の成分Ｋとからなる結合体で
あるレセプターR1を添加する。次いでレセプターR1は成
分Ｋを介して測定すべき物質に結合する。第１図に示し
た概略図においては抗体である。この際、各抗体はそれ
ぞれ２つのレセプターR1にＫを介して結合している複合
体を形成する。
に、特異的に相互に結合するペアの片側成分Ｐと測定す
べき物質と特異的に結合性の成分Ｋとからなる結合体で
あるレセプターR1を添加する。次いでレセプターR1は成
分Ｋを介して測定すべき物質に結合する。第１図に示し
た概略図においては抗体である。この際、各抗体はそれ
ぞれ２つのレセプターR1にＫを介して結合している複合
体を形成する。
R1と同時に、又は一定の時間の後レセプターR2を添加す
る。このレセプターR2は少なくとも２つ、有利には多数
のＰへの結合位を有する。この際Ｐを介してのレセプタ
ーR1のレセプターR2への結合が生じる。各抗体は２つの
レセプターR1、こうしてR2への結合能力を有する片側成
分P2つを有しているので、架橋もしくは凝集が生じ、こ
れは他方では測光法により測定可能な混濁もしくは混濁
変化を惹起する。測定すべき抗体を溶液中に多量に含有
すればする程、架橋は強くなり、混濁もより強力にな
る。こうして凝集の量は測定すべき物質の直接の尺度で
ある。評価はこの際検量線を用いて行なう。
る。このレセプターR2は少なくとも２つ、有利には多数
のＰへの結合位を有する。この際Ｐを介してのレセプタ
ーR1のレセプターR2への結合が生じる。各抗体は２つの
レセプターR1、こうしてR2への結合能力を有する片側成
分P2つを有しているので、架橋もしくは凝集が生じ、こ
れは他方では測光法により測定可能な混濁もしくは混濁
変化を惹起する。測定すべき抗体を溶液中に多量に含有
すればする程、架橋は強くなり、混濁もより強力にな
る。こうして凝集の量は測定すべき物質の直接の尺度で
ある。評価はこの際検量線を用いて行なう。
実施法第１図のｂ）は多価物質、例えば、多数の特異的
結合位を有する蛋白質の検出のために用いられる。この
際この原理は第１図のａ）と同じである。しかしなが
ら、この際測定すべき物質は２つより多いレセプターR1
と結合することができるので、レセプターR2の添加後単
に線状の架橋だけでなく、三次元的架橋も行なわれる。
ここでも凝集の量が測定すべき物質に関する直接の尺度
であり、この際評価は検量線を介して行なわれる。
結合位を有する蛋白質の検出のために用いられる。この
際この原理は第１図のａ）と同じである。しかしなが
ら、この際測定すべき物質は２つより多いレセプターR1
と結合することができるので、レセプターR2の添加後単
に線状の架橋だけでなく、三次元的架橋も行なわれる。
ここでも凝集の量が測定すべき物質に関する直接の尺度
であり、この際評価は検量線を介して行なわれる。
本発明による方法は同様にいわゆるアツプテイクテスト
（Uptake-Test）を実施するために好適である。このた
めには少なくとももう１つのレセプターR3及び場合によ
りR4を使用する。２つの方法を第２図に図示する。有利
な実施形は第２図のａ）である。ここではチロキシン結
合能の測定法である。すなわちTBG（チロキシン結合グ
ロブリン）により提供される遊離結合位の数が測定され
る。このためには試料溶液にチロキシンとビオチンとか
らなる結合体であるレセプターR1及び抗−T4−抗体であ
るレセプターR3を添加する。この際、チロキシンに対し
て遊離結合位を有する試料溶液中のTBGとレセプターR3
とはレセプターR1中に含有されているチロキシンへの結
合に関して競合する。レセプターR1及びR3と同時に、又
は恒温保持に引き続いてレセプターR2（この場合にはス
トレプトアビジンである）を添加する。TBGもしくはレ
セプターR3とレセプターR1とから形成されたすべての複
合体はストレプトアビジンと結合することができる。し
かしながら架橋はレセプターR3に２つのレセプターR1が
結合している複合体によつてのみ行なわれる。遊離結合
位を有するTBGが試料溶液中に多量に存在すればする程
レセプターR1はTBGに結合し、架橋もしくは凝集及び混
濁の上昇がわずかとなる。こうして混濁の上昇はチロキ
シンに関する遊離結合位の量に関する間接的な尺度であ
る。評価は検量線を介して行なわれる。
（Uptake-Test）を実施するために好適である。このた
めには少なくとももう１つのレセプターR3及び場合によ
りR4を使用する。２つの方法を第２図に図示する。有利
な実施形は第２図のａ）である。ここではチロキシン結
合能の測定法である。すなわちTBG（チロキシン結合グ
ロブリン）により提供される遊離結合位の数が測定され
る。このためには試料溶液にチロキシンとビオチンとか
らなる結合体であるレセプターR1及び抗−T4−抗体であ
るレセプターR3を添加する。この際、チロキシンに対し
て遊離結合位を有する試料溶液中のTBGとレセプターR3
とはレセプターR1中に含有されているチロキシンへの結
合に関して競合する。レセプターR1及びR3と同時に、又
は恒温保持に引き続いてレセプターR2（この場合にはス
トレプトアビジンである）を添加する。TBGもしくはレ
セプターR3とレセプターR1とから形成されたすべての複
合体はストレプトアビジンと結合することができる。し
かしながら架橋はレセプターR3に２つのレセプターR1が
結合している複合体によつてのみ行なわれる。遊離結合
位を有するTBGが試料溶液中に多量に存在すればする程
レセプターR1はTBGに結合し、架橋もしくは凝集及び混
濁の上昇がわずかとなる。こうして混濁の上昇はチロキ
シンに関する遊離結合位の量に関する間接的な尺度であ
る。評価は検量線を介して行なわれる。
アツプテイクテストの変法を第２図のｂ）に示した。こ
こでは第２図のａ）に使用した３種のレセプターに加え
て第４のレセプターR4としてチロキシンを使用した。レ
セプターR1,R3及びR4の添加後、遊離結合位を有するTBG
とレセプターR3とが、レセプターR1及びR4への結合に関
して競合する。レセプターR1が結合している複合体だけ
がレセプターR2の添加後、R2に結合することができる。
レセプターR3とレセプターR1２つとからなる複合体だけ
がレセプターR2の添加後架橋し、こうして混濁上昇に導
びく。遊離結合位を有するTBGが試料溶液中に多量に存
在すればする程、多くのレセプターR1がTBGに結合す
る。TBGとレセプターR1とからなる複合体は全く架橋を
おこすことができず、従つて架橋の量は減少し、こうし
て混濁の上昇も減少する。こうしてここでも混濁の上昇
は遊離結合位を有する試薬溶液中に存在するTBGに関す
る間接的な尺度である。
こでは第２図のａ）に使用した３種のレセプターに加え
て第４のレセプターR4としてチロキシンを使用した。レ
セプターR1,R3及びR4の添加後、遊離結合位を有するTBG
とレセプターR3とが、レセプターR1及びR4への結合に関
して競合する。レセプターR1が結合している複合体だけ
がレセプターR2の添加後、R2に結合することができる。
レセプターR3とレセプターR1２つとからなる複合体だけ
がレセプターR2の添加後架橋し、こうして混濁上昇に導
びく。遊離結合位を有するTBGが試料溶液中に多量に存
在すればする程、多くのレセプターR1がTBGに結合す
る。TBGとレセプターR1とからなる複合体は全く架橋を
おこすことができず、従つて架橋の量は減少し、こうし
て混濁の上昇も減少する。こうしてここでも混濁の上昇
は遊離結合位を有する試薬溶液中に存在するTBGに関す
る間接的な尺度である。
本発明により定義された方法原理は多くの実施変法を提
供する。それぞれの場合において、少なくとも２種のレ
セプターが必要である。測定すべき物質は特異的に結合
性の物質であり、特に前記のように二価又は多価の抗
原、抗体又は蛋白質であつてよい。
供する。それぞれの場合において、少なくとも２種のレ
セプターが必要である。測定すべき物質は特異的に結合
性の物質であり、特に前記のように二価又は多価の抗
原、抗体又は蛋白質であつてよい。
第１のレセプターR1としては、特異的に結合するペアの
片側成分Ｐと測定すべき物質と特異的に結合性の成分Ｋ
とからなる結合体を使用する。特異的に相互に結合する
ペアは自体公知である。好適な結合ペア（P-R2）は特に
ビオチン−ストレプトアビジンもしくはアビジン；ハプ
テン−抗体；抗原−抗体；コンカバリン−抗体；糖−レ
クチン；ハプテン−結合蛋白質、例えばチロキシン結合
グロブリン及びチロキシン又はオリゴペプチド−抗体で
ある。
片側成分Ｐと測定すべき物質と特異的に結合性の成分Ｋ
とからなる結合体を使用する。特異的に相互に結合する
ペアは自体公知である。好適な結合ペア（P-R2）は特に
ビオチン−ストレプトアビジンもしくはアビジン；ハプ
テン−抗体；抗原−抗体；コンカバリン−抗体；糖−レ
クチン；ハプテン−結合蛋白質、例えばチロキシン結合
グロブリン及びチロキシン又はオリゴペプチド−抗体で
ある。
結合するペアとしてはビオチンとストレプトアビジンも
しくはアビジンを使用するのが特に有利であり、レセプ
ターR1は特にビオチンを含有するのが有利である。
しくはアビジンを使用するのが特に有利であり、レセプ
ターR1は特にビオチンを含有するのが有利である。
レセプターR1の成分Ｋは測定すべき物質と結合性であ
る。成分Ｋはその都度測定すべき物質により選択され
る。ここでは多くのレセプターが好適である。ハプテ
ン、蛋白質、DNA又は糖の測定のためには、これらの物
質又はそのフラグメントに対する抗体又はその他のレセ
プター、例えば天然に存在する結合蛋白質、例えばチロ
キシン結合グロブリンを使用することが特に有利であ
る。成分ＫとしてFab−フラグメントを使用するのが特
に有利である。抗体の測定のためには、成分Ｋは有利に
抗体に結合性であるエピトープを有する物質又はハプテ
ンが有利である。
る。成分Ｋはその都度測定すべき物質により選択され
る。ここでは多くのレセプターが好適である。ハプテ
ン、蛋白質、DNA又は糖の測定のためには、これらの物
質又はそのフラグメントに対する抗体又はその他のレセ
プター、例えば天然に存在する結合蛋白質、例えばチロ
キシン結合グロブリンを使用することが特に有利であ
る。成分ＫとしてFab−フラグメントを使用するのが特
に有利である。抗体の測定のためには、成分Ｋは有利に
抗体に結合性であるエピトープを有する物質又はハプテ
ンが有利である。
結合体の製造は自体公知法で行なわれる（例えばEur.J.
Biochem.第131巻、1980年、第333〜338頁に類似の方
法）。
Biochem.第131巻、1980年、第333〜338頁に類似の方
法）。
本発明による方法に必要な第２のレセプターR2は少なく
とも２つのＰに関する結合位を有し、かつ有利に特異的
に結合するペアのＰに対して相補的片側成分を多数有し
ている。レセプターR2は反応の際に生じる複合体の凝集
を仲介する。この特異的に結合性のペアの他の片側成分
の多数が反応系に存在するので、天然に試料溶液中に存
在する、この片側成分と結合性物質のわずかな量は妨害
に導びかない。レセプターR2はすでに天然に多くのＰに
対する結合位を有する物質であつてよく、例えばストレ
プトアビジン又は抗体である。レセプターR2は多価であ
つてよく、多数のＰに対する結合位を有しているか又は
特異的に結合するペアのＰに相補的な片側成分のポリマ
ー、例えばポリストレプトアビジンであつてよい。この
際、この個々の成分が相互に直接結合しているか、又は
橋を介して相互に結合している。この種のポリマーの製
法は専門家に公知であり、より詳細な説明は必要ない。
とも２つのＰに関する結合位を有し、かつ有利に特異的
に結合するペアのＰに対して相補的片側成分を多数有し
ている。レセプターR2は反応の際に生じる複合体の凝集
を仲介する。この特異的に結合性のペアの他の片側成分
の多数が反応系に存在するので、天然に試料溶液中に存
在する、この片側成分と結合性物質のわずかな量は妨害
に導びかない。レセプターR2はすでに天然に多くのＰに
対する結合位を有する物質であつてよく、例えばストレ
プトアビジン又は抗体である。レセプターR2は多価であ
つてよく、多数のＰに対する結合位を有しているか又は
特異的に結合するペアのＰに相補的な片側成分のポリマ
ー、例えばポリストレプトアビジンであつてよい。この
際、この個々の成分が相互に直接結合しているか、又は
橋を介して相互に結合している。この種のポリマーの製
法は専門家に公知であり、より詳細な説明は必要ない。
もう１つの実施形によれば、レセプターR2は多数のＰに
相補的な特異的に結合性の片側成分が結合している担体
材料からなる。担体材料としては通常50〜1000nmの大き
さを有する粒子を使用することができる。好適な材料は
ポリスチロール、微細粉二酸化珪素、赤血球又は架橋ア
ルブミンである。特異的に結合性の片側成分でのこれら
の粒子の被覆は専門家により常用の方法で行なわれる。
例えばヨーロッパ特許第73611号明細書及び米国特許第4
703018号明細書中に記載されている。
相補的な特異的に結合性の片側成分が結合している担体
材料からなる。担体材料としては通常50〜1000nmの大き
さを有する粒子を使用することができる。好適な材料は
ポリスチロール、微細粉二酸化珪素、赤血球又は架橋ア
ルブミンである。特異的に結合性の片側成分でのこれら
の粒子の被覆は専門家により常用の方法で行なわれる。
例えばヨーロッパ特許第73611号明細書及び米国特許第4
703018号明細書中に記載されている。
このように被覆されたもしくは重合されたレセプターR2
は本発明による方法に一般的に使用され、従つてパラメ
ーター特異性ではない。
は本発明による方法に一般的に使用され、従つてパラメ
ーター特異性ではない。
本発明による方法の実施にとつて、レセプターR1がR2に
対する結合位をただ１つ有するということ、すなわち各
々のレセプターR1がただ１つのR2と反応することができ
るということは重量である。このことは重量な前提条件
である、それというのもそうでなければR2は単独でレセ
プターR1により架橋され、こうして検出すべき物質に起
因しない凝集に作用するためである。
対する結合位をただ１つ有するということ、すなわち各
々のレセプターR1がただ１つのR2と反応することができ
るということは重量である。このことは重量な前提条件
である、それというのもそうでなければR2は単独でレセ
プターR1により架橋され、こうして検出すべき物質に起
因しない凝集に作用するためである。
本発明方法をアツプテイクテストの実施のために使用す
る時、少なくとも２つの測定すべき物質のエピトープを
有し、R1と結合性である、更なるレセプターR3を使用す
る。こうして、レセプターR3のエピトープは測定すべき
物質のエピトープに相応し、これはR1のＫへの結合に作
用する。レセプターR3としては成分Ｋに対する結合位を
有する抗体又はFab2‐フラグメントが有利である。この
方法の実施の際にはレセプターR3が試料とR1への結合に
関して競合する。
る時、少なくとも２つの測定すべき物質のエピトープを
有し、R1と結合性である、更なるレセプターR3を使用す
る。こうして、レセプターR3のエピトープは測定すべき
物質のエピトープに相応し、これはR1のＫへの結合に作
用する。レセプターR3としては成分Ｋに対する結合位を
有する抗体又はFab2‐フラグメントが有利である。この
方法の実施の際にはレセプターR3が試料とR1への結合に
関して競合する。
本発明方法のもう１つの変法においてはレセプターR3に
加えて更にレセプターR4を使用する。この際、このレセ
プターR4はレセプターR1の成分Ｋである。この方法の実
施の際にはレセプターR3と試料がレセプターR1とレセプ
ターR4への結合に関して競合する。
加えて更にレセプターR4を使用する。この際、このレセ
プターR4はレセプターR1の成分Ｋである。この方法の実
施の際にはレセプターR3と試料がレセプターR1とレセプ
ターR4への結合に関して競合する。
この方法は１工程又は多工程で実施することができる。
評価は凝集の量の測定により行なわれる。このための方
法は公知である。好適であるのは例えば測光法による混
濁の測定、比濁法による散乱光測定、粒子の数え挙げ又
は光子−相関−分光法（PCS）である。
評価は凝集の量の測定により行なわれる。このための方
法は公知である。好適であるのは例えば測光法による混
濁の測定、比濁法による散乱光測定、粒子の数え挙げ又
は光子−相関−分光法（PCS）である。
各レセプターも、測定すべき物質もそれに決められた反
応成分とそれぞれ特異的に反応することができるので、
すべてのレセプター及び試料を一緒に恒温保持し、この
方法を１工程で実施することが可能である。これは特に
自動分析機中でこの方法を実施する際に有利である。
応成分とそれぞれ特異的に反応することができるので、
すべてのレセプター及び試料を一緒に恒温保持し、この
方法を１工程で実施することが可能である。これは特に
自動分析機中でこの方法を実施する際に有利である。
すべての変法の実施は有利に緩衝液中で行なわれる。こ
の方法の緩衝系は自体公知である。このために特に好適
であるのはGOOD−緩衝液及び燐酸塩緩衝液である。
の方法の緩衝系は自体公知である。このために特に好適
であるのはGOOD−緩衝液及び燐酸塩緩衝液である。
本発明により、簡単で迅速に実施され、測定すべき物質
の濃度に依存する測定シグナルを提供する方法が得られ
る。免疫学的な拮抗にある系とシグナル形成系とが分離
しているので、本発明により検出の感度は高められる。
これにより簡単な試薬で低濃度の物質を、迅速かつ確実
に定量測定することができる。
の濃度に依存する測定シグナルを提供する方法が得られ
る。免疫学的な拮抗にある系とシグナル形成系とが分離
しているので、本発明により検出の感度は高められる。
これにより簡単な試薬で低濃度の物質を、迅速かつ確実
に定量測定することができる。
本発明のもう１つの課題は特異的に結合性の物質の測定
試薬であり、これは特異的に結合するペアの片側成分Ｐ
と測定すべき物質と特異的に結合性の成分Ｋとからなる
結合体であるレセプターR1と、Ｐに関する少なくとも２
つの結合位を有するレセプターR2を含有することを特徴
とする。
試薬であり、これは特異的に結合するペアの片側成分Ｐ
と測定すべき物質と特異的に結合性の成分Ｋとからなる
結合体であるレセプターR1と、Ｐに関する少なくとも２
つの結合位を有するレセプターR2を含有することを特徴
とする。
本発明による試薬は個々のレセプターR1及びR2並びに場
合によりR3及びR4をあらかじめ混合して含有するか、又
は物理的に相互に分離して含有していてよい。
合によりR3及びR4をあらかじめ混合して含有するか、又
は物理的に相互に分離して含有していてよい。
この試薬は体液及び組織抽出液中の多数のパラメーター
を測定するために好適である。
を測定するために好適である。
有利な実施形においては試薬は付加的に緩衝物質を含有
する。特に燐酸塩緩衝物質又はGOOD緩衝物質を含有する
のが有利である。
する。特に燐酸塩緩衝物質又はGOOD緩衝物質を含有する
のが有利である。
実施例 次に図面及び実施例につき本発明を詳細に説明する。
第１図は本発明による方法の２つの反応原理に関する概
略図である。
略図である。
第２図はアツプテイクテストの２つの反応原理に関する
概略図である。
概略図である。
すべての示した方法においては、レセプターR2としては
Ｐに関する４つの結合位を有するストレプトアビジンを
使用する。レセプターR1としては測定すべき物質と結合
性のレセプターとビオチンとからなる結合体を使用す
る。
Ｐに関する４つの結合位を有するストレプトアビジンを
使用する。レセプターR1としては測定すべき物質と結合
性のレセプターとビオチンとからなる結合体を使用す
る。
第１図のａ）は抗体の検出に好適である変法を示す。そ
のためにレセプターR1は測定すべき抗体と結合性のエピ
トープを含有する。
のためにレセプターR1は測定すべき抗体と結合性のエピ
トープを含有する。
第１図のｂ）は多価物質、例えば蛋白質の測定のために
働らく。
働らく。
第２図のａ）はチロキシンに関するアツプテイクテスト
を実施するための変法である。ここには前記のレセプタ
ーR1及びR2の他に付加的に更にレセプターR3を使用す
る。これは抗−T4−抗体である。
を実施するための変法である。ここには前記のレセプタ
ーR1及びR2の他に付加的に更にレセプターR3を使用す
る。これは抗−T4−抗体である。
第２図のｂ）はアツプテイクテストのもう１つの実施形
であり、ここではレセプターR1、R2及びR3に付加的にレ
セプターR4としてチロキシンを使用する。
であり、ここではレセプターR1、R2及びR3に付加的にレ
セプターR4としてチロキシンを使用する。
第３図は抗−T4−抗体テストに関する検量曲線を示し、
第４図はAFP−測定に関する検量曲線を示し、第５図は
Ｔ−アツプテイクテストに関する検量曲線を示す（原理
は第２図のａ）。第６図はT4−量を変化させることによ
るＴ−アツプテイクテストに関する検量曲線を示す（原
理は第２図のｂに類似）。
第４図はAFP−測定に関する検量曲線を示し、第５図は
Ｔ−アツプテイクテストに関する検量曲線を示す（原理
は第２図のａ）。第６図はT4−量を変化させることによ
るＴ−アツプテイクテストに関する検量曲線を示す（原
理は第２図のｂに類似）。
例１ ａ）ストレプトアビジン−ラテツクスの製造 2mg/mlの濃度のストレプトアビジンをイミダゾール緩衝
液、pH7.5、15mMol/l、NaC100mMol/l中でクロルメチ
ルスチロール粒子（ラテツクス、ｄ＝70nm、米国特許第
4703018号明細書）と２重量％の濃度で24時間一緒に55
℃で恒温保持し、攪拌する。反応混合物を60分間20000r
pmで遠心分離したあと、上澄を傾潟し、沈殿を牛血清ア
ルブミン0.5％を有するpH7.5のグリシン緩衝液200mMol/
l中に取り込む。相応する希釈により１重量％のストレ
プトアビジン／ラテツクス試薬を製造する。
液、pH7.5、15mMol/l、NaC100mMol/l中でクロルメチ
ルスチロール粒子（ラテツクス、ｄ＝70nm、米国特許第
4703018号明細書）と２重量％の濃度で24時間一緒に55
℃で恒温保持し、攪拌する。反応混合物を60分間20000r
pmで遠心分離したあと、上澄を傾潟し、沈殿を牛血清ア
ルブミン0.5％を有するpH7.5のグリシン緩衝液200mMol/
l中に取り込む。相応する希釈により１重量％のストレ
プトアビジン／ラテツクス試薬を製造する。
ｂ）ハプテン／ビオチン結合体の製造 このためにはｎ−ブチルオキシカルボニル−テトラヨー
ドチロニン（西ドイツ国特許公開第2805961号公報）を
ペンタメチレンジアミンを介してビオチンと結合する
（Eur.J.Biochem.第131巻、1980年、第333〜338頁に記
載と同様に行なう）。T4−ビオチン結合体が得られる。
ドチロニン（西ドイツ国特許公開第2805961号公報）を
ペンタメチレンジアミンを介してビオチンと結合する
（Eur.J.Biochem.第131巻、1980年、第333〜338頁に記
載と同様に行なう）。T4−ビオチン結合体が得られる。
例２ T4に対する抗体の測定 試薬1: T4−ビオチン結合体 0.1μmol/l バルビツール酸ナトリウム 緩衝液、pH8.5 0.1mol/l デキストラン ２重量％ 試薬2: ストレプトアビジン−ラテツクス 10mg/ml グリシン緩衝液、pH7.5 200mmol/l ナトリウムアジド 0.1重量％ 試料としては生理学的食塩溶液中のT4に対するポリクロ
ーナル抗体を非特異的羊−免疫グロブリン（IgG）0.1％
の添加下に使用する。
ーナル抗体を非特異的羊−免疫グロブリン（IgG）0.1％
の添加下に使用する。
測定の実施： 試料20μｌ及び試薬１ 960μｌを37℃で５分間恒温保
持する。その後、凝集反応を試薬２ 20μｌの添加によ
り開始し、測光機で405nmで単位時間あたりの光学密度
の変化を測定する。結果を第３図に示す。
持する。その後、凝集反応を試薬２ 20μｌの添加によ
り開始し、測光機で405nmで単位時間あたりの光学密度
の変化を測定する。結果を第３図に示す。
例３ AFP（α−フエト蛋白質：α‐Foetoprotein）の測定 ａ）抗−AFP−抗体のFab−フラグンメントとビオチンと
からなる結合体の製法（抗−AFP-Fab−ビオチン） AFPに対するポリクローナル抗体を免疫吸着法により精
製しかつ“Analyt.Biochem.",161巻,262〜271頁（1987
年）もしくは“Analyt.Biochem.,"149巻,529〜536頁（1
985年）によりビオチンに結合させる。
からなる結合体の製法（抗−AFP-Fab−ビオチン） AFPに対するポリクローナル抗体を免疫吸着法により精
製しかつ“Analyt.Biochem.",161巻,262〜271頁（1987
年）もしくは“Analyt.Biochem.,"149巻,529〜536頁（1
985年）によりビオチンに結合させる。
ｂ）試験の実施 試薬1: 抗−AFP-Fab−ビオチン ５μg/l バルビツール酸ナトリウム 緩衝液、pH8.5 0.1mol/l 試薬2: ストレプトアビジン−ラテツクス 10mg/ml グリシン緩衝液、pH7.5 200mmol/l ナトリウムアジド 0.1重量％ 試料としてはヒト血清中のAFPを使用する。
試料50μｌ及び試薬1 900μｌを37℃で５分間恒温保持
する。その後、凝集反応を試薬２ 20μｌの添加により
開始し、かつ単位時間当りの光学密度の変化を測光機に
より405nmで測定する。結果は第４図に示されている。
する。その後、凝集反応を試薬２ 20μｌの添加により
開始し、かつ単位時間当りの光学密度の変化を測光機に
より405nmで測定する。結果は第４図に示されている。
例４ Ｔ−アツプテイクテスト（第２図のａ）による反応原
理） 試験原理は、抗−T4−抗体とT4−ビオチン結合体が試料
のTBG（チロキシン結合グロブリン）に対して競合する
という点にある。
理） 試験原理は、抗−T4−抗体とT4−ビオチン結合体が試料
のTBG（チロキシン結合グロブリン）に対して競合する
という点にある。
測定の実施 試薬1: T4−ビオチン結合体 40nmol/l リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5 0.1mol/l デキストランサルフエート １重量％ 試薬2: 羊（IgG）からのポリクローナル 抗−T4−抗体 0.1mg/ml ストレプトアビジン−ラテツクス 10mg/ml グリシン緩衝液pH7.5 200mmol/l ナトリウムアジド 0.1重量％ 試料として生理食塩溶液（Ａ）及び生理食塩溶液中のTB
G100μg/mlを使用する。
G100μg/mlを使用する。
試料20μｌ及び試薬１ 960μｌを37℃で５分間恒温保
持する。その後、凝集反応を試薬２ 20μｌの添加によ
り開始し、かつ測光機を用いて405nmで単位時間当りの
光学密度の変化を測定する。結果を第５図に示す。
持する。その後、凝集反応を試薬２ 20μｌの添加によ
り開始し、かつ測光機を用いて405nmで単位時間当りの
光学密度の変化を測定する。結果を第５図に示す。
例５ Ｔ−アツプテイクテスト（第２図のｂ）による反応原
理） 測定は、過剰のTBGを飽和するためにT4試料に添加して
行なう。その後、結合していないT4を測定する。これに
より、チロキシン結合指数（TBI）に正比例する検量曲
線が得られる。
理） 測定は、過剰のTBGを飽和するためにT4試料に添加して
行なう。その後、結合していないT4を測定する。これに
より、チロキシン結合指数（TBI）に正比例する検量曲
線が得られる。
試薬1: T4 １μg/ml リン酸ナトリウム緩衝液pH7.5 0.1mol/l 試薬2: バルビツール酸ナトリウム緩衝液 pH8.5 0.1mol/l デキストランサルフエート ２重量％ ストレプトアビジン−ラテツクス 0.2mg/ml 羊からのポリクローナル抗− T4−抗体（IgG） ２μg/ml 試薬3: エタノール／水（1:1）中の T4−ビオチン結合体 ２μmol/l 試料としては、規定されたチロキシン結合指数（TBI）
目標値を有するヒト血清を使う（試料A:TBI0.19,試料B:
TBI1.64） 測定の実施 試料20μl,試薬１ 20μｌ及び試薬２ 900μｌを37℃
で５分間恒温保持する。その後、凝集反応を試薬３ 20
μｌの添加により開始し、かつ測光機を用いて単位時間
当りの光学密度の変化を405nmで測定する。結果を第６
図に示す。
目標値を有するヒト血清を使う（試料A:TBI0.19,試料B:
TBI1.64） 測定の実施 試料20μl,試薬１ 20μｌ及び試薬２ 900μｌを37℃
で５分間恒温保持する。その後、凝集反応を試薬３ 20
μｌの添加により開始し、かつ測光機を用いて単位時間
当りの光学密度の変化を405nmで測定する。結果を第６
図に示す。
第１図は本発明による方法の２つの反応原理に関する概
略図、第２図はアツプテイクテストの２つの反応原理に
関する概略図、第３図は抗−T4−抗体テストに関する検
量曲線、第４図はAFP−測定に関する検量曲線、第５図
はＴ−アツプテイクテストに関する検量曲線、第６図は
T4−量を変化させることによるＴ−アツプテイクテスト
に関する検量曲線を示す。
略図、第２図はアツプテイクテストの２つの反応原理に
関する概略図、第３図は抗−T4−抗体テストに関する検
量曲線、第４図はAFP−測定に関する検量曲線、第５図
はＴ−アツプテイクテストに関する検量曲線、第６図は
T4−量を変化させることによるＴ−アツプテイクテスト
に関する検量曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−80766（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−116630（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−118672（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−93063（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−30963（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−10590（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／05913（ＷＯ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】試料溶液と少なくとも２種のレセプターR1
及びR2、ここでR1とR2とは相互に結合性であり、かつR1
は測定すべき物質と特異的に結合性である、との恒温保
持及び反応において生じる凝集の測定により特異的に結
合性の物質を測定するための方法において、レセプター
R1として、R2に関する結合位１つだけを有する特異的に
結合するペアの片側成分Ｐと測定すべき物質と特異的に
結合性の成分Ｋとからなる結合体を、R2として少なくと
もＰに関する結合位２つを有し、試料溶液中に天然に存
在しないレセプターを使用することを特徴とする特異的
に結合性の物質の測定法。 - 【請求項２】R2に関する結合位１つだけを有する特異的
に結合性のペアの片側成分Ｐと測定すべき物質と特異的
に結合性の成分Ｋとからなる結合体であるレセプターR1
と、少なくとも２つのＰに対する結合位を有し、試料中
に天然に存在しないレセプターR2とを含有することを特
徴とする請求項１による特異的に結合性の物質の測定試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3829245A DE3829245A1 (de) | 1988-08-29 | 1988-08-29 | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| DE3829245.9 | 1988-08-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02107966A JPH02107966A (ja) | 1990-04-19 |
| JPH0765998B2 true JPH0765998B2 (ja) | 1995-07-19 |
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ID=6361800
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1220526A Expired - Lifetime JPH0765998B2 (ja) | 1988-08-29 | 1989-08-29 | 特異的に結合性の物質の測定法及び測定試薬 |
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| JP (1) | JPH0765998B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE117433T1 (ja) |
| AU (1) | AU607348B2 (ja) |
| DE (2) | DE3829245A1 (ja) |
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| DE4009848A1 (de) * | 1990-03-27 | 1991-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von phosphoryliertes tyrosin enthaltenden proteinen |
| DE4020204A1 (de) * | 1990-06-25 | 1992-01-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Durchfuehrung eines homogenen immunoassays nach dem agglutinationsprinzip |
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| EP0510483A1 (en) * | 1991-04-22 | 1992-10-28 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. | Method for the detection of viruses |
| DE4134833A1 (de) * | 1991-09-25 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fibrin |
| WO1996022533A1 (en) * | 1995-01-18 | 1996-07-25 | First Medical, Inc. | Method for immobilizing haptens on a test article |
| DE19649390A1 (de) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antigenspezifischer IgG-Nachweis |
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| EP1321768A1 (en) * | 2001-12-18 | 2003-06-25 | Roche Diagnostics GmbH | Diagnosis of endometriosis from menstrual blood |
| WO2005062048A1 (de) * | 2003-12-01 | 2005-07-07 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogenes nachweisverfahren |
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| WO2009072385A1 (ja) * | 2007-12-07 | 2009-06-11 | Alfresa Pharma Corporation | 微小粒子の凝集反応を用いる検体の免疫学的測定方法および測定用キット |
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| KR101515020B1 (ko) * | 2013-11-13 | 2015-04-24 | 에스케이텔레콤 주식회사 | 햅텐 및 이에 결합하는 항체를 레퍼런스 항체로 이용하는 면역학적 측정 방법 및 상기 레퍼런스 항체를 이용한 면역학적 측정장치 |
| CN107576806A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-01-12 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法 |
| CN107748251A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-02 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法 |
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| US4184849A (en) * | 1977-12-05 | 1980-01-22 | Technicon Instruments Corporation | Mixed agglutination |
| GB2013211B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Immunoassays using f(ab')2 fragments |
| JPS5510590A (en) * | 1978-05-04 | 1980-01-25 | Wellcome Found | Enzyme immunity quantity analysis |
| US4289747A (en) * | 1978-12-26 | 1981-09-15 | E-Y Laboratories, Inc. | Immunological determination using lectin |
| JPS56118672A (en) * | 1980-02-23 | 1981-09-17 | Ajinomoto Co Inc | Measuring method of antigen or antibody |
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| US4935339A (en) * | 1985-05-07 | 1990-06-19 | Nichols Institute Diagnostics | Delayed solid phase immunologic assay |
| US4900685A (en) * | 1987-01-29 | 1990-02-13 | Cytosignet, Inc. | Analyte detection in particulate-containing samples |
| US4829011A (en) * | 1987-08-27 | 1989-05-09 | Biotrack, Inc. | Agglutination assay |
| US4914040A (en) * | 1988-03-03 | 1990-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate |
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- 1988-08-29 DE DE3829245A patent/DE3829245A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-08-22 AU AU40143/89A patent/AU607348B2/en not_active Ceased
- 1989-08-22 US US07/396,860 patent/US5362655A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-28 ES ES89115852T patent/ES2068222T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-28 DE DE58908905T patent/DE58908905D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1989-08-28 EP EP89115852A patent/EP0356964B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 JP JP1220526A patent/JPH0765998B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 KR KR1019890012281A patent/KR920000056B1/ko not_active Expired
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| ZA896535B (en) | 1990-06-27 |
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