JPH05501958A - 迅速微生物検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２、インディケータ−遺伝子がルシフェラーセである、請求の範囲第１項に記載 のリポータ−細菌。

３、　流体試料または適切な処理により流体となされた試料中のターケ・ｌト細 菌を下記工程により検査する方法 ａ）存在するターゲット細菌を感染させる条件下で試料にバクテリオファージを 添加し、 ｂ）試料中の細胞外バクテリオファージを破壊、除去、中和または不活化し、ｃ ）試１１をインキュベートして感染を完了させ、ターゲット細菌にバクテリオフ ァージを放出させ、そして ｄ）Ｈｉｔ料中のターゲット細菌を指示するものとしてバクテリオファージをア ッセイする。

４、　工程ｄ）が下記により実施される、請求の範囲第３項に記載の方法ｄｉ） 得られたバクテリオファージを用いて請求の範囲第１項または第２項に記載のリ ポータ−細菌を感染させ、そしてｄ百）リポータ−細菌が発現した検出可能なポ リペプチドを、試料中のターゲット細菌を指示するものとして観察する。

５、　工程Ｃ）とｄ〕の間に下記の追加工程か含まれる、請求の範囲第３項また は第４項に記載の方法： ｃｉ）許容宿主細菌を用いて試料中のバクテリオファージを増幅する。

６、　ターゲット細菌が病原体である、請求の範囲第５項に記載の方法。

７、　工程ｂ）が試料を不飽和脂肪酸の存在下にフォトン照射することにより実 施される、請求の範囲第３項ないし第６項のいずれかに記載の方法。

８、　工程ｂ）が酢酸を用いて実施される、請求の範囲第３項ないし第６項のい ずれかに記載の方法。

９、　工程ａ）が周囲温度より低い温度で実施される、請求の範囲第８項に記載 の方法。

１０、試料中のターゲット細菌を下記工程により検査する方法ａ）請求の範囲第 １項または第２項に記載のリポータ−細菌を試料に添加し、ｂ）存在するターゲ ット細菌および添加されたリポータ−細菌を感染させる競合アッセイ条件下で試 料にバクテリオファージを添加し、Ｃ）リポータ−細菌が発現した検出可能なポ リペプチドを、試料中のターゲット細菌を指示するものとして観察する。

１１、試料中のバクテリオファージを下記工程により検査する方法。

ａ）存在するバクテリオファージがリポータ−細菌に感染する条件下で請求の範 囲第１項または第２項に記載のリポータ−細菌を試料に添加し、ｂ）リポータ− 細菌が発現した検出可能なポリペプチドを、試料中のバクテリオファージを指示 するものとして観察する。

１２、殺ウィルス薬を下記工程により試験する方法：ａ）既知濃度の予め定めら れたバクテリオファージを含有する流体を用意し、ｂ）流体を殺ウィルス薬によ り処理し、Ｃ）処理された流体に、生存バクテリオファージが感染する条件下で 、請求の範囲第１項または第２項に記載のリポータ−細菌を添加し、ｄ）標識細 菌が発現した検出可能なポリペプチドを、殺ウイルス処理の有効性を指示するも のとして観察する。

明細署 本発明は、多種多様な場合、たとえば食品、臨床検体、および環境上重要な試料 において微生物、たとえば細菌およびバクテリオファージを検出する方法に関す るものである。本発明は坑菌性化合物に対する感受性および殺ウィルス薬の有効 性の検査にも利用しうる。

余男の背量 細菌の検出および同定は種々の微生物利用において極めて重要である。たとえば 食品、水および他の飲料を病原性細菌についてスクリーンする必要性は、消費者 の安全を保証するのに極めて重要である。特定の科の細菌の量を測定することは 、これらの製品の貯蔵寿命および微生物許容度、ならびにそれらの製造に用いら れる加工装！および原料の衛生状態を推定するために慣用される方法である。

微生物感染の診断も原因生物の検出に依存する。環境水をレジオネラ属（Ｌｅｇ ｉｏｎｅｌｌａ）などの微生物についてスクリーンすることはがなり重要である と最近では考えられている。

バクテリオファージ（細菌に特異的に感染するウィルス）を検出するという要望 は、細菌を死滅させるそれらの能力、従ってそれらがたとえば発端培養細菌を死 滅させることにより牛乳の発酵に及ぼす可能性がある有害な影響に起因する。

バタテリすファージは水工業において河川の流速または下水の漏出を調へるため のトレーサーとしても用いられる。

細菌の検出および計数を行うために用いられる方法には多数の欠点がある。伝統 的な培養に基づ（方法が、用いられる試験法の主体をなす。しかしそれらは目的 とする生物を増殖させるか他の細菌の増殖は抑制する選択培地における細菌の増 殖に依存するので、本来緩徐であり２生育性細菌全体の計数に１８−２４時間を 要し、サルモ不う属菌（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌ　ａ）の検出に４−７日を要 する。

多くの場合、与えられた培地により細菌の特定の増殖要件が満たされない可能性 かあり、または準致死状態にまで損傷を受けているが、もしくはそれらが生育性 であるが培養し得ないストレス誘導された生理状態に陥っている可能性があるの で、細菌数は実際より少なく評価される可能性がある。培養に基づく方法は必要 とするインキュベーション期間が長いため、現場試験には不適当である。

これらの欠点に対処し、迅速な細菌検出を可Ｒしにする種々の方法が提案され、 あるものは現場使用に適用しつると主張された。たとえばすべての生体の細胞内 成分であるアデノシントリホスフェ−１−（ＡＴＰ）の測定は迅速法を提供する が、これは特異的でなく、従ってせいぜい全細菌数が推定されるにすぎない。

目的とする細菌に特異的な抗体を用いるイムノアッセイは、特異性および感層か 不適当であるため、たとえばサルモ不う属菌試験の場合はイムノアッセイ前に２ 日間の増菌培養を必要とするので、広範には採用されなかった。競合生物および 試料マｈｌＪックスからの妨害は、許容し得ない割合の擬陽性および擬陽性結果 、ならびに培養法より実質的に短期間ではないプロトコールをもたらした。

ＤＮＡまたはＲ，Ｎ　Ａプローブに基づく方法が細菌の検出に適用されたが、現 在では複雑なプロトコール、ある溶液中の不快な化学物質、および高い温度の必 要性に付随する問題がある。それらはもちろん、古典的な微生物学に熟練した技 術者には快く利用されない。イムノアッセイ法および核酸増幅法、たとえばポ■ リラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と共に、それらは生存細菌と死滅細菌を識別しない 。

このためそれらは生育性細菌の直接アッセイ（生存生物を増幅させる培養工程が ない場合）には不適当である。ある用途にはこの区別が極めて重要である。たと えば水系９生存レシオネラ属菌がほとんど無いことを保証するために殺菌薬を用 いる場合、殺菌過程で死滅した生物を識別および検出しないアッセイ法を採用す ることは無意味である。

細菌の検出速度を高めるために高価な計測器に依存する方法は多数ある。その− 例は細菌の存在をそれらか複鯵な栄養を代謝してより簡単な化学物質に変換し、 同時に培地の電気的特性が変化することにより検出するインピーダンス／コンダ クタンス測定である。このような方法は資本集中性が高く、小規模の研究所また は現場使用には不適当である。

場合により選択的染色を用いる鏡検法は感炭に限界があり、一般に生存細菌と死 滅細菌の識別性に乏しい。ルーティン鏡検法は、選択培養または免疫学的染色と 組み合わせない限り、形態に基づ（推定同定が可能であるにすぎない。

以上からみて、実施か容易であり、特異的、迅速であり（数日ではなく数時間で 結果を与える〕、生存生物のみを検出することができ、現場使用か可能であり、 かつ高価な針脚ｊ器を必要としない、細菌およびバクテリオファージの検出法を 得ることか極めて望ましい。アッセイは多種多様な種類の試料について前処理な しに、かつ最少の工程数で実施しうろことか好ましい。アッセイ結果は、観察が 容易であり、カリ自動読み取り化し易い、検出可能なものでなければならない。

さらに、他の場合には検出のために予備増菌培養工程および選択的増菌工程を必 要とする不能な細菌をアッセイにより検出しうろことか望ましいであろう。培養 不可能であるか生育性である生物をも検出し得なければならない。

先行技術の説明 徴生物同定法の多くは栄養寒天平板を用いる古典的な微生物学に基づくものであ る。近年、分子生物学および遺伝子修飾を利用する試みもこの傾城に適用されて いる。特にウリツルおよびターン（欧州特許出願第０１６８９３３号明細書）に よれば、バクテリオファージに検出性マーカー（しばしば酵素ルシフエラーゼ） を導入し、次いでこれを利用して細菌を検出することができる。そのバクテリオ ファージの宿主である当該細菌を含む疑いのある試料に、修飾されたファージを 添加する。適切な宿主細菌が存在する場合、バクテリオファージ核酸はその宿主 に感染し、−その細菌において発現するであろう。修飾されたバクテリオファー ジかマーカーであるルシフェラーゼを保有する場合、細菌の存在は容易に検出し うる発光により測定しうる。

ＤＮＡプラント・コーポレーシゴンによるＰＣＴ／９０１０４０４１は異なるマ ーカー系、すなわち氷核（ｉｃｅ　ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）を用い、かつ判定を 行うためにファージのパネルを利用する。

ＰＣＴ９０１０４０３７は、一連の有毒物置を検出するための試験系に遺伝子修 飾された微生物を指示体として用いる。

ＰＣＴ８９１０３８７８には、真核生物ウィルスに適用しうる遺伝子修飾に基づ く系かｇ己載されている。

米国特許第４．７９７．３６３号は種々のシグナル系で標識されたバクテリオフ ァージを用いる。しかし標識は直接的な化学的方法によるものであり、付加遺伝 子の発現によるものではない。

新規な発明の利点 細菌を検出するためのバクテリオファージを用いる遺伝子修飾に基づく系におい ては、遺伝子修飾はバクテリオファージに対するものであった。種々の技術的理 由から、これは必ずしも形成するのか容易ではない修飾である。細菌同定のため にファージのパネルを必要とする場合、パネルの各ファージが同様な修飾を必要 とし、従って問題は増大する。本発明の１形態によれば、遺伝子修飾されていな いバクテリオファージを使用し、検出可能なマーカーを保有する修飾された細菌 （または修飾された細菌のパネル）をのちに使用する。バクテリオファージと比 較して細菌を修飾することは技術的にはるかに容易である。

発明の要約 本発明は試料中の細菌またはバクテリオファージを試験および検ａするための数 種の方法からなる。本発明は抗菌薬に対する細菌の感受性を判定し、抗ウィルス 薬の有効性を評価することもできる。定性的および定量的双方の試験が包含され る。

これはバクテリオファージと細菌の相互作用を利用することにより達成される。

バクテリオファージが細菌に感染する様式をアッセイ法の開発に利用することが できる。この相互作用は特異的であり、この認識／結合が起こると、バクテリオ ファージはその核酸を宿主細菌中へ注入する。次いで宿主は産生される′ファー ジ′の複製に利用され、次いで宿主が破壊されると、他の細菌の感染に利用され る。

ファージが特異的に細胞に感染し、その核酸を注入すると、それは細胞外環境属 菌を含む場合は特異的ファージが保護され、サルモネラ属菌が存在しない場合は ファージは保護されない。結合していないファージの排除または死滅は種々の方 法、たとえば抗ウィルス藁、熱、ファージの安定性に必須であるイヒ学物質の除 去などにより達成しうる。

この観点は、直接または間接標識されたファージを細菌の表面に結合させ、結合 していないものを洗浄除去したのちシグナル（酵素、蛍光、ルミネセントなど） を発現させる、ファージを用いる他の診断法とは明らかに著しく異なる。この場 合、重要な出来事はすべて細胞の外で起こり、本発明と明瞭な対照をなす。

本発明の次の工程は、検出される細胞の数に依存する。保護され、複製および出 現しうるバクテリオファージの数は、直接に検出するのに十分なものである。

そうでない場合、それらを増殖中の宿主上で必要な期間（ファージの世代時間は １時間以下であり、１０−１０００の後代か産生されるので、これは短期間でよ い）増殖させることにより、増幅することができる。

ファージの数が検出に適したものになると、多数の方法により、たとえばファー ジのある成分に対する抗体もしくはファージゲノムに対する核酸プローブを用い て免疫学的に、またはプラークアッセイにより、検出を行うことができる。好ま しい方法は、検出しうるシグナルを形成するポテンシャル（容易に検出しうる表 現型をコードする遺伝子）を含むが、このポテンシャルは細菌かファージに感染 した場合にのみ発現する細菌を遺伝子修飾により構成しうるという知見に基づく 。ファージがシグナル産生の引き金を引き、従ってファージ（従ってそれを保護 する細菌）の存在を高感度で容易に検出しうる。ここでリポータ−細菌と呼ぶこ れらの細菌はそれ自体新規な材料であり、本発明の他の観点をなす。

従って本発明は２つの重要な特色のうち一方または両方を用いることによる数種 の試験法を包含する。重要な特色の１つは、ファージに感染した細菌をも含む流 体試料中の細胞外バクテリオファージを死滅させることである。他方の重要な特 色は、発現した際に検出可能なポリペプチドを産生ずるインディケータ−遺伝子 を含むべく遺伝子工学的に処理されたリポータ−細菌を提供することである。

インディケータ−遺伝子の性質、および検出可能なポリペプチドを検出するため に用いられる手段は本発明の本質ではない。

以下の節にこれら２つの重要な特色について述べる。それに続いて本発明による 種々の試験法につき述へる。

鑑別ファージ死滅 ヒロタニ（Ｈｉｒｏｔａｎｉ）ら（１９９１）には、Ｔ５ファージに対する不飽 和脂肪酸および関連アルコール類の抗ウィルス活性か記載されている。３０００ 　±旦五（ルーメン／　ｃ　ｍりの照明を付加して、彼らはＣ１８：　２リノエ ライジン酸（ＬＡ）を５０μｇ／ｍｌで用いて９７．６％のＴ５ファーシネ活化 を達成した。本発明者らは、これらの方針に沿ったプロトコールにより本発明者 らが目的とする鑑別ファージ死滅を達成しうろことを証明した。この酸またはア ルコール類を添加含有する流体試料をフォトン照射する。蛍光が極めて好適であ る。

単色光を用いる場合、波長は好ましくは４２０ｎｍ付近であるが、補助効果は５ ３０ｎｍ付近で見られる。試料中の細菌を感染したファージに不都合な影響を及 ぼすことなく細胞外バクテリオファージを選択的に死滅させるのに十分な期間お よび強度の照明が有効である。

鑑別ファージ死滅のための処！の別法は、試料にＣ１−Ｃ４カルボン酸、たとえ ば酢酸を添加することによる。試料中の酢酸濃度は、好ましくは０．　０１−１ ゜０％、特に０．　１−０．　５％である。これらの数値は試料中の氷酢酸の容 量％で表される。濃度が低すぎると細胞外バクテリオファージは死滅しない、濃 度が高すぎると試料中の感染細菌が損傷を受ける可能性がある。酢酸がウィルス 死減作用を呈す棚間、たとえば３７℃で１５分間、試料をインキュベートし、次 いで塩基の添加によりほぼ中性に戻す。酢酸の代わりにビネガー（５％）を用い て、極めて類似する結果を得た。

細胞外バクテリオファージを死滅させたのち、試料中の生存ファージ（感染細菌 内に存在）を増幅する必要がしばしばある。しかし周囲温度またはより高い温度 における細菌のバクテリオファージ感染は細菌を後続の酢酸暴露に対して感受性 となし、従って細菌がその後ファージを適正に増幅し得ないと思われる。この問 題に対する好ましい解決策は、試料中の細菌のバクテリオファージ感染を周囲温 度より低い温度で行うことである。たとえば試料を水浴中で０℃に保持すること かできる。ファージ感染はこのような低温でも効果的に起こり、得られた感染細 菌はもはや酢酸処理に対して感受性ではない。

それ自身が酸感受性である生物、たとえばプソイドモナス科細菌については、こ のような処理は有効でない。可能な他の処理は、過酸化水素および水酸化ナトリ ウムの混合物を用いるものである。

リポータ−細菌の調製 有効なバクテリオファージ（ファージ）感染は、一般に一組の遺伝子が順次発現 することを必要とする。多数のバクテリオファージの研究により、一時的な調節 を得るための種々の生物学的方法が確認された（たとえばラブセイおよびガイド シェフ　（Ｒａｂｕｓｓａｙ、Ｇｅ１ｄｕｓｃｈｅｋ）、１９７７；マツフナイ トおよびチアン（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｔｊｉａｎ）、１９８６を参照されたい） 。

これらの方法は大部分か転写制御を伴うものである。報告されている古典的な方 法は転写開始に際して作動する（ヤコブおよびモノード（Ｊａｃｏｂ、Ｍｏｎ。

ｄ）、１９６１：ブタシュネ（Ｐｔａｓｈｎｅ）、１９８６）。

最初にファージＬａｍｂｄａに関して報告された他の機構においては、感染に際 して初期に発現された遺伝子の転写に用いたものと同じプロモーターを用いて、 のちに転写体の終止解除過程で発現される遺伝子を転写する（ロバーツ（Ｒｏｂ ｅｒｔｓ）、１９６９）。この型の制御を示すオペロンは、終止シグナルに対し てプロモーター近位に位置する遺伝子を最大限に発現することができ、これに対 し終止シグナルに対してプロモーター遠位に位置する遺伝子は発現しないか、ま たはわずかじか発現しないように配置される。これら後者の紐の遺伝子は、生理 的または発生上の何らかの変化により終止シグナルの活性か除かれた場合に発現 する。終止シグナルの性質および終止解除因子の性質は大幅に異なる（ブラット （Ｐｌａｔｔ）、１９８６）。

分子微生物学の用具および手法を用いて、バクテリオファージのゲノムを切断し 、そのゲノムの要素を自己複製プラスミドベクター中へクローン化することがで きる。ランダムに形成されたこれらの構造体のライブラリーうち、バクテリオフ ァージプロモーターを含むものはプロモーター近位遺伝子を発現する。ただしプ ロモーターが正常なりファンビラン感受性細菌ＲＮＡポリメラーゼを利用する場 合に常にそうである。クローン化されたバクテリオファージＤＮＡがプロモータ ーのほかに終止シグナルを含む場合、プロモーターに近位の遺伝子は発現される か、プロモーターターミネータ−に遠位の遺伝子は発現されない。これらのプロ モーター遠位遺伝子は、終止解除シグナルを含む適正なバクテリオファージが供 給され、これかクローン化されたＤＮＡセグメント上に存在しない場合にのみ発 現する。しかしバクテリオファージ感染に対応して一時的に制御される遺伝子発 現の自然な部分として、トランスアクティング（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）終 止解除因子か付与されていてもよい。すなわち転写ターミネータ−の下流にある プラスミドクローン化されたプロモーター遠位遺伝子は、バクテリオファージ感 染に際してのみ発現される。天然のバクテリオファージ遺伝子が、その産生物を 容易に監視しうるインディケータ−遺伝子、たとえば±ｕｘＡ上且五Ｂにより１ 換されている場合、ファージ依存性終止解除によりこのインディケータ−遺伝子 表現型が発現するであろう。ＩｕｘＡｌｕｘＢを用いた構造体について、これは 初期のプラスミドベクター構造体は暗色であるが、バクテリオファージ感染に際 してはバイオルミネセンスが生じることを意味する。ＩｕｘＡｌｕｘＢ発現およ びバイオルミネセンスは好ましいインディケータ−系であるが、バクテリオファ ージ感染後のトランスアクティング終止解除状態の監視を容易にする他のインデ ィケータ−系も用いられる。

バクテＩＪ−オファージ、たとえばＬａｍｂｄａ　φ８０、Ｐ２、Ｐ２２、Ｈｋ Ｏ２２および２１の分子構成および遺伝子制御機構に関する既存の知識により、 当業者は前記の構造体を工学的に構成するためにインビトロで単離すべき特異的 ＤＮＡ領域を確認することができるであろう。しかし遺伝学的に解明されていな いバクテリオファージのゲノムのランダムクローニングによって同様に有効な構 造体を得ることができるので、この′徹底的な′知識は有用ではあるが、必要で はない。

バクテリオファージ２３０７４−Ｂ　１　（ＡＴＣＣ）は、そのゲノムが解明さ れていないリステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙ ｔｏｇｅｎｅｓ）血清タイプ４フアージである。ゲノム２３０７４−Ｂｌについ て制限酵素Σａｕ３ａを用いる部分消化を行い、ｐｃＫ１グラム陽性レプリコン （ガッソンおよびアンダーリン（Ｇａｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、 １９リゲ一ンヨン反応を用いてリステリア・モノサイトジェネス２３０７４をク ロラムフェニコール耐性に形質転換し、組換えクローンをパイオルミネセント表 現型につきスクリーンした。ｍｆｆ性ハイオルミ不セノスを含まないクローン（ 暗色クローン）をさらにバクテリオファージ２３０７４−Ｂｌに感染させたのち 、バイオルミネセンスにつきスクリーンした。ファージ依存性バイオルミネセン スを備えたクローンが確認された。第２図はファージ感染後のこのような構造体 の１つ（ｐ、ＳＰｌ、９）のバイオルミネセンスプロフィルを示す。ファージ感 染細胞と非感染細胞の間に１００倍のバイオルミネセンスの差が認められた。ｐ ｓＰ１９および類傭の表現型を示す構造体は、バクテリオファージ２３０７４＝ Ｂ１の存在を検知するための基礎となる。ｐｓＰ１９は予めファージゲノムに関 する知識なしに構成され、選択法の一般的な性質を表す。同様なプロトコールに よりリステリア・モノサイトジェネスに対する他のバクテリオファージを検出す ることができた。

必ずしもすへてのバクテリオファージが終止解除による一時的な遺伝子発現を制 御するわけではないことは知られている。たとえばＴ７は新規なＴ７　ＲＮＡポ リメラーゼ特異性バクテリオファージプロモーターからの転写を促進する新規な りファンビシン耐性ＲＮＡポリメラーゼを備えている（チャンバーリン（Ｃｈａ ｍｂｅ　ｒ　ｌ　ｉｎ）、１９７．０）。それにもかかわらず、上ｇ己のクロー ニングプログラムによりスクリーンした場合、Ｔ７型の他のファージは対応する バクテリオファージに感染しない限りインディケータ−遺伝子に対してサイレン トである組換え１１４４体を備えている。これらの構造体はインディケータ−遺 伝子に対して近位にバクテリオファージ特異性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター 配列を備えていると思われる。宿主ＲＮＡポリメラーゼはこのような構造体を転 写せず、従って用いたインディケータ−が１ｕｘＡ±ｕｘＢである場合、この組 換え体は暗色であろう。しかしバクテリオファージ感染はバクテリオファージＲ ＮＡポリメラーゼの一時的発現、従ってインディケータ−遺伝子の能動転写を生 じる。Ｔ７、Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６フアーシ特異性ＲＮＡポリメラーゼを用い て組換えプラスミドベクターにおける遺伝子発現を制御することは周知である（ オールドおよびプリムローズ（Ｏｌｄ、Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）、１９８９）ａ　し かし従来これはバクテリオファージの計数には用いられておらず、この要素は交 換にインディケータ−遺伝子の発現を誘導するために一時的発現を杓用する一般 的方法における可能な制御方式の１つにすぎない。

バクテリオファージＰ１は、ファージ遺伝子発現を一時的に調節するために終止 または特異的ＲＮＡポリメラーゼのいずれも用いないと思われる、十分に解明さ れたファージである（ヤルモリンスキーおよびスターンバーブ（Ｙａｒｍｏｌｉ ｎｓｋｙ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）、１９８８）、それにもかかわらす、誘導され ていない溶源菌においては不活性であるが、プロファージ誘導後、約３０分で活 性になるプロモーターがＰｌから確認された（前掲）。これらのプロモーターは バクテリオファージ２３０７４−８１に関して先に述べたスクリーニング法によ り確認されると予想される。クローニングベクターはＰ１宿主細菌において機能 するものでなければならないが、選択の原理は同じである。

現在遺伝子レベルで十分に解明されているバクテリオファージのうちには、一時 的制御の要素を欠如すると思われるものはない。従ってこれらの要素がすべての バクテリオファージに存在すると仮定するのが妥当である。一時的制御の機構は 異なるが、現在確認されている機構はすべて、インディケータ−遺伝子（たとえ ば±ｕｘＡ土旦ｘＢ）を一時的に制御されるバクテリオファージ遺伝子スイッチ の発現制御下に置くバクテリオファージ／インディケータ−キメラを構成しやす い。ファージ感染していない宿主中に安定な遺伝子構造体として存在する場合、 インディケータ−遺伝子は発現しないであろう。しかしファージ感染に際して、 バクテリオファージはキメラインディケータ−Ｎ４遺体の発現を活性化するトラ ンスアクティング因子を供給しつる。インディケータ−発現（たとえば１ｕｘＡ ±ｕｘＢを用いた場合はインビボバイオルミネセンス）の１１１定はヴイルレン トハクテリオファーン粒子の存在を直接に定量測定するものである。バクテリオ ファージを分子生物学的に詳細に理解することはキメラインディケータ−の構成 を助成するであろうか、リステリア・モノサイトジェネスファージ２３０７１− Ｂｌに関するこのような構造体の立証は、全く解明されていないバクテリオファ ージからキメラインディケータ−を形成しうろことを示す。従って原則としてキ メラインディケータ−構造体はいかなる細菌／ノークテリオファーシ対について も形成しうる。

これらの方法により、リポータ−細菌、すなわち遺伝子スイッチ／インディケー タ−遺伝子牛メラを含むへく構成された遺伝子工学的に形成された細菌であって 、スイッチの活性化かファージ感染に際して供給されたトランスアクティング因 子に依存するものか得られる。これらの遺伝子工学的に形成された細菌は非生育 性および非培養性となるが、それらがファージ感染を検出する能力は保持される 。

これらのリポータ−細菌を用いた種々の試験法を以下の節に記載する。

サルモネラ属菌種またはリステリア属菌種などの細菌は検出前に採取および増菌 する必要かある。細菌数を検出水準にまで高める増菌は、微生物の増殖および分 割の速度４こ応じた時間を要する。細菌数の増加は指数曲線に従い、従って１個 のサルモネラ属菌またはリステリア属菌が１０８個の細菌に達するためには、そ れぞれ２７回の分割を必要とし、増殖速度を３０分とすれば、これは最低１４時 間を要する。これに対し、バクテリオファージ感染サイクルは一般に４０分を要 し、後代ファージ１０（００個を産生ずる。溶菌性ファージに感染した１個のサ ルモネラ属菌またはリステリア属菌はさらにヘルパー細菌の存在下で、放出数１ ０において５．３時間、放出数１００において２．６時間で１，０８個のバクテ リオファージ粒子を産生ずる。すなわちバクテリオファージは細菌の３−５倍の 速度で増幅される。このバクテリオファージ増幅を利用して、下記により食品そ の他の試料中の低い数の病原性細菌の存在を検知することかできる１−１０個の 病原性細菌を含む２５ｇの食品を増殖培地にホモンナイズし、病原体を確実に迅 速感染するのに十分な濃度で病原体付随性バクテリオファージを添加する（１０ 以上のｍ、ｏ、ｉ、＊）　（ｍ、ｏ、ｉ、＊　感染の多重度）。ファージＤＮＡ を１０−１５分間病原体に注入させたのち、化学的または物理的処理により残存 バクテリオファージすへてを破壊、除去、中和または不活化する。化学的処理の 例には、殺ウイルス濃度であるか抗微生物濃度未満であるバイオサイトか含まれ る。物理的処理の例には、殺ウイルス濃度であるか抗微生物濃度未満である熱か 含まれる。バクテリオファージを破壊したのち、殺ウイルス性化学物質を中和し 、熱を用いた場合は温度を微生物の増殖に最適なものに戻す。当初の病原体はこ の時点ではファージ感染しており、生育性の細胞外ファージは存在しない。さら に３０−４０分間インキュベートしたのち、当初の病原体のファージ感染サイク ルは完了し、病原体の溶解に伴ってヴイルレントバクテリオファージが放出され る。放出されたバクテリオファージの数は検出するにはすくなすぎるであろうが 、培養物に許容（ｐｅ　ｒｍｉ　ｓ　ｓ　１ｖｅ）宿主（必ずしも病原性ではな い）を添加すると、これらのわずかなファージが増幅される。許容細菌１０６− １０７個を添加すると、３−５時間で１０−１００またはそれ以上のファージ粒 子を増幅しうる。このような濃度のバクテリオファージの存在は前記のバクテリ オファージアッセイ様式によって迅速かつ好都合に検出しうる。

食品その他の試料が低い濃度のターゲット病原体を含む場合、これらを感染およ び増幅ののち陽性バクテリオファージアッセイ法により間接的に検出する。バク テリオファージの好ましいアッセイ法は、発現に関してファージ感染依存性であ るプロモーター／工且五ＡＢまたは上旦五Ａ土且五Ｂキメラを含むべく遺伝子工 学的に処理された細菌においてバイオルミネセント表現型を誘導することによる ものである。しかし最終的な増幅された培地中のファージの存在を免疫学的にア ッセイすることも考慮しうる。

ターゲット細菌を含まない試料はバクテリオファージを殺ウイルス処理から保護 （食、ｅｃ　ｌ　１ｐｓｅ）Ｌ得ない。従って許容宿主細菌により増幅すべきフ ァージが得られない。このようΔ試料は最終的な増幅培養物中にバクテリオファ ージを含まず、これらの培養物からの試料は前記のバクテリオファージアッセイ に際して陰性である。

試料は病原体付随性バクテリオファージの存在または不在に基づいて、３６時間 以内にターゲット病原体につき陽性または陰性と判定することができる。

バクテリオファージは生育性であるか非培養性である細菌を感染しうるので、細 菌の迅速検出には準致死的損傷を受けた細菌を含むはずである。準致死的損傷を 受けた細菌の増殖能を回復させる必要性が避けられることは、アッセイ速度に著 しく寄与する。

低濃度の細菌を検出するために用いられるバクテリオファージは、Ｎ　ａ、　Ｏ Ｈなどの藁品て化学的に処理されるか、または化学的もしくは物理的不活化剤に 対するそれらの感受性を高める自然突然変異に関して選択することかできる。こ のような突然変異体は、ターゲット細菌の初回感染後にこれらのターゲット細菌 から放出されたファージを増幅する荊に行われる残存バクテリオファーシネ活化 を容易にするであろう。

ターゲット細菌から放出されたバクテリオファージの増幅に用いられる許容細菌 は、病原性ポテンシャルおよび／または自然環境において効果的に競合する能力 を減じる自然突然変異体に関して選択することができる。

ｂ）１サイクルの感染およびアンセイ インディケーター微生物、たとえば腸内細菌群は、一般に食品および環境試料中 に個々の病原体を十分に越える濃度で存在する。漸増する濃度の細菌を漸増する 病原体の存在確率の尺度として用い、その結果、衛生状態の確立およびＨＡＣＣ Ｐ監視において慎重な監視かかなり有用であることを証明しうる（Ｍ　ｉ　ｃ　 ｒ　。

ｏｒｇａｎ＋ｓｍｓ　ｉｎ　Ｆｏｏｄｓ　４；ＩＣＭＳＦ）。１０２／ｇまたは ０ｍ２の濃度のインディケータ−細菌の存在の監視は、前記のファージ増幅アノ 行わない１サイクルのファージ感染により、従って１００分以下の時間規模でア ・ンセイすることができる。

≧１０３／ｇまたは０ｍ２のインディケータ−細菌を含む試料を、インディケー タ−の迅速感染を保証するのに十分な濃Ｉのインディケータ−付随性バクテリオ ７７−シで処理する（１０以上のｍ、ｏ、ｉ、　）。ファージＲＮＡを１０−１ ５分間インディケータ−細菌に感染させたのち、化学的または物理的処理により 残存バクテリオファージをすへて破壊する。ウィルス処理を中和したのち、微生 物増殖培地中でのインキュベーションを４０−５０分間継続してファージ感染サ イクルを完了させる。バクテリオファージは１０禰以上の濃度で放出される（最 小放出数１０と仮定して）。この濃度ではバクテリオファージの存在は、許容宿 主によりさらに増幅させることなく、上記の新規なアッセイ形式によって直接に アｙ１サイクルの感染およびアッセイに際して記載したものに代わる形式では、 アッセイされる試料中に存在するインディケータ−細菌とファージの存在を検出 するために工学的に処理された細菌との間におけるバクテリオファージの競合結 合を利用する。等濃度の天然インディケータ−細菌および工学的に形成されたア ッセイ用細菌ならびに飽和濃闇未膚のバクテリオファージが与えられると、ファ ージはインディケータ−細菌とアッセイ用細菌の結合と感染の間に均等に分布す るであろう。これらの状況下では、ＩｕｘＡＢから得られるバイオルミネセンス の量はインディケータ−細菌が存在しない場合に得られるものの半分であろう。

この結合の場合、アッセイ時間は６０分以下であり、殺ウイルス処理工程の必要 がなく、アッセイ細菌とバクテリオファージの比率を操作することにより細菌数 を定量的に推定することができる。

２　環境内バクテリオファージの迅速検出バクテリオファージアッセイ形式を、 リポータ−細菌が先に詳述した環境内バクテリオファージによる感染に対して反 応性となるように工学的に処理されたものに設計することができる。この種類の ファージには大腸菌ファージか含まれる。

このアッセイ法は水および下水廃液中の生育性大腸菌ファージを迅速検出するこ とかできる。このアッセイ法は原則としていかなる細菌／ノークテリオファーシ 対をも検出すへく設計しつるので、いかなる関連ｔ＜’７テリオフアーシの現場 検出をも考慮しうる。

３、殺ウィルス薬の迅速評価 上記のバクテリオファージ検出アッセイ形式は生育性および感染性ファージのみ を検出し、ファージ粒子の存在のみでなく生物活性を反映する。有効な殺ウィル ス夏の抗ウィルス活性の測定および評価は、一般に複雑な細胞培養または電子顕 微鏡設備を必要とする。原核細胞のウィルスとしての／１クテリオファーシは殺 ウイルス化合物の効力を試験するためのモデルウィルス試薬として使用しうる。

野生型バクテリオファージに対する殺ウイルス活性は、発現に関してファージ感 染に依存するプロモーター／±ｕｘＡＢキメラを含むへく遺伝子工学的に処理さ れた細菌を用いるアッセイにより、／ヅオルミネセンスの減少として測定しうる 。

この種類の細菌をここでは新規なバクテリオファ−シア７セイ形式として説明し た。

これまでにバクテリオファージゲノム内に１ｕｘＡＢを含むへく遺伝子工学的に 処理された紐換えバクテリオファージを用いる殺ウィルス薬のアッセイ法は報告 されている（ジャツム（Ｊａｓｓｉｍ）ら、１９９０）。しかし本発明（よ野生 型バクテリオファージを用い、一方ではウィルス生育性の尺度としての７（イオ ルミ不センスの発現を維持することができる。

本発明を以下の実施例によってさらに説明する実施例１４よ、リステリア・モノ サイトジェネス２３０７４に基づくリポータ−細菌の調製および使用につき記載 する。

実施例２−５は、ファージ感染は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）かその後増幅される活 性を損なうことなく細胞外バクテリオファージを死滅させる方法につき記載する 。

実施例６は、実施例１で得たリポータ−細菌を増幅バクテリオファージで活性化 することによるリステリア属菌の検出法につき記載する。

リステリア・モノサイトジェネス２３０７４のＢ１ファージからのプロモーター プラスミドＤＮＡを標準法により単離し、ＣｓＣ１濃度勾配中で遠心分離して平 衡化することによりＮＵした。Ｂ１ファージ粒子をリステリア・モノサイトジェ ネス　ＡＴＣＣ２３０７４中で増殖させ、ＣｓＣｌ濃度勾配中で７＜ンデイング することにより精製した（オーデュリエール（Ａｕｄｕｒｉｅｒ）ら、１９７７ による）。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出処理によりファージから遊離 させ、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下でのエタノール沈殿により採取した。

プロモータースクリーニングのためのｐＳＢ２９２中のＢ１ファージライブラリ ーの調製　−−□− Ｂ１ファーンからのＤＮＡを制限酵素Δ土旦１１旦見ｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉオよび尺上 ユ■で別個に消化した。反応か完了したのち、酵素をフェノール／クロロホルム 抽出により除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿により採取した。平行してプラスミ ドｐＳＢ２９２　（第１図およびパーク（Ｐａｒｋ、）ら、１９９１）をＳｍａ Ｉで消化し、上記と同様にＤＮＡを採取した。等容量のＡｌｕＩ、旦ａｉＩＩお よび旦ｓａＩ消化物を混合することによりＢ１ファージＤＮＡフラグメントの混 合物を調製した。次いで１ｍＭ塩化へキサミンコバルトＩＩＩを含む標準リゲー ション反応により、これらのフラグメントをｐＳＢ２９２のＳｍ−ａＩ部位にリ ゲートした（挿入配列／ベクター比２．１）。リゲーション混合物をｖｓｗｐフ ィルター（ミリボア）により蒸留水に対して３０分間透析し、これを用いてノ々 −りおよびスチュワード（Ｐａｒｋ、Ｓｔｕｗａｒｔ、１９９０）の方法により リステリア・モノサイトジェネス　ＡＴＣＣ２３０７４を形質転換した。５μｇ ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するプレイン・／１−ト・インフュージョ ン寒天（ＢＨｒ、オフスフオード）に接種し、３０℃で１夜インキユベートする ことにより形質転換体を採取した。

ファージ誘導性プロモーターについての形質転換体のスクリーニングＢ１ファー ジライブラリーから約３×１０３の形質転換体を得た。ファージプロモーターか ±ｕｘＡＢを構成性発現したｐ　Ｓ　Ｂ　２９２の誘導体を含む形質転換体を、 ベトリ皿の五に２０μＩのドデカノールを添加したのち、アーガス１０１００Ｖ ｒフォトン・イマシング・カメラ（ハママツ・フォトニクス）によりバイオルミ ネセントコロニーとして視覚化した。１ｕｘｉｆｉ伝子か発現しなかった多数の 暗“形質転換体（３５０）を２重試験用セットのＢＨ１／クロラムフニニコール 平板土に拾い上げ、３０℃で４時間インキュベートした。次いてＢ１ファージ（ １０μｌ、３〆１０’ＰＦＵを含有）を１セットの２重試験用平板上にスボント し、さらに１時間インキュベーションを続けた。次いてファージ感染および非感 染平板を７オトン・イマンノグ・カメラで視覚化した。８１ノ・クテリオファー ン感染の存在下でのみバイオルミ不セントである１形質転換体は、ファージ誘導 性プロモーターかｌｕｘ遺伝子の発現を指示するｐＳＢ２９２誘導体を含むと思 われた。このプラスミドをｐ　Ｓ　Ｐ　］、　９と表示した。

プロモーター誘導実験 ｐＳＰ１９を含む細胞を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＢＨ ｌブロス中において３０°Ｃで振盪しなから増殖させた。６００ｎｍにおける吸 光度か０．　１となった時点で細胞を採取した（８０００ｇおよび３０°Ｃて１ ０分間）。上澄液を廃棄し、細胞ベレットを最初の容量の１／１００のブロスに 再懸濁した。領　５ｍｌのこの懸濁液２アリコートをプラスチック製試験管中へ 取り出した。１本の試験管にはＢ１バクテリオファージを感染の多重度３で添加 した。

次いで両方の試験管を撹拌せずに３０’Ｃで１０分間インキュベートし、ファー ジを吸収させた。この期間ののち、予め加温した５０ｒｎｌのＢＨｒを入れた別 個のフラスコに試験管の内容物を移した。次いで培養物を最初の条件下でインキ ュベートした（３０°Ｃ１Ｌ　５０　ｒ　ｐｍ）。細胞濃度および細胞バイオル ミネセンス測定のために、一定の時間間隔で１ｍｌの試料を取り出した。バイオ ルミネセンスは試料にエタノール中の１％ドデカノール溶Ｍ０．０１容量を添加 し、直ちにルミノメータ−（ターナ−・デザインズ、２０）により発光を評価す ることにより評価された。

プラスミドｐｓＰＬ９を含むリステリア・モノサイトンエネス２３０７４に、セ ロの時点でバタテリオフ７−シ２３０７４−８１を感染させた。ファージ感染後 に経時的にバイオルミネセンスの増大か認められた。結果を第２図に示す。

ＮａＣ１；０．０７５ｇ　ＣａＣＩｚ；１％Ｗ／Ｖ　ＣＬＩＳＯ４１０ｍ１／ｌ 　；ｐＨ７，４）中のリノエライジン酸（ＬＡ）（５０μｇ／ｍｌ）に、種々の 照明条件下で暴露した。これらには、暗所、蛍光照明、ならびに３００．３３８ ．３６０．３７５．３９５．４００．４２０．４５０．４５５および５：３０ｎ ｍに通過最大をもつ一連のフィルター（ウォーターズ・アソンエーツ社、マニュ アルＮｏ、１’Ｍ８２９０２．１９８０、および第３図）を用いた比較的特異的 な波長の露光か含まれる。フィルター透過用の入射光は顕微鏡用集光レンズから 得られた。

露光時間、露光温度、およびＣｕ”の重要性を評価した。

結果 ＬＡは５０μｇ／ｍｌの濃度で３７°Ｃにおいて３０分間で、９３％のＬ　ａｍ ｂｄ、ａファージを不活化した（第１表）。この不活化は、試料を暗所でインキ ュベートシた場合には認められなかった。大腸菌Ｗ：Ｈ１０は照明の有無いずれ においても一不飽和脂肪酸によって著しい影響を受けなかった。

第１表　５０ｔｉｇ／ｍｌ　リノエライジン酸（ＬＡ）および光の組み合わせか ３７°Ｃで３０分間のファージＬａｍｂｄａおよび宿主細胞の動的死滅に及ぼす 影響 微生物　トリス−Ｃｕ緩衝液　トリス−Ｃｕ緩衝Ｈ憂　トリス−Ｃｕ緩衝液　ト ＩＪスーＣｕ緩衝Ｈ支フｒ−ノＬａｍｂｄａ　３Ｘ１０”ｐｆｕ／ｍｌ　４Ｘ１ ０”ｐｆｕ／ｍｌ　３Ｘ１０’°ｐｆｕ／ｍｌ　４Ｘ１．０９ｐｆｕ／ｍｌ大腸 菌Ｙ３１１０　３Ｘ１０８ｃｆｕ、／ｍｌ　３ＸＩＯ’ｃｆｕ／ｍｌ　４ＸＩＯ ’ｃｆｕ／ｍ１　３ＸＩＯ’ｃｆｕ／’ｍｌこの実施例は選択的殺ウィルス薬と しての酢酸の使用につき説明する。

無菌工７ベントルフ試験管に１０９ｐｆｕ／ｍｌのファージ８４μｌ十個々の宿 主細菌細胞希釈液８．４μｌを分配した。この混合物を水上で１０分間インキュ ベートした。次いで各試験管に下記のいずれかを添加したｉ）　Ｌａｍｂｄａ緩 衝液中の最終ビネガー濃度５．１０．１５もしくは２０％ｙ　／　ｖとなるビネ ガー溶液、またはｉ　ｉ）　Ｌａｍｂｄａ緩衝液中の最終酢酸濃度０．００５． ００５．０，１．０．２５および０．　５％　ｖ　／　ｖとなる氷酢酸溶液。試 験管をさらに３７°Ｃで静止条件下に１５または３０分間インキュベートした。

次いで酸を３Ｍ水酸化ナトリウムにより中和した。感受性宿主細胞（１０”　ｃ 　ｆｕ／ｍ１）１００μｌを用いて平板上でプラーク形成によりファージの増Ｍ （ｐｆｕ／ｍｌ）を検出した。

結果は後記の策２表に示され、ビネガーについて得た結果（結果は示されていな い）と同様にｐＨ２，９１−２，３５でファージが急速に（１５分）で死滅する ことを表す。またビネガーと同様に酢酸はリステリア・モノサイトシニ不スファ 一ジに対しても同等に有効である。

５％　Ｖ　、／　Ｖヒ不カーと０．２５％　ｖ／ｖ酢酸の比較試験はほぼ均等な ファージ不活化プロフィルを示した。フ７−ンに対する細菌暴露の好ましい時間 は水上で５−５０分間であり、水上で約１０分間か最適であることか示された。

このプロトコールにより、後記の第３表に示すように細菌をプラーク形成によっ て５時間で検出することかできる。水上で２０分間という長い感染期間であって も、その後ビネガーまたは酢酸による１５分間の処理に際して細菌生育性の損失 は認められなかった。

混合細菌集団において大腸菌Ｗ３１１０を検出するために酢酸によるファージ死 滅を採用しうる可能性について調へた。１０’ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（ Ｓ　ｔ　ａｐｈ、ｅ　ｐ　ｉｄｅ　ｒｍｉ　ｓ）　、サルモネラ・アリシナ（Ｓ 、ａｒｉｚ。

ｎａｅ）、ストレプトコンカス・ミュータンス（Ｓｔ　ｒｅｐ、ｍｕｔａｎｓ） 、緑膿菌（Ｐｓ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および枯草菌（Ｂ、ｓｕｂ　ｔ　ｉ　 Ｉ　ｉｓ）を含む混合培養物に種々の量の大腸菌Ｗ３１ＬＯを接種した。ファー ン旦ａｒｎｂｄａを用い、上記の酢酸によるファーシネ活化プロトコールを採用 して、混合培養物中に存在する大腸菌Ｗ３１１０を特異的に検出した。第４表は この方法か実用化しうるちのであることを立証する結果を示す。

！ス摩　種々の１度およびｐＨ値の酢酸が３７℃／１５分間においてファージお よび宿主細胞の生存に及ぼす影響 ｌａＢ　ｂｄａ　ｐＨ値　大腸菌７３１１０　フＴ−ルａｍｂｄａ緩衝液中の　 ｃｆｕ／ｍｌ　ｐｆｕ／ｉｔ水酢酸％ ０（Ｌａｍｂｄａ緩衝り　７．４　３Ｘ１０’　３Ｘ１０９０．００５　４．１ 　６Ｘ１．０８９Ｘ１０１ＩＯ，０５３，２４３Ｘ　１０’　１．５　Ｘ　１０ ７０．１　２．９１　５Ｘ１０８７Ｘ１０３０．２５　２．５７　４Ｘ１０Ｉｌ （５，７Ｘ１０８）　０（０）０、５　２．３５　６　Ｘ　１０７０ かっこ内のデータは、リステリア・モノサイトジェネスＡＴＣＣ２３０７４のｃ ｆｕ／ｍｌ、およびファージ２３０７４　Ｂｌのｐｆｕ／ｒｎｌである。

箪ｌｋ　種々の数のリステリア・モノサイトジェネスＡＴＣＣ２３０７４の感染 後に得られるファージ２３０７４．　ＢＬのｐｆｕｆｉ下記によるファ　宿主細 胞不在　宿主細胞数１００　宿主細胞数１０００１０００Ｌａ緩衝液　完全な細 胞溶解　完全な細胞溶解　完全な細胞溶解０．２３酢酸　プラーク無し　１２０ 　８０００３％酢酸　プラーク無し　１５０　７５０１５％ビネガー　プラーク 無し　１１０　９００！ユ考　プラーク形成による混合培養における大腸菌Ｗ３ １１０の検出ファーシネ活化　混合培養物中の大腸菌１３１１０　約ｃｆｕ方式 　１００　Ｌ、ＯＯｏ　１０．００００２５％酢酸　１１１　７００　完全な細 胞溶解５％ビネガー　１３２　１．０００　完全な細胞溶解種々の数の細胞を含 む８．４７１Ｌアリコートを２重試験法で無菌エッペンドルフ試験管に移した。

これに８４μｌのファーンＬａｍｂｄａ懸濁液（Ｉ　Ｘ　１０９ｐｆｕ、’ｍｌ ）を添加し、ファージを０℃で１０分間、細胞に吸着させた。次いで吸着されて いないファージをＬ　ａｒｎｂ　ｄ　ａ緩衝液中の酢酸８３．２μｌの添加（最 終濃度０．２５％となす）により不活化し、３９℃で２０分間インキュベートし た。次いで１４μｍの０．３Ｍ　ＮａＯＨの添加により酸を中和した（最終ｐＨ 約８．０となす）。

次いで直ちに、影響を受けなかったファージ（すなわちＷ３１１０細胞への吸着 によりＬｉ［されたもの）のタイターを２重試験用セットの一方において測定し た　１００μｌのＷ３１１０細胞（ＩＸ１０’ｃ　ｆｕ）および３ｍｌの０．　 ６％上層寒天と混合し、ルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天平板上に注入し、３７℃でイ ンキュベートした。１８時間のインキュベーションののち、プラークを計数した 。２重試験用セントの他方のファージ増幅を３ｍｌのＦＴブロスの添加により開 始し、培養物を３７°Ｃで振盪しながら（１５０ｒｐｍ）５時間インキュベート した。上記に従って１００μＩの試料を平板培養することによりファージタイタ ーを測定した。

結果を下記の第５表に示す。

Ｌａｍｂｄａ緩衝液は、６ｍＭトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，８，１０ｍＭ　Ｍｇ５ ｏ−・７Ｈ２０，１０ｍＭ　ＣａＣ１２，０，００５％セラチンである。

ＦＴブロスは、リットル当たり５ｇのＮａｃ　Ｉ、ｌｏｇのトリプトン、ＬＯｍ ｌの１Ｍ　ＭｇＣ’１．ｚ、２０ｍ１の１０％マルトースである。

リ　種々の数の大腸菌Ｗ３１１０のファー＊Ｌａｍ互旦Ａ感染、および外部ファ ージ死滅後に３７°Ｃ１５時間で得られる増幅大腸菌Ｗ３１１０　約ｃｆｕ 固体培地上　無　２　７　２０　１０００時間ゼロ 液体培地中　無　４　Ｘ　１０５５　Ｘ　１０’　２　Ｘ　１０’　２　Ｘ　１ ０９５時間 （ファージ増幅） これらの実施例３および４は、殺ウイルス処理後に同時に存在する細菌の細胞数 またはそれらの増幅能を検知しつる程変に低下させることなく、バクテリオファ ージを１５分以内に、対数サイクル９以上の効率で死滅させることかできる完全 なプロトコールを記載する。これらの実施例はさらに、この方法を種々のバクテ リオファージに適用することかでき、かつグラム陽性およびグラム陰性双方の細 菌属に有効であることを示す。−考および複合培養におけるバクテリオファージ 増幅による細菌の直接検出が立証される。

被験生物に応じてわずかなプロトコール変更が若干必要であるが、以下の実施例 が示すように原理は依然として同じである。

実施例５ 実施例３および４の方法を反復し、ただし黄色ブドウ球菌（ＳｊａｐｈＹｌｏ。

ａｕｒｅｕｓ）ＮＣＩ’ＭＢ　８５８８およびファージＮＣＩＭＢ　９５６３を 用いた。２種類の異なる酢酸濃度により鑑別ファージ死滅を行った。０°Ｃでフ ァージを結合させたのち、試料を３７°Ｃに５分間加温し、次いでＯ′Ｃに冷却 したのち酢酸処理した。結果を第６表に示す。

ファージ不活化に　黄色ブドウ球菌数 用いた酢酸　％　０　８　８０　８００　８００００．１５％　０　８　８０　 ８００　８００００．２５％　０　８　８０　８００　８０００増幅したファー ジを用いたＬｍ２３０７４　（ｐｓＰ１９）の活性化によるリステロＸ１０８個 ／ｍｌを含むリステリア・モノサイトジェネス２３０７４（ＡＴＣＣ）の−夜培 養物を、Ｌａｍｂｄａ緩衝液中に１０倍段階希釈した。種々の数の細胞を含む１ ０μＩアリコートを無菌エッペンドルフ試験管に移し、氷水上で５分間冷却した 。これに、ｌＸ１０’ｐｆｕ／ｍｌを含むファージＬｍ２３０７４−Ｂｌ　（Ａ ＴＣＣ）懸濁液１０μｌを添加し、ファージを０℃で１０分間、細胞に吸着させ た。次いで吸着されていないファージをＬａｍｂｄａ緩衝液中の０９３１％酢酸 ８０μＩの添加により不活化し、３９℃で２０分間インキュベートした。次いで １４μｍの０．３Ｍ　ＮａＯＨの添加により酸を中和した（最終ｐＨ約８．０と なす）。ファージを増幅するために、シリアブロス１．４ｍｌ中の増殖菌株Ｌｍ ２３０７４　１ＸＩＯ’個をエッペンドルフ試験管に添加し、試料を３０℃で４ 時間インキュベートした。この培養物中に存在するファージの数を、まず増殖細 菌の添加直後にＬｍ２３０７４のローン（ｌ　ａｗｎ）上に試料１０μｍをスポ ットすることにより測定した（このアッセイ法のみが最低１０３ｐｆｕ／ｍｌの タイターを測定しうる）。４時間の増幅後に上澄液中のファージの存在は、１０ ０μｌアリコートをＬｍ２３０７４　（ｐｓＰ１９）の指数増殖培養物２００μ ｌに添加することにより、Ａ４５Ｏ０，２５０，３において検出された。

６０分間感染させたのち、光誘導を測定した。

結果を下記の第７表に示す。ここで各細胞につき記録された光単位を第３欄に挙 げる。

初期細菌数　初期ファージタイター　４時間増幅後の光単位６Ｘ１０’　１．８ Ｘ１０’　２０８１８６Ｘ１０’　９．０ＸＩＯ”　１４２４３６Ｘ１０’　１ ．８Ｘ１０’　４４５８６Ｘ１Ｇ’　９．０ＸＩＯｌ　３６０１６Ｘ１０２　ｎ ｄ　１９２ ６０　ｎｄ　１０５４ ６　ｎｄ　２６８ Ｑ　ｎｄ　３２ 上記の例は、６個程変の少数のリステリア・モノサイトジェネス細胞を全アッセ イ時間５．５時間で検出しうろことを示す。これは現在の迅速検出法における重 要な進歩である。

シばシーニー１ Ａｕｄｕｒｉｅｒ、Ａ、、Ｒｏｃｏｕｒｔ、、７．ａｎｄ　Ｃｏｕｒｔｉｅｕ、 Ｌ。

１９７フ　Ｉｓｏｌｅｍｅｎｔ　ａｔ　ｃａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｄａ 　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓｄｏ　、Ａｎｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（工 ｎｓｔ。

Ｐａ５ｔｅｕｒ）、１２７Ａ、１８５−１９８゜Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｍ、、 ＭｃＧｒａｔｈ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｗａｓｋｅｌｌ、Ｌ、。

＋９７０．Ｎｅｗ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｉｎｆｅｃｔｅ ｄｗｉｔｈ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｑｅ　Ｔ７．　＄Ｂ−エ瓜＋　２２７゜Ｇ ａ５５ｏｎ、Ｍ、Ｊ、、ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｐ、Ｈ，，１９８５゜Ｈｌ ｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｕ ｓｅ　ｉｎ　１ａｃｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、ＥＩＪｍ　出工二北ｌ− １！ａｔよ、ｎ：　１９３゜）１１ｒｏｔａｎｉ、Ｈ，、Ｏｈｉｇａｓｈｉ、Ｈ ，、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｍ、。

Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ、Ｋ、＆　？ａｋａｈａｓｈｉ、Ｅ、　１９９１　１ｎａｃ ｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ５ｐｈａｇｅ　ｂｙ　＝１−ｖａｃｃｅｎｉｃ　ａ ｃｉｄ、ａｎ　ａｎｔｉｖｉｒｕｓ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　ｆｒｏｍ、ａｎｄ　 ｂｙ　ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅ ｄ　ａｌｃｏｈｏｌｓ、ＦＥＭＳ　）ｕｃｒｏｂｉｏＬｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｄ ７７．１３−１８゜ Ｊａｃｏｂ、　Ｆ、、ａｎｄ　Ｍｏｎｏｄ、Ｊ、、１９６１．　Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓ＋ｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　、Ｌ社ＩＬｊｌｊ≦Ｂ、ユｉ　３１１１゜ Ｊａｓｓｉｍ、　Ｓ、　Ａ、　Ａ、、Ｅｌｌｉｓｏｎ、　Ａ、、Ｄｅｎｙｅｒ、 Ｓ、　Ｐ、。

ａｎｄ　Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ、　Ｓ、　Ａ、　Ｂ、、１９９０．　ＬＬエムコｂ ｉｏｌｕｍｉｎｓｓｓｃｓｎｃｅ：　ａ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ 　ｆｏｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄｉｎｄｕｓｔｒｙ、　３＋　１１５゜ ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｌ、ａｎｄ　Ｔコｉａｎ、Ｒ，、１９８６゜Ｔｒａｎ＋ｃｒ ｉｐｔｉｏｎａｌ　５ｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅｓ　 ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎＣｅｌＩＳ、　Ω立１よ　ｉ五；　フ９５゜０１ｃｌ 、Ｒ，Ｗ、、ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、Ｓ、Ｂ、、ｔ９８９゜Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｐｈａｇｅ　ａｎｄ　Ｃｏ５ｍ１ｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｌ工―よ、１ ｎ＝４ｔｈ　ｅｄｎ、、ｐｐ、６０−８６゜ＢｌａｃｋｗｅＬＬ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌ工ＣａｔｉＯｎＳ。

Ｐａｒｋ、Ｓ、Ｆ、ａｎｃｉ　Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｂ、１９９０Ｈ１ ｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　−１−二 ハｂｙ　ｓｌ＊ｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ｔｒ ｅａｔｅｄｃ＠ｌｌｓ、Ｇｏｎｅ　３４１２９−１３２゜Ｐａｒｋ、Ｓ、Ｆ、、 Ｎ１５ｓｅｎ　Ｕ、ａｎｄ　Ｓｔｓｗａｒｔ　Ｇ、Ｓ、Ａ。

Ｂ、１９９１　’ｒｈｏ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏ ｆ　お繍すＢ　１ｎｉｎ＋　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄＣｈｅｍ ｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｓ　（Ｓｔａｎｌａ ｙ、Ｐ、　Ｅ、　ａｎｄＫｒｉｃｋａ、Ｌ、Ｊ、ｅｄｓ）　ｐｐ　コ５−３８　 （Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓｌ　。

Ｐｌａｔｔ、Ｔ、、１９８６．　τｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａ ｔｉｏｎａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ、　ｕｌ−ニーツ１社：　３３９゜ Ｐｔａｓｈｎｅ、Ｍ、、１９８６．　・、Ｃａ１ｌ　Ｐｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ｂｌ ａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐａ１ｏ　 Ａｌｔｏ、ＣＡ。

Ｒａｂｕｓｓａｙ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｇａ１ｄｕｓｃｈａｋ、Ｅ、Ｐ、、？９７７ ゜Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｌｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ、ｉｎ： 　８　（Ｐ、Ｃ。

Ｗａｇｎｅｒ、ｅｄ、）、ｐｐ、１−１ｓｏ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｗ、、１９６９．Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ 　ｆｏｒＲＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｈむ一工旦λ１４ｓ　１１６８゜τｈａ 　Ｚｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｃｉｓ　（Ｚ Ｃ）４５Ｆ）。

：　Ｈａｚａｒｄ　Ａｎａｌｙ１１１！ｉ　ａｎｄＣｒｉｔｉｃａｌ　Ｃｏｎｔ ｒｏｌ　Ｐｏ１ｎｔ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ａｆａｔｙ　 ａｎｄＱｕａｌｉｔｙ、　工ＳＢＮ　’０６３２０２６５１０．　Ｂｌａｃｋｗ ｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、０ｘｆｏｒｄ。

Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ、Ｍ、Ｂ、、　ａｎｄ　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、　Ｎ、、 １９８８゜Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｐｌ、ｉｎ＋　１　（Ｒ。

■　２３０７４−Ｂｌ　取決ｌしの）・１照４　２３０７４−８１に７ｉｉ染ｔ ｒ：　Ｌ：ｔノサイドジ１オス（ｐｓＰ１９）Ｂ＋間（分） 要約書 ターゲット細菌を検査する方法は、試料にバクテリオファージを添加して試料中 の細菌を感染させ：バクテリオファージに感染した細菌を同時に殺すことなく細 胞外バクテリオファージを殺し：試料中に残存するバクテリオファージを増幅し 、バクテリオファージでリポータ−細菌を感染して検出可能なシグナルにする各 工程からなる。一般に、リポータ−細菌は、発現時に検出可能なシグナルを産生 ずるインディケータ−遺伝子を有しており、発現は細菌がバクテリオファージに 感染することによって始まる。

１＋　ｊｌｌ−ＰＣＴ／ＧＯ９１１０１３５４

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．発現に際して検出可能なポリペプチドを産生するインディケーター遺伝子を 含むべく遺伝子工学的に処理されたリポーター細菌において、該インディケータ ー遺伝子の発現が該細菌のバクテリオファージ感染に際して開始されるリポータ ー細菌。
2. ２．インディケーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求の範囲第１項に記載 のリポーター細菌。
3. ３．流体試料または適切な処理により流体となされた試料中のターゲット細菌を 下記工程により検査する方法： ａ）存在するターゲット細菌を感染させる条件下で試料にバクテリオファージを 添加し、 ｂ）試料中の細胞外バクテリオファージを破壊、除去、中和または不活化し、ｃ ）試料をインキュベートして感染を完了させ、ターゲット細菌にバクテリオファ ージを放出させ、そして ｄ）試料中のターゲット細菌を指示するものとしてバクテリオファージをアッセ イする。
4. ４．工程ｄ）が下記により実施される、請求の範囲第３項に記載の方法：ｄｉ） 得られたバクテリオファージを用いて請求の範囲第１項または第２項に記載のリ ポーター細菌を感染させ、そしてｄｉｉ）リポーター細菌が発現した検出可能な ポリペプチドを、試料中のターゲット細菌を指示するものとして観察する。
5. ５．工程ｃ）とｄ）の間に下記の追加工程が含まれる、請求の範囲第３項または 第４項に記載の方法： ｃｉ）許容宿主細菌を用いて試料中のバクテリオファージを増幅する。
6. ６．ターゲット細菌が病原体である、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．工程ｂ）が試料を不飽和脂肪酸の存在下にフォトン照射することにより実施 される、請求の範囲第３項ないし第６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．工程ｂ）が酢酸を用いて実施される、請求の範囲第３項ないし第６項のいず れかに記載の方法。
9. ９．工程ａ）が周囲温度より低い温度で実施される、請求の範囲第８項に記載の 方法。
10. １０．試料中のターゲット細菌を下記工程により検査する方法：ａ）請求の範囲 第１項または第２項に記載のリポーター細菌を試料に添加し、ｂ）存在するター ゲット細菌および添加されたリポーター細菌を感染させる競合アッセイ条件下で 試料にバクテリオファージを添加し、ｃ）リポーター細菌が発現した検出可能な ポリペプチドを、試料中のターゲット細菌を指示するものとして観察する。
11. １１．試料中のバクテリオファージを下記工程により検査する方法：ａ）存在す るバクテリオファージがリポーター細菌に感染する条件下で請求の範囲第１項ま たは第２項に記載のリポーター細菌を試料に添加し、ｂ）リポーター細菌が発現 した検出可能なポリペプチドを、試料中のバクテリオファージを指示するものと して観察する。
12. １２．殺ウイルス薬を下記工程により試験する方法：ａ）既知濃度の予め定めら れたバクテリオファージを含有する流体を用意し、ｂ）流体を殺ウイルス薬によ り処理し、ｃ）処理された流体に、生存バクテリオファージが感染する条件下で 、請求の範囲第１項または第２項に記載のリポーター細菌を添加し、ｄ）標識細 菌が発現した検出可能なポリペプチドを、殺ウイルス処理の有効性を指示するも のとして観察する。