JPH05502245A - 変性タンパク質の再活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 変性タンパク質の再活性化法 本発明は、タンパク質が少なくとも４００ミリモル／ｌの濃度のトリス塩基また はトリス塩を有するトリス緩衝液で処理される変性タンパク質の可溶化及び復元 のための改良方法に関する。

タンパク質が原核細胞、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中で生産される場合、難溶性タン パク質凝集物（封入体）がしばしば生成される。これらのタンパク質をそれらの 活性形態に変換するためには、可溶化工程及び復元工程が必要である。タンパク 質の可溶化は既知の方法である（例えば、Ｅ　ＰＯ３６１４７５、Ｅ　Ｐ−ＡＯ １＋４５０６、ＥＰ−Ａ００９３６１９及びＥ　Ｐ　−ＡＯ２５３８２３を参照 のこと）。

その池に、変性タンパク質の復元のための緩衝液並びに方法が知られている（例 えば、国際特許第８７／’０２６７−１号、Ｅ　Ｐ　−Ａ　０３６４９２６　、 Ｅ　ＰＯ２４１０２２を参照のこと）。

復元タンパク質の収率を制限するタンパク質（ジスルフィドブリッジを有する、 または存しない）の再活性化に重要な因子は、変性タンパク質から正しい折りた たみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）中間体への変換と幾つかのタンパク質分子の凝集の間の 競争反応である。この理由のため、復元緩衝液中の変性タンパク質の濃度は、復 元法の収率に重要なパラメーターであり、即ち、変性タンパク質の濃度を増大す ることは凝集を促進し、そして天然タンパク質の配座を存する虞元タンパク質の 関連収率を低下する。

それ故、タンパク質の再活性化に関して現在知られている全ての方法に於いて、 反応混合物中の変性タンパク質の量が臨界濃度を越えないことが必要である。タ ンパク質は使用される再活性化緩衝液に極わずかに可溶性であることがよくあり 、それ故、これは低収率、必要とされる多量の時間及び／またはより多量の緩衝 液の点でかなりの欠点を生じる。

それ故、本発明の目的は、再活性化（例えば、特に、可溶化及び復元）の条件を つくり、そして変性され、復元されたタンパク質の溶解性が既知の緩衝液に較べ てかなり増大される緩衝液を提供することである。

この目的は、本発明に従って、タンパク質を、処理されるタンパク質かその天然 配座をとることができるｐＨて、少なくとも４００ミリモル／ｌの濃度のトリス （ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩基（以下、トリスと称する）またはトリ スの塩の溶液とタンパク質をインキュベートすることを特徴とする変性タンパク 質の再活性化法により達成される。

変性タンパク質の再活性化のために４００　ミリモル／１以上の濃度のトリス塩 基またはトリスの塩を含む緩衝液の使用は、復元タンパク質の溶解性をかなり増 大させる。これは、既知の通常の方法に較べて活性タンパク質の収率のかなりの 増加をもたらす。従来知られている再活性化緩衝液は反応溶液を緩衝するために ５０〜１００　ミリモル／ｌの濃度のトリスをしばしば含むが、少なくとも４０ ０ミリモル／１の濃度のトリスの可溶化（従って復元収率を改良する能力）を媒 介する驚くべき性質は従来認められてぃなかった。

本発明の意味の範囲内のトリスの塩は、任！の有機または無機の酸のトリス塩と 理解される。トリス塩の例は、例えば、トリス酢酸塩、トリス安息香酸塩、トリ スホウ酸塩、トリス炭酸塩、トリスクエン酸塩、トリス塩酸塩、トリスマレイン 酸塩、トリス硝酸塩、トリスシュウ酸塩、トリスリン酸塩、トリスコハク酸塩、 トリス硫酸塩、等である。

本発明の方法はタンパク質の一般的復元に適し、それにより変性の原因（塩、加 熱、等）は実際に重要ではない。本発明の方法は遺伝子操作により生産され、封 入体物質として不活性形態で生じる生産物の復元に特に適するが、その方法はま た原註ｊｌとしてその他の変性タンパク質に適用し得る。特に、本発明の方法は 国際特許第８７１０２６７３号、Ｅ　Ｐ　−Ａ　０２４１０２２及びＥ　Ｐ　− Ａ　０３６４９２６に開示された方法に適用し得る。これに関して、国際特許第 ８７１０２６７３号は、原核生物中の発現後細胞溶解、変性条件及び還元条件下 の可溶化、そしてＧＳＨ／Ｇ５５Ｇの存在下の酸化条件下の再活性化（この場合 、９〜１２のｐＨ値、０．１〜２０ミリモル／ｌのＧＳＩ（濃度、０．Ｏ１〜３ ミリモル／ｌのＧ５５Ｇ濃度及び非変性濃度の変性剤か再活性化工程で使用され る）による非グリコジル化ｔＰＡの活性化法を開示している。Ｅ　Ｐ　−Ａ　０ ２４＋０２２は、復元されるタンパク質の溶液か選択された緩衝液中、臨界濃度 て調製され、そして折りたたみ中間体の生成後に、復元される別のタンパク質か 臨界濃度を得るのに必要な量添加される、復元緩衝液中の溶液状懸の変性タンパ ク質の復元法を開示している。Ｅ　Ｐ　−ＡＯ３６４９２６は、遺伝子操作によ り生産され、原核生物中で発現され、細胞溶解後変性条件及び還元条件下の可溶 化、続いて酸化条件及び復元条件下の再活性化による、生物活性タンパク質の活 性化法に関するものであり、この方法では１〜１０００μｇ／ｍｌのタンパク質 濃度か使用され、そして透析か可溶化と再活性化の間で、１〜４のｐＨ値を有し 、４〜８モル／ｌのグアニジン塩酸塩または６〜ｌＯモル／ｌの尿素を含む緩衝 液に対して行われる。

本発明の方法は二つの別法で行うことかできる。一つの別法は、トリス及び／ま たはトリス塩がまたｐＨを調節するのに使用されるように上記の濃度のトリス緩 衝液で行うことである。第二の別法は、相当する方法のために従来記載され、更 にトリス及び／またはトリス塩を添加した緩衝液で行うことである。これは、イ ンキュベーション溶液のｐＨ値がトリスとは異なる緩衝液物質により調節される ことを意味する。両方の場合、トリスの添加またはトリス濃度の増加がｐＨの変 化を生じないよう注意することが適切である。

インキュベーションは、処理されるタンパク質が天然配座で存在し得るｐＨ値で 行われる。これは、本発明の方法のインキュベーションが天然タンパク質配座の 形成を可能にしないｐＨ値で行われないことを意味する。天然タンパク質配座は 、次に、二次構造、三次構造及び、所望により、タンパク質が生物活性を有する ことができる四次構造を含むと理解される。

本発明の方法は、少なくとも４００　ミリモル／ｌの濃度を有するトリス溶液と の変性タンパク質のインキュベーションを含む。トリス濃度は０．４〜２モル／ ｌであることが好ましく、約１モル／ｌのトリスであることが特に好ましい。幾 つかのタンパク質（例えば、抗体フラグメント）では、０．５モル／ｌの範囲の トリス濃度で最適の再活性化収率か既に得られている。

復元法の収率は、既に上記したように、復元溶液中のタンパク質の濃度に依存す る。本発明の方法に関して、４０００μｇ／ｍ　ｌまでの範囲であるタンパク質 濃度が選ばれることが好ましい。しかしながら、タンパク質の種類及び復元法に 応じて、この範囲を越えるタンパク質濃度が好適であることがわかっている。

本発明の方法に於いて、変性タンパク質は復元溶液に連続的またはバッチ式（例 えば、パルス復元）に添加される。多くの場合（例えば、ｔＰＡ及びｔＰＡ誘導 体の復元の場合）、０．２〜１モル／ｌのアルギニンをインキュベーション溶液 に添加することか有利であることがわかっている。

本発明の方法により復元し得るタンパク質の好ましい例は、組換えｔＰＡまたは ｔＰＡ突然変異タンパク質（特に、ドメイン組成に２Ｐを有する非グリコシリル 化ｔＰＡ突然変異タンパク質）、組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ） または抗体またはそれらのフラグメントである。しかしながら１２本発明の方法 は、これらの例に限定されるのではなく、あらゆるタンパク質に適用し得る。

本発明の再活性化法の利点は、特に、低トリス濃度を有する緩衝液が使用される 方法に較べて３０〜３００％の活性タンパク質の最終収率の増加を含む。更に、 復元緩衝液中の変性タンパク質の濃度は最終収率の損失を生じないで増加するこ とかでき、即ち、復元法はかなり迅速になり、しかも更に有効になる。

特に、本発明の方法は復元リアクター中のパルス復元に有利である。この場合、 復元タンパク質の収率が増大され、加えて、パルス当たりのタンパク質濃度が増 加でき、これが再活性化期間の短縮をもたらす。また、復元収率の低下を観察し ないて復元調製物中に更に高い最終濃度のタンパク質にまでパルスを与えること か可能である。その結果として、緩衝液量かかなり減少される。

パルス復元操作は、復元がアルギニンを含む約１モル／１のトリス濃度の緩衝液 中で行われ、そして復元されるタンパク質の濃度かパルス当たり約２００μｇ／ ｍｌだけ増加される場合に、特に有利であることがわかった。

本発明を以下の実施例により更に説明することが意図されている。

略号： ＧＳＨ：還元グルタチオン Ｇ５５Ｇ　：酸化グルタチオン ｔ−ＰＡ　：組織プラスミノーゲンアクチベーターＣｐｒｏｔ　：タンパク質濃 度 ｒｅｎａｔ、　：復元 ＣＫ：クレアチンキナーゼ 実施例１ 第二パルス（＋／−１モル／Ｉ！のトリス）添加までのインキュベーション時間 に対する復元収率の依存性 出発物質： ｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの封入体（］Ｂ）を国際特許第９０１０９４３ ７号（実施例１）に従って生産し、続いてＥ　Ｐ　−ＡＯ３６１４７５Ａ　１（ 実施例１）に従って可溶化し、そして混合ジスルフィドに変換した。実施例２〜 ５では、出発物質を同様の方法で使用した。

復元＝０．６モル／ｌのアルギニン／ＨＣＩ、　ｐＨ８，５１ミリモル／ｌのＥ ＤＴＡ ０．７　ミリモル／ｌの還元グルタチオン（ＧＳＨ）＋／−１モル／Ｉ！のトリ ス Ｃｐｒｏｔ＝パルス当たり１４０　μｇ／ｍｌ第二パルスの添加＝１〜９時間（ 表を参照のこと）インキュベーションコ最後のパルスの添加後、室温で１２時間 表１ 第二パルス　（＋フィブリン）　（＋フィブリン）（時間）　（Ｕ／ｍｌ）　（ Ｕ／ｍ１）復元ｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの活性の測定及び単位Ｕの定義 ｔｔＬｉｌｌ（ＺＧｒＭＡＬ　４２（１９８７）、４７８−４８６）　１．：記 載サレテイル。

トリスを使用しないアルギニン緩衝液中では、第二パルスの添加前の滞留時間が 〉６時間である場合に、最大の復元収率が得られることか表１に見られる。１モ ル／ｌのトリスが反応混合物に添加される場合には、下記の変化が生じる。復元 の最大収率は３０〜４０％増加される。１〜３時間の滞留時間後であっても、変 性タンパク質か復元収率を減少しないで添加し得る。

実施例２ 復元・トリス濃度及びＡｒｇ／グアニジン比に対する依存性出発物質： 実施例１に記載したように生産されたｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの封入体 （ｒＢ） 復元：実験Ａニドリスに対する依存性 ０．６モル／１のアルギニン／ＨＣＩ、　ｐＨ８，５１ミリモル／ｌのＥＤＴＡ ０．７ミリモル／１のＧＳＨ トリス：０．５０Ｓ１００．５００．１０００及び２０００ミリモル／１Ｃｐｒ ｏｔ＝８０　ｕ　ｇ／ｍｌ インキュベーション：室温で２４時間 実験Ｂ：緩衝液依存性 １ミリモル／ｌのＥＤＴＡ％ｐＨ８，５０，７ミリモル／ｌのＧＳＨ Ｃｐｒｏｔ＝８０μｇ／ｍｌ 緩衝液：（１）０．６モル／ｌのアルギニン／ＨＣ１（２）０．４モル／ｌのア ルギニン／ＨＣ１＋０．２モル／１のグアニジン（Ｇｄｎ）／ＨＣＩ（３）０． ２モル／ｌのアルギニン／ＨＣＩ＋０．５モル／ｌのグアニジン（Ｇｄｎ）／Ｍ ＣＩ夫々の場合、十／−１モル／ｌのトリスインキュベーシコン二室温で２４時 間 表２Ａ 実験Ａニドリスに対する依存性 トリス　活性 （＋フィブリン） （ミリモル／ｌ）　（０７ｍ１） １ｏｏｏ　５：ｌ：１９ 表２Ｂ 実験Ｂ、緩衝液の変量 緩衝液　添加剤　活性 （１）　０．６　％ル／ｌ’Ａｒｇ　２０４７１モル／１トリス　３５５〕 （２１０，４Ｆ−Ｊｔｔ／ｌ　Ａｒｑ／　１５７７０・２モル／ｉ’Ｇｄｎ　１ モル／ｅトリス　４〕５０（３）　０．２モル／　ｅ　Ａｒｑ／　１４０２０． ５モル／１Ｇｄｎ　１モル／ｅトリス　〕２７７実験Ａ：収率は復元緩衝液中の トリス濃度の増加につれて増加する。復元の最適値は約１モル／ｌのトリス濃度 にある。驚くことに、復元収率は１００ミリモル／ｌ〜５００ミリモル／ｌのト リスの間で増加する。

実験Ｂ：収率は全ての場合に１モル／ｌのトリスの添加によりかなり増加される 。

実施例３ タンパク質濃度に対する復元の依存性（＋／−、１モル／ｌのトリス）出発物質 ： 実施例１に従って生産されたｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの封入体（［Ｂ） 復元：緩衝液Ａ： ０．６モル／ｌのアルギニン／ＨＣＩ、　ｐＨ８，５１ミリモル／ｌのＥＤＴＡ ０．７　ミリモル／ｌのＧＳＨ Ｃｐｒｏｔ：１１２．２２３及び４４６μｇ／ｍｌ緩衝液Ｂ。

０．６モル／ｌのＡｒｇ／ＨＣＩ　、　ｐＨ８，５１ミリモル／１のトリス １ミリモル／ｉ！のＥＤＴＡ Ｏ１７ミリモル／！のＧＳＨ Ｃｐｒｏｔ：１１２．２２３．４４６　、８９３　、２２３０及び４４６０μｇ ／ｍｌインキュベーション、室温で２４時間 この実験の結果を下記の表３に示す。

（モル／ｌ）　（μｇ／ｍｌ）　（Ｕ／ｍＬ）２２３　４Ｌ８７　１８７８０ ４４６　５９５６　Ｌ３３５０ 復元率は、トリスを使用しないアルギニン緩衝液中のタンパク質濃度を増加する につれて減少する。１モル／１！のトリスか緩衝液に添加される場合には、復元 収率（活性／Ｃｐｒｏｔ）のかなりの減少が４００μｇ／ｍ　１のタンパク質濃 度まで測定し得ない。更に高いタンパク質濃度でのみ、濃度の増加につれて収率 の減少かある。

実施例４ パルス復元：＋／−１モル／ｌのトリス出発物質： 実施例１に従って生産されたｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの封入体（Ｅ８） 復元　０．６モル／１のＡｒｇ／ＨＣＩ　、　ｐＨ８，５１ミリモル／１のＥＤ ＴＡ ０．７　ミリモル／ｌのＧＳＨ トリス：＋／−１モル／１ Ｃｐｒｏｔ＝パルス当たり１５０　μｇ／ｍｌ滞留時間滞留時間量 １２時間：　１５００μｇ／ｍｌ 混合ジスルフィドを窒素雰囲気下のＯ″Ｃの反応に保つ。

この実験の結果を下記の表４に示す。

°表４ （モル”）（ｕｑ／ｍｌ）　（ＩＪ／ｍ１）７５０　１７３１９　２コ０９２ 濁度のかなりの増加が、トリスを使用しないでパルスを加える場合に７００μｇ ／ｍｌのタンパク質濃度で起こるが、一方、１モル／ｌのトリスの添加によるパ ルスは１．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度であっても完全に明らかである。最終 収率は１モル／１のトリスの添加により約３０％増加された。

実施例５ パルス復元：連続法に近似（＋／−１モル／１のトリス）出発物質： 実施例１に従って生産されたｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの封入体（］ＩＢ 復元＝０．６モル／ｌのＡｒｇ／ＨＣＩ　、　ｐＨ８，５０，７ミリモル／１の ＧＳ）１ １ミリモル／１のＥＤＴＡ 十／−１モル／ｌのトリス パルス・滞留時間；３０分 Ｃｐｒｏｔ−パルス当たりの増加：　（Ａ）９．３ｕ　ｇ／ｍｌ、ＣＢ）３１μ ｇ／ｍｌ ポンプ輸送期間　２分間 最終濃度　３０００１ｔ　ｇ／ｍｌ 混合ジスルフィドを窒素雰囲気下の０°Ｃの反応に保つ。

この実験の結果を下記の表５に示す。

表５Ａ： １モル／ｌのトリス、Ｃｐｒｏｔ＝３０分当たり９．３　μｇ／ｍ１１６　２４ ５　１０２２：ｌ　４１７２６４８　９０４　４３３３９　４７９４／Ｌ６９　 １２９９　４］９６４　３３８４４１４６　２７５９　１０４００９　３７６９ Ｂトリスを使用しない場合、Ｃｐｒｏｔ・３０分当たり９．３μｇ／ｍ　１４０ 　５６〕　１４７２］　２６１５０５６　７８８　２４０’３５　’３０５０１ ８８　１２］８　］：１８０２　２７３０１１０４　１４６］　３７７］４　２ ５７９２１７６　２４８５　５９１９５　２］８２１２２４　’３１６０　６５ ８９６　２０Ｂ５３表５Ｂ： １モル／ｌのトリス、Ｃｐｒｏｔ＝３０分当たり３［ｕ　ｇ／ｍ１４２　２５６ コ ４９　３０：１１　５３０３３　１７４９６トリスを使用しない場合、Ｃｐｒｏ ｔ＝３０分当たり３１μｇ／ｍｌコ　２１９　４５８７　２０９４５ ４２　２５６３　２］５８０　９２００４９　：ｌ（ｍ　コ３４８２　１１０４ ６連続法への近似（個々の復元パルスの添加速度を、それ以外は同様である条件 下で増すこと）は、パルス実験と比較して同じ復元率を生しる。復元緩衝液への １モル／ｌのトリスの添加は一般に最終収率を約２０％〜１００％増加する。

実施例６ トリス濃度に対する還元に２Ｐの復元の依存性出発物質： 実施例１に従って生産されたｔＰＡ突然変異タンパク質に２Ｐの封入体（ＩＢ） 可溶化・６モル／ｌのＧｄｎ／ＨＣＩ　、　ｐＨ８，３０，１ミリモル／ｌのト リス １ミリモル／ｌのＥＤＴＡ ０．１モル／ｌのＤＴＥ Ｃｐｒｏｔ＝７．５　ｍｇ／ｍｌ； ２分のウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）インキュベーション：室 温で１時間 停止：ＨＣＩでｐＨ３，０ 透析：　６モル／ｌのＧｄｎ／ＨＣＩ　、　ｐＨ３，０１ミリモル／ｌのＥＤＴ Ａ 復元：０．７モル／ｌのＡｒｇ／ＨＣＩ　、ｐＨ８，５１ミリモル／ｌのＥＤＴ Ａ ３ミリモル／ｌのＧＳＨ ０，３ミリモル／ｌのＧ５５Ｇ（酸化グルタチオン）トリス：　０　：０．３＋ ０．６：０．９＋１．２：１．５：１．８及び２．１モル／ｌ Ｃρｒｏｔ＝Ｉ５０μｇ／ｍｌ 結果が表６に見られる。

表６＝ トリス　活性 （モル／ｌ）　（Ｕ／ｍｌ＋ 還元タンパク質か直接復元される場合であってら、復元収率は１モル／Ｉ！以上 のトリスの添加により３０％増加さＩｌる。

実施例７ Ｇ−ＣＳＦの復元 出発物質 国際特許／εＰ９１１００１９２（実施例３）に従って生産されたＧ−Ｃ５Ｆの 封入１本 可溶化　６モル／ｌのＧｄｎ／ＨＣＩ　、　ｐＨ８０１モル／ｌのトリス Ｉミリモル／ｊのＥＤＴＡ ０．１モル／ｌのＤＴＥ Ｃｐｒｏｔ：１０ｍｇ／ｍｌ： ２分のウルトラタラノクス インキュベーション　撹拌しながら室温で２時間待表千５−５０２２４５　（ｅ ）） 停止：ＨＣｌでｐＨ３ 透析−６モル／ｐのＧｄｎ／ＨＣＩ　、ｐＨ２，５３ミリモル／ｌのＥＤＴＡ 還元剤か完全に除去されるまで４°Ｃ 透析後のタンパク質濃度：　８．５ｍｇ／ｍｌ復元・実験Ｉ。

０．６モル／１のＡｒｇ／ＨＣ１，ｐＨ８１ミリモル／ｌのＥＤＴＡ ０．５　ミリモル／１のＧＳＨ ５ミリモル／１の［、ＳＳＧ パルス：Ｃ＝３０分間て５０Ｂｇ／ｍｌｔ・１時間 最終タンパク質濃度＝　１　ｍｇ／ｍｌ実験ＩＩ・ ０．６モル／ｌのＡｒｇ／ＨＣ１，’　ｐＨ８１ミリモル／１のＥＤＴＡ ０．５　ミリモル／ｌのＧＳＨ ５ミリモル／１のＧ５５Ｇ パルス：Ｃ”３０分間で５０　ｔｔ　ｇ／ｍ１１＝　１時間 タンパク質濃度＝　０．６ｍｇ／ｍｌ 復元後に、遠心分離を１６０００ｒｐｍで３０分間行う。続いて、透析を２０ミ リモル／ｌのトリス、ｐＨ８，１ミリモル／ｌのＥＤＴＡに対して行う。

結果か表７に見られる。

表７ 実験　トリス緩衝液ｐ）１８．０中の透析後の復元率（％） 実験Ｉ Ａ：Ｏ，ｌ　モル／ｌのトリス　ｌＯ Ｂ：１モル／ｌのトリス　６３ 実験］Ｉ Ａ：０．Ｉ　モル／ｉのトリス　２０ Ｂ　Ｉモル／ｌのトリス　５０ Ｇ−ＣＳＦの活性の測定は、Ｍｏｓｓｍａｎｎ、　Ｔ、　（１９８５）Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ６５、６６−７３及び）ｆｏｌｍｅｓ、　Ｋ、　 Ｌ、　＋Ｐｌａｓｚｙｎｓｋｉ、　Ｅ、　；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ、　Ｔ、 　Ｔ、　：ｋｌｏｒｓｅ、　Ｈ，Ｃ，ｌｌｒ　＆　［ｈｌｅ、　Ｊ、　（１９８ ５）ＰＮＡＳ　［ＩＳＡ　８２．６６８７−６６９１に記載さ験（’Ｈ−チミジ ン混入）の助けにより行う。同様の結果が、ＥＰ９１１０７４２９、２に従って 生産されたＧ−ＣＳＦ及びＧ−Ｃ３Ｆ突然変異タンパク質で得られる。

実施例８ 抗体Ｆａｂフラグメントの復元 変性＝５モル／ＩｌのＧｄｎ／ＨＣ［、ｐＨ８，５０，１モル／１のトリス ２ミリモル／ｌのＥＤＴＡ ０．３モル／ｌのＤＴＥ Ｃｐｒｏｔ＝　５　ｍｇ／ｍｌ　； インキュベーション：室温で２〜３時間復元ニドリス緩衝液、ｐＨ７，５ （トリス：　０．０５：０．１：０．２：ＯＪ：０．５：０．７５及び１モル＃ ） ２ミリモル／ｌのＥＤＴＡ ６ミリモル／ｌのＧ５５Ｇ Ｃｐｒｏｔ＝５０　μｇ／ｍＩ： インキュベーション・１０℃で８０時間活性試験：　Ｄ　Ｅ　−Ａ　３８３５３ ５０．４（実施例８．２）　＋：従ッテビオチニル化されたＣＫを用いたＥＬ［ ＳＡ 結果が表８に見られる。

表８ トリス　復元率（％） ０．５モル／ｌのトリス濃度まで抗体Ｆａｂの復元収率の線形の増加がある。ト リス濃度の更に増加のみが、わずかの改良をもたらす。

要約書 本発明は、タンパク質を、処理されるタンパク質がその天然配座をとることがで きるｐＨで、少なくとも４００　ミリモル／ｌの濃度のトリス塩基及び／または トリスの塩の溶液とインキュベートする、変性タンパク質の再活性化法に関する 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質を、処理されるタンパク質がその天然配座をとることができるｐ Ｈで、少なくとも４００ミリモル／ｌの濃度のトリス塩基及び／またはトリスの 塩の溶液とインキュベートする、変性タンパク質の再活性化法。
2. ２．インキュベーション溶液のｐＨ値がトリスと異なる緩衝物質により調節され る請求項１に記載の方法。
3. ３．トリスがまたｐＨ値を調節するのに使用される請求項１に記載の方法。
4. ４．０．４〜２モル／ｌのトリス溶液が使用される請求項１〜３の一つに記載の 方法。
5. ５．０．２〜１．０モル／ｌのアルギニンがインキュベーション溶液に添加され る請求項１〜４の一つに記載の方法。
6. ６．組換えｔＰＡまたはｔＰＡ突然変異タンパク質が処理される請求項５に記載 の方法。
7. ７．ドメイン組成Ｋ２Ｐを有する非グリコシル化ｔＰＡ突然変異タンパク質が処 理される請求項６に記載の方法。
8. ８．変性タンパク質が復元溶液に連続的またはバッチ式に添加される請求項１〜 ７の一つに記載の方法。
9. ９．パルス復元法が復元リアクター中で行われる請求項８に記載の方法。
10. １０．復元が約１モル／ｌのトリス濃度のアルギニンを含む緩衝液中で行われ、 そしてタンパク質濃度がパルス当たり約２００μｇ増加される請求項９に記載の 方法。
11. １１．組換えＧ−ＣＳＦが処理される請求項１〜５または８〜１０の一つに記載 の方法。
12. １２．抗体またはそれらのフラグメントが処理される請求項１〜５または８〜１ ０の一つに記載の方法。