JPH05502585A - ポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドの利用により向上される標的核酸の捕獲 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドの利用により向上される標的核酸の 捕獲 発明の背景 １、発明の技術分野 本発明は核酸ハイブリダイゼーション方法を利用するポリヌクレオチド配列の検 出のための方法に関する。特に、本発明は生物学的試料に含まれる特定の標的核 酸の捕獲の速さ及び程度を高めるための、ポリマーに共有結合しているオリゴヌ クレオチドの利用に関連する。好ましい方法において、この試料中の標的核酸を 、該標的における配列に相補する複数のオリゴヌクレオチド配列を有するポリヌ クレオチド捕獲ポリマーに暴露せしめる。標的ポリヌクレオチドの捕獲の後、こ のポリマーをリガンド／レセプターの組合せを介して固相支持体上に固定化（封 鎖）する。

２、情報開示 核酸ハイブリダイゼーションは核酸を同定するための知れている且つ開示されて いる方法である。ハイブリダイゼーションは相補性の核酸鎖の塩基対合に基づく 。−末鎖の核酸を適当な緩衝液の中でインキュベートした場合、相補性の塩基配 列の組は安定な二本鎖分子を形成する。このような対合の有無は当業界によく知 られている種々の方法により検定されうる。

はとんどのハイブリダイゼーシゴンアッセイは複数の段階、例えばＤｕｎｎ　＆ 　ＨａｓｓｅｌｌのＣｅ１ｌ、第１２巻、頁２３−２６　（１９７７）に詳細の ハイブリダイゼーション技術を包含している。彼らのアッセイはサンドインチ型 である。

Ｒａｎｋｉらは、米国特許第４．４８６．５３９号及び第４，５６３，４１９号 において、サンドインチ型アッセイであって、第１に核酸を変性せしめる段階、 その後−末鎖核酸を固相担体に固定されている核酸及び放射性同位元素により標 識されている第２核酸とハイブリダイズさせる段階を必要とするアッセイを詳細 している。

５ｔａｂｉｎｓｋｙは米国特許第４，７５１，１７７号（Ａｍｇｅｎ）で、標的 及び固相支持体における両方の配列とハイブリダイズする中介オリゴヌクレオチ ドの利用を詳細している。

米国特許第４，７５１．１７７号は、標的及び固相支持体それぞれに対する単一 の相補配列のみしか有さないリンカ−を詳細している。類似のリンカ−がヨーロ ッパ特許出願ＥＰＡ２２５．８０７号において利用されている。種々の診断アッ セイにおけるシグナルの増幅のためのポリマー試薬が詳細されている（米国特許 第４，６８７，７３２号及び第４，１５２，４１１号）。

発明の概要 本発明は標的ポリヌクレオチドの捕獲の方法であって、以下の段階 （ａ）ｔａ標的ポリヌクレオチドを、ポリマーに共有結合している相補性の捕獲 ポリヌクレオチドと接触させる（ここで該ポリマーは、共有結合している該捕獲 ポリヌクレオチドのコピーを少なくとも２個有する）； （ｂ）ｉｆ相補性のポリヌクレオチド間にハイブリダイゼーションを起こさせる ；そして （Ｃ）該ポリマーを固相表面に封鎖させること、を含んで成る方法を提供する。

該ポリマーは水溶性であることが好ましい。好ましい水溶性ポリマーは、ポリオ キシド、ポリエーテル、ポリ（エチレンイミン）、アクリル系ポリマー、ビニル 系ポリマー及びポリビニルピロリドンより成る群から選ばれる。最も好ましいポ リマーは、ポリ（エチレンイミン）、ポリアリルアミン及びポリビニルアミンよ り成る群から選ばれる。水溶性ポリマーは好ましくは約６００〜約１００，００ ０ダルトンの分子量、そして最も好ましくは約１０，０００〜約７０．０００ダ ルトンの分子量を有す。

固相又は混合相核酸ハイブリダイゼーションアッセイのためには、該ポリマーは それに結合するりガントを有すことがある。このリガンドは共有結合を介して固 相支持体に結合している対応の結合性レセプターを有し、従って上記の方法は該 固相支持体への水溶性ポリマーの結合を更に含んで成るであろう。全てのシグナ ルプロセスはごの固相支持体上又はそのまわりの溶液において検出される。この リガンドはポリヌクレオチドプローブであり、そしてこのレセプターは該プロー ブに相補性のポリヌクレオチドであることが好ましい。

該方法は任意的にマイクロビーズを利用し、これによってマイクロビーズ、水溶 性ポリマー及び標的ポリヌクレオチドの３成分複合体が形成される。次にこの３ 成分複合体を二次元の固相支持体に封鎖又は結合せしめる。好ましいマイクロビ ーズは磁性ビーズ及びポリスチレン／ラテックスビーズより成る群から選ばれる ものを含む。

更に本発明は標的ポリヌクレオチドを捕獲する方法であって、以下の段階： （ａ）該標的ポリヌクレオチドを、マイクロビーズに共有結合している相補性の 捕獲ポリヌクレオチドと接触させる（ここで該マイクロビーズは、それに共有結 合している該捕獲ポリヌクレオチドのコピーを少なくとも２個有する）；（ｂ） 該相補性のポリヌクレオチド間にハイブリダイゼーションを起こさせる； （Ｃ）該マイクロビーズを固相表面に封鎖させる；そして（ｄ）ハイブリダイゼ ーションを検出すること、を含んで成る方法を開示する。

好ましいマイクロビーズは、磁性ビーズ、テフロンビーズ、シリカ及びポリスチ レン／ラテックスビーズより成る群から選ばれる。この封鎖は相補性オリゴヌク レオチド間の二本鎖の形成の結果として生ずることが好ましい、該マイクロビー ズは約０．５〜約１２０ミクロンの粒径を有することが更に好ましい。

本明細書において、標的ポリヌクレオチド分離ポリマーのものを開示する。この ポリマー主鎖は約６００〜約１ｏＯ１ＯＯＯダルトンの分子量を有す。この分子 量は約１０，０００〜７０，０００ダルトンであることが好ましい。この玉鎖は 前記に挙げたのと同一のポリマーから好適に選ばれ、そして更にはポリ（エチレ ンイミン）、ポリアリル及びポリビニルアミンより成る群から選ばれることが好 ましい。該ポリマー主鎖は少なくとも２個の固相支持体−相補性捕獲核酸が共有 結合していることが好ましい。好ましい捕獲ポリヌクレオチドは約１５〜約７０ 個分の塩基の平均の長さのオリゴヌクレオチドである。

本発明のプローブ及び方法は任意の生物材料由来の標的核酸を検出するために用 いることができるが、細菌及びウィルス生物の検出において特別な用途が見い出 せるであろう。本発明は１又は複数の種類の標的の検出に利用できる。好ましい 態様は、複数標的ディノブスティノクであり、ここでは固相表面は複数の種類の 標的を結合せしめているポリマーを捕獲するために用いる。これらのディノブス ティノクは捕獲ポリマーが結合することができる複数の独立した領域を有し、そ して複数の標的を検出するため、例えば感染性ウィルスもしくは細菌のパネルと してデザインされている。

定義 「マイクロビーズ」なる語は、水に不溶性な結晶（例えばシリカ）を含むポリマ ーを称し、従ってそれらは遠心（遠心力）によって水溶液から分離せしめること ができる。マイクロビーズなる語は微小球も含む。

本明細書における「ポリマー」なる語は水溶性ポリマー及びマイクロビーズの両 者を称する。

「ポリヌクレオチド」なる語は長い及び短いプローブの両者を称し、短いプロー ブはオリゴヌクレオチド又はオリゴとしても称される。

「封鎖する」なる語は、捕獲ポリマーを固相支持体に、リガンド／レセプター結 合により、典型的には核酸の二本鎖の形成により結合させることを称する。

「固相支持体」なる語は、ｆ４液から溶液へと移すことが可能である任意の表面 を称し、そして膜、ビーズ、マイクロタイターウェル、糸、プラスチ・ツクスト リップ又は任意の表面であってそれにＤＮＡプローブが固定化されうるちのを含 む。

図面 図１は操作における標的分離ポリマーの絵図を提供する。

図２はポリマーを「捕獲」又は分離することを利用するもしくは利用しないハイ ブリダイゼーションの反応速度の詳細を提供する。

詳細な説明 本発明は核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行うための改善された方法を提 供する。この改善は、複数のオリゴヌクレオチドが共有結合しているポリマーを 用いる、溶液からの標的核酸の高められた捕獲を包含する。固相アッセイに関し 、これらのポリマーの利用は標的核酸を固相支持体に固定化せしめるのに必要と する時間を劇的に短くし、そしてこの方法を用いないアッセイに比べて固相支持 体上に固定化される標的核酸の量を高めた。水溶性ポリマーの代りにマイクロビ ーズが代用されうる。

サンドインチ方式を用いる典型的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおい て、３種のヌクレオチド配列がこのアッセイに含まれる。固相支持体に典型的に 結合する捕獲プローブは、標的核酸を捕獲するための手段として働く。一般に遊 離溶液の中にある標的核酸はその有無が検定される核酸として働く。第３に、シ グナルプローブを用いる。シグナルプローブは一般に検出可能な物質、例えば酵 素又は放射性同位元素に結合しており、これは標的核酸の有無のシグナルのため の手段として働く。この捕獲及びシグナルプローブは標的核酸の異なる配列に相 補する。このサンドイッチアッセイは、互いにハイブリダイズし合うこの３種の 核酸が相互反応して三層の構成物を形成せしめることにより起こり、ここでこの 捕獲及びシグナルプローブは、この標的プローブを囲むサンドインチを形成せし める層として働く。

本発明において、該アッセイにいかなる異なる工程の導入の必要性を伴わずにハ イブリダイゼーションの速度を高めるた・２）の第４の成分を導入する。この第 ４の成分はポリヌクレオチド結合ポリマ〜である。該ポリマーを固相支持体に結 合させるための手段はあらゆるリガンド／レセプターの組合せでありうるが、オ リゴヌクレオチド二本鎖形成が好ましい。

該ポリマーに共有結合しているこのオリゴヌクレオチドは互いに同−又は異なる ことができる。該ポリマーに結合する該オリゴヌクレオチドの箇所が１つのオリ ゴヌクレオチド塩基配列のみを示す場合、この配列は標的及び固相支持体の両者 に結合するであろう。唯一の理論的な考察は、利用する捕獲ポリマーの量が、該 固相支持体上のオリゴヌクレオチドにより捕獲される可能性のあるポリマーの量 を越えないことである。

Ａ、ポリマー 本発明のポリマーは溶液中で自由であり、その相対運動は標的核酸の捕獲につい ての反応速度を最大にする。この標的がポリマーに結合したなら、該ポリマーを 固相支持体に結合（通常はハイブリダイズ）させるこの第２段階は非常に速い反 応速度で起こる。この第２段階が核酸のハイブリダイゼーションを含んでいる場 合、ハイブリダイゼーションの速度は配列複雑度の低いオリゴヌクレオチド／相 補性オリゴヌクレオチド（１６〜５０塩基対）の利用、及び固相支持体への単一 のポリマーのハイブリダイゼーションのための可能な複数の部位の利用により最 大となる。図１は図解式にこの概念を核酸ハイブリダイゼーションにおいて機能 を果さない。これらの化学組成は、このポリマーがこの捕獲ポリヌクレオチドを 保持することができ、そしてハイブリダイゼーション反応を阻害しない限り重要 な因子ではない。２つの型のポリマーが好適に利用される：水溶性ポリマー及び マイクロビーズ。

Ｌ、ＪＪ　ポリマー 水溶性ポリマーはその溶解する能力により限定され、そして全ての有用な濃度に わたり水又は緩衝水溶液と混和するものである。水溶性ポリマーはホモ又はヘテ ロポリマーであり、そしてポリマー、例えばポリオキシド、ポリエーテル、ポリ アリルアミン、ポリ（エチレンイミン）、アクリル系ポリマー、ビニル系ポリマ ー、ポリサンカライド、改質デンプン、メチル−及びヒドロキシプロピルメチル セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ ビニルアルコール、エチレンオキシドポリマー基、ポリペプチド、ポリヌクレオ チド並びにポリビニルピロリドン、又は任意の他の水溶性バイオポリマーが含ま れる。ポリ（エチレンイミン）、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン及び架橋 オリゴ−又はポリヌクレオチドが好ましい。水溶性ポリマーのサイズの範囲は約 ６００〜１００．０００ダルトンである。

好ましい範囲は約１０．０００〜約７０．０００ダルトンである。

水溶性ポリマーの単位は一般に直接重合プロセス結合又はカプリング剤結合によ って互いに連結される。直接重合は、隣り合う単位における有用な化学基又は主 鎖成分の内結合（ｉｎｔｅｒｂｏｎｄ　ｉｎｇ）を生しせしめる。例えば、酸化 架橋によりモノマー単位を重合せしめるために酸化酵素が利用できる。他方、二 価又は多価有機架橋剤に由来するカプリング剤は、この単位の適当な化学基又は 主鎖成分と結合する。これに関連して、「カプリング剤」なる語は結合後のリン ケージ基を表わし、そして架橋剤なる語は結合前のリンケージ成分を表わす。

好ましい架橋剤は一般式Ｉで表せる。

Ａ−Ｒ’　−Ｅ　［Ｎ □ 式Ｉの反応基Ａ、Ｂ及びＥはそれぞれ水素、カルボン酸基、酸ハロゲン化物、活 性エステル、混合無水物、イミノエステル、第１アミン、アルデヒド基、α−ハ ロアシルカルボニル基、ヒドラジン基、アシルヒドラジド基、アジド基又はＮ− マレイミド基から選ばれる。Ａ、Ｂ及びＥの少なくとも２つは水素以外のもので ある。Ａ、Ｂ及びＥに類似する反応基を３個より多く有す多価架橋剤も本発明の 範囲に含まれる。これらの更なる反応基はＡ、Ｂ及びＥの上記の定義からそれぞ れ選ばれるであろう。

弐ＩのＲ１は少なくとも２個の炭素原子、そして典型的には１０個より多くない 炭素原子の脂肪族、５−１Ｏ個の炭素原子のシクロアルカン基又は少なくとも６ 個の炭素原子の芳香族である。

式Ｉの反応基の選択は連結せしめるポリマーにおけるその単位の化学基又は主鎖 成分の選択に依存するであろう。各種の化学基又は主鎖成分は、弐Ｉの対応する 適当な（複数の）反応基と反応するであろう。アミン基はカルボン酸基、酸ハロ ゲン化物、活性エステル、混合無水物、アシルイミダゾール、Ｎ−（カルボニル オキシ）イミド基、イミノエステル、アジド又はアルデヒド基と反応するであろ う。酸化１．２−ジオール基（ジアルデヒド）は第１アミン、ヒドラジン基、ア ジド又はアシルヒドラジド基と反応するであろう。カルボン酸基は第１アミン、 ヒドラジド基、アジド又はアシルヒドラジド基と反応するであろう。メルカプタ ン基はカルボン酸基、酸ハロゲン化物、活性エステル、混合無水物、アシルイミ ダゾール、Ｎ−（カルボニルオキシ）イミド、アルファーーヘーターー不飽和ラ クトン又はマレイミドと反応するであろう。炭素−水素結合はアジドにトレン） と反応するであろう。反応条件はよく知られており、そして好ましい例を以下に 提供する。好ましいモノマー単位ば、−Ｃ）−（ＣＨ−ＣＨ２）　−；　（ＣＨ ＣＨ２）；　ＮＨＣＨｚ　ＣＨｚ　１−Ｏ−（ＣＨ２）−；　−Ｃ−（ＣＨｚ　 ）−；単糖類、アミノ酸又はそれらの組合せを含むであろう。

２、マイクロビーズ 他方、標的捕獲ポリマーはマイクロビーズでありうる。マイクロビーズは球形及 び非球形両者の水不溶性構造を含む。

このマイクロビーズ組成は水溶性ポリマーと同様又は異なることがある。好まし い組成はポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、シリカ、磁性、テフロン又 はその他の種類のビーズであってその表面に反応基を有するものである。好まし いサイズは０．５〜１２０ミクロンである。好ましい官能基はカルボキシ、チオ ール又はアミンである。更に、上記の（１）に記載のポリマー化合物を有する又 はそれにより被覆されているビーズが含まれるであろう。磁気ビーズは米国特許 ｉ　４，６７２，０４０号に記載され、これは本明細書に参照文献として組入れ ている。

このマイクロビーズの表面は適切なモノマーを選ぶことにより、又は適切な試薬 によりこのビーズを覆うことによって活性化されうる。あらゆるマイクロビーズ の表面上の反応基の選択は、このマイクロビーズの表面上に連結する単位の化学 基又は主鎖成分の選択に依存するであろう。

各種の化学基又は主鎖成分は、式■の対応する適当な（複数の）反応基と反応す るであろう。アミン基はカルボン酸基、酸ハロゲン化物、活性エステル、混合無 水物、アシルイミダゾール、Ｎ−（カルボニルオキシ）イミド基、イミノエステ ル、アジド又はアルデヒド基と反応するであろう。酸化ｌ。

２−ジオール基（ジアルデヒド）は第１アミン、ヒドラジン基、アジド又はアシ ルヒドラジド基と反応するであろう。活性カルボキシ基は第１アミン、ヒドラジ ド基、アジド又はアシルヒドラジド基と反応するであろう。メルカプタン基はカ ルボン酸基、酸ハロゲン化物、活性エステル、混合無水物、アシルイミダゾール 又はＮ−（カルボニルオキシ）イミドと反応するであろう。炭素−水素結合はア ジドにトレン）と反応するであろう。

Ｂ、アッセイ方法 本発明の主な用途は核酸ハイブリダイゼーションにある。

−ａに、ハイブリダイゼーション方法は以下の段階、ａ）　−末鎖標的ポリヌク レオチド配列又は変性せしめた二本鎖ポリヌクレオチド標的を、適切な塩基相補 性を有する一末鎖ポリヌクレオチドブローブと接触させ、そしてｂ）この標的と プローブとで形成される得られるポリヌクレオチド二本鎖を検出することを含ん で成る。特に有用な常用のハイブリダイゼーション方式はサンプル核酸が細胞（ 本来の位置）に含まれている場合、ポリヌクレオチド標的又はポリヌクレオチド プローブのいづれかがポリマーに固定化されている場合（固相ハイブリダイゼー ション）、及び全てのポリヌクレオチド分子が溶液中にある場合（溶液ハイブリ ダイゼーション）を含む。

特定のハイブリダイゼーション方式は本発明には重要でない。従来のハイブリダ イゼーション方式における改善がなされ、且つ新たな方式が開発されているため 、それらは容易に本発明に適用することができる。

選ぶ方式が固相支持体を含む場合、この固相支持体は膜型固相支持体（二次元固 相支持体）、ビーズ型固相支持体又はその他の固相表面、例えばマイクロタイタ ーウェルでありうる。

該ポリマーの封鎖は核酸ハイブリダイゼーションにより制限されるものであって はならない。任意のりガント／レセプターの組合せが代用されうる。これらには 、抗体／抗原、ホルモン／レセプター、ストレプトアビジン／ビオチンの組合せ 等が含まれるであろう。封鎖に関して、任意のりガント／レセプターの組合せは 、この封鎖の速度がポリマーに結合しているオリゴヌクレオチドへの該標的の溶 液ハイブリダイゼーションの速度よりも遅い限りよいであろう。

固相支持体を用いる混合相アッセイに関し、好ましいりガント／レセプターの組 合せは相補性オリゴヌクレオチドである。特に、ポリマーに結合しているオリゴ ヌクレオチドの一部又は全ての配列は、固相支持体に共有結合しているオリゴヌ クレオチドの配列とも相補する（図１参照）。従って、このポリマーは該標的核 酸と該固相支持体上の核酸の両者と二本鎖を形成する。

拡散的な束縛に基づき、該ポリマーは溶液中の標的核酸と、固相支持体にハイブ リダイズしているポリマーよりもより迅速なる反応速度によってハイブリダイズ する。従って、この方法における第１段階は一般に、ポリマー構遺体上のオリゴ ヌクレオチドへの該標的核酸のハイブリダイゼーション又は捕獲である。第２段 階は、該固相支持体への該ポリマー（捕獲された標的核酸を含む又は含まない） の並進的な拡散である。この第２ハイブリダイゼーシヨン現象の完了により、こ の標的含有複合体は封鎖されたものと考えられる。

該支持体上への該標的核酸の封鎖の全体速度はこの方法を用いて大いに高まる。

該ポリマー上のオリゴヌクレオチドへの該標的核酸のハイブリダイゼーションの 速度は、はぼ理論的な溶液反応速度により生ずるものである。その理由は、該ポ リマーは溶液中に均一に分散され、そしてこの捕獲オリゴヌクレオチドが疑−次 反応速度によりこの反応を進行せしめるような濃度で存在することができるから である。固相支持体上べのポリマーのハイブリダイゼーション及び封鎖は構造体 の並進拡散を必要とし、従ってこの溶液をこの並進拡散を促進せしめるような状 態において撹拌せしめることが好ましい。このポリマーが固相支持体に出会った ら、この封鎖は非常に速く、その理由は配列複雑度の低いハイブリダイゼーショ ンのみが二種の相補性オリゴヌクレオチドの間で生ずるからである。

このポリマーを下記に詳細の化学物質を介して、単独分子又は複数の分子（異な る核酸塩基配列を有す）のオリゴヌクレオチドのいづれかと共有的にコンジュゲ ートせしめる。所望のポリマーは、各ポリマーに結合している２個より多く、そ して典型的には１，０００個以下のオリゴヌクレオチドを有する。該ポリマーに 結合しているオリゴヌクレオチドの配列は標的核酸（例えばｒＲＮＡ、ＲＮＡ、 変性プラスミドＤＮＡ、変性ＤＮＡ、他）に相補性である。

もしこのポリマー上に複数の種類のオリゴヌクレオチドがあるなら、該固相支持 体上及び更には該標的上のオリゴヌクレオチドと多重の結合点を作ることがこの ポリマーにとって可能でもあり、従って、この複合は単一のオリゴヌクレオチド 結合を介して固相支持体上に直接的に保持される又は標的とされる標的核酸より も安定となりうる。

その他の方式はマイクロビーズ（水不溶性ポリマー）と水溶性ポリマーを組合せ る。水溶性ポリマーとビーズを組合せる場合、両者は固相支持体への標的核酸の 捕獲における中間体として働きうる。好ましくは、この水溶性ポリマーは前記の 通りに標的を捕獲し、次いでこの複合体をマイクロビーズに結合させる。最後′ に、この３成分複合体を固相支持体により捕獲させる。大きいビーズと小さいビ ーズ及びポリマーの更なる組合せも有用である。このような組合せは３成分又は ４成分の複合体を、面相支持体への封鎖の前に示すであろう。

固相ハイブリダイゼーションのためには、ポリヌクレオチド分子を固相上に固定 化する。このポリヌクレオチドはこの固相に共有的又は非共有結合のいづれでよ い。非共有結合支持体は、ニトロセルロース、ナイロン誘導体（即ち、Ｎｙｔｒ ａｎ　（商標〕）及びフン素化ポリヒドロカーボンのようなポリマーを含む。共 有結合支持体は、その表面上に適当な活性ポリヌクレオチドの結合の部位として 働きうる反応成分を有する材料を含んで成る。

この固相支持体は二次元、例えば膜、又は三次元表面、例えば磁性もしくはプラ スチックビーズ、又は反応容器、例えアッセイである。この方法において、該標 的ポリヌクレオチド分子上の一定の配列に相補性のポリヌクレオチド配列（捕獲 配列）を固相支持体上に固定化する。この固定化ポリヌクレオチド配列を、該標 的ポリヌクレオチド分子の別の配列と相補性の標識化ポリヌクレオチド配列（シ グナル配列）の存在下において該標的配列を接触せしめるか（ワンステップサン ドイッチアッセイ）、又は該標的配列の捕獲後、シグナル配列とのその後のハイ ブリダイゼーション（ツーステップサンドイツチアンセイ）を行う。サンドイッ チアッセイの実施において、第１セントの捕獲ビーズを、第２セントのビーズ、 膜、ディツプスティック又はマイクロタイターウェルの壁に該標的を結合させる ために用いることができる。

Ｃ，ハイブリダイゼーション条件 本発明にとって特定のハイブリダイゼーション技術は重要ではない。ハイブリダ イゼーション技術は一般にＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ 、及びＨｉｇｇｉｎｓ、Ｓ、Ｊ、Ｗ、ＩＲＬ出版、１９８５に詳細されている。

ハイブリダイゼーション技術において改良が行なわれており、それらは容易に利 用できる。

特定のハイブリダイゼーション条件は重要ではなく、そして研究者の好み及び必 要性に応して変えることができる。種々のハイブリダイゼーション溶液が利用さ れることができ、これは約２０〜６０容量％、好ましくは４０容量％の極性有機 溶媒を含んで成る。一般のハイブリダイゼーション溶液は約３０−６０　ｖ　／ 　ｖ％のホルムアミド、約０．０５〜ＩＭの塩化ナトリウム、約０．０１〜０． １Ｍの緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウム、トリスＨＣＩ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰ ＥＳ。

ＥＰＰＳ、約０，０５〜０．５％の清浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、及 び１．１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１〜５％のフィコール（約３００−５００キ ロダルトン）、０．１〜５％のポリビニルピロリドン（約２５０　５００ｋｄａ ｌ）、並びに０．０１−１０％の牛血清アルブミンを利用する。典型的なハイブ リダイゼーション溶液は約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識担体核酸、例えば部分 断片化ウシ胸腺もしくはサケ精子、ＤＮＡ、及び／又は部分断片化酵母ＲＮＡ、 並びに任意的に約０．５〜２　ｗ　／　ｖ％のグリシンも含む。その他の添加物 、例えば硫酸デキストラン及びポリスチレンスルホン酸を含む容量排除剤（ｖｏ ｌｕｍｅ　ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ　ａｇｅｎｔ）も含まれうる。

種々の強さの程度のハイブリダイゼーションが利用できる。

ハイブリダイゼーションのための条件がより緊張化するに従い、安定な二本鎖の 形成のためのプローブと標的間の相補性の程度は大きくなる。緊張の程度は温度 、イオン強度、極性有機溶媒の包含等によりコントロールされうる。例えば、利 用する温度は通常約２０″〜９０°Ｃの範囲、一般には２５〜７５゛Ｃの範囲で あろう。ハイブリダイゼーションの緊張度はイオン強度、及びホルムアミドの濃 度を２０〜５０％の範囲内で操作することを介してハイブリダイゼーション溶液 の極性を変えることにより好適に変えることもできる。

利用する特定のハイブリダイゼーション溶液のために適切な温度及び時間にわた るハイブリダイゼーションの後、プローブ−標的バイブリドが結合しているガラ ス、プラスチック又はフィルター支持体を、このハイブリダイゼーション溶液に 付与されているのと同様の試薬を典型的に含む洗浄液の中に導入せしめる。これ らの試薬はハイブリダイゼーション媒体と同様の濃度でありうるが、しかしより 緊張なる洗浄条件を所望する場合にはそれらは通常より低い濃度である。この支 持体が洗浄液の中に保持される時間は数分から数時間又はそれより長く変えるこ とができる。

このハイブリダイゼーション又はこの洗浄媒体のいづれもが緊張状態であること ができる。適切な緊張洗浄後、適切なハイブリダイゼーション複合体がここで標 識物の性質に従って検出されうる。

Ｄ、標識及び検出 種々の標識物が本発明に由来する有利なハイブリダイゼーポーターグループとし て働く。ここで用いるリポータ−グループは、測定又は検出されることができる 物理又は化学特性を有す。検出性は色調変化、ルミネッセンス、蛍光もしくは放 射活性のような特性により、又はリガンド認識部位として働くリポータ−グルー プの能力により得られる。

プローブは当業界において一般的に利用されている複数の方法のうちのいづれか によって標識されうる。検出の一般的す方法ハ３Ｈ、’　２ｓｌ　、　３５Ｓ　 、　”　Ｃ又ハ’　”　Ｐ　標ｔｈ　化７”　ｏ　７”等によるオートラジオグ ラフィーの利用である。その他のリポータ−グループには、蛍光物質、ケミルミ ネッセンス剤及び酵素により標識されている抗体が含まれる。他方、プローブを 標識物、例えば蛍光物質、ケミルミネッセンス剤、酵素及び酵素基質に直接コン ジュゲート化することもできる。他方、これらの成分をリガンド−抗リガンド複 合体、例えば標識物にコンジュゲートされたりガントと反応性の抗体を介して間 接的に結合せしめることもできうる。標識物の選択は要求する感度、プローブと のコンジュゲーションの容易さ、安定条件及び利用する手段に依存する。

標識物の選択は、プローブにこの標識物を一体化せしめる方法を決める。放射活 性プローブは一般に所望の放射性同位元素を含む市販されているヌクレオチドを 用いて作られる。

この放射活性ヌクレオチドは、例えばニックトランスレーションにより、末端ト ランスフェラーゼによるプローブの３′末端への放射活性塩基の付加により、放 射活性ｄＮＴＰの存在下においてＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントに よって特定のインサートを有するＭ１３プラスミドをコピーすることにより、又 は放射活性ｒＮＴＰの存在下においてＲＮＡポリメラーゼを用いて鋳型からＲＮ Ａを転写することによりプローブの中に一体化されうる。

非アイソトーププローブはシグナル（例えば蛍光物質、ケミルミネッセンス剤又 は酵素）により直接標識されるか、又はリガンドとのコンジュゲーションにより 間接的に標識されうる。例えば、リガンド分子をこのプローブに共有結合させる 。次にこのリガンドをもとから検出可能であるか、又は検出可能なシグナル、例 えば酵素もしくは光学反応性化合物に共有結合しているかのいづれかのレセプタ ー分子と結合させる。リガンド及び抗リガンド（レセプター）は広範囲にわたり 変えることができる。リガンドが天然の「抗リガンド」を有する場合、即ちリガ ンドが例えばビオチン、チロキシン及びコルチゾールの場合、それらは標識化せ しめた天然の抗すガントと一緒に利用されうる。他方、任意のハブテン又は抗原 化合物を適切に標識せしめた抗体と組合せて利用できる。

レポーターグループとしての対象の酵素は主にヒドロラーゼ、特にホスファター ゼ、エステラーゼ、ウレアーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドリダクターゼ 、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物には、フルオレセイン及びその誘 導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれる。

ケミルミ♀ツセンサーにはルシフェリン、ルミノール及び１．２ジオキセクンが 含まれる。

ハイブリダイゼーション複合体に存在する標識化プローブの量は広範囲にわたり 変えることができる。一般に、標識核酸の量に対する大量のモル過剰量のプロー ブが、該標的ＤＮＡに該プローブが結合する速度を高めるために利用されるであ ろう。

例えば、この標識物が放射活性である場合、結合しているハイブリダイゼーショ ン複合基体を有す支持体の表面をＸ線フィルムに暴露せしめる。標識物が蛍光＄ ｌＪ質の場合、このサンプルは、まずこれに特定の波長の光を照射せしめること により検出される。サンプルはこの光を吸収し、その後検出される異なる波長の 光を発する。この標識が酵素の場合、このサンプルはこの酵素のための適切な基 質とのインキュベーションにより検出される。発生するシグナルは色を有する沈 殿物、色もしくは蛍光を有する可溶性物質、又はハイオルミネソセンスもしくは ケミルミ矛ンセンスにより生ずる光子でありうる。

ハイブリダイゼーション複合体の検出は、シグナルを発生する複合体を標的及び プローブポリヌクレオチド又は核酸との二本鎖に結合させることを必要としうる 。一般にこのような結合はりガントと抗リガンドとの相互反応、例えぼりガント −コンジュゲート化プローブと、シグナルとコンジュゲートされている抗リガン ドとの間の相互反応を介して起こる。

該標識物は、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出も可能にする。例え ば、この標識物がハプテン又は抗原の場合、このサンプルは抗体を用いることに よって検出されうる。このような系において、シグナルは酵素分子の蛍光物質を 抗体に結合せしめること、又はあるケースにおいては放射活性標識物に結合せし めることにより発生する。

Ｅ、捕獲ポリヌクレオチドのポリマーへのコンジュゲーシヨン ■、捕獲オリゴヌクレオチドの官能化 以下の化学に従って、捕獲ポリヌクレオチドを創製して、上述のいずれのポリマ ーにも結合させることができる。

ＤＮＡプローブは、商業的に利用できる方法及び装置を使用して化学的に合成す ることが好ましい。例えば、固相ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄ ｉｔｅ）法を使用して、１５〜５０塩基の短いプローブを調製し、そして分子量 １６，０００ダルトン未満を示すことができる。本明細書では、これらのポリヌ クレオチドを［類プローブまたはオリゴヌクレオチド」と称する。（Ｃａｒｕｔ ｈｅｒｓ、ｅｔ。

ａｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ。

Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、、４７：４１１−４１８．　１９８２、及びＡｄａｍｓ 、ｅＬ　ａ　１．、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ。

ｃ、、１０５：６６１．　１９８３） 特定標的用のプローブを合成すると、ヌクレオチド配列の選択が試験の特異性を 決定する。例えば、数種のウィルス単離からのＤＮＡ配列を比較することによっ て、型特異的または属特異的いずれかのウィルス検出用配列を選択することがで きる。Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉＩ域及び配列の比較は、商業的に利用できるコンピュータ ープログラムを使用して達成できる。

本発明の用途に好ましい捕獲核酸は、２０〜１００塩基の合成オリゴヌクレオチ ドである。合成の際には、ブロックさいて、オリゴヌクレオチドの５′−ヒドロ キシル基に結合させることができる。本発明の出発材料として使用される活性化 オリゴヌクレオチドは、数種の方法から誘導することができる。第一アミンを末 端基とする一次リンカーアームの結合用試薬は、商業的に利用可能である。第一 アミンは、ヘテロ二官能性試薬への結合に好ましい基であり、そしてヘキシルア ームによる結合が好ましい。本発明の用途に適した出発材料は、ＰＣＴ米国米国 特許第８６１０１２苛０ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ．、１５：３１３１　（１９８７）； Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ．、１５：２８９１　（１９８７）；及びＮｕｃ ｌ．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ．、１４ニア９８５（１９８６）に記載されている。

詳細には、以下の化学式、すなわち、 （上式中、Ａはポリまたはオリゴヌクレオチドであり、ｎ及びｍは２〜１２であ り、ＸはＮＨまたはＮ　Ｈ　Ｃ　：　Ｏ　（　Ｃ　Ｈｚ）、％ＮＨであり、そし てＹはチオール反応性部位である）で示されるような５′末端構造を有するオリ ゴヌクレオチドが用いられる。オリゴヌクレオチドは、約９〜５ｏ塩基、好まし くは約１５〜３０塩基の範囲にあることができ、５′−ヒドロキシルのみが結合 のための修飾を必要とする。好ましいチオール反応性部位は、アルファーハロア シル、アルファーもしくはベーター不飽和カルボニル、またはアルファーもしく はヘーター不飽和ラクトンである。第一アミンへのチオール反応性置換基の結合 は、１９８９年７月２７日発行の国際特許出願−０８９１０６７０１号明細書（ 特に４〜８頁を参照されたい）に詳細に記載されており、本明細書ではこのすべ てを参照として取り入れる。最も好ましいチオール反応性部位は、アルファーハ ロアセトアミドベンゾイル及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボニルである。好マしいハロゲンはヨウ素及び臭素である。チオール反 応性オリゴヌクレオチドを活性化オリゴヌクレオチドと称する。

代わりに、オリゴヌクレオチドをその３′末端において、ブロックされたアミン 基を含有するリンカ−アームで修飾することができる。これは、コンジュゲート したりボヌクレオ千ドを含有する固体支持体上でＤＮＡ合成を行うことによって 達成できる。固体支持体から除去した後、一本の３′末端リボヌクレオチドを含 有するＤＮＡオリゴヌクレオチドが得られる。これは、例えば１）リボヌクレオ チドシス−グリコールを過ヨウ素酸で酸化し、２）そのように修飾されたオリゴ ヌクレオチドを、例えばブタンジアミンで処理してシッフ塩基を生成させ、そし て３）水素化ホウ素ナトリウムまたはンアノボロヒドリドで処理して、続くコン ジュゲーション用に一つのアミンを遊離させたままにしておく安定な還元シッフ 塩基誘導体を生成させることによって請求核性アミンを含有するリンカ−アーム で修飾することができる。ｒＰｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　 Ｅｎｚｙｍｅ　ｒｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓＪＰ、Ｔｉ　ｊｓｓｅｎ、ｐｐ、２３ ７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、Ａｍ ｓｔｅｒｄａｍ、ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄＤＮＡ合成機での調製前または調製後に チオールを反応性にするためにＤＮＡ塩基を修飾することもできる。後合成法を 用いて、天然核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）及び分子的にクローン化した核酸、並び に合成核酸を修飾することができる。

シトシンの場合、より核性のアミンが様々な化学によってシトシンの４位に結合 する。アミンは、ヒドラジンで処理してＮ−４−アミノシトシンを生成させるこ とによって付加することができる（Ｓｖｅｒｄｌｏｖ、Ｅ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、 。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、６２．Ｐ、２１２．Ｆｅｂ。

１９７６）。この反応は重亜硫酸塩により触媒される。代わりに、ジアミノアル カンが４位に付加する重亜硫酸塩触媒アミノ交換反応によって、アミンを４位に 付加することができる（Ｓｈａｐｉｒｏ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｇｒａｓ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、４０：８３９，１９７ ０）。

二官能性のセミカルバジドを使用して、シトシンの４位に核性アミンを付加する ことも可能である（Ｈａｙａｔｓｕａｎｄ　Ｕｋｉｔａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌ　ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ ｉｏｎｓ、１４：１９Ｂ、１９６４）、次いで、オリゴ中に遊離アミノ基を有す る塩基は、アルファーもしくはベーター不飽和カルボニルまたはアルファーハロ カルボニル基などで置換されたカルボン酸誘導体のＮ−ヒドロキシスクシニミジ ル（ＮＨ３）エステル及び核性アミンの反応によって、チオール反応性となる。

アルファーもしくはベーター不飽和カルボニルまたはアルファーハロアシルで置 換されたカルボン酸誘導体のＮＨＳエステルとの反応には、他の位置に核性アミ ンを有する他の核酸塩基を使用することもできる。例えば、末端デオキシヌクレ オチジルトランスフェラーゼを用いた反応で、５−（Ｎ−（７−アミンへキシル ）−１−アシルアミド〕−２′−デオキシウリジン−５′−トリホスフェートを オリゴヌクレオチドの５′末端に付加することができる（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　」　Ｔ、Ｍａｎｉ ａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、ｐ、１４８．　１９８２）、。

オリゴヌクレオチドの化学的固定化の好ましい方法は、以下の手順によって達成 される。二種類の異なる官能基を有する試薬に、係留されたアミンを有するオリ ゴヌクレオチドを共有結合する。これらの二官能性試薬は、典型的には、Ｎ　− ヒドロキシスクシニミジル（Ｎ　ＨＳ　）エステルを有し、それは第一官能基と してアミン反応性であり、そして第二官能基としてチオール反応性である。ＮＨ Ｓエステルは、オリゴヌクレオチドの５′末端の遊離アミンをアシル化する。そ のアシル化条件はよく知られており、しかも高選択性である。アデニンやシトシ ンの環外アミンは核性ではなく、ＮＨＳエステルとは容易には反応しない。オリ ゴヌクレオチドへのアシル化後、チオール反応性官能基が、遊離のスルフヒドリ ル基を含有する表面とのコンジュゲーションに利用できる。

係留された核性アミンを５′末端に結合して有するオリゴヌクレオチドは、比較 的簡単な化学によって、このようなチオール反応性基で誘導体化することができ る。例えば、Ｎ−スクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ ＳＩＡＢ）を、１０〜１００倍モル過剰でオリゴヌクレオチド水溶液に加える。

ｐＨは約６〜９の間で緩衝化させ、そして温度は約２０°Ｃ〜３０°Ｃである。

約３０〜９０分の反応時間後、過剰の未反応試薬を排除ゲル濾過により除去する 。

好ましいチオール反応性部位は、アルファーハローアシル化合物またはアルファ ーもしくはベーター不飽和カルボニル化合物である。チオール反応性基には、マ レイミド、ピリジルスルフィド、活性ハロゲン、アルファーまたはヘーター不飽 和ラクトンなどが含まれうる。活性ハロゲンは、典型的にはアルファーハロアシ ルである。有用なハロゲンには、塩素、臭素、ヨウ素、及びフン素が含まれるが 、ヨウ素及び臭素が好ましい。本発明に有用な試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｒｏｒｄ、ｒＬ、から購入できる。例として、Ｎ− スクシニミジル４−（ヨードアセトアミド）ヘンシェード（Ｓ　ＩＡＢ）　、及 びスルホスクシニミジル（４−ヨードアセトアミド）ベンゾエート（スルホ−５ ＩＡＢ）が含まれる。

２、ポリマー官能化 本発明のポリマー表面は、以下に記述するチオール反応性結合オリゴヌクレオチ ドとの続く反応のためにスルフヒドリル基で修飾されることが好ましい。好まし い方法は、コンジュゲーションに関与する核性アミンを含有するジスルフィド誘 導体でポリマーまたは表面を修飾し、次いで活性化オリゴヌクレオチドのチオー ル反応性部分が該表面に共有結合させるため、例えばジチオトレイトールで処理 することによってジスルフィド基をモノチオールへ還元する方法である。

修飾用には数種のポリマーが利用できる。好ましい水溶性ポリマーには、例えば ポリオキシド、ポリエーテル、ポリ（エチレンイミン）、アクリル系ポリマー、 ビニル系ポリマー、及びポリビニルピロリジンが含まれる。ポリ（エチレンイミ ン）、ポリアリルアミン、及びポリビニルアミンが最も好ましい。以下のビーズ の表面を修飾することができる：セファデックス、アガロース、ポリスチレンビ ーズ、テフロンビーズ、ポリスチレン／ラテックスビーズ、ラテ・ノクスビーズ 、または活性カルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、もしくは類似の 活性化性基を有するいずれかのビーズもしくは微小球。

ポリマーは、基体及び上述の材料の反応性表面を含んで成ることができる。捕獲 ポリヌクレオチドを共有結合する反応性部位に対する必要性が表面の選択を制限 するが、基体は表面と同じであっても異なってもよい。異なる場合には、基体は 実質的にいずれの不活性組成物であることもできる。

例えば、予備活性化表面またはアミン型部位を有する孔質または非孔質いずれか のシリカ粒子を使用することができる。

これらのシリカ粒子は商業的に入手することができる。

以下の化学的部位をポリマー表面に結合することができる：（オリゴヌクレオチ ドの結合用の）いずれかのアミノアルキルまたは了り−ルジスルフィド、（表面 修飾用の）いずれかのメルカプタン、（オリゴヌクレオチドの結合用の）いずれ かのアミノチオールアルコール、及び（オリゴヌクレオチドの結合用の）アリー ルジスルフィド、アミノアリールジスルフィド、またはアミノアルキルアリール ジスルフィド。

有機残基は、本発明の重要な特徴ではない。チオールエーテルまたはチオール結 合を保持する性能が保存されている限り、置換基には実質的に制限はない。

ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、ラテックス、または（活性化性カル ボキシ基を有する）他のいずれかのポリマー構造合には、Ｊ、Ｖ、５ｔａｒｏｓ 　ｅｔ　ａｌ、。

ＡｎａＩｙｔ’ｒｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５６：２２０−２２２ 　（１９８６）の手順が使用される。ｐＨ５，０〜５．５の水性緩衝液において 、１００，０００〜１，００ｏ、ｏｏｏモル過剰の１−エチル−３−（３−ジエ チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）または他のカルボキシル活性化 試薬にビーズを２０°Ｃ〜３０°Ｃで２分間入れておく。次いで、過剰の及び未 反応のＥＤＣを、ビーズの濾過または遠心分離によって除去する。その活性化ビ ーズを、ｐＨ約７〜９のアミン不合緩衝液例えばホウ酸ナトリウム、リン酸ナト リウム、または炭酸ナトリウム中で、アミノアルキルジスルフィドまたはアミノ アルキルメルカプタン、好ましくはシスタミンまたはシステアミン（２−アミノ エタンチオール）のＯ，０１〜１モル溶液に暴露して、１〜２４時間反応させる 。

適当な洗浄段階、続く遠心分離または濾過の後、還元剤例えば０．０１〜０，１ Ｍジチオトレイトールまたはジチオエリトリトールを用いて、コンジュゲートし たシスタミンのジスルフィドをスルフヒドリルへ還元する。最後の段階でシステ アミンを使用した場合には、ビーズは還元段階を必要としない。

３、活性化オリゴヌクレオチドのチオール化ポリマー表面へのコンジュゲーンヨ ン及び最適後コンジュゲーション修飾ポリマー構造の最大オリゴヌクレオチド結 合容量を２〜１００倍上回る活性化オリゴヌクレオチドを使用して、ポリマーの チオール化表面を活性化オリゴヌクレオチドと反応させる。

ポリマー構造表面を捕獲ＤＮＡプローブでコンジュゲートした後、大過剰の遊離 スルフヒドリル基が存在しうる。共有結合した捕獲オリゴヌクレオチドに対する これらの残存スルフヒドリル基の比率は１０：１〜１，０００，０００：１の範 囲にあることができる。これらの過剰のチオール基の存在が、Ｒ−３Ｈ基（Ｒは いずれかの化学官能価である）の選択的化学結合によるポリマー構造表面の第二 の修飾を可能にする。この化学結合は、不可逆的（例、マレイミド誘導体との反 応による）であっても、あるいは可逆的（例、ジスルフィド結合の生成による） であってもよい。

ポリマー構造表面の第二の修飾を行える性能は、ポリマー構造上に様々な所望の 表面特性を達成するために重要である。

ａ、チオール化表面は、遊離結合の処理による第二のコンジュゲーション段階に おける不可逆的修飾の化学的手段を提供する。このようなスルフヒドリルコンジ ュゲーションは、表面の電荷、疎水性、親水性、色、反射率、透過率、気孔率、 摩擦係数、気孔率、導電率、及び熱容量を改変しうる。チオール化表面はまた、 タンパク質、核酸、抗体、抗原、または他の重要な高分子をポリマー構造に不可 逆的に結合させることができる手段をも提供する。このような修飾表面は、固体 表面支持体上の捕獲プローブに対する標的核酸のハイブリダイゼーションの速度 を部分的に制御し、そしてハイブリダイズした標識プローブの検出の際に生じる 非特異的ハックグラウンドのレベルを低減することにおいて重要である。

ｂ、直前に記載した不可逆的修飾とは対照的に、チオール化表面はまた、表面と 所望の試薬との間のジスルフィド結合の生成（例、表面−３−３−Ｒ結合の生成 ）による第二のコンジュゲーション段階における可逆的修飾の化学的手段をも提 供する。このようなコンジュゲーシヨンは、表面の透過率、Ｆｆ！擦係数、気孔 率、導電率、及び熱容量を改変しうる。チオール化表面はまた、特異的タンパク 質、核酸、抗体、抗原、または他の重要な高分子をポリマー構造に可逆的に結合 させることができる手段をも提供する。これらの種類の部位は、シグナルディベ ロップメントプロセスにおいて、レセプター、リガンド、または基質として役に 立つことができる。

実施例 実施例１は一般的方法及び材料を提供する。

実施例２，３、及び４では、標的捕獲ポリマーを使用した場合と使用しない場合 の標的核酸の特異的封鎖の速度及び程度を比較する。その結果は、封鎖の感度（ 程度）が５〜２０倍上昇し、しかも封鎖の速度が１０〜２５倍上昇したことを示 した。

実施例１．一般的方法及び材料 溶液及び緩衝液 濾過洗浄（ＦＷ）は、０．０９Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ ｐＨ７，６）　、２５ｍＭ　ＥＤＴＡであり；ＳＤＳ／ＦＷはＦＷ及び０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり；西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲ Ｐ）ｉ！溶液は０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５，５）、０．５ｍｇ／ｍ１ ４−メトキシ−１−ナフトール、０．　０２ｍｇ／ｍｌ　３−メチル−２−ベン ゾ−チアゾリノンヒドラゾン、及び０゜０１３５％過酸化水素であり；アルカリ ホスファターゼ（ＡＰ　）　４’ｌ溶液ハ１　ｍＭ　Ｓ−ブロモ−４−クロロイ ンドイル−３−ホスフェート、１．ｍＭニトロブルーテトラゾリウム、及びＴＭ ＮＺ　（１００ｍＭｈリスＨＣＩ　（ｐＨ８，５）、１００ｍＭＮａＣ］、５０ ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、及び０，１ｍＭ　ＺｎＣＩｚ）中の０．０１％　Ｔｗｅｅｎ ２０であり；リシス溶液は３Ｍグアニジニウムチオシアネート、２％　Ｎ−ラウ ロイルサルコシン（サルコシル）、５０ｍＭｈリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，６）、 ２５ｍＭ　ＥＤＴＡである。

材料 ａ、オリゴヌクレオチド ハタテロイドギンギハリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａ　］　ｉ ｓ）の１．６　ＳリポソームＲＮＡの二つの異なる領域に相補的な二種のオリゴ ヌクレオチドを、アプライドバイオシステムＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂで合成 した。

以下に記載するすべてのオリゴヌクレオチドの配列を表１に記載した。

ｂ、ポリ（エチレンイミン）はポリサイエンシス（Ｐａｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　 ；Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）より購入した。

ヨードアセトアミドベンゾイル化オリゴヌクレオチドの調製＝１０〜１１０００ ｕの５′末末端アミ粘結オリゴヌクレオチド（ＰＵ９Ａ）または５′末端アミン 相補的（“′Ｃ”で表記）オリゴヌクレオチド（ＵＰ９Ａ’“Ｃ”）を、過剰の Ｎ−スクシニミジル４−（ヨードアセトアミド）−ベンゾエート（ＳＩＡＢ）と 、アルカリ性（好ましくはｐＨ８，０）緩衝液中で、１８°Ｃ〜２５°Ｃで３０ 〜１２０分間反応させた。未反応のＳ　ＩＡＢはＮＡＰ２５（ファルマシア）カ ラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。

面体支持体の調製： １６ｃｍ２のＮ）ｒｔｒａｎ片を、ｐＨ８，３のＯ，ＬＭホウ酸ナナトリウム中 ５ｍｇ／ｍｌイミノチオラン１０ｍ１とインキュベートした。インキユベーシヨ ンは周囲温度において３０分間である。メンプランを、上述のホウ酸ナトリウム 緩衝液を５回変更して洗浄し、そして導入されたスルフヒドリル基の存在及び定 量は５，５−ジチオ−ビス（２−二トロ安息香酸）を使用して決定した。次いで 、誘導体化されたメンプランを０．２８ｃｍ”ディスクに切り出して、０．１Ｍ ホウ酸ナナトリウム緩衝液１回洗浄した。ｒＡＢ−オリゴヌクレオチドを上述の ように調製し、そしてメンプランディスクと混合した。

ＩＡＢ−オリゴヌクレオチド１．０ｍｇを含有する０、１Ｍホウ酸ナナトリウム 緩衝液２ｌ中に３００枚のメンプランディスクを浸漬し、そして暗室内で一定の 攬はんをしながら室温で１６時間反応を進行させた。　。

次いで、ディスクを０．１Ｍホウ酸ナトリウム及びＳＤＳ／ＦＷを用いて順次洗 浄した。フィルターディスク当たり０．１〜１．２マイクログラムのオリゴヌク レオチドが結合した。次いで、フィルターをｐＨ８，３のＯ，ＬＭホウ酸ナナト リウム中５０ｍｇ／ｎ１１ヨードアセトアミドで処理することによって、未反応 のスルフヒドリル基をキャップした。次いで、フィルターをさらにホウ酸ナトリ ウム及びＳＤＳ／ＦＷで洗浄した。

ポリ（エチレンイミン）−オリゴヌクレオチドポリマーの調製： ａ、チオール化：ポリ（エチレンイミン）（ポリサイエンシス、Ｗａｒｒｉｎｇ ｔｏｎ、ＰＡ製の°’ＰＥビ、分子量１０．０００）の３０％水溶液５０μＩを 、イミノチオラン５０ｍｇを含有するｐＨ，：３のＯ，ＬＭホウ酸ナナトリウム ２５０マイクロリンドル加えて、周囲温度で１時間混合した。

次いで、チオール化ポリマーを、ｐｔｉｓ、３のホウ酸ナトリウム緩衝液中のＧ −２５セフアデンクスを用いた排除クロマトグラフィーによって精製し、そして 導入されたチオール基数を５，５′−ジチオ−ビス（２−二トロ安息香酸）を用 いた滴定により決定した。

ｂ、上述のへテロ三官能性架橋試薬５ＩＡＢを用いて、５００〜５０００マイク ログラムの８ｇｌオリゴヌクレオチドを誘導した。精製したオリゴヌクレオチド をブタノールを使用して濃縮し、次いで減圧下で近乾燥へ導いて残存するブタノ ールを除去した。そのオリゴヌクレオチドに１００〜２００μＩのＮ−メチル− ピロリドンを加え、次いでそのオリゴヌクレオチド溶液に５μｌのチオール化ポ リマーを加え、そしてその溶液を１〜１８時間激しく混合した。ＣＦ−２５０カ ラム（デュポン）を用いたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ排除クロマトグラフィーによってコン ジュゲートを精製した。ポリマーを濃縮し、そして０．０１Ｍトリス１０．ＯＩ Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、２％（Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール、及び５０％グリセロ ール中−２０°Ｃで保存した。ゲル分析は、ポリマー当たり５〜１５個のオリゴ ヌクレオチドが結合していることを示した。

実施例２．比色アッセイにおけるＰＥｌ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを 用いたＢｇ　ｒＲＮＡの捕獲の増幅この実施例は、１６Ｓ　Ｂｇ　ｒＲＮＡを捕 獲し、そして共有結合的に固定化されたＢｇｌＣ−オリゴヌクレオチドを有する Ｎｙｔ、ｒａｎ固体支持体にハイブリダイズする、Ｂｇｌ−オリゴヌクレオチド にコンジュゲートされた１０，０００ＭＷＰＥＩポリマーの使用を利用する。

３Ｍ　ＧｎＳＣＮ溶菌溶液を使用して、１９°Ｃで１００マイクロリツトル中１ ×１０１１細胞のＡｃｔ　１ｎｏｂａｃ　ｉ　１１ｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ ｔｅｍ　ｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａａ）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａ ｌｉｓ（Ｂｇ）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕＳ　（Ｂｉ） 、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄ６１３（Ｂｃ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｆｎ）、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ　ｒｅｃ　Ｌ　ａ（Ｗ ｒ）　をン容菌した。次いで、試料を６５°Ｃに５〜１０分間加熱した。バクテ リア１６３　ｒＲＮＡの保存領域（シグナルプローブ）に相補的なビオチニル化 ２４マーオリゴヌクレオチドプローブを加えて、１ｍｌ当たり１００ナノグラム の最終濃度にしだ。

一つの溶液に、Ｂｇｌ−１０Ｋ　ＰＥＩコンジュゲートを加えて、最終濃度１マ イクログラム／信Ｉ（オリゴヌクレオチド濃度を基準として）とした。全細胞数 ｌＸｌ０”のＡａ。

Ｂｉ、Ｅｋ、Ｆｎ、及びＷ「及びＰＥＪ−オリゴヌクレオチド′コンジュゲート を用いるかまたは用いずに、そしてビオチニル化シグナルオリゴを含有する希釈 剤を用いて、溶菌液の５倍の連続希釈液を調製した。次いで、その溶液を、ｌｕ ｇのＢｇｌＣまたは８ｇｌ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プローブ） が共有結合的に固定されているｎｙｔｒａｎディスクと一緒に、周囲温度で１０ 分間インキュベートした。インキユベーシヨンの際には、回転式ブラットホーム 振とう機を用いて、容器を穏やかに攬はんした。

次いで、周囲温度でＳＤＳ／ＦＷを用いて固体支持体を洗浄し、続いてＳＤＳ／ ＦＷ中のストレブタビジン（Ｓｕｒｅｐａｖｉｄｉｎ）／西洋わさびベルオキシ ダーゼ（ＳＡ／ＨＲＰ）コンジュゲート１０　ｎｇ／ｍｌと共にインキュベート した。

次いで、固体支持体をＳＤＳ／ＦＷ、ＦＷで洗浄し、続いてフィルターを実施例 １に記載したＨＲＰ基質溶液と共にインキュベートして不溶性生成物を生成させ ることによって、ベルオキシダーゼの存在を決定した。その結果は、１ｏ分間の ハイブリダイゼーシヨンにおいて、捕獲増幅ポリマーを用いると３×１０５個の 細胞が検出され、一方、増幅ポリマーを用いないと８×１０６個が検出された。

増幅ポリマーを用いてもハックグラウンドレベルは上昇しながった。Ａａ、Ｂｉ 。

Ｅｋ、及びＷｒが存在し且つＢｇが存在しない対照は発色をまったく示さず、Ｂ ｇの捕獲は特異的であった。

実施例３．固体支持体上に標的核酸を封鎖することにおける中間体として標的捕 獲ポリマーを使用する標的核酸の向上した捕獲の速度及び程度の決定 本実施例は、ハイブリダイゼーション手順における中間体としてポリマー／オリ ゴヌクレオチドコンジュゲートを使用するかまたは使用せずに、固体支持体上に 標的核酸（１６ｓｒＲＮＡ）を封鎖する速度及び程度について記述する。

実験は、１６３　Ｂｇ　ｒＲＮＡを捕獲し、そして共有結合的に固定化されたＵ Ｐ９Ａ　’“Ｃパ−オリゴヌクレオチドを有するｎｙｔｒａｎ固体支持体にハイ ブリダイズする、ＵＰ９Ａ−オリゴヌクレオチド（１６ＳバクテリアｒＲＮＡ用 の“一般的パオリゴヌクレオチドプローブ）にコンジュゲートされた７０．ＯＯ Ｏ？ｊＷ　ＰＥＩポリマーの使用を利用する。

３Ｍ　ＧｎＳＣＮ溶菌溶液を使用して、１９°Ｃで１００？イクロリノトル体積 中のＢｇ細胞Ｉ　Ｘ　１０’個を溶菌し、そして６５゛ｃに５〜ＩＯ分間加熱し た。バクテリア１６Ｓ　ｒＲＮＡの超可変領域（シグナルプローブ）に相補的な ３２Ｐ２４マーオリゴヌクレオチドプローブ（比活性５Ｘ１０’ｃρｍ／マイク ログラム）を加えて、最終濃度１０ナノグラム／　ｍ　＋とした。一つのシリー ス゛に、ン容液のＬＩＰＯａ−７０Ｋ　ＰＥＩコンジュゲートを加えて、最終濃 度１マイクログラム／ｍｌ（オリゴヌクレオチド濃度を基準として）とした。各 反応速度曲線について、７個の二重の時点を使用した。次いで、その溶液を、Ｕ Ｐ９ａまたはＩＪＰ９ａＣ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プローブ） １マイクログラムを共有結合的に固定化したｎｙｔｒａｎディスクと共に、周囲 温度で０゜５．１．０，１５，３０．４５、及び６０分間インキュベートした。

インキュベーションの際には、先に記述したように試料を穏やかに攬はんした。

次いで、固体支持体を周囲温度でＳＤＳ／ＦＷを用いて５回洗浄し、そして結合 した放射能をシンチレーション計数によりモニターした。

その結果を図２に示した。ポリマーを使用した場合としない場合の二つの反応速 度分布の比較は、中間体ポリマーを含有する反応の速度が１０〜２５倍に上昇し 、しかも６０分時点における反応の程度が約２０倍に上昇していることを示して いる。こうして、ＰＥＩ／オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いると、中間 体として標的捕獲ポリマーを使用することなく１時間で達成されるレベルの約２ 倍のレベルの標的核酸封鎖が５分で達成される。

表１１選択オリゴヌクレオチド 、　配　１　ｒＲＮＡ負 ＵＰ９Ａ　５’ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ３’　３３８−３５ ７８ｇ−５８５’ＣＣＧＡＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＡＣＧＧＴＡＣＡＴ３’　４ ７５−５０５８ｇ−ＩＢ　５’ＣＡＡＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＴＴＡＴ ＴＣ３’　４５０−４７５ＨＰＶ　１１４　５’　ＡＡＡＴＧＣＧＧＴＧＴＣＡ ＧＩＩ；ＡＡＡＡＣＣＡＡＡ３’ＲＰＶ　１１５　５’　ＣＣＡＣＣＴＡＧＡＡ ＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴ３’実施例４．標的二本鎖ＤＮＡの一本鎖に相補 的な捕獲ポリマーを使用する変性二本鎖ＤＮＡの捕獲の増幅この実施例は、プラ スミドＤＮＡに含まれるヒトパピローマウィルス配列に相補的な２４マーオリゴ ヌクレオチドを有する７０．ＯＯＯＭ−ＰＥＩポリマーを使用して、変性二本鎖 ＤＮＡの固体支持体上への捕獲の速度及び程度を増大させる。

本実施例のための配列を表１に記載する。Ｔ４キナーゼを用いてＰ３２−ｄＡＴ Ｐにより末端標識せしめた、０．２９マイクログラムのＨＰＶ　１１５’“Ｃ” オリゴヌクレオチド（“Ｃ”は表１に記載のＨＰＶ　１１５オリゴヌクレオチド に相補する配列を表わす）；５０，７５又は１００ナノグラム（７）ＨＰＶ　１ １５−７０Ｋ　ＰＥＩボＩＪ？−；ＨＰＶ血清型１６ゲノムを含むＰＢＲ３２２ プラスミドのコピー１×１０９個（種々の（ＨＰＶ）ゲノムに相補するＤＮＡは Ｐブルースクリプトクローニングベクターにおける組換インサートより調製した 〔即ち、ｐＨＰＶ−１６はブルースクリプト■＼のＢａｍＨＩ制限部位の中に挿 入されているヒトバピローマウイルス１６型のゲノム配列である］。ｐブルース クリプト■＼は、ｐＢＳ　（土／−）のｐＵＣポリリンカーを２１個の固有制限 部位を含む合成ポリリンカーと変換することにより得られる、２．９５ｋｂのコ ロニー形成性ファージ（ｃｏｌｏｎｙ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｐｈａｇｅｍｉｄ ）である）を含むＮｙｔｒａｎフィルターの全てを、０．６ＭのＮａＣ１，９０ ｍＭ。トリス、ｐｕ＝ｓ、ｏ、１０ａ＋ＭのＥＤＴＡ、０゜５％のＳＤＳ、３０ ％の脱イオンホルムアミド（ハイブリダイゼーション溶液）に含ませた。次にこ の溶液（総容量１００マイクロリツター）を湯浴の中で９０°Ｃで５分間加熱せ しめた。次いでこの溶液を２０°Ｃで４時間インキュベートし、この時点でハイ ブリダイゼーション反応を停止させ、そしてこの固相支持体（フィルター）をこ の溶液から除去した。

次いで、フィルターを上述のハイブリダイゼーション溶液で２回、続いてＳＤＳ ／ＦＷで３回洗浄した。次いで、液体シンチレーション計数を用いて、フィルタ ーを放射能についてモニターした。表２は、ｌ１ｋｂ　ＨＰＶ１６含有プラスミ ドの捕獲程度を記述する。

ポリマー無し　１０１４　３％ ５０ｎｇ　３３０８７　８６％ ７５ｎｇ　２４１４７　６３％ １１００ｎ　２８９３９　７５％ １）各反応における全部の利用可能な標的のｃｐｍは３８゜０００ｃｐｍであっ た。ポリマーは有意な一本鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを一つしかもたない ので、総投入ｃｐｍの１／２のみが捕獲に利用できると仮定した。

それゆえ、捕獲ポリマーを使用すると、１ｌｋｂ変性プラスミドＤＮＡの封鎖を 、固体支持体によるＤＮＡの直接捕獲よりも平均して２５倍増大させることが示 された。

ＦＩＧ、−１ ＦＩＧ−２ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ポリマーに共有結合している相補的捕獲ポリヌクレオチドと、標的ポ リヌクレオチドとを接触させること（但し、前記ポリマーは、 （１）水溶性ポリマー、または水溶性ポリマーで被覆されたマイクロビーズであ り； （２）前記ポリマーに共有結合している捕獲ポリヌクレオチドを少なくとも２コ ピー有し；そして（３）溶液中で移動性を示す）； （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドと前記捕獲ポリヌクレオチドとの間でハイブリ ダイゼーションを起こさせること（そこで溶液中の前記ポリマーの移動性がハイ ブリダイゼーションを増幅する）；及び （ｃ）前記ポリマーを固体表面に封鎖すること；を含んで成る、標的ポリヌクレ オチドの捕獲を向上させる方法。 ２．ポリマーを用いるハイブリダイゼーションの増幅が、ポリマーを用いないハ イブリダイゼーションと比較して、１０分間のハイブリダイゼーションで約１０ 〜２５倍に上昇する、請求の範囲１記載の方法。 ３．前記固体表面が、共有結合している前記捕獲ポリヌクレオチドに相補的なオ リゴヌクレオチドを有する、請求の範囲１記載の方法。 ４．前記ポリマーが、ポリオキシド、ポリエーテル、ポリ（エチレンイミン）、 アクリル系ポリマー、ビニル系ポリマー、ポリアリルポリマー、ポリサッカライ ド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリビニルピロリジンポリマーより 成る群から選択される、請求の範囲１記載の方法。 ５．前記ポリマーが、ポリ（エチレンイミン）、ポリアリルアミン、ポリビニル アミン、及びポリペプチドより成る群がら選択される、請求の範囲４記載の方法 。 ６．前記マイクロビーズが、架橋デキストランマイクロビーズ、アガロースマイ クロビーズ、ポリスチレンマイクロビーズ、ポリテトラフルオロエチレンマイク ロビーズ、ポリスチレン／ラテックスマイクロビーズ、シリカマイクロビーズ、 磁性マイクロビーズ、または活性化カルボキシレート、スルホネート、ホスフェ ート、もしくは類似の活性化性基を有する微小球もしくはマイクロビーズである 、請求の範囲１記載の方法。 ７．前記マイクロビーズが直径約０．５〜約１２０ミクロンを有する、請求の範 囲１記載の方法。 ８．前記水溶性ポリマーが分子量約６００〜約１００，０００ダルトンを有する 、請求の範囲１記載の方法。 ９．前記水溶性ポリマーが分子量約１０，０００〜約７０，０００ダルトンを有 する、請求の範囲８記載の方法。 １０．前記固体表面が、二次元固体支持体、ビーズ型固体支持体、マイクロタイ ターウェル、ストリング、またはプラステックストリップである、請求の範囲１ 記載の方法。 １１．前記固体表面が、ニトロセルロース支持体、誘導体化ナイロン支持体、フ ッ素化ポリ炭化水素支持体、メンブラン、ナイロンディスク、磁性ビーズ、プラ スチックビーズ、ポリテトラフルオロエチレンビーズ、ポリスチレンビーズ、ポ リスチレン／ラテックスビーズ、ラテックスビーズ、及びシリカ支持体より成る 群から選択される、請求の範囲１０記載の方法。 １２．（ａ）ポリマーに共有結合している相補的捕獲ポリヌクレオチドと、標的 ポリヌクレオチドとを接触させること（但し、前記ポリマーは、 （１）水溶性ポリマー、または水溶性ポリマーで被覆されたマイクロビーズであ り； （２）前記ポリマーに共有結合している捕獲ポリヌクレオチドを少なくとも２コ ピー有し； （３）前記ポリマーに結合しているリガンド／レセプター結合体のリガンド部を 有し；そして （４）溶液中で移動性を示す）； （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドと前記捕獲ポリヌクレオチドとの間でハイブリ ダイゼーションを起こさせること（そこで溶液中の前記ポリマーの移動性がハイ ブリダイゼーションを増幅する）；及び （ｃ）前記ポリマーを、リガンド／レセプター結合体のレセプター部を結合して 有する固体表面に封鎖すること；を含んで成る、標的ポリヌクレオチドの捕獲を 向上させる方法。 １３．ポリマーを用いるハイブリダイゼーションの増幅が、ポリマーを用いない ハイブリダイゼーションと比較して約１０〜２５倍に上昇する、請求の範囲１２ 記載の方法。 １４．前記ポリマーが、ポリオキシド、ポリエーテル、ポリ（エチレンイミン） 、アクリル系ポリマー、ビニル系ポリマー、ポリアリルポリマー、ポリサッカラ イド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリビニルピロリジンポリマーよ り成る群から選択される、請求の範囲１２記載の方法。 １５．前記ポリマーが、ポリ（エチレンイミン）、ポリアリルアミン、ポリビニ ルアミン、及びポリペプチドより成る群から選択される、請求の範囲１４記載の 方法。 １６．前記マイクロビーズが、架橋デキストランマイクロビーズ、アガロースマ イクロビーズ、ポリスチレンマイクロビーズ、ポリテトラフルオロエチレンマイ クロビーズ、ポリスチレン／ラテックスマイクロビーズ、シリカマイクロビーズ 、磁性マイクロビーズ、または活性化カルボキシレート、スルホネート、ホスフ ェート、もしくは類似の活性化性基を有する微小球もしくはマイクロビーズであ る、請求の範囲１２記載の方法。 １７．前記マイクロビーズが直径約０．５〜約１２０ミクロンを有する、請求の 範囲１２記載の方法。 １８．前記水溶性ポリマーが分子量約６００〜約１００，０００ダルトンを有す る、請求の範囲１２記載の方法。 １９．前記水溶性ポリマーが分子量約１０，０００〜約７０，０００ダルトンを 有する、請求の範囲１８記載の方法。 ２０．前記固体表面が、二次元固体支持体、ビーズ型固体支持体、マイクロタイ ターウェル、ストリング、またはプラステックストリップである、請求の範囲１ ２記載の方法。 ２１．前記固体表面が、ニトロセルロース支持体、誘導体化ナイロン支持体、フ ッ素化ポリ炭化水素支持体、メンブラン、ナイロンディスク、磁性ビーズ、プラ スチックビーズ、テフロンビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリスチレン／ラテッ クスビーズ、ラテックスビーズ、及びシリカ支持体より成る群から選択される、 請求の範囲２０記載の方法。 ２２．前記リガンド／レセプター結合体が、抗原／抗体、ホルモン／ホルモンレ セプター、ビオチン／ストレプタビジン、またはビオチン／アビジンである、請 求の範囲１２記載の方法。 ２３．水溶性ポリマー、または水溶性ポリマーで被覆されたマイクロビーズを含 んで成る標的ポリヌクレオチド捕獲組成物において、前記ポリマーがそれに共有 結合している捕獲ポリヌクレオチドを少なくとも２コピー有し、しかも前記ポリ マーまたはマイクロビーズが溶液中で移動性を示す、前記標的ポリヌクレオチド 捕獲組成物。 ２４．前記ポリマーが、ポリオキシド、ポリエーテル、ポリ（エチレンイミン） 、アクリル系ポリマー、ビニル系ポリマー、ポリアリルポリマー、ポリサッカラ イド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリビニルピロリジンポリマーよ り成る群から選択された、請求の範囲２３記載の標的ポリヌクレオチド捕獲組成 物。 ２５．前記ポリマーが、ポリ（エチレンイミン）、ポリアリルアミン、ポリビニ ルアミン、及びポリペプチドより成る群から選択された、請求の範囲２４記載の 標的ポリヌクレオチド捕獲組成物。 ２６．前記ポリマーが水溶性であり、そして分子量約６００〜約１００，０００ ダルトンを有する、請求の範囲２４記載の標的ポリヌクレオチド捕獲組成物。 ２７．前記ポリマーが分子量約１０，０００〜約７０，０００ダルトンを有する 、請求の範囲２６記載の標的ポリヌクレオチド捕獲組成物。 ２８．前記捕獲ポリヌクレオチドの長さが約１５〜約７０ヌクレオチドである、 請求の範囲２３記載の標的ポリヌクレオチド捕獲組成物。 ２９．前記ポリマーが、それに結合しているリガンド／レセプター結合体のリガ ンド部を有する、請求の範囲２３記載の標的ポリヌクレオチド捕獲組成物。