JPH10508741A - 核酸−プローブ標的ハイブリッド検出の感度上昇のための増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸ハイブリダイゼーション試験を単純化し、且つ該試験の感度を高めるための方法を提供する。開示された方法によって、一本鎖標的核酸配列に相補的な配列領域を含む一本鎖の一次核酸配列が、標的分子に対してハイブリダイズされる。ＤＮＡが標的であるときはプローブとしてＲＮＡを用い、また標的がＲＮＡであればプローブとしてＤＮＡを用いることによって、形成された二本鎖複合体の安定性を高めることができる。このプローブ／標的の複合体は、続いて検出のために免疫捕捉される。夾雑物を洗い落とした後に、多くの繰り返し配列ユニットを含む二次核酸配列を、固定化されたプローブ／標的複合体のプローブ成分に対してハイブリダイズさせる。多くの標識された核酸配列プローブを、核酸増幅プローブの繰り返し配列ユニットの夫々に対してハイブリダイズさせた後に、検出が行われる。こうして、固定化されたプローブ／標的複合体にハイブリダイズされた増幅プローブに、複数の標識されたプローブを結合させることによって、検出信号を増幅させて核酸ハイブリダイゼーション試験の感度を増幅させるための単純化された方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸−プローブ標的ハイブリッド検出の感度上昇のための増幅方法 〔発明の背景〕 本発明は、特異的核酸配列の探索手段として有用な核酸ハイブリダイゼーショ ン試験に関する。核酸の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮ Ａ）がある。ＤＮＡとＲＮＡの分子サブユニットはヌクレオチドと呼ばれ、互い に連結されて長いポリヌクレオチド鎖を形成する。各ヌクレオチドサブユニット は、糖残基、リン酸残基および塩基残基より構成される。ＤＮＡやＲＮＡの遺伝 情報を有しているのは、塩基残基［アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン （Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）］の連続的な順序である。特異的ＤＮＡ またはＲＮＡ配列を探索、検出および単離するために、本発明においてポリヌク レオチド鎖中のこれらの塩基残基の順序、および塩基が他の特異的塩基残基と引 き寄せあって結合する性質が利用される。 ＤＮＡは通常、側面は同じ糖（デオキシリボース）とリン酸分子で構成され、 横木は互いの鎖から延びている弱い引力で結合した塩基で構成されている、はし ごに似たらせん形で、縦に互いの周りにねじれている２つのポリヌクレオチド鎖 を含有する。ＤＮＡでは、１つの鎖の塩基チミンはいつも反対の鎖のアデニンと 対合し、塩基グアニンはいつも反対の鎖のシトシンと対合する。これは、相補的 な塩基対合と呼ばれる。 ＲＮＡもまたポリヌクレオチド鎖である。しかし、糖残基はリボース（ＤＮＡ のデオキシリボースに対応する）であり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン およびウラシルである。ＲＮＡでは、１つの鎖の塩基ウラシルはいつも反対の鎖 のアデニンと対合し、塩基グアニンは反対の鎖のシトシンと対合する。ＲＮＡは 、ＲＮＡまたはＤＮＡの相補的な鎖と対合できるが、通常１本鎖であり、従って らせん形を取らない。 本発明は、１本鎖核酸配列は適当な条件下で相補的な１本鎖核酸配列と組合わ さり、またはハイブリダイズして２本鎖分子を形成することができるという技術 に一部基づく。この技術は、目的とする特定の核酸配列を検出および／または単 離するための手段として開発された。ウイルス、細菌または他の微生物内のＤＮ ＡまたはＲＮＡの存在、従ってこれらの病原体自身の存在を検出するための応用 が最近広がっている。この技術はまた、抗生物質耐性について細菌をスクリーニ ング、遺伝疾患（例えば、鎌形赤血球貧血およびタラセミア）の診断の補助、お よび癌性細胞の検出などの他の目的にも使用することができる。臨床試料、食品 試料、環境試料、および法医学的試料の微生物的解析のために、いくつかの応用 法が開発されている。この技術およびその現在と将来の意義についての総説は、 Biotechnology（1983年８月）、471-478頁（これは参考のため本明細書に引用さ れる）に記載されている。 本発明の理解を促進するために、以下の用語を定義する。「プローブ」という 用語は、少なくとも３つのタイプの以下の核酸配列を意味する：主プローブ、増 幅プローブ、および標識プローブ。主プローブは、目的の標的ＤＮＡまたはＲＮ Ａ分子の核酸配列のある部分に相補的な（すなわち、これと対合する）少なくと も１つの核酸配列を含有する。増幅プローブは、主プローブのある配列に相補的 な配列を含有し、典型的には少なくとも１つの繰り返し配列単位である領域を含 有する。標識プローブは、化学的標識物以外に、繰り返し配列単位の１つに相補 的な配列を含有する。標識物は検出可能な化学的な群であり、放射性分子または 非放射性分子であり、放射性アイソトープ、西洋ワサビペルオキシダーゼのよう な酵素活性のある群、蛍光物質、化学発光物質、沈降物質、および／または色素 などを含む。「シグナル」という用語は、検出可能な化学的な群の検出できる特 徴を意味するのに自由に使用され、基質に作用する標識プローブに結合した酵素 の酵素作用に由来する反応溶液の光吸収特性の変化、色素の色または色の変化、 蛍光、リン光、放射活性、または当業者に明らかな他の任意の指標を含んでよい 。 増幅プローブは、多くの検出可能な化学的標識物が１つのプローブ−標的複合 体に結合すると、得られるシグナルが、増幅プローブにハイブリダイズする標識 プローブの数に比例して増幅されるために、このように名付けられる。もし増幅 プローブが、標識プローブに親和性の配列よりなるただ１つの配列単位を含有す るなら、ただ１つの標識プローブのみがプローブ−標的複合体に結合し、シグナ ルは増幅されないであろう。しかし、本発明に開示された増幅プローブは典型的 には、標識プローブに親和性のある５つまたはそれ以上の配列単位を含有し、そ の結果５つの標識プローブが１つのプローブ−標的複合体に結合し、検出可能な ５倍量の化学的標識物が１つのプローブ−標的複合体の存在を示し、形成される １つのプローブ−標的複合体が５倍増幅されたことを意味する。さらに、増幅プ ローブが標識プローブに親和性のある２０個の配列単位を含有するなら、２０個 の標識プローブが１つのプローブ−標的複合体に結合し、２０倍量の検出可能な 化学的標識物が１つのプローブ−標的複合体の存在を示し、形成される１つのプ ローブ−標的複合体が２０倍増幅されることを意味する。増幅の程度は任意であ り、本明細書に記載のように増幅プローブの設計と作成により操作することがで きる。 核酸ハイブリダイゼーション試験の１つの目的は、ハイブリダイゼーション条 件下で、ある試料を相補的な核酸配列（プローブ）に接触させて、プローブ−標 的複合体の形成または存在を観察することにより、その試料中の特定の核酸配列 （標的配列）の存在を検出することである。プローブ−標的複合体は、プローブ に結合した標識物により直接検出することができる。この複合体はまた、標識物 に結合した別の核酸配列のハイブリダイゼーションのような方法により、または 検出可能な化学的な群で標識した抗体の結合により間接的に検出することもでき る。 当該分野で現在使用されている検出作戦は、ＰＣＴ出願84/03520号とＥＰＡ12 4221号に例示されており、酵素標識した核酸配列を用いて、プローブのテイル(t ail)上の相補的な配列とのハイブリダイゼーションによりプローブ−標的複合体 を検出する。例えば、エンゾ・バイオケム（Enzo Biochem）の「バイオブリッジ 」（″Bio-Bridge″）系は、ポリ（Ｔ）テイル（チミンヌクレオチドのみを含む 核酸配列）を有するＤＮＡプローブを標的ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーション させた後に、検出系としてポリ（Ａ）テイル（アデニンヌクレオチドのみを含む 核酸配列）に結合したビオチン分子を使用する。 このような方法を測定法として使用するためには、プローブ−標的複合体を高 感度に検出できることが必要である。核酸配列ハイブリダイゼーション試験の感 度は主に、バックグランドノイズおよび／または偽陽性に対してプローブ−標的 複合体の形成を示す標識物の検出限界により決定される。核酸ハイブリダイゼー ション試験の感度を改良するために異なる作戦が使用され、これは以下の４つに 広く分類される：１）プローブ−標的複合体の分離；２）標的増幅；３）プロー ブ増幅；４）複数の標識物、またはこれらの組合せ。 いくつかの核酸ハイブリダイゼーション試験では、固体支持体へ標的配列を固 定化し、次に残りの反応混合物を洗浄して除去する。この第１の分類では、標的 配列を固定化してから標識プローブを加えるか、または固定化標識プローブを用 いて標的核酸配列を捕捉する方法がある。あるいは、プローブ−標的複合体の形 成後にこれを固定化する方法が開発されている。例えば、ヨーロッパ特許出願公 報第0225807号は、固体支持体に捕捉された相補的なプローブとのハイブリダイゼ ーションによりプローブ−標的複合体を溶液から除去する、核酸ハイブリダイゼ ーション試験を開示している。次に固相複合体は、標識プローブとのハイブリダ イゼーションにより検出される。一般に、核酸配列を用いてこの段階でプローブ −標的複合体を固定化する方法は、不均一な試料中のタンパク質や他の物質が核 酸の固定化を妨害し易いという欠点を有する。さらに標識物対標的の比が１：１ であるため感度が低い。 第２の分類の作戦では、標的増幅により核酸ハイブリダイゼーション試験の感 度を上昇させる。標的増幅の１つの例は、染色体ＤＮＡではなく微生物のリボゾ ームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を測定する。任意の細胞においてｒＲＮＡはＤＮＡより １万倍高濃度で存在するため、プローブ−標的複合体の数が増加し、従って標的 微生物を検出する可能性が上昇する。あるいは、米国特許第4,683,105号および 第4,683,202号に記載のポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ（登録商標））を用 いて、標的核酸配列を増幅する方法が使用される。この方法の利点と限界は、ギ レンステン（Gyllensten）（Biotechniques 7，700-706，1989、参考のため本明 細書に引用される）による総説がある。例えば、この転写に基づく増幅系は、４ サイク ルでＲＮＡ標的を２００〜５００万倍増幅することができる（リザルディ（Liza rdi）ら、Biotechnology 6，1197-1202，1988）。しかし、この技術には、過剰 のノイズや偽陽性という問題、熟練した技術が必要であること、および比較的高 価な装置と試薬が必要であるという問題がある（ワルコット（Walcott）ら、Foo d Protein 54:387-401，1991）。 核酸ハイブリダイゼーションの感度を上昇させるための第３の分類の作戦では 、主プローブの組合せを用いるプローブ増幅を利用する。この方法の例は、米国 特許第4,731,325号および第4,868,105号に開示されており、標的核酸配列に結合 する２つ以上のプローブを使用する。さらなる例は、米国特許第4,868,105号に 記載されており、ここでは標識された第２のプローブが、標的核酸配列に結合し た複数の主プローブとハイブリダイズする。 最後に、シグナルを増幅する作戦として、カスケード的にまたはサンドイッチ 的に複数のプローブを使用も試みられている。これらの方法は、複数の標識群が 主プローブ−標的複合体に結合するため、第４の分類のシグナル増幅法に属する 。本発明はこの分類に属すると言える。 この第４の分類内の作戦を開発する初期の試みの例としては、ＰＣＴ出願ＷＯ 90/13667号があり、これはＢ型肝炎ウイルスの核酸配列の増幅液相サンドイッチ 核酸ハイブリダイゼーション試験を記載しており、ここではアナライトを、増幅 プローブボリヌクレオチドと捕捉プローブポリヌクレオチドとのセットとハイブ リダイズさせる（それぞれは、標的核酸に相補的な第１の部分を有し、さらに、 増幅プローブはポリヌクレオチドマルチマーの単位に相補的な第２の部分を有し 、捕捉プローブは固相に結合したポリヌクレオチドに相補的な第２の部分を含有 する）。得られる生成物を、固相に結合したポリヌクレオチドと反応させ、次に マルチマーと反応させる。マルチマープローブは、主プローブに相補的な配列を 有するアームとの、化学的に架橋した１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの 星形構造の複合体である。結合した物質を、マルチマーのポリヌクレオチド単位 に相補的な標識プローブと反応させると、検出できる。 この作戦はＢ型肝炎ウイルスの検出の使用に限定されているにもかかわらず、 測定試薬を作成する場合の困難な点が多く、特に一般的に使用する場合に多い。 ２次プローブに架橋を作成するには、高度な熟練技術が必要であり、また目的の 架橋を行うためにこれらのポリヌクレオチドの注意深い化学的修飾が要求される 。２次プローブの星形構造を多くし過ぎると、星形構造同士および固相に結合し た固定アーム同士の立体障害が起きる。さらに２セットの主プローブ（いずれも 標的核酸に相補的な配列を必要とする）には、Ｂ型肝炎ウイルスサブタイプの多 様性に基づくコンセンサスＢ型肝炎ウイルス２本鎖領域配列の場合の、ある特定 の標的のみに対するプローブの合成が必要である。これらの方法では、プローブ 試薬を調製するためのコストが高くなり、最終的に測定法または診断キットの総 コストに反映される。簡単に言うと、この作戦は技術的に複雑であり、プローブ 試薬は多様な標的に対して応用できない。従って、シグナル増幅のためのより簡 便な系に対する一般的なニーズが存在する。 さらに別の方法において、カナダ特許出願第2,039,517号は、主プローブと展 開核酸配列にハイブリダイズすることができるブリッジング核酸を使用すること によりシグナルを増幅する方法が提供する。この方法では主プローブを標的配列 にハイブリダイズさせ、次にブリッジング配列に接触させ、次に第１の展開分子 に接触させ、最後に第２の展開分子により展開鎖を形成させる。展開分子の１つ は標識され、標識物は展開鎖中で検出される。この作戦の場合も大きな欠点はそ の複雑さであり、感度上昇を可能にするより簡便な系に対する一般的なニーズが まだ存在する。 この分類のさらなる方法は、米国特許第4,716,106号に見いだされ、ここでは 主プローブ配列がまず繊維状ファージＭ１３ＤＮＡ中でクローン化される。標的 相補的配列を有するＭ１３ＤＮＡこの１本鎖型が単離され、次に主プローブとし て使用される。このプローブを有するＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖はまた、分離 的に単離され、その長さに沿って複数の部位で標識され、次に検出プローブとし て使用される。この測定法では、複数の標識物を使用するが、この方法では必ず Ｍ１３ファージ中のプローブ配列をクローニングする必要がある。現在の分子生 物学的方法では、Ｍ１３のクローニングは当業者にとっても困難で面倒な方法で あ る。特定の標的核酸に対するプローブ試薬を調製するために、クローニングは毎 回新たに行う必要がある。これは、関連する時間、労力およびコストを上昇させ る。従って、特定の核酸配列の検出のためのより簡便で感度の高い測定系に対す るニーズがまだ存在する。 上記の作戦のおのおのの複雑さのために、研究室におけるこれらの方法の使用 は限定されている。従って、主プローブが、標的と、標識分子の複数のコピーの 結合を可能にする増幅物質ポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズする、簡便、迅 速かつ適用可能なハイブリダイゼーション試験に対するニーズがまだ存在する。 〔発明の概要〕 本発明は、当該分野で現在利用できる測定法の限界を克服するのに有用である 。本発明の好適な態様は、標的核酸配列の検出の間、シグナルを増幅する以下の 工程よりなる方法を提供することを当業者は理解するであろう： ａ）標的核酸配列にポリヌクレオチドプローブ（主プローブ）をハイブリダイズ させる工程（ここで、主プローブは増幅核酸配列（増幅プローブ）に結合する手 段を有し、増幅分子は、化学的標識物に結合した少なくとも１つの標識核酸配列 （標識プローブ）にハイブリダイズすることができる）； ｂ）プローブ−標的複合体を固定化する工程； ｃ）増幅プローブ（複数の繰り返し配列単位と主プローブの領域中の配列に相補 的な配列の領域を含有するポリヌクレオチド配列）がプローブ−標的複合体にハ イブリダイズすることができる条件下で、固定化したプローブ−標的複合体を増 幅プローブに接触させる工程； ｄ）多くの標識プローブ（化学的標識物に結合し、増幅プローブ上の繰り返し配 列単位に相補的な配列の領域を含有する核酸配列）が増幅プローブにハイブリダ イズすることができる条件下で、ハイブリダイズした増幅プローブを標識プロー ブに接触させる工程； ｅ）得られる複合体中で標識プローブを検出する工程。 この方法には先行技術に対して多くの利点がある。第１にそして最も重要な点 は、本発明は増幅プローブ中の複数の繰り返し単位を提供することにより（ここ では１つのプローブ−標的複合体に対して、最高２０分子（またはそれ以上）の 選択された標識プローブを受け取ることができる）、核酸ハイブリダイゼーショ ン試験における標識物検出を大幅に促進することである。このため、感度が大幅 に上昇し、ハイブリダイゼーション試験の有用性が向上する。 さらなる利点は、反応のカスケードに使用されるプローブの設計にある。これ らのプローブは、現在利用可能な方法と装置を用いてより容易かつ安価に合成で きる。ハイブリダイゼーション反応の速度は、多くの短いプローブを使用するた め、長いプローブを用いる場合よりも遥かに速い。さらに、１本鎖プローブの使 用により、ハイブリダイゼーション反応中のプローブの自己アニーリングの問題 を避けることができる。標識物は主プローブに直接結合していないため、主プロ ーブのハイブリダイゼーション性は変化せず、このためプローブ試薬を多くの標 的物検出測定法に適用できるようになる。従ってこのような試薬の調製は、簡便 な方法で行われ、測定法の全体のコストが低下する。 さらなる利点は、主プローブはいつもポリ（Ａ）配列を用いて合成することが できるため、増幅プローブや標識プローブのような測定に使用される他の成分は 、任意の核酸ハイブリダイゼーション試験に普遍的に使用できるという事実にあ る。これは、労力やコストが大幅に節約でき、反応条件が均一になることを意味 する。さらに、これはある特定の標的に対する測定法を迅速に開発することを可 能にする。各方法において唯一新たに必要になることは、主プローブの特異的部 分の作成であろう。 本発明のさらなる利点は、従来知られている方法よりバックグランドノイズが 低く、感度が高く、シグナル／ノイズ比が高く、そして既知の方法よりスピード の速いハイブリダイゼーション試験を提供することである。伝統的なハイブリダ イゼーション試験においては、主プローブはその長さに沿ってビオチンまたは他 のマーカーで標識される。ポリヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーション反 応を促進することが必要な時は、プローブのこのような高価な修飾では、標的分 子とのハイブリダイゼーションの効率が低下し、プローブ−標的複合体が迅速ま たは安定に形成できないかも知れない。これらの伝統的な測定法の主プローブは 末端が標識されるため、各プローブ−標的複合体は１つのマーカーしか持たず、 従ってその測定法の感度は、１つのプローブ−標的複合体について１つのマーカ ーの検出に限定されるであろう。これに対して本発明の１つの態様においては、 １つのプローブ−標的複合体について２０個またはそれ以上のマーカー分子を加 えることにより、シグナルが増幅される。従って測定法の感度は、増幅プローブ に結合したマーカー分子の数に比例して増幅されるであろう。 本発明の好適な態様において、標的核酸配列にポリヌクレオチドプローブ（主 プローブ）をハイブリダイズさせる工程（ここで、主プローブは増幅核酸配列（ 増幅プローブ）に結合する手段を有し、増幅分子は、化学的標識物に結合した少 なくとも１つの標識核酸配列（標識プローブ）にハイブリダイズすることができ る）；プローブ−標的複合体を固定化する工程；増幅プローブ（複数の繰り返し 配列単位と主プローブの領域中の配列に相補的な配列の領域を含有するポリヌク レオチド配列）がプローブ−標的複合体にハイブリダイズすることができる条件 下で、固定化したプローブ−標的複合体を増幅プローブに接触させる工程；多く の標識プローブ（化学的標識物に結合し、増幅プローブ上の繰り返し配列単位に 相補的な配列の領域を含有する核酸配列）が増幅プローブにハイブリダイズする ことができる条件下で、ハイブリダイズした増幅プローブを標識プローブに接触 させる工程；得られる複合体中で標識プローブを検出する工程を含む、細胞性物 質を含有する試料中の標的核酸配列の検出の間、シグナルを増幅する方法が提供 される。 さらに好適な態様において、本発明は、核酸配列の少なくとも２つの領域を含 むプローブ（第１の領域は、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含 み、また選択された該核酸標的の配列に相補的な配列も含む；第２の領域は、複 数の別々に標識可能な配列単位を含む）のような、選択された核酸標的の検出可 能な標識を増強するようにさせた増幅プローブを使用する。 本発明のさらに別の好適な態様は、核酸配列の少なくとも２つの領域を含むプ ローブ（第１の領域は、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、 また選択された該核酸標的の配列に相補的な配列も含む；第２の領域は、複数の 別々に標識可能な配列単位を含む）のような、選択された核酸標的の検出可能な 標識を増強するようにさせた増幅プローブを取り込んだ、核酸ハイブリダイゼー ション試験において、プローブ−標的複合体の検出可能な標識を増強する方法に 関する。 さらに好適な態様において、本発明は、ａ）選択された標的核酸配列に主ポリ ヌクレオチドプローブの第１の配列をハイブリダイズさせる工程（ここで、主プ ローブは、検出可能な標識を増強するようにさせた核酸配列を含む増幅核酸配列 に結合する手段を有し、増幅プローブは、化学的標識物に結合した核酸配列を含 む少なくとも１つの標識プローブにハイブリズすることができる）；ｂ）標的− プローブ複合体を固定化する工程；ｃ）増幅プローブ（このプローブは、選択さ れた主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、また選択された核酸標的の配列 に相補的な配列も含む第１の領域と、複数の別々に標識可能な配列単位を含む第 ２の領域の、核酸配列の少なくとも２つの領域を含む）が標的−プローブ複合体 にハイブリダイズすることができる条件下で、固定化した標的−プローブ複合体 を増幅プローブに接触させる工程；ｄ）多くの標識プローブ（検出可能な化学的 標識物に共有結合し、増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含有する）が増幅 プローブにハイブリダイズすることができる条件下で、ハイブリダイズした増幅 プローブを、標識プローブに接触させる工程；ｅ）標的配列の有無を示す試料と ともに、標識プローブに共有結合した検出可能な化学的標識物の有無を観察する 工程を含む、特異的核酸配列の検出方法に関する。 さらに別の態様において、本発明は、（ｉ）検出される配列に実質的に相補的 な少なくとも１つの１本鎖塩基配列を含む主核酸プローブ；（ii）試料中の検出 される特定のポリヌクレオチド配列の任意のものと主プローブの間のハイブリッ ドに結合することができるが、１本鎖核酸に実質的に結合することができない抗 体試薬；（iii）選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた 増幅プローブ（このプローブは、核酸配列の少なくとも２つの領域を含み、第１ の領域は、選択された核酸標的配列に相補的な配列を含み、第２の領域は、複数 の 別々に標識可能な配列単位を含む）；（iv）増幅プローブ上の配列に相補的な配 列を含有する、検出可能な化学的標識物に共有結合した標識プローブ、を含む、 試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するための試薬に関する。 さらに別の態様において、本発明は、（ｉ）検出される配列に実質的に相補的 な少なくとも１つの１本鎖塩基配列を含む主核酸プローブ；（ii）試料中の検出 される特定のポリヌクレオチド配列の任意のものと主プローブの間のハイブリッ ドに結合することができるが、１本鎖核酸に実質的に結合することができない抗 体試薬；（iii）選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた 増幅プローブ（このプローブは、核酸配列の少なくとも２つの領域を含み、第１ の領域は、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、また選択され た核酸標的配列に相補的な配列も含み、第２の領域は、複数の別々に標識可能な 配列単位を含む）；（iv）増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含有する、検 出可能な化学的標識物に共有結合した標識プローブ、を含む、試料中の特定のポ リヌクレオチド配列を検出するための診断用キットに関する。 別の態様において、測定すべき細胞は溶解緩衝液で溶解され、核酸配列は変性 される。主プローブは、液相中の変性核酸と接触させられる。形成されたプロー ブ−標的複合体は、複合体の免疫捕捉により他の物質から除去される。これは、 ハイブリダイゼーション反応混合物を、あらかじめモノクローナル抗プローブ− 標的複合体でコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに移すことに より行われる。洗浄後、固定化されたプローブ−標的複合体を増幅プローブに接 触させ、次に標識プローブに接触させて検出する。固定化されたプローブ−標的 複合体に結合した酵素の有無を、酵素にその基質を接触させ、得られる反応を測 定することにより決定する。このような例には、チーズ中のリステリア・モノシ トゲネス（Listeria monocytogenes）の検出、肉の中の大腸菌（Escherichia co li）の検出、ヒト血液中のサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）の検出が ある。 〔図面の簡単な説明〕 本発明のいくつかの態様が図面に示されている。 図１は、増幅プローブを産生するためのプラスミド調製の模式図である。 図２は、増幅プローブを調製するための方法の模式図である。 図３は、標的核酸配列を検出するための測定法において、複数のプローブが連 続的に使用される例を示す。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、多くの核酸配列プローブの調製法を含む。本発明はまた、核酸ハイ ブリダイゼーション試験を簡便にし、生成されるシグナルを有意に増幅する方法 を含む。この簡便化と増幅は主に、多数の繰り返し配列単位を含む増幅プローブ と、繰り返し配列単位に相補的な標識プローブを用いることにより達成される。標的核酸配列 本発明において検出される標的核酸配列は、任意の核酸配列である。標的核酸 配列の最大の長さに制限はないが、最小の長さは少なくとも１６ヌクレオチド塩 基である。主プローブ 主プローブは１本鎖核酸配列であり、２つの明確な領域を有する。この配列は ５’末端において標的中の配列に相補的であり、そのような配列は少なくとも６ ヌクレオチドから最大は目的の任意の長さまでの範囲の充分な長さの配列である 。 好適な態様において、この長さは１６〜２５ヌクレオチドである。この主プロー ブの３’末端は、ホモポリマー性ヌクレオチドテイル配列[例えば、ポリ（ｄＡ ）]を含有する。このポリ（ｄＡ）配列の長さには範囲があるが、増幅プローブ とハイブリダイズするのに充分な長さでなければならない。好適な態様において 、この長さは１２〜２０ヌクレオチドの範囲である。 標的がＤＮＡの場合、プローブは好ましくはＲＮＡの形で調製される。標的が ＲＮＡの場合、プローブは好ましくはＤＮＡの形で調製される。標的へのプロー ブのハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが形成される 場合、これはヘテロ２本鎖として知られている。好適な態様において、主プロー ブのホモポリマーの領域は本質的にＤＮＡであるが、一般的な態様では、任意の 型の核酸配列をこの領域に使用することができる。 標的配列に相補的な、主プローブの１本鎖ポリヌクレオチド配列の合成法は、 当該分野で公知であり、ここでは説明しない。抗体試薬 プローブ−標的複合体の固定は、表面に結合した、２本鎖核酸に結合する抗体 を用いて行われる。試料混合物からプローブ−標的複合体を分離することにより 、この方法によって標的検出の感度が改良される。 これらの特定の抗体は、表面に抗体分子をコーティングする方法のように、文 献（フリス（F1iss）ら、Appl．Environ．Microbiol．56:2608-2705，1993；コ ルテー（Coultee）ら、Anal．Biochem．181:96-105，1989；米国特許第5,200,31 3号、これらすべては参考のため本明細書に引用される）で公知である。抗体全 体、抗体断片、多官能性抗体凝集物、または一般的にプローブ−標的複合体の抗 体からの１つまたはそれ以上の特異的結合部位を含む任意の基質が、本明細書に 記載のように使用される。特に明記しない場合は、本明細書および請求の範囲に おいて使用される抗体という用語は、抗体全体、その多官能性型および／または 断片化型を意味する。この用語が抗体全体を意味する場合、これは公知の免疫グ ロブリンのクラスおよびサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭなど）の任意のものである 。またハイブリダイズされるプローブに対して特異的結合親和性を保持する任意 の抗体の断片（例えば、しばしばＦab、Ｆ(ab')およびＦ(ab)２と呼ばれるＩｇ Ｆの断片）を使用することもできる。さらに、免疫グロブリンおよび／またはそ の断片の凝集物、重合体、誘導体、および結合体を適宜使用することもできる。 抗体試薬の免疫グロブリン供給源は、通常の抗血清法およびモノクローナル抗 体法のような任意の利用できる方法から産生することができる。抗血清は、適当 な免疫原により動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモットまたはヤギ）を免疫 する、公知の方法により得ることができる。さらに免疫グロブリンは、体細胞ハ イブリダイゼーション法により得ることができ、これによりモノクローナル抗体 が生成される。 ヘテロポリマー性（すなわち、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡ）プロー ブ−標的複合体に特異的な抗体を刺激するための免疫原の調製は、種々の方法に より行われる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼによるφＸ１７４ウイルスＤＮＡの 転写を利用することができる（ナカザト（Nakazato）、（1980）Biochem．19:28 35、参考のため本明細書に引用される）。得られるプローブ−標的複合体はメチ ル化タンパク質に吸着するか、または通常の担体物質（例えば、ウシ血清アルブ ミン）に結合させてから、目的の宿主動物に注射することができる（ストーラー （Stollar）、(1980)Meth．Enzymol．70:70、参考のため本明細書に引用される ）。 このような標的−プローブ２本鎖複合体に対して作成される抗体の最も重要な 性質は、その結合性により標的−プローブ複合体の２本鎖型と１本鎖型核酸配列 を有意に区別することができることである。抗体は特定の配列を認識する必要は ないため、この目的を達成することはそれほど困難ではない。むしろ抗体は、プ ローブ−標的複合体の全体的な２本鎖性を認識する。これは本発明の決定的に重 要な特徴であり、これにより、試料中の非標的シグナル鎖核酸配列への標識プロ ーブのハイブリダイゼーションに起因するバックグランドノイズと偽陽性が有意 に低下する。 抗体が結合または固定される固体支持体を使用することが好ましい。固体は、 共有結合または非共有結合により結合させることができる。非共有結合には、適 切に安定で強力な結合を提供する吸着法がある。固体支持体は種々の形および組 成であってよい。これらには、ビーズ、微粒子、多孔性および含浸性ストリップ や膜、ならびに試験管やマイクロタイタープレートなどがある。選択された固体 支持体に目的の反応パートナーを結合させる技術は、当業者に公知である。増幅プローブ 増幅プローブは本発明の主要な特徴であり、これが複数の検出可能な化学的標 識物を各増幅プローブに結合させる。こうして１つのプローブ−標的複合体の形 成を示すシグナルが、繰り返し配列単位にハイブリダイズする標識プローブの数 に正比例して増幅される。 増幅プローブは、少なくとも２つの領域から構成される１本鎖核酸配列である 。 第１の領域は、増幅プローブが免疫捕捉プローブ−標的複合体の一部である主プ ローブとハイブリダイズすることを可能にする、主プローブの一部に相補的な短 い核酸配列を含有する。ある態様において、この第１の領域は３’末端に存在し 、約１２〜２０ヌクレオチドのホモポリマー性テイル［例えば、ポリ（ｄＡ）配 列］よりなるが、これは目的の任意の長さに延長することができる。 第２の領域は、複数の繰り返し配列単位を含有し、これは標識プローブ（１つ の配列単位内の領域に相補的な配列を含有する）がこれらの各繰り返し単位にハ イブリダイズする時、検出指数が増幅される基礎をなす。繰り返し単位の数は、 本発明の特定の応用で使用される任意の長さまで変動する。ある試験系で必要な 増幅の程度が大きいほど、または使用される検出手段の感度が悪いほど、必要な 繰り返し単位の数は大きくなる。１つの態様において、繰り返し単位の数は約２ ０である。 本発明の特定の応用の必要性により、各単位の長さは変動する。繰り返し単位 の最小の長さは約１６ヌクレオチドであるが、最適な長さは約７０〜１００ヌク レオチドである。各繰り返し単位の長さを決める時に考慮すべき決定的に重要な 要因は、標識プローブに結合した検出可能な化学的標識物のサイズにより引き起 こされる立体障害である。例えば、比較的大きな酵素は、小さな色素分子または 放射性アイソトープより大きな間隔を必要とするであろう。さらに、標識プロー ブは繰り返し単位の一部にのみハイブリダイズし；標識プローブの配列に相補的 な単位内の残りのヌクレオチドは、検出可能な化学的標識物を互いに離して存在 させるスペーサーとして機能する。さらに、縦列の繰り返し核酸断片中のサブユ ニットは、同じ５’→３’方向に配向する。図１で選択された例では、各繰り返 し配列単位は、７５ヌクレオチドの長さである。 繰り返し配列単位は同一であるか、または異なる。例えば、増幅プローブに２ つ以上のタイプの検出可能な化学的標識物を結合させることが好ましく、そのた め対応する数の異なる配列の標識プローブが必要である。この場合、あるタイプ の標識プローブの配列に相補的である２つ以上のタイプ配列で、繰り返し配列単 位が作成されるであろう。例えば、増幅鎖に３つのタイプの標識プローブ（例え ば、プローブＸ、プローブＹおよびプローブＺ）が結合することが好ましい場合 、増幅プローブ上の相補的な繰り返し配列単位（単位ｘ、単位ｙおよび単位ｚ） は、ｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚ式に作成することができるであろう。繰り返し配 列領域を形成するように結合する核酸配列は、それぞれｘｙｚ式に作成され、こ れらが結合された時ｘｙｚ−ｘｙｚ−ｘｙｚ式に結合されるであろう。 増幅プローブの複数のコピーを産生するために使用することができるプラスミ ドの作成は、公知の方法により行われ、その１つの例を図１に示す。増幅プロー ブをコードするＤＮＡ断片を、適当なプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ（登録商標））または他の適当なクローニングベクター中でクローン化する 。このプラスミドは、繰り返し単位とホモポリマー性テイルの相補的なＲＮＡコ ピーより構成される増幅プローブの調製のための鋳型として使用される。ＤＮＡベクターおよびクローニング 増幅プローブを産生するために使用されるＤＮＡベクターを作成するための実 験方法は、当該分野の当業者に公知の分子生物学の種々のマニュアルに記載され ている（例えば、サムブルーク（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニ ユアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（第２版）、コールド・ス プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、１ ９８９、参考のため本明細書に引用される）。 １つの例では、２００μgのプラスミドｐＢＲ３２２（ボリバー（Bolivar）ら 、Gene 61:253-264，1977）を、制限酵素ＰｓｔＩで完全に消化した。ＤＮＡを フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、次に制限酵素Ａｓ ｅ１で完全に消化した。制限酵素によるｐＢＲ３２２ ＤＮＡの消化により、環 状プラスミドから７５ヌクレオチドの長さの断片が得られた。この７５塩基対（ ｂｐ）断片は、８％ポリアクリルアミドゲルで反応混合物を電気泳動して、残り のプラスミドから分離した。７５塩基対断片を、バイオラッド（Bio-Rad）装置 を用いて電気溶出法によりゲルから単離し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。 この７５塩基対断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で配列５’ＴＡＴＧＣ Ａ３’のアダプターポリヌクレオチドと混合した。このアダプターで仲介された 結 合により、ポリマー中で同じ５’→３’配向に並んだ各サブユニットで７５塩基 対断片が重合した。この結合反応混合物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ゲ ルを臭化エチジウムで染色することにより、異なるポリマーサイズのＤＮＡを示 すはしごが観察された。ゲルから１５００塩基対サイズに相当するＤＮＡ断片を 切り出し、ＱＩＡｅｘゲル抽出法（キアゲン（QIAGEN）、チャツワース（Chatts worth）、カリホルニア州）を用いてゲルから抽出した。 上記１５００塩基対ＤＮＡを、ｄＡＴＰの存在下でポリヌクレオチド末端トラ ンスフェラーゼで処理して、このＤＮＡの３’末端に約１２〜２０ｄＡをつけ加 えた。同時にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（ストラタジーン （Stratagene）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州）を、制限酵素Ｓｍａ Ｉで線状化し、次にｄＴＴＰの存在下でポリヌクレオチド末端トランスフェラー ゼで処理して３’末端に１２〜２０ｄＴをつけ加えた。こうして調製されたＤＮ Ａ配列を適当な条件下（ギブコ・ビーアールエル（GIBCO BRL）技術情報８００ ８−１）で混合して、相補的なテイルをアニーリングし、環状組換えプラスミド ＤＮＡを形成した。 アニーリングしたＤＮＡを、ストラタジーン（Stratagene）が推奨する細菌形 質転換法を用いて、大腸菌（エピキュリアン（Epicurian）大腸菌ＸＬ−１；ス トラタジーン（Stratagene））に導入した。形質転換体から、主プローブをコー ドする配列を含有するコロニーを、プラスミドＤＮＡの解析により確認した。主 プローブをコードするプラスミドのＤＮＡを、キアゲン（QIAgen）メガ−プラス ミド単離キットを用いて大腸菌から精製した。 増幅プローブをコードする核酸配列を含有するＤＮＡプラスミドを転写する方 法は、以下の通りである。増幅プローブをコードするプラスミドＤＮＡ（１０μg ）を、アンビコン社（Ambicon Inc.）（オースチン、テキサス州）のメガ転写キ ット（Mega-Transfection kit）（カタログ番号１３３４）に示唆される方法で 、酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで処理した。この転写は、５’末端にポリ（Ｕ ）配列を含む、図２に示す構造のＲＮＡ産物を生成した。 一般に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる増幅プローブをコードするプラスミ ドのインビトロ転写は、その相補的なＲＮＡである、５’末端にポリ（Ｕ）ホモ ポリマー性テイル断片を有する増幅プローブ（図２）を生成する；このポリ（Ｕ ）領域は、既に記載された主プローブのポリ（Ａ）領域に相補的である。当該分 野の最近の進歩により、インビトロ転写においてＴ７ ポリメラーゼに仲介された ＲＮＡ分子の大量産生が可能になった。マイクログラム量の鋳型ＤＮＡからミリ グラム量のＲＮＡを産生するために、「メガ−トランスクリプトキット」（″ME GA-Transcript kits″（アンビコン社（Ambicon Inc.）、オースチン、テキサス 州）のようなキットを用いることができる。 適当なホモポリマー性テイルによりいったん増幅プローブが作成されると、任 意の核酸ハイブリダイゼーション試験(ここで、主プローブは、増幅プローブの ホモポリマー性領域に相補的な配列を含む)に使用される増幅プローブの産生に 、同じプローブが使用することができることを、当業者は理解するであろう。標識プローブ 免疫捕捉したプローブ−標的複合体は、種々の公知の方法により検出すること ができる。好適な態様において、増幅プローブの繰り返し配列単位の少なくとも １つに相補的な配列を含む標識プローブは、それ自身検出可能な化学的な群で標 識される。検出可能な化学的な群は、検出可能な化学的または部分的性質を有す る任意の物質よりなる。これらの物質は、核酸ハイブリダイゼーション試験にお いて公知であり、開発されている。さらに、このような方法に有用なほとんどの 標識物は、本発明に応用できる。例えば、酵素活性を有する群、特に酵素（Clin ．Chem．(1976)22:1243；米国特許第31,006号；および英国特許第2,019,408号） 、酵素基質（米国特許第4,492,751号）、補助因子（米国特許第4,230,797号およ び4,238,565号）、および酵素インヒビター（米国特許第4,134,792号）は、有用 であることが見いだされている。また蛍光物質（Clin．Chem．(1979)25:353）、 発色物質、化学発光物質や生物発光物質のような発光物質（米国特許第4,380,58 0号）、ならびにビオチン（ヨーロッパ特許明細書第63,879号）またはハプテン （米国特許第4,380,580号）のような特異的に結合可能なリガンド、および³Ｈ、¹⁴ Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、および¹²⁵Ｉのような放射性アイソトープも有用である。従 ってこれらの標識物および標識対は、それ自身の理化学的性質（例えば、蛍光物 質、発色物質および放射性アイソトープ）、またはそれらの反応性もしくは結合 性（例えば、酵素、基質、補助因子およびインヒビター）に基づき、検出するこ とができる。良好な例は、酵素の添加により検出される補助因子標識抗体（酵素 に対して標識物は、補助因子であり基質である）である。さらに詳しくは、検出 可能な分子で標識した、リガンドに結合するハプテンもしくはタンパク質（例え ば、アビジン）に抗体を加えることにより、ハプテンもしくはリガンド標識抗体 を検出することができる。これらの検出可能な分子は、測定可能な理化学的性質 （例えば、蛍光または吸光度）または酵素反応に参加することができる性質（上 記リストを参照）を有する分子である。１つの例では、基質に作用する酵素を用 いて、測定可能な理化学的性質を有する生成物を産生することができる。この種 の具体例には、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼおよびホス ファターゼがあるが、これらに限定されない。他の類似の標識方法は、当業者に は明らかであろう。 標識プローブ中の標識物の性質と量は決定的に重要ではない。プローブはその 末端または全長に沿って、１つのもしくは複数のマーカー（任意の検出可能な物 質）で標識される。すなわち、測定を行う人が必要であればさらに操作した後に 、これらの標識物の有無を検出できるように、プローブはアイソトープでまたは 化学的に修飾される。 標識プローブのハイブリダイズする部分の長さは、本発明の応用の必要性に応 じて変化してもよい。プローブの最小の長さは、約１６ヌクレオチドであり、最 大の長さは約２５ヌクレオチドであるが、２５ヌクレオチド以上に延長すること が好ましい場合もある。具体例において、５’アミノ修飾を有する２５塩基ポリ ヌクレオチド断片が市販されている（バイオ／カン・サイエンティフィック社（ Bio/Can Scientific Co.）、ミッシサウガ（Mississauga）、オンタリオ州）。 この断片中の配列は、増幅プローブの繰り返し単位配列内の領域に相補的であっ た。アミノ修飾により、配列の３’末端に酵素アルカリ性ホスファターゼを共有 結合することが可能になった。ポリヌクレオチドへの酵素の共有結合は、公知の 方法 により行なった（バイオ／カン・サイエンティフィック社（Bio/Can Scientific Co.）。 標識プローブと増幅プローブの設計は変化させることが好ましいこともある。 例えば、増幅プローブ自身は、インビトロ転写中にビオチンで標識するか、また は別に末端標識する。標識プローブは、図１に示すように１つだけのマーカーで なく複数のマーカーで標識する。増幅プローブと標識プローブの間のハイブリダ イゼーションを妨害しないように標識する限り、これらの補助的標識により測定 法の感度は比例的に上昇する。 本発明はプローブカスケードを作成する一般的方法を記載する。一般的な態様 において、カスケードは、主プローブ、増幅プローブ、および本明細書に記載の ように化学的および機能的特徴を有する標識プローブより構成される。前記した プローブ試薬の作成において記載された正確な配列（もちろん、主プローブの標 的相補的配列を除く）は決定的に重要ではなく、ハイブリダイズされる配列の相 補性が重要である。本明細書に記載の種々のプローブの長さは、本明細書の実施 例に記載のサイズに限定されない。当業者はこれらの長さを容易に変更してもよ く、このような変更法は当該分野で公知である。測定法 本発明は、多くの種類のハイブリダイゼーション法に有用である。測定される 試料は、実質的に任意の媒体（例えば、医学的、獣医学的、栄養学的または工業 的意味のあるもの）でよい。 本発明の１つの態様は、プローブ−標的複合体を検出するための高感度な方法 、および試料中の特異的微生物の存在の測定への応用を含む。本発明において測 定法は、少なくとも以下の工程を含む： ａ）標的核酸配列に主ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程； ｂ）プローブ−標的複合体を固定化する工程； ｃ）増幅プローブがプローブ−標的複合体にハイブリダイズすることができる条 件下で、固定化したプローブ−標的複合体を増幅プローブに接触させる工程； ｄ）多くの標識されたプローブが増幅プローブにハイブリダイズすることができ る条件下で、ハイブリダイズした増幅プローブを標識されたプローブの多くのコ ピーに接触させる工程； ｅ）得られる複合体中で標識されたプローブを検出する工程。 特定の態様において、試験される試料は、典型的には食物片（例えば、肉また はチーズ）、または主に２本鎖核酸を含有する他の物質である。これには、これ らの試料に結合した微生物および／または他の細胞性物質がある。試料はまず、 細胞から核酸を放出するように処理され、次に変性工程で核酸を変性する。これ は典型的には、細胞を溶解緩衝液中で溶解し、得られる溶液を好ましくは沸騰水 で加熱するかまたはアルカリ処理（例えば、０．１Ｎ水酸化ナトリウム）により 核酸を変性する。 変性工程は、しばしば細胞を溶解するための方法として同時に使用される。核 酸の放出はまた、凍結／融解、摩砕、直接音波処理のような機械的破壊、物理的 ／化学的破壊（例えば、トリトン（登録商標）のようなポリオキシエチレンエー テル界面活性剤、ツイーン（登録商標）のようなポリオキシエチレンソルビタン 界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、アルカリ処理、浸透圧ショック、熱、ま たはプロテイナーゼＫ、リゾチーム、ペプシンのような酵素を用いる溶解）によ り行われる。得られる媒体は、１本鎖型の核酸を含有し、これは次にハイブリダ イゼーション法により測定される（ワング（Wang）ら、Appl．Environ．Microbi ol.，1992）。 試料が遊離の１本鎖核酸配列を含有する場合、試料は特異的プローブと使用す るための正しい形である。微生物（例えば、細菌）の検出のために測定を行う場 合、プローブとのハイブリダイゼーションに利用できるようにするために細胞を 溶解し、核酸を露出させなければならない。溶解の方法は既に記載されており、 当業者に公知である。 １つの一般的な態様において、５０μlの液体培養物（１mlあたり約１０⁸〜１ ０⁹細胞）に等量の２％トリトンＸ−１００（登録商標）を混合し、１．５mlの エッペンドルフマイクロフュージ管中で１００℃で５分間加熱して、細胞を溶解 する。試料を氷で冷却して、標的核酸を変性する。プローブを、８×ＳＳＣ（１ ×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、４０mM ヘペス（ｐＨ７．４）および４mMＥＤＴＡを含有する緩衝液中で２００ng/mlの 濃度で希釈する。こうして調製された１００μlのプローブを、細胞溶解液に加 えて、プローブを標的核酸に接触させ、この溶液中で７０℃で３０分間ハイブリ ダイゼーションを行う。 測定法で使用できる多くの既知のハイブリダイゼーション条件がある。典型的 にはハイブリダイゼーションは、やや高温で進行する。典型的な温度は、約３０ ℃〜７５℃の範囲であり、通常約６５℃である。ハイブリダイゼーションは、ｐ Ｈが約６〜８で適当なイオン強度の緩衝液よりなる溶液中で行われる。典型的な イオン強度は、２×ＳＳＣである（ｐＨ７で１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）。さらにハイブリダイゼーション溶液は、 ウシ血清アルブミン、フィコール（登録商標）（ショ糖とエピクロロヒドリンの 共重合体、ファルマシア・ファインケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）、 ピスカタウェイ（Piscataway）、ニューヨーク州）、ポリビニルピロリドン、お よびロム（rom）コウシ胸腺やサケ精子のような変性外来ＤＮＡを含有する。ハ イブリダイゼーションが起きるのに必要な標的核酸配列と主プローブの間の相補 性の程度は、この条件の厳密性に依存する。 主プローブは、溶液相中で変性核酸配列と接触させられる。プローブ−標的複 合体は、これを免疫捕捉することにより過剰のハイブリダイズしなかったプロー ブから除去される。これは、あらかじめモノクローナル抗プローブ−標的複合体 でコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルにハイブリダイゼーショ ン反応混合物を移すことにより行われる。抗体をこうして３７℃で３０分間ハイ ブリダイゼーション反応混合物中に存在するプローブ−標的複合体と接触させる 。この接触により、プローブ−標的複合体が免疫捕捉され、従ってマイクロタイ タープレートのウェルの表面に固定化される。こうして次にプローブ−標的複合 体に結合する試薬は、固体の表面に固定化される。免疫捕捉反応が完了後、プレ ートをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；０．１５ＭＮａＣｌを含有する５０mM リン酸緩衝液）で３回洗浄して、ハイブリダイズしなかった過剰のプローブをウ ェルから除去する。 あるいは、プローブ−標的複合体の免疫捕捉のために任意の他の固相を使用す ることもできる。ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしない過剰のプ ローブから分離するために、プローブ−標的複合体の固定化の任意の方法を使用 することができる。 １つの態様において、増幅プローブを、４×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７． ４）および２mMＥＤＴＡを含有する緩衝液中の２００ng/mlの濃度に希釈する。 こうして調製した増幅プローブ２００μlを、マイクロタイタープレートのウェル に加え、固定化したプローブ−標的複合体（これはプローブの３’末端にポリ（ ｄＡ）１２−２０を有する）に増幅プローブを接触させる。プレートを４２℃で ３０分間インキュベートして、プローブのポリ（ｄΛ）と増幅プローブのポリ（ Ｕ）の間のハイブリダイゼーションが完了する。このポリ（ｄＡ）−ポリ（Ｕ） はまた、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり、熱力学的には２本鎖の核酸の最も 安定な型である。ハイブリダイゼーション期間の最後に、プレートを０．５Ｍ塩 化ナトリウム溶液で３回洗浄する。 標識プローブを、４×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴ Ａを含有する緩衝液中２００ng/mlに希釈する。 上記標識プローブ２００μlをマイクロタイタープレートに加えて、標識プロー ブを、固体表面に固定化された増幅プローブに接触させる。このハイブリダイゼ ーションは４２℃で３０分間い、次に０．５Ｍの塩化ナトリウムで３回洗浄する 。 標識プローブは増幅プローブの繰り返し単位とハイブリダイズする。標識プロ ーブは１本鎖ポリヌクレオチドであるため、ハイブリダイゼーション反応の速度 はきわめて速い。 増幅プローブが２０個の繰り返し単位を有する場合、元々免疫捕捉されたプロ ーブ−標的複合体１個について２０個の標識プローブ分子が固定化される。プロ ーブ−標的複合体により生成したシグナルは、２０倍増幅される。標識プローブ 中に存在する酵素は、次に本明細書に記載のかつ当該分野で公知の標準的比色法 、化学発光法、蛍光法または他の検出方法を用いる検出される。 比色法を用いる１つの例において、アルカリ性ホスファターゼ酵素に対する基 質を含有する溶液をウェルに加える。例えば、２００μlのｐ−ニトリルフェニ ルリン酸（ｐ−ＮＰＰ；１０％ジエタノールアミンおよび０．５mM塩化マグネシ ウム中４mg、ｐＨ９．８）を加える。室温（２０〜２５℃）で１５分間インキュ ベート後、発色した色を４１０nmの波長の光で測定する。試薬系 本発明の別の態様は、このキットは、１つまたはそれ以上の溶液、および食物 試料（例えば、チーズまたは肉）中のリステリア・モノシトゲネス（Listeria m onocytogenes）や大腸菌（Escherichia coli）のような食物病原菌の検出のため の測定を行うための装置を含む、診断用キットに関する。 本発明はさらに、試薬系を提供する。さらに詳しくは、本発明は、目的の測定 法を実施するために必要なすべての必須の成分を含む試薬の組合せを提供する。 この試薬系は、組成物または混合物として市販のパッケージされた型で提供され 、ここで試薬の融和性により、必要な試薬、および通常は測定法を説明する取り 扱い説明書を含む、１つまたはそれ以上の容器、装置などのパッケージされた組 合せである検査装置構成（最も典型的には検査キットとして）を可能にする。本 発明の試薬系は、本発明に記載の種々のハイブリダイゼーションを行うための可 能な構成や組成を含む。 この試薬系は一般的に、細菌溶解液、標的に対する主プローブ、増幅プローブ 、標識プローブ（好ましくは検出可能な化学的な群で標識される）、酵素基質を 含有する溶液、抗標的−プローブ複合体抗体でコーティングされたマイクロタイ タープレートまたはストリップ、および当業者に理解できる測定法の説明書を含 む。この試薬系の検査キットは、さらに付属の化学物質を含有してもよい。この ような付属の化学物質には、ハイブリダイゼーション溶液の成分、および試料中 の２本鎖核酸を１本鎖型に変換することができる変性剤がある。さらに好ましく は、１本鎖核酸をそこから放出させるために試料を処理するための化学的溶解お よび変性剤（例えば、アルカリ）が含まれる。 本発明を以下の実施例により例示するが、本発明は決してこれらに限定されな い。実施例１：ヒト血中のサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）の測定 被験患者から０．０５mlの血液を採取し、１０mlのグラム陰性菌ブロス（brot h）（ディフコ（Difco））に接種し、３７℃で１６〜２０時間インキュベートし た。増殖したブロス１００μl中の細菌を、マイクロフュージ試験管中の等量の ２％トリトンＸ−１００でブロスを１００℃で５分間沸騰させて溶解する。溶液 を急速に氷で冷却した。８×ＳＳＣ、４０mMヘペス（ｐＨ７．４）および４mMＥ ＤＴＡ中のプローブ溶液（１００μl；２００ng/ml）を、溶解物に加えて、３７ ℃で３０分間インキュベートした。ここで選択されたプローブは本質的にＲＮＡ であり、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）のＶｉ抗原遺伝子に特異的 にハイブリダイズした。 上記ハイブリダイゼーション反応混合物（２００μl）を、あらかじめモノク ローナル抗プローブ−標的複合体抗体でコーティングしたマイクロタイタープレ ートのウェルに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次にプレートをＰ ＢＳで３回洗浄した。 ４×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴＡ中の増幅プロー ブ溶液（２００μl；２００ng/μl）をウェルに加え、３７℃で３０分間インキ ュベートして、標的核酸を検出した。次にプレートを０．５Ｍ塩化ナトリウム溶 液で３回洗浄した。４×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴ Ａ中の標識プローブ溶液（２００μl；２００ng/μl）をウェルに加え、３７℃ で３０分間インキュベートした。次にプレートを０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で ３回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ基質溶液（１０％ジエタノールアミン および０．５mM塩化マグネシウム中４mgのｐ−ＮＰＰ、ｐＨ９．８）をウェルに 加え、室温で１５〜３０分間インキュベート後、発色した色を標準的マイクロタ イタープレートリーダーで４１０nmの波長の光で測定する。 陽性対照および陰性対照を利用して、サルモネラ・ティフィ（S．typhi）を含 有する試料および含有しない試料の間で統計的に明確な比色値を選択した。この 「カットオフ値」を用いて、元々の試料の病原体の有無について生成した色を解 釈した。実施例２：チーズ中のリステリア・モノシトゲネス（L．monocytogenes）の検出 のための測定法 試験チーズ２５ｇを２５０mlの１％無菌ペプトン水でストマチャー（stomache r）中で２分間ホモジナイズし、約１５分間沈降させた。このホモジネートの清 澄な上層部分の試料０．５mlを、トリプトケース大豆−０．６％酵母エキスブロ ス１０ml中に接種し、３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。 増殖したブロス１００μl中の細菌を、マイクロフュージ試験管中の等量の２％ トリトンＸ−１００でブロスを１００℃で５分間沸騰させて溶解した。溶液を急 速に氷で冷却した。 ８×ＳＳＣ、４０mMヘペス（ｐＨ７．４）および４mMＥＤＴＡ中のプローブ溶 液（１００μl；２００ng/ml）を、溶解物に加えて、３７℃で３０分間インキュ ベートした。ここで選択されたプローブは本質的にＤＮＡであり、リステリア・ モノシトゲネス（L．monocytogenes）のリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に特異的 にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション反応混合物（２００μl）を、 あらかじめモノクローナル抗プローブ−標的抗体でコーティングしたマイクロタ イタープレートのウェルに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次にプ レートをＰＢＳで３回洗浄した。 ４×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴＡ中の増幅プロー ブ溶液（２００μl；２００ng/μl）をウェルに加え、３７℃で３０分間インキ ュベートした。次にプレートを０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回洗浄した。４ ×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴＡ中の標識プローブ溶 液（２００μl；２００ng/μl）をウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベ ートした。プレートを０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回洗浄した。アルカリ性 ホスファターゼ基質溶液（１０％ジエタノールアミンおよび０．５mM塩化マグネ シウム中４mgのｐ−ＮＰＰ、ｐＨ９．８）をウェルに加え、室温で１５〜３０分 間インキュベート後、発色した色を標準的マイクロタイタープレートリーダーで ４１０nmの波長の光で測定した。 陽性対照および陰性対照を利用して、リステリア・モノシトゲネス（L．monoc ytogenes）を含有する試料および含有しない試料の間で統計的に明確な比色値を 選択した。この「カットオフ値」を用いて、元々の試料の病原体の有無について 生成した色を解釈した。 リステリア・モノシトゲネス（L．monocytogenes）の存在を検出するために行 なった測定の結果を以下に示す。測定＃１は、７８４塩基対の長さのビオチン化 プローブで行い、ハイブリダイズしたプローブをストレプトアビジン−アルカリ 性ホスファターゼ結合体系で検出した。測定＃２は、本明細書に記載の方法に従 って行なった。 実施例３：肉中の大腸菌（E．coli）０１５７：Ｈ７の検出のための測定法 試験肉２５ｇを２５０mlの１％無菌ペプトン水でストマチャー(stomacher)中 で２分間ホモジナイズし、約１５分間沈降させた。このホモジネートの清澄な上 層部分の試料０．５mlを、グラム陰性菌ブロス（ディフコ(Difco)）１０ml中に 接種し、３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。増殖したブロス１００μ l中の細菌を、マイクロフュージ試験管中の等量の２％トリトンＸ−１００でブ ロスを１００℃で５分間沸騰させて溶解した。溶液を急速に氷で冷却した。 ８×ＳＳＣ、４０mMヘペス（ｐＨ７．４）および４mMＥＤＴＡ中のプローブ溶 液（１００μl；２００ng/ml）を、溶解物に加えて、３７℃で３０分間インキュ ベートした。ここで選択されたプローブは本質的にＲＮＡであり、大腸菌（E．c oli）０１５７：Ｈ７のＳＫＴ−１毒素遺伝子に特異的にハイブリダイズした。 上記ハイブリダイゼーション反応混合物（２００μl）を、あらかじめモノク ローナル抗プローブ−標的抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートの ウェルに移し、３７℃で３０分間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳで ３回洗浄した。 ４×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴＡ中の増幅プロー ブ溶液（２００μl；２００ng/μl）をウェルに加え、３７℃で３０分間インキ ュベートした。次にプレートを０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回洗浄した。４ ×ＳＳＣ、２０mMヘペス（ｐＨ７．４）および２mMＥＤＴΛ中の標識プローブ溶 液（２００μl；２００ng/μl）をウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベ ートした。プレートを０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回洗浄した。 アルカリ性ホスファターゼ基質溶液（１０％ジエタノールアミンおよび０．５ mM塩化マグネシウム中４mgのｐ−ＮＰＰ、ｐＨ９．８）をウェルに加え、室温で １５〜３０分間インキュベート後、発色した色を標準的マイクロタイタープレー トリーダーで４１０nmの波長の光で測定する。 陽性対照および陰性対照を利用して、大腸菌（E．coli）０１５７：Ｈ７を含 有する試料および含有しない試料の間で統計的に明確な比色値を選択した。この 「カットオフ値」を用いて、元々の試料の病原体の有無について生成した色を解 釈した。 大腸菌（E．coli）の存在を検出するために行なった測定の結果を以下に示す 。測定は、あらかじめガンマ線照射で滅菌した２５ｇの肉に接種した既知量の大 腸菌で行なった。測定は、本明細書に記載の方法に従って行なった。 上記の実施例は、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきであ る。本発明の精神を逸脱することなく、本発明の多くの変更が可能であることは 、当業者には明らかであろう。請求の範囲のみが本発明の範囲を限定する。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９６年３月５日 【補正内容】 請求の範囲 １．第一および第二の二つの核酸配列領域を含む増幅プローブであって、前記 第一の領域はホモポリマーヌクレオチドテールを含み、前記第二の領域は複数の 別々に標識し得る配列単位（該単位の数は２〜１５）を含む増幅プローブ。 ２．ヌクレオチド分子の数が１０〜６０の範囲である、請求項１に記載の増幅 プローブ。 ３．別々に標識可能な配列単位は、標識プローブ上の相補的な配列にハイブリ ダイズ可能なヌクレオチド塩基の配列を含み、標識プローブは検出可能な化学的 標識物に共有結合している請求項１に記載の増幅プローブ。 ４．各配列単位の長さは１６〜１００ヌクレオチドである、請求の範囲第３項 に記載の増幅プローブ。 ５．核酸ハイブリダイゼーション試験においてプローブ−標的複合体の検出可 能な標識を増強する方法であって、選択された核酸標的と選択された一次プロー ブとの複合体を、前記選択された核酸標的の検出可能な標識を増強させるために 適用される増幅プローブとハイブリダイズさせることを具備し、該増幅プローブ は核酸配列の少なくとも２つの領域を有しており、その第１の領域は、選択され た前記一次プローブ（これは前記選択された核酸標的の配列に対して相補的な配 列も含む）上の配列に対して相補的な配列を含むと共に、その第２の領域は、複 数の別々に標識可能な配列単位を含む方法。 ６．別々に標識可能な各配列単位は、標識プローブ上の相補的な配列にハイブ リダイズ可能なヌクレオチド塩基の配列を含み、標識プローブは検出可能な化学 的標識物に共有結合している、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．検出可能な化学的標識物は、酵素活性を有する群、蛍光物質、発色物質、 発光物質、特異的に結合可能なリガンド、または放射性アイソトープから選択さ れる、請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．別々に標識可能な配列単位に結合した標識物は、標識検出系の試薬メンバ ーと相互作用して検出可能な応答を与える、請求の範囲第５項に記載の方法。 ９．検出可能な化学的標識物は、標識物が相互作用して検出可能な応答を与え る標識検出系のメンバーであって、酵素の基質、補助因子、またはインヒビター である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．標識物は、酵素の作用を受けて発色、蛍光または発光シグナルを発生す る、請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．標識物は酵素の補欠分子族であり、そのアポ酵素は、標識物が相互作用 して触媒活性のあるホロ酵素を産生する標識検出系のメンバーである、請求の範 囲第９項に記載の方法。 １２．補欠分子族はフラビン・アデニンジヌクレオチドであり、アポ酵素はア ポ（グルコースオキシダーゼ）である、請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．特異的核酸配列の検出方法であって、 ａ）選択可能な標的核酸配列に主ポリヌクレオチドプローブの第１の配列 をハイブリダイズさせる工程（ここで、主プローブは、検出可能な標識を増強で きるようにさせた核酸配列よりなる増幅プローブに結合する手段を有し、増幅プ ローブは、化学的標識物に結合した核酸配列よりなる少なくとも１つの標識プロ ーブにハイブリダイズすることができる）と； ｂ）標的−プローブ複合体を固定化する工程と； ｃ）増幅プローブが標的−プローブ複合体にハイブリダイズすることがで きる条件下で、固定化した標的−プローブ複合体を増幅プローブに接触させる工 程（ここで、増幅プローブは、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を 含み、選択された核酸標的の配列に相補的な配列も含む第１の領域と、複数の別 々に標識可能な配列単位を含む第２の領域の、少なくとも２つの領域よりなる） と； ｄ）多くの標識プローブが増幅プローブにハイブリダイズすることができ る条件下で、ハイブリダイズした増幅プローブを検出可能な化学的標識物に共有 結合した標識プローブ（このプローブは、増幅プローブ上の配列に相補的な配列 を含む）に接触させる工程と； ｅ）標的配列の有無を示す試料とともに、標識プローブに共有結合した検 出可能な化学的標識物の有無を観察する工程とを含む方法。 １４．プローブ−標的複合体を固定化する手段は、選択可能な標的配列と相補 的な主プローブ配列の間に形成される、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、また はＲＮＡ／ＲＮＡ２本鎖に結合できる抗体試薬が関与する、請求の範囲第１３項 に記載の方法。 １５．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、抗体試薬は、 （i）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ここで、検出されるプローブと配列 の１つはＤＮＡであり、他はＲＮＡである）への結合について選択的であり； （ii）ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ここで、検出されるプローブと配列 の１つはいずれもＲＮＡである）への結合について選択的であり； （iii）挿入複合体（ここで、測定中で生成する２本鎖は、挿入複合体の 形でそこに結合した核酸を含む）への結合について選択的である方法。 １６．検出可能な化学的標識物は、酵素活性を有する群、蛍光物質、発色物質 、発光物質、特異的に結合可能なリガンド、または放射性アイソトープから選択 される、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １７．別々に標識可能な配列単位に結合した標識物は、標識検出系の試薬メン バーと相互作用して検出可能な応答を与える、請求の範囲第１３項に記載の方法 。 １８．標識物は、標識物が相互作用して検出可能な応答を与える標識検出系の メンバーであって、酵素の基質、補助因子、またはインヒビターである、請求の 範囲第１７項に記載の方法。 １９．標識物は、酵素の作用を受けて発色、蛍光または発光シグナルを産生す る、請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０．標識物は酵素の補欠分子族であり、そのアポ酵素は、標識物が相互作用 して触媒活性のあるホロ酵素を産生する標識検出系のメンバーである、請求の範 囲第１８項に記載の方法。 ２１．補欠分子族はフラビン・アデニンジ・ヌクレオチドであり、アポ酵素は アポ（グルコースオキシダーゼ）である、請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２．その中に存在する核酸を放出かつ変性する条件下に置いた、生物学的試 料を含む、試験媒体中の特定の核酸配列の検出に応用される、請求の範囲第１３ 項に記載の方法。 ２３．生物学的試料は食物物質を含有し、標的核酸配列は細菌性微生物のもの である、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２４．生物学的試料は食物物質を含有し、標的核酸配列はウイルスのものであ る、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２５．試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するための試薬であって、 （i）検出される配列に実質的に相補的な少なくとも１つの１本鎖塩基配 列を含む主核酸プローブと； （ii）試料中の検出される特定のポリヌクレオチド配列の任意のものと主 プローブの間のハイブリッドに結合することができるが、１本鎖核酸に実質的に 結合することができない抗体試薬と； （iii）選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた増 幅プローブ（このプローブは、核酸配列の少なくとも２つの領域を含み、第１の 領域は、選択された核酸標的の配列に相補的な配列を含み、第２の領域は、複数 の別々に標識可能な配列単位を含む）と； （iv）増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含有する、検出可能な化学 的標識物に共有結合した標識プローブとを含む試薬。 ２６．試料中の２本鎖核酸を１本鎖型に変換することができる、請求の範囲第 ２５項に記載の試薬系。 ２７．試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するための診断用キットで あって、 （i）検出される配列に実質的に相補的な少なくとも１つの１本鎖塩基配 列を含む主核酸プローブと； （ii）試料中の検出される特定のポリヌクレオチド配列の任意のものと主 プローブの間のハイブリッドに結合することができるが、１本鎖核酸に実質的に 結合することができない抗体試薬と； （iii）選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた増 幅プローブ（このプローブは、核酸配列の少なくとも２つの領域を含み、第１の 領 域は、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、また選択された核 酸標的の配列に相補的な配列も含み、第２の領域は、複数の別々に標識可能な配 列単位を含む）と； （iv）増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含有する、検出可能な化学 的標識物に共有結合した標識プローブとを含むキット。 ２８．試料中の２本鎖核酸を１本鎖型に変換することができる変性剤をさらに 含む、請求の範囲第２７項に記載の診断用キット。 ２９．請求の範囲第２７項に記載の診断用キットを含む、試料中の大腸菌（Es cherichia coli）の検出のための診断用キット。 ３０．請求の範囲第２７項に記載の診断用キットを含む、試料中のサルモネラ ・ティフィ（Salmonella typhi）の検出のための診断用キット。 ３１．請求の範囲第２７項に記載の診断用キットを含む、試料中のリステリア ・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）の検出のための診断用キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オー、 エン・ジョム カナダ国、ケー２エム・２エル８、オンタ リオ、カナタ、ファーンブルック・プレイ ス 22 (72)発明者 スミス、 デイビッド・アイ カナダ国、ケー０エー・２ゼット０、オン タリオ、リッチモンド、ルールワース・コ ート ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた増幅プロー ブであって、核酸配列の少なくとも２つの領域（第１の領域は、選択された主プ ローブ上の配列に相補的な配列も含み、また選択された核酸標的の配列に相補的 な配列を含み、第２の領域は、複数の別々に標識可能な配列単位を含む）を含む 、上記増幅プローブ。 ２．別々に標識可能な配列単位の数は２〜５０の範囲である、請求の範囲第１ 項に記載の増幅プローブ。 ３．別々に標識可能な配列単位は、標識プローブ上の相補的な配列にハイブリ ダイズ可能なヌクレオチド塩基の配列を含み、標識プローブは検出可能な化学的 標識物に共有結合している、請求の範囲第１項に記載の増幅プローブ。 ４．各配列単位の長さは１６〜１００ヌクレオチドである、請求の範囲第３項 に記載の増幅プローブ。 ５．核酸ハイブリダイゼーション試験においてプローブ−標的複合体の検出可 能な標識の増強方法であって、核酸配列の少なくとも２つの領域(第１の領域は 、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、また選択された核酸標 的の配列に相補的な配列も含み、第２の領域は、複数の別々に標識可能な配列単 位を含む)を含む、選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせ た増幅プローブを取り込んでなる、上記方法。 ６．別々に標識可能な各配列単位は、標識プローブ上の相補的な配列にハイブ リダイズ可能なヌクレオチド塩基の配列を含み、標識プローブは検出可能な化学 的標識物に共有結合している、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．検出可能な化学的標識物は、酵素活性を有する群、蛍光物質、発色物質、 発光物質、特異的に結合可能なリガンド、または放射性アイソトープから選択さ れる、請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．別々に標識可能な配列単位に結合した標識物は、標識検出系の試薬メンバ ーと相互作用して検出可能な応答を与える、請求の範囲第５項に記載の方法。 ９．検出可能な化学的標識物は、標識物が相互作用して検出可能な応答を与え る標識検出系のメンバーであって、酵素の基質、補助因子、またはインヒビター である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．標識物は、酵素の作用を受けて発色、蛍光または発光シグナルを産生す る、請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．標識物は酵素の補欠分子族であり、そのアポ酵素は、標識物が相互作用 して触媒活性のあるホロ酵素を産生する標識検出系のメンバーである、請求の範 囲第９項に記載の方法。 １２．補欠分子族はＰＡＤであり、アポ酵素はアポ（グルコースオキシダーゼ ）である、請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．特異的核酸配列の検出方法であって、 ａ）選択可能な標的核酸配列に主ポリヌクレオチドプローブの第１の配列をハイ ブリダイズさせる工程（ここで、主プローブは、検出可能な標識を増強できるよ うにさせた核酸配列よりなる増幅プローブに結合する手段を有し、増幅プローブ は、化学的標識物に結合した核酸配列よりなる少なくとも１つの標識プローブに ハイブリダイズすることができる）； ｂ）標的−プローブ複合体を固定化する工程； ｃ）増幅プローブが標的−プローブ複合体にハイブリダイズすることができる条 件下で、固定化した標的−プローブ複合体を増幅プローブに接触させる工程（こ こで、増幅プローブは、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、 選択された核酸標的の配列に相補的な配列も含む第１の領域と、複数の別々に標 識可能な配列単位を含む第２の領域の、少なくとも２つの領域よりなる） ｄ）多くの標識プローブが増幅プローブにハイブリダイズすることができる条件 下で、ハイブリダイズした増幅プローブを検出可能な化学的標識物に共有結合し た標識プローブ（このプローブは、増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含む ）に接触させる工程； ｅ）標的配列の有無を示す試料とともに、標識プローブに共有結合した検出可能 な化学的標識物の有無を観察する工程、を含む上記工程。 １４．プローブ−標的複合体を固定化する手段は、選択可能な標的配列と相補 的な主プローブ配列の間に形成される、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、また はＲＮＡ／ＲＮＡ２本鎖に結合できる抗体試薬が関与する、請求の範囲第１３項 に記載の方法。 １５．請求の範囲第１４項に記載の方法であって、抗体試薬は、 （ｉ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ここで、検出されるプローブと配列の１つ はＤＮＡであり、他はＲＮＡである）への結合について選択的であり； （ii）ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ここで、検出されるプローブと配列の１つ はいずれもＲＮＡである）への結合について選択的であり； （iii）挿入複合体（ここで、測定中で生成する２本鎖は、挿入複合体の形でそ こに結合した核酸を含む）への結合について選択的である、上記方法。 １６．検出可能な化学的標識物は、酵素活性を有する群、蛍光物質、発色物質 、発光物質、特異的に結合可能なリガンド、または放射性アイソトープから選択 される、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １７．別々に標識可能な配列単位に結合した標識物は、標識検出系の試薬メン バーと相互作用して検出可能な応答を与える、請求の範囲第１３項に記載の方法 。 １８．標識物は、標識物が相互作用して検出可能な応答を与える標識検出系の メンバーであって、酵素の基質、補助因子、またはインヒビターである、請求の 範囲第１７項に記載の方法。 １９．標識物は、酵素の作用を受けて発色、蛍光または発光シグナルを産生す る、請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０．標識物は酵素の補欠分子族であり、そのアポ酵素は、標識物が相互作用 して触媒活性のあるホロ酵素を産生する標識検出系のメンバーである、請求の範 囲第１８項に記載の方法。 ２１．補欠分子族はＦＡＤであり、アポ酵素はアポ（グルコースオキシダーゼ ）である、請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２．その中に存在する核酸を放出かつ変性する条件下に置いた、生物学的試 料を含む、試験媒体中の特定の核酸配列の検出に応用される、請求の範囲第１３ 項に記載の方法。 ２３．生物学的試料は食物物質を含有し、標的核酸配列は細菌性微生物のもの である、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２４．生物学的試料は食物物質を含有し、標的核酸配列はウイルスのものであ る、請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２５．試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するための試薬であって、 （ｉ）検出される配列に実質的に相補的な少なくとも１つの１本鎖塩基配列を含 む主核酸プローブ； （ii）試料中の検出される特定のポリヌクレオチド配列の任意のものと主プロー ブの間のハイブリッドに結合することができるが、１本鎖核酸に実質的に結合す ることができない抗体試薬； （iii）選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた増幅プロ ーブ（このプローブは、核酸配列の少なくとも２つの領域を含み、第１の領域は 、選択された核酸標的の配列に相補的な配列を含み、第２の領域は、複数の別々 に標識可能な配列単位を含む）； （iv）増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含有する、検出可能な化学的標識 物に共有結合した標識プローブ、を含む上記試薬。 ２６．試料中の２本鎖核酸を１本鎖型に変換することができる、請求の範囲第 ２５項に記載の試薬系。 ２７．試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するための診断用キットで あって、 （ｉ）検出される配列に実質的に相補的な少なくとも１つの１本鎖塩基配列を含 む主核酸プローブ； （ii）試料中の検出される特定のポリヌクレオチド配列の任意のものと主プロー ブの間のハイブリッドに結合することができるが、１本鎖核酸に実質的に結合す ることができない抗体試薬； （iii）選択された核酸標的の検出可能な標識を増強するようにさせた増幅プロ ーブ（このプローブは、核酸配列の少なくとも２つの領域を含み、第１の領域は 、選択された主プローブ上の配列に相補的な配列を含み、また選択された核酸標 的 の配列に相補的な配列も含み、第２の領域は、複数の別々に標識可能な配列単位 を含む）； （iv）増幅プローブ上の配列に相補的な配列を含有する、検出可能な化学的標識 物に共有結合した標識プローブ、を含む上記キット。 ２８．試料中の２本鎖核酸を１本鎖型に変換することができる変性剤をさらに 含む、請求の範囲第２７項に記載の診断用キット。 ２９．請求の範囲第２７項に記載の診断用キットを含む、試料中の大腸菌（Es cherichia coli）の検出のための診断用キット。 ３０．請求の範囲第２７項に記載の診断用キットを含む、試料中のサルモネラ ・ティフィ（Salmonella typhi）の検出のための診断用キット。 ３１．請求の範囲第２７項に記載の診断用キットを含む、試料中のリステリア ・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）の検出のための診断用キット。