JPH05502671A - タンパク質を親水性の表面に共有結合する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質を親水性の表面に共有結合する方法固体表面へのタンパク質の固定化 は、固相診断法、バイオセンサによる分析、アフィニティクロマトグラフイ、体 外治療および生物有機化学合成などの多数の応用における確立された技術である 。これらすへての場合において、糖タンパク質またはりボタンバク質のような、 純タンパク質または接合体であり得るタンパク質か、固体表面に結合され、そこ で、タンパク質の生物活性か特定の目的のために利用される。

固相診断法では、抗体は、通常ポリスチレンて構成されているプラスチックの表 面にしばしば固定化される。体液と接触すると、固定化された抗体は、存在して いるかもしれない抗原に結合する。次いて、抗体・抗原の複合体は標識抗体によ って検出される。標識化は、放射性同位体、蛍光基または酵素接合体の形態であ ってもよい。

体外治療では、生物的活性物質か、患者の血液かそれを介して伝えられるチャン バに結合される。体外治療の現在の例は、固定化された免疫活性化物質での血液 潅流である。

インターフェロンおよびインターロイキンはこのような物質の例である。この技 術によって治療され得る病気の例は癌およびＡＩＤＳである。

生物有機化学合成では、有機化合物を生成するための酵素か用いられる。生物有 機化学合成への適切な使用は、脂質変換、すなわち、通常トリグリセリドである 脂質を他のものに変換することである。はとんどの酵素は高価であり、プロセス の節約を確実にするのにしばしば再利用される必要がある。これに鑑みて、固定 化された酵素を使用することはほとんどの大規模酵素プロセスに重要である。

上記のように、有機表面および無機表面の両表面へのタンパク質の固定化は、現 在、定着した技術であり（エリスホーウッド社（Ｅｌｌｉｓ　Ｈｏｒｗｏｏｄ　 Ｌｉｍ１ｔｅｄ）の酵素生物工学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅ ｎｚｙｍｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第２版１９８５年のｒ酵素の固定化 の原理ｒ　（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆｒｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｅｎｚｙｍｅｓ）の第４章を参照せよ）、かつ適切な生物活性を維持しなから 、多量のタンノくり質を表面に結合することか可能である。

しかし、はとんとの固体表面は自発的にタンパク質および他の生体分子を吸着す るように構成されていることか見出された。水溶液での吸着は、静電誘引および 疎水的相互作用の２つの型の物理的力によって主に促進される。はとんどの表面 は、通常のｐＨて、負に帯電されるか、しかし通常疎水的領域もまた含んでいる 。タンパク質は通常、正負の疎水的領域の両方を有しており、それは、タンｌく り質か、一方では正の領域と表面内の負に帯電された基との間の静電誘引によっ て、他方、タンパク質の疎水的領域と表面との間の疎水的相互作用によって、は とんとの表面に誘引されることを意味している。これは、たとえば、Ｊ、　Ｄア ントレイト（Ａｎｄｒａｄｅ’）によるｒ生物医学ポリマーの表面および界面の 局面Ｊ　（Ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕ ｍ　Ｐｒｅｓｓ）１９８５年第２巻、第８１頁に記載されている。

この非特定的な吸着は、上記の応用では不所望の現象である。固相診断法ては、 感度か劣化しかつ診断キ・ソトの寿命か短くなる。体外治療および生物有機化学 合成の両方において、自発的吸着により活性が劣化しかつキ・ノドの寿命か短く なる。

タンパク質の吸着および固体表面上の他の生体分子を大きく減少させる１つの方 法は、帯電していない親水性ポリマーの層を表面に設けることである。この目的 のために使用されたポリマーの一例はポリエチレングリコール（Ｃ。

−Ｇ、ゲランゾール（ＧＯｌａｎｄｅｒ）によるｒ官能基化されｔこポリマー表 面の調製法およびその性質Ｊ　（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄＰｒｏｐｅｒ ｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｕｒｆａ ｃｅｓ）と題された論文、王立技術研究所、スト・ツクホルム１９８６年を参照 せよ）であるか、たとえば、デキストラン、セノしロースエーテルおよびデンプ ンである多糖類、ポリビニルアルコール、および中性シリカゾルのような他の物 質もまたこの目的のために使用された。

表面を帯電されていない親水性ポリマーの層で被覆することによって、静電誘引 および疎水的相互作用の両方か避けられ得る。この態様で、タンパク質の自発的 吸着か減少されることかでき、かつ時にはほとんど完全に解消されることかでき る。

この型の親水化された表面は、とりわけ、上記の固定化されたタンパク質の応用 に非常に重要である。タンパク質をこのような表面に共存結合させるために、タ ンパク質のための固定点として作用する反応性官能基を親水性層に導入する必要 かある。しかし、たとえ表面か高濃度の反応基を含んでいるとしても、完全に親 水化された表面にタンパク質を共有結合することは極めて困難であることか判明 した。親水性表面はタンパク質を誘引しない。これに反して、このような表面に 接近することは水溶液中のタンパク質にとってはエネルギー的に好ましくないた め、この表面は忌避体として作用する。その結果、それか固相診断のための抗体 であるか、体外治療のための免疫活性化物質であるか、または生物有機化学合成 のための酵素であるかとうかにかかわらず、固定化されたタンパク質の量は通常 低量であるであろう。

ここで本発明は、大量のタンパク質か親水性表面に固定化され得ることを示す。

タンパク質か固定化された親水性表面の、不所望の生成物の自発的吸着は低い。

本発明によれば、これは、担体上で従来の態様で固定化され、かつタンパク質反 応基を有し、最終生成物か使用されるへきである温度よりも少なくとも５°Ｃ高 い曇点を有する非イオン性ポリマーて構成された親水性表面に、タンパク質を結 合することによって達成され、また、水性の反応媒質内で非イオン性ポリマーの 反応基に、この反応媒質内のポリマーの曇点よりも５°Ｃ以上低い温度で、公知 の態様で、タンパク質を共用結合させることによって達成される。本発明の基本 的原理は、ある非イオン性水溶性ポリマーによって示された通常でない温度依存 性を利用することである。こうして、ポリアルキレンゲリコールおよび非イオン 性セルロースエーテルは、昇温された温度て水溶性か減少することを表わしてい る。この温度依存性の背後にあるメカニズムは、未だ完全に説明されてはいない が、エチレンオキシド基の配座は温度が上ることと関連して変化され、それによ ってエチレンオキシド基かますます疎水性になり、したかって、水により溶けな くなると推定される。所与の温度で、ポリマーの水溶性は非常に低いためその溶 液は相分離する。この温度は通常溶液の曇点と称される。ポリアルキレングリコ ールとセルロースエーテルは共に規定された曇点を存するように生成されること かでき、かつ特に役立つのは、曇点か１０℃ないし１００″Ｃ（７）範囲、好ま しくは３０℃ないし５０°Ｃの範囲にあるポリマーである。非イオン性親水性ポ リマーは、タンパク質が被覆された表面か用いられる温度で親水性になるであろ う。曇点か、被覆された表面か使用される温度よりも少なくとも５°Ｃ１好まし くは少なくともＩＯ’Ｃ高いように選択される。好ましいタンパク質の固定化温 度は、反応媒質内の非イオン性親水性ポリマーの凝集温度より低い３°Ｃから５ ０°Ｃである。

適切なポリアルキレングリコールの例は、３〜４の炭素原子を存するエチレンオ キシドおよびアルキレンオキシドまたはテトラヒドロフランかランダムに分布さ れるかまたはブロックで分布される例である。特に適切なのは、２゜００ないし １００００の分子量を有し、かっ３００ないし３０００の分子量を有する１つま たはそれ以上のブロックのポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンを含 むポリアルキレングリコールである。他の型の適切なポリアルキレングリコール は、高級アルキレンオキシド、または、グリセロールまたはペンタエリトリトー ルのような、ジヒドロキソもしくはポリヒドロキシ化合物を有するテトラヒドロ フランと結合したエチレンオキシドの付加物である。

セルロースエーテルは好ましくは、その１％の水溶液が、ブルックフィールド（ Ｂｒｏｏｋｆ　１ｅｌｄ）、ＬＶ、１２ｒｐｍ、２０℃に従って測定された、１ ０〜＋００００ｃＰ、好ましくは３０〜５０００ｃＰの粘性を存する重合度を有 している。それらは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンシル、および８ 〜２４の炭素原子を有する高級炭化水素基なとのような疎水性炭化水素基、また はヒドロ牛ジエチル、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシブチルなとのような 極性ヒドロキシル基、または炭化水素基と極性基との混合物を含んでもよい。適 切なセルロースエーテルの例は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロ キノエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルヒドロキンエチ ルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、エチルヒドロキシエチル セルロースおよびヘンシルエチルヒドロキシエチルセルロースである。アルキル ヒドロキソアルキルセルロースは好ましいセルロースエーテルである。

親水性ポリマーを担体に共存結合するために、かつタンパク質を親水性ポリマー に共存結合するために、反応性官能基が固定点としての役割を果たすために従来 の態様で導入される。担体に結合され得る反応基の例は、親水性非イオン性ポリ マーまたはその活性化された形態か反応することかできるアミノ、カルホキツル またはヒドロキシル基である。親水性ポリマーは好ましくは、担体Ｅて反応基と 反応することかてき、かつそのアミノ、チオールおよび／またはフェノールヒド ロキシル基の１つまたはそれ以上の基によって通常結合されるタンパク質と反応 することができる、エポキシ、トリジレート、カルボニル、イミダゾールおよび アシルアジド基のような反応基を含む。この固定化技術は、とりわけ、上記引例 、Ｊ、　Ｄ　アントルイドによる「生物医学ポリマーの表面および界面の局面１ ブレナムプレス１９８５年第２巻、第８１頁、およびＣ，Ｇ、ゲランゾールによ る「官能基化されたポリマー表面の調製法およびその性質１と題された論文、王 立技術研究所、スト・ツクホルム１９８６年に詳細に記載されており、これらの 引例はここて本発明の説明の一部として含まれている。タンパク質か糖タンパク 質である場合、たとえば、過ヨウ素酸ナトリウムとの酸化による炭水化物部分に 発生されたアルデヒド基との結合か生じるがもじれない。物理的吸着によって従 来の態様で親水性ポリマーを固体ポリマー表面に固定することも可能である。

本発明は以下の実施例によってさらに説明される。

実施例Ｉ カルボキシル基か、２Ｘ２ｃｍの寸法を有するポリスチレンプレート上に、表面 上のアクリル酸のプラズマ重合によって堆積された。次いで、カルボキシル官能 表面が、ｐＨ４，５〜５．０で水溶性カルボジイミド（ｏ、６％）が存在した状 態で、水の中の１０％のジアミノプロパン溶液で処理された。そのプレートは蒸 留水で水洗され、かつ２０００の分子量を有しかつｐＨ９，５で４０’Ｃの曇点 を有する、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロック共重合体のジ ェポキシドの１０％の溶液で、１５時間２０℃で処理された。

０．５ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含むｐＨ９，５の１０％炭酸 塩緩衝剤か、４０’Ｃまて加熱され、エポキシ官能プレートと接触された。この 反応は２時間４０℃て行なわれた。

参考として、一方で、上記と同様の方法で親水化されたか、しかし、４０’Ｃて ＩｇＧ溶液と接触する前にエポキシド基か灰汁による処理によって除去されたポ リスチレンブレートか使用され、他方、上記と同様に親水化されたか、しかし、 ＩｇＧ溶液での処理は４０°Ｃの代わりに２０’Ｃて行なわれたポリスチレンプ レートが使用された。後者の場合、反応時間は２時間、あるいは８時間であった 。

固定化されたＩｇＧの量は、いわゆるＥＬＩＳＡ（たとえば、Ａ、ポラ−（Ｖｏ ｌｌｅｒ）およびり、　Ｅ、　ビドウエル（Ｂｉｄｗｅｌｌ）による【交互免疫 検定法Ｊ　（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　［ｍｍｕｎｏａ、５ｓａｙｓ）　（Ｗ、 　Ｐ、　：１リンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）版）第６章、ライレイ（Ｗｉｌｅｙ）　 、ニューヨーク１９８５年を参照せよ）に従ったＩｇＧに対抗した酵素共役抗体 て測定された。従来の分光技術によって評価か行なわれた。

試料　４９５ｍｍでの吸着 エポキシド基のない表面　２時間　０．１６７２０°Ｃて結合　２時間　０．３ ８０ ２０°Ｃて結合　８時間　０．４０５ ４０°Ｃて結合　２時間　２．４５０ 結果から明らかなように、固定化された免疫活性タンパク質の量は、結合温度か 曇点である場合、この点よりも低い２０℃の温度と比較すると、非常に増加して いる。固定化か増大すると、免疫診断法の感度か向上する。

実施例２ ＋２Ｘ８ｃｒｎの寸法を有し、生体外の小室の一部を形成するように意図された ＰＶＣプレートか、波長３２０ｎｒｎフエノンが存在した状態で、クロトン酸で 移植された。結果として得られたカルボキシル官能表面は、ｐＨ４，５〜５．０ で水溶性力ルホジイミト（０，６％）か存在した状態で、水の中の１０％のポリ エチレンイミン溶液で処理された。次いて、プレートは、４０００の分子量を存 しかつｐＨ８，０て３８°Ｃの曇点を存する、エチレンオキシドおよびプロピレ ンオキシドのブロック共重合体のビス（カルボニルイミダゾール）誘導体の１０ ％溶液で、３時間２０℃で処理された。

５００００　Ｕ／ｍ　］　γイレインフェロンを含む、ｐＨ８，０の１０％炭酸 塩緩衝剤か、カルボニルイミダゾール官能親水性ＰＶＣプレートと接触されて、 かっこの反応は２０°Ｃ１３０°Ｃおよび４０°Ｃの温度て２時間および８時間 続けられた。

末梢の単核性の血球は、リンパ調製物（ＬｙＩＩ］ｐｈｏｐｒｅｐ）　（フィコ ール溶液）で勾配遠心法によって分離された。血球は、１０重量％のウシ胎児血 清（ＦＣ３）と、１重量％の抗生物質のベニノリンストレブトマイソン（ＰＥＳ Ｔ）とを添加した、組織培養媒体ＲＰＭＩＩ６４０て、１・１゜’／ｍｌまて希 釈されて、７日間３７°Ｃ１５％ＣＯ２てγ−インターフェロンで固定化された プレート上でインキュベートされた。

参考として、上記のように親水化されたたけである２つのプレートもまた使用さ れ、これらのプレートの１つに、インキュベーションの始めに、遊離γ−インタ ーフェロンが直接細胞培養に添加された。

ネオプテリン（Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ）か、得られた細胞刺激にマーカとして使用 された。リンパ球およびマクロファージのような単核性血球か、とりわけγ−イ ンターフェロンによって刺激されるとネオプテリンを分泌することか公知である 。

試料　ネオプテリン（口ｍｏｌ／Ｉ） 遊離γ−インターフェロンか 添加された親水性表面　８３ γ−インターフェロンのない 親水性表面　５ ２０°Ｃて結合　２時間　９ ２０°Ｃて結合　８時間　１１ ３０°Ｃて結合　２時間　１５ ３０°Ｃて結合　８時間　２０ ４０″Ｃて結合　２時間　６０ ４０°Ｃて結合　８時間　６２ この結果は、固定化か本発明に従って行なわれたとき、より低い温度で行なわれ たときよりも、生物的に活性のγ−インターフェロンか非常に高い程度にまで固 定化されたことを表わしている。この状態は、細胞刺激、たとえば、体外治療に 利用されてもよい。

実施例３ ノリ力（１０ｇ）か、トルエンで３−アミノブロピルトリミトキソソランの１０ ％溶液、１５０ｍ１の中で、−晩還流沸とうされた。その結果得られたアミノプ ロピルシリカは、０５ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムか存在した状態で、ｐ Ｈ７の４０ｇの水溶液内で、４２℃の曇点を存する、過ヨウ素酸により酸化され たエチルヒドロキシエチルセルロースを１ｇ含む溶液に添加された。この反応は ２２°Ｃて、１６時間振とうすることにより続けられた。シリカは濾過され、注 意深く水で洗浄された。

アルデヒド官能性のセルロースで処理されたノリ力に、３３ｍｇ／ｍｌのリパー ゼと０．５ｇのシアン水素化ホウ素ナトリウムを含んだ３０ｇの水溶液か添加さ れた。反応は２０°Ｃおよび４０°ＣてｐＨ７で１６時間続けられた。次いで、 粒子はｐＨ９，０の炭酸塩緩衝液と、ｐＨ４，０の酢酸塩緩衝液で交互に洗浄さ れた。

結合されたタンパク質の量は、４０’Ｃての反応には３５ｍ　ｇ　／　ｇのシリ カて、かつ２０°Ｃの反応については４ｍｇ／ｇのシリカて決定された。４０° Ｃの反応からのリノく一部の活性は、エステル交換反応（トリグリセリド内にス テアリン酸を含めること）で測定され、遊離リノく−ゼの活性の５６％であるこ とかわかった。同様の活性か２０°Ｃで固定化されたリパーゼについて判明し、 これは、本発明に従った調製物の容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）か、比較調製物より もおよそ９倍高いことを示している。

要約 本発明は、最終生成物の使用の温度よりも少なくとも５℃高い曇点を存する非イ オン性親水性ポリマーて被覆された表面にタンパク質を共有結合させる方法を開 示している。

タンパク質の固定化は、反応媒質内の非イオン性親水性ポリマーの曇点よりも５ °Ｃ以上低い温度で行なわれる。

国際調査報告 国際調査報告 ＰＣＴ／ＳＥ　９０１００８５１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．担体上でそれ自身公知の態様で固定化され、かつタンパク質反応基を示す非 イオン性ポリマーから構成された親水性表面にタンパク質を共有結合する方法で あって、非イオン性ポリマーは、最終生成物が使用されるべき温度よりも少なく とも５℃高い曇点を有し、かつ水性反応媒質内で非イオン性ポリマーの反応基に 、反応媒質内のポリマーの曇点よりも、５℃より高い温度だけ低い温度で、それ 自身公知の態様でタンパク質が共有結合されることを特徴とする方法。
2. ２．非イオン性親水性ポリマーは３０℃ないし１００℃、好ましくは３０℃ない し５０℃の範囲に曇点を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ３．非イオン性親水性ポリマーはポリアルキレングリコール化合物であることを 特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. ４．非イオン性親水性ポリマーはセルロースエーテルであることを特徴とする、 請求項１または２に記載の方法。
5. ５．セルロースエーテルは、ブルックフィールド、ＬＶ、１２ｒｐｍ、２０℃に 従って測定された、３０ないし５０００ｃＰの粘性を有するアルキルヒドロキシ アルキルセルロースであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. ６．非イオン性親水性セルロースエーテルは、その曇点が、最終生成物が使用さ れるべき温度よりも少なくとも１０℃高いように選択されることを特徴とする、 請求項１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
7. ７．親水性ポリマーは、担体上で反応基と反応することができかつタンパク質と 反応することができるエポキシ、トリジレート、カルボニルイミダゾールまたは アシルアジド基を有することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに 記載の方法。