JPH05503078A - 再構成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 再構成方法 本発明は一般的に薬剤科学に関しており、さらに特にリポソーム類およびその他 の脂質二重層小胞の商業的製造に関するものである。

発明の背景および要旨 脂質二重層小胞は、コレステロールおよびその他のステロール類を所望により包 含できるが、極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分とをそれぞれ有する分 子から基本的に形成されている閉鎖状顧微鏡的小胞である。

これらの親水性基は、ホスファイト、グリセリルホスファト、カルボキシ、スル ファト、アミノ、ヒドロキシ、コリンまたはその他の極性基であることができる 。非極性基の例には、飽和または不飽和の炭化水素類、たとえばアルキル、アル ケニルまたはその他の脂質基がある。

リポソーム類はこれらの二重層小胞のサブセットであり、基本的にリン脂質分子 からなる。水にさらされると、これらの分子は、この二重層膜の内側表面と外側 表面とを形成している、膜の中央にある各層の分子の脂質部分と反対の極性の部 分とによって二重層膜を形成する。すなわち、膜の各側面には、親水性表面が存 在し、かつまた膜の内部は親油性メジウムから構成されている。過剰の水か存在 すると、これらの膜は初期には、濃縮的に閉鎖された層系に配置することができ 、この様相は、内部水性空間を取り囲んでいるタマネギの層と似ていないことは ない。これらの膜はそれぞれ、脂質分子の破れ目のない二重層シートである。均 一化、超音波処理または押出しなどの追加のエネルギーによって、これらの多重 ラメラ小胞（ＭＬＶ）は小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を形成する。リポソーム 形成の技術的様式は当技術で周知であり、リポソームか生物学的活性物質の封入 に存利であることも周知である。

リポソームは、特に医薬の放出ベヒクルとして重要な利益をもたらすが、リポソ ーム類およびそれらの医薬含有物は水性分散液中て比較的に不安定である。従っ て、当業者は成る種のリポソーム状生成物の比較的短い貯蔵寿命を、その分散液 の脱水によって、たとえば水性分散液を真空凍結乾燥（凍結乾燥）させ、長期間 貯蔵することができ、かつまた水性メンラムを用いて、それからリポソーム分散 液を再構成することができる安定な粉末を生成させることによって、増加しよう と試みた。

リポソーム類なとの脂質二重層小胞を脱水する初期の試みは、脂質二重層膜か分 子の配向を維持する水性相の存在の下では最も安定であるという事実によって、 成功しなかった。しかしながら、種々の親水性膜安定剤、たとえばショ糖のよう な炭水化物類の使用によって有意の改良か得られた。これらの炭水化物類は、乾 燥処理中の各脂質粒子を支持するものと考えられる。たとえば、Ｒａｃｋｅｒ　 （１９７２）　Ｊ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌ、ｌ　Ｏｌ　２２　ｌ　−２３ ５および５Ｃ１１ｎｅｉｄｅｒ等に対する米国特許４，２２９゜３６０参照。

親水性膜安定剤を使用すると、視覚的に許容されるリポソーム粉末をうることが できるが、脱水した、または凍結乾燥した粉末を再構成するための伝統的方法、 すなわち制御されている室温（米国薬局方で定義されでいる１５°〜３０°）で 水性相を加え、最終リポソーム分散液を生成させる方法はしばしば、予想外の結 果をもたらす。特に、これらの粉末はしばしば、むしろ極めて大きいリポソーム または脂質球状体を生成し、初めのリポソーム分散液のものに匹敵するサイズ、 サイズ分布および固をの性質を有するリポソームを再生しない。従って、脱水脂 質二重層小胞粉末、特に凍結乾燥粉末を、一定の、予め定められたサイズ分布を 有する使用可能な分散液に再構成するための信頼できる方法の提供が望まれてい る。

本発明にしたがい、乾燥した脂質二重層小胞の再構成方法が提供され、この方法 は乾燥した粒子に、約１５゜より低い温度を有する液状水性相を、水性粒子分散 液が生成される量で加えることからなる。好ましくは、二重層小胞はリポソーム 類であり、最も好ましくは、リポソーム類は小さい単ラメラ小胞であり、これは 約２°〜８°の温度で再構成される。本明細書て使用するものとして、脂質二重 層小胞の用語は、一枚または二枚以上の脂質二重層膜によって定められている顕 微鏡的セルまたはサックを意味するものとし、リポソーム類を包含する。

乾燥した小胞または乾燥したリポソームの用語は、各脂質小胞分散液から水を蒸 発させることによって生成された生成物を意味し、そしてまた、再構成の用語は 、小胞のサイズおよびサイズ分布が脱水前の初期分散液中のこれらのパラメータ ーの数値に近い数値に維持されるように実質的に制御されている様相で小胞また はリポソームの水性相分散液を形成することを意味する。本明細書中の温度はい づれも、摂氏度で表わされている。

いづれか特定の理論に拘束されることは望まないが、乾燥した小胞粉末を伝統的 に室温（１５°〜３０°）で水和すると、水が充分に侵入して、各脂質分子をそ の初めの二重層形懸で安定にする以前に、膜安定化補助剤が溶解されることは明 らかである。

本発明のもう一つの感様において、再構成温度、１種または２ｆ！Ｉｔ以上の親 水性膜安定剤の量および形感、ならびにその池の因子、たとえば緩衝剤などのパ ラメーターが制御され、広い条件範囲の下に小胞の最適再構成が達成される。

図面の簡単な説明 図面は、脱水リポソーム状アンホテリシンＢ粉末の種種の試料に係り、再水和水 性相（注射用水、ＵＳＰ）の温度に対してグラフに描き入れた。本明細書に記載 の６５０〜７５０　ｎｍ光散乱指数のグラフである。

前記したように、初めのリポソーム分散液の生成方法は当技術で周知であり、本 発明の方法の一部ではない。

同様に、初めのリポソーム分散液の特定の脱水方法は知られており、この方法に は上述の親水性膜安定剤の使用か包含される。従って、リポソームの調製および 乾燥に関する記載は一般的説明であり、本発明の主要点は、リポソームなどの二 重層粒子のサイズ、サイズ分布および固有の性質か信頼できるように制御されて いる様相で、これらの乾燥粒子を再水和することにある。本発明において使用す ることができるリポソーム類はＭＬＶ類、多肥りボソーム類（ＭＶＬ類）、大型 車ラメラ小胞類（ＬＵＶ類）およびＳＵＶ類であることができ、一般に脂質二重 層膜を有する全ての顛微鏡的粒子を包含する。以下の例においては、２００ｎｍ より小さい粒子サイズを有する乾燥ＳＵＶの再構成を示す。

一般的なセルおよび脂質二重層小胞、特にリポソーム類の脱水技術は周知である 。リポソーム類およびその他の小胞類を凍結乾燥させ、凍結乾燥粉末（真空凍結 乾燥物＝　１ｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）を生成させることは、米国特許４゜２２ ９３６０　、米国特許４，８５７，３１９および１９８８年ＩＯ月５日付で出願 された、審査中の米国出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　２５３．　６８０に記載され ている方法によって行なうことができる。リポソーム類は公開出願ＷＯ３８１０ ６４４１に記載されているような噴霧乾燥またはその他のフラッシュ蒸発方法に よって脱水させることができる。

一般的に、凍結乾燥の場合には、初期リポソーム分散液、好ましくは親水性膜安 定剤を含有する分散液を先ず、予め定められた温度、たとえば−３０゛〜−５０ ゛に冷凍し、この液状混合物が固化した後に、これを減圧（たとえば、Ｏｌトー ル）にさらし、氷を昇華させる。当技術で知られているように、この温度および 減圧を継続し、生成物から残留水を除去し、このようにして得られた凍結乾燥粉 末を次いで、密ｉｔ　Ｌ、使用まで保存する。

本発明に従い、このようにして得られる小胞粉末は、室温より低い温度条件、す なわち約１５°より低い温度条件の下に、この乾燥リポソーム粉末に液状水性相 を加えることによって再構成される。好ましくは、水性相は１０°より低い温度 で加え、最も好ましくは、この液状水性相は約２°〜約８°の温度を有する。液 状水性相は多くの溶液のいづれであってもよく、その組成は特定のリポソーム溶 液および意図するその用途に依存する。−例として、無菌注射用水（ＷＦＴ）を 使用することかでき、この注射用水は、５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、１ｊン 酸１−２矛ｆｉ塩類またはその他の溶液であることかできる。液状水性相は、こ の液体か所望の温度に達することかできる充分な時間にわたり、冷蔵庫内に入れ ることかでき、あるいは再水和条件に対して特に敏感なリボノーム組成物の場合 （こは、水性相を無菌シリンジ中に入れ、これを必要温度に達するまで冷蔵庫内 に入れる。臨床用途の場合には、冷い水性相を小胞粉末に注入し、次いで小胞を 再水和させた後に、その温度を高めて、小胞のサイズ分布に損害を与えることな く、所望の処置または注射に使用することかできる。

以下の例においては、抗菌剤アンホテリシンＢを含有するｓｕｖの初期分散液か ら調製された乾燥リポソーム粉末を本発明の方法によって再構成する。リポソー ムの初期分散液は、特許公開ＥＰＡＯ３１７１２０に記載のとおりにして生成し た。一般的に、約１．０〜３．０のｐＨに酸性にされているクロロホルムおよび メタノールの溶液中で、アンホテリシンＢをジステアロイルホスファチジルグリ セロールとから、可溶性複合体を生成させた。

このアンホテリシンＢ／リン脂質複合体を次いで、ホスファチジルコリンおよび コレステロールと混合し、次いで乾燥させ、脂質粉末を生成させた。リポソーム の調製は、この脂質複合体粉末を約５，５またはそれ以下のｐＨを有し、かつま た膜安定剤としてショ糖を含有する水性緩衝液により、米国特許４，８５７，３ １９の技術に従い水和し、次いて超音波処理または均一化処理なとの剪断力を適 用し、ＳＵＶを生成させることによって行なった。この場合には、米国特許４， ７５３，７８８に記載の均一化装置を用いて、リポソームを生成させた。このバ ラグラフに記載の両特許の記載をここに引用して組入れる。脱水以前において、 この初期リポソーム分散液は２００ｎｍより小さい平均直径のアンホテリシンＢ 含有単ラメラリボノームを含有しており、 可視部スペクトルの非吸収域（６５０〜７５０ｎｍ）における波長依存性光散乱 によって測定して、約４０の粒子の狭いサイズ分布を有していた。

８種の初期アンホテリシンＢリポソーム調製物を次いて、それぞれバイアルに充 填し、次いて凍結乾燥させた。

凍結乾燥後に、全バイアル中のリポソーム粉末を窒素により浄化し、次いで密封 した。

表１および図面に記載されている再構成されたリポソーム分散液の粒子のサイズ 分布は、Ｌｏｎｇ等によるＪ。

Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、４２．　５４５　（１９７３） に記載の技術により、可視部スペクトルの非吸収域（６５０〜７５０ｎｍ）にお ける波長依存性光散乱の測定によって評価したものである。この刊行物の記載を ここに引用して組入れる。

このスペクトル　ウィンドに関する１０ｇ（吸収）対１０ｇ（波長）のグラフの 負の傾斜は、散乱指数（ｎ）を表わす。散乱光の波長に関して小さい粒子の分散 液の場合には、この指数は約４，０である。集合物または大型粒子の存在は、散 乱指数か一定値（ｕｎｉｔｙ　）以下でありうる数値に減少することによって見 ることかできる。

この医薬製剤の放出性は毒性試験および種々のその他の試験にもとづくか、この Ｌｏｎｇ等の方法の変法による、約３０またはそれ以上の指数数値は粒子サイズ の観点か）　ら、このアンホテリシンＢリポソーム製剤の非経口使用に係る優れ が使用可能性に関連している。約２５またはそれ以上の指数数値は、粒子サイズ の観点から、このような製剤としての良好な使用可能性に関連している。

この例の製剤の場合には、その凍結乾燥剤散乱指数は、約３９〜４１である。

バイアル中のリポソーム詞製物を、選ばれた温度において、ＷＦＩを注入するこ とによって、再構成した。表■の第１欄では、４°ＣのＷＦ＋含有容器を冷蔵庫 から取り出し、一定量のＷＦＩを各シリンジに導入した。バイアルに注入する前 に室温にさらした後に、シリンジを冷蔵庫内に入れ、ＷＦＩを４°に平衡化した 。第２欄では、冷蔵庫から取り出し、平衡化することなくバイアルに注入したＷ ＦＩの温度を４°の代りに６°にした。第３欄および第４欄は、有意の変化がな いものと推定される貯蔵温度を示している。その他の再水和はいづれも、ＷＦＩ 含有容器を、制御温度環境から指定温度で取り出し、シリンジ内のＷＦＩを平衡 化することなく、そのリポソーム粉末を水和させることによって行なった。臨床 用途には、バイアルはいづれも、４＠で保存される。この例のバイアルはいづれ も、室温で保存し、その後水性相を注入した。冷水の注入後に、バイアルをそれ ぞれ、１〜２分間激しく振りまぜ、次いで１０分間６５°に加熱した後に、粒子 のサイズ分布を前記頃に記載のとおりにして評価した。

これらの結果は、室温以下（すなわち、１５°以下）における再水和が、粒子サ イズ分布の観点から、全ての被験アンホテリシンＢリポソーム製剤の非経口使用 に対して良好な使用可能性を付与することを示している。

４°、６＠またはｌＯｏの温度における再水和はいづれも、全ての試料に対して 優れた使用可能性を与えた。これに対して、２０°において、４種の試料は使用 できないものであり、１種の試料は良好であり、そして３種の試料だけが優れて いた。そしてまた、典型的病院または診療所環境の室温、すなわち約２６°にお いて、５種の試料は使用できないものであった。

従って、本発明により、水和メジウムとして、冷い水性相を使用することによっ て、脱水リポソーム状製剤の一定の、かつまた信頼できる再構成か達成される。

特に有利な結果は、凍結乾燥リポソーム状製剤の再構成で得られ、室温における リポソーム生成物の類似試料の再構成における他の因子による可変性が低温度に おって克服される・。

この説明から、本発明の必須の特徴は容易に認識することかでき、本発明の精神 および範囲から逸脱することなく、種々の用途に対して適合させることができる 。形態の変更および同等の置き換えは、状況か適当であることを示唆し、または 適当なものとするかぎり、本発明の意図に含まれ、かつまた本明細畜では特定の 用語か使用されているか、これらの用語は説明のためのものであって、制限する 目的を有するものではない。

手続補正書１発） 平成４年７月２０日 １、事件の表示 再構成方法 氏名（名称） ベスター、　インコーホレイテッド ４、代理人 ６−補正により増加する請求項の数 ７、補正の対象 明細書及び請求の範囲翻訳文 明細書及び請求の範囲翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査＠吉 国際調査報告 ＵＳ　９００６１８３ Ｓ＾　４１９４０

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．乾燥した脂質二重層小胞の再構成方法であって、乾燥した脂質二重層小胞に 、約１５℃より低い温度を有する液状水性相を、分散液が生成される量で加える ことからなる方法。
2. ２．上記小胞がリボソーム類である、請求項１の方法。
3. ３．上記小胞が凍結乾燥物である、請求項１または２の方法。
4. ４．上記液状水性相が約８℃より低い温度を有する、請求項１、２または３の方 法。
5. ５．上記乾燥した小胞が親水性膜安定剤を含有している、請求項１、２、３また は４の方法。