JPH06501246A - アミノ酸及びペプチドのリポソーム内への蓄積 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノ酸及びペプチドのリポソーム内への蓄積いくつかの生体アミン及び抗腫瘍 剤は、゛遠隔装填（ｒｅｍｏＬｅ　１ｏａｄｉｎｇ）　”として知られているプ ロトン勾配を加えることによって、リポソーム内に蓄積することがわかっている 〔例えば、Ｍａｙｅｒ等、バイオとミカ・バイオフィジカ・エト・アクタ　（Ｂ ｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　８５７．１２３　（１９８６）、Ｍａｙｅｒ 等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｒｙ）　、　２７．２０５３　 （１９８８）及びＭ、　Ｂ、　Ｂａ１ｌｙ等、ケミカル・アンド・フィジカル・ リビズ（Ｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ）　、　４７．９７　（１９８８ ）参照コ。この装填技術では、任意のリポソームパラメーターを単独で変えるこ とができる。通常の技術に比較してはるかに高い、脂質に対する薬剤の割合を達 成することができる［Ｍａｙｅｒ等、Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、 　４０．３３３　（１９８６）］　、更に、薬剤の膜内外分布は、一般に、小胞 的媒体の緩衝能の変化により薬剤漏出を調整するプロトン勾配によって決まる。

非両性イオン弱塩基である薬剤を取り込むために、プロトン及び他のイオン勾配 を用いることが、アドリアマイシン、局所麻酔剤であるジブカイン及びドパミン 並びに他の薬剤に関して実用的であることかわかっている。この系の利点として は、十分な薬剤取り込み、受動的に取り込まれた薬剤よりも低速での薬剤放出、 及び他で達成できるよりも脂質に対する薬剤の割合が高いことが挙げられる。

更に、薬剤の存在しないときに、リポソームを調製できるので、保存中の薬剤放 出又はリポソーム調製中の薬剤分解にともなう問題を避けることができる。ｐＨ 勾配でのリポソーム内薬剖蓄積は、他の弱塩基、例えば、ｐＨ勾配プローブであ るメチルアミンと同様な方法で生ずると信じられている。メチルアミンは、非帯 電形態でのリポソーム膜の両側を平衡化し、その環境のｐＨのヘンダーソンーハ ッセルバッハ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ）の関係に従って、 再イオン化する。平衡分布は、膜内外ｐＨ勾配を反映し、その再分布をこれらの 勾配の測定に用いることができる。

しかし、ヘンダーソンーハツセルバツハの関係によってイオン化される能力を有 する全ての医薬が、この関係にしたがってリポソーム内に蓄積するのではない。

事実、ある医薬は、蓄積するようには全くみえない。更に、この関係にしたがっ て蓄積するかも知れないと考えられるある医薬は、直ちに放出され、製造直後に 使用しなければならず、徐放性製品として実質的に使用できない非実際的な医薬 製剤となる。

リポソームは、取り込まれた水性容積を含む完全に閉鎖された脂質単分子膜であ る。リポソームは、単ラメラ（１個の膜）でも、多重ラメラ（複数の膜状二分子 膜が、水性層により、それぞれ隣接する膜から分離されていることを特徴とする 玉葱状構造物）でもよい小胞である。二分子膜は、疎水性“尾″領域と親水性“ 頭″領域とを有する２つの脂質単分子膜で構成されている。膜状二分子膜におい ては、脂質単分子膜の疎水性（非極性）′尾”が二分子膜の中心に向かって配向 し、一方、親水性（極性）“′頭′°は水性相に向かって配向している。

本発明の一つの態様は、弱酸又は弱塩基特性を示すあるアミノ酸及びペプチドの 装填を開示することである。より具体的には、本発明のこの態様のアミノ酸及び ペプチドは、Ｃ末端及びその他のカルボキシル基の機能が、その置換により変性 されており、例えば、エステル又はアミドのような官能基と結合しているもので ある。更に具体的には、本発明の塩基性アミノ酸及びペプチドは、メチルエステ ル、エチルエステル又はアミドの形に変性されている。

膜内外濃度勾配、より具体的には膜内外ｐＨ勾配による装填は、Ｃ末端カルボキ シル官能基が置換され、アミノ酸又はペプチドが弱酸又は弱塩基特性を示すよう な、更に具体的には、かかるアミノ酸又はペプチドのカルボキシル官能基が、ア ミドやメチルエステルのような非酸性基に変性されている、あるアミノ酸及びペ プチドに対して生じる。このようなアミノ酸誘導体及びペプチド誘導体は、弱塩 基特性を示す。このようなアミノ酸及びペプチドは、膜内外濃度勾配（例えば、 膜内外ｐＨ勾配）（内側は酸性）による本発明の方法でＬＵＶ内に装填される。

本発明の方法は、アミノ酸誘導体であるリジンメチルエステル、リジンアミド及 びリジンエチルエステル並びにペプチドであるボンベシン（ｐＧｌｕ−Ｇｉｎ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｃ＋Ｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａ　ｌ−Ｇｌ ｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ，）、ガストリン関連ペプチド（Ｎ−ｔ−Ｂ ＯＣ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−アミド）及び成長ホルモン放出因子断 片（Ｌｙｓ−Ｔｙ　ｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ，）について、膜内外濃 度勾配による装填をもたらす。

しかし、本発明の方法は、他のアミノ酸及びペプチドをＬＵｖ内に装填すること にはならない。例えば、ペプチドであるヒスチジンメチルエステル、（Ｌｙｓ） 。メチルエステル及び（Ｌｙｓ−（Ａ、１　ａ）　、）メチルエステルは、本発 明の方法によってリポソーム内に装填することができない。

図１は、７．５／４．Ｏ（外部／内部）のｐＨ勾配を有する１１００ｎのＥＰＣ 小胞内へのリジンメチルエステルの時間経過をグラフで示す（白丸）。ｐＨ勾配 のない対照小胞（７，５／７゜５−白三角及び４．Ｏ／４．Ｏ−白四角）につい てもテストした。

取り込みは、２０℃で行なった。リジンメチルエステルの外部濃度は、１．３ｍ Ｍであった。

図２は、７．５／４．０　（外部／内部）のｐＨ勾配を有する１１００ｎのＥＰ Ｃ：ｒレスチロール小胞（５５：４５モル％）内へのリジンメチルエステルの取 り込みの時間経過をグラフで示す。

取り込みは、４℃（白丸）、２０℃（白三角）及び３７℃（白四角）で行なった 。リジンメチルエステルの外部濃度は、２．ＱｍＭであった。

図３は、７．５／４．Ｏ（外部／内部）（白四角）及び７．５／７．　５　（外 部／内部）（白丸）のｐＨ勾配を有する１１００ｎのＥＰＣ小胞内へのＬｙｓ− Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−アミドの取り込みの時間経過をグラフで示す 。取り込みは、２３℃で行なった。Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ− アミドの外部濃度は、７６ｕＭであった。

本発明は、ｐＨ勾配を有するリポソーム組成物に関し、かかるリポソームは、イ オン（プロトン）濃度の異なる第一の内部緩衝水溶液と第二の外部緩衝水溶液と を用いてリポソームを製剤化することにより、ヘンダーソンーハツセルバツハの 関係から予想されるような、著しく高いアミノ酸及びペプチドの蓄積を示す。

更に、本発明は、Ｃ末端カルボキシル官能基置換アミノ酸又はペプチド、従って アミノ酸又はペプチドが弱酸又は弱塩基特性を示すような、更に具体的には、か かるアミノ酸又はペプチドのカルボキシル官能基が、アミドやメチルエステルの ような非酸性基に変性されている、アミノ酸又はペプチドを、リポソームに装填 する方法に関するものである。このようなアミノ酸誘導体及びペプチド誘導体は 、弱塩基特性を示す。

装填は、膜を挾んで、一つもしくはそれ以上の荷電種（ｃｈａｒｇｅｄ　５ｐｅ ｃｉｅｓ）の濃度勾配を有し、該濃度勾配が、ペプチドをリポソーム内に装填さ せるようにする膜内外ヂテンシャルを発生させることができるリポソームを調製 すること、及びアミノ酸又はペプチドをこのリポソームと混合することを含む。

リポソームは、任意の方法で形成することができるものであるが、大単ラメラ小 胞（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）であることが好 ましい。濃度勾配は、一つもしくはそれ以上の荷電種の第一の濃度を有する第一 の媒体をリポソーム内にカプセル化し、そのリポソームを、一つもしくはそれ以 上の荷電種の第二の濃度を有する第二の媒体中に懸濁させることにより形成され る。このような濃度勾配は、例えば、ｐＨ勾配であることができる。

本発明の膜内外ｐＨ勾配法により装填する−とのできるアミノ酸誘導体及びペプ チド誘導体としては、アミノ酸誘導体であるリジンメチルエステル、リジンアミ ド及びリジンエチルエステル並びにペプチドでそるボンベシン（ｐ、Ｇｌｕ−Ｇ １ｎ７Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ７ＧＩｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇ ｌｙ−Ｈ，ｉ　ｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ　−ＮＨ，、）　、ガストリン関連ペプチド （Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−’Ｔ：ｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−アミド）、成長ホル モン放出ペプチドＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−アミド及びＴ　ｒ 　ｐ　−Ａ　１　ａ　−Ｔ　ｒ　ｐ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ａ　１　ａ　−アミド、 及び成長ホルモン放出因子断片（Ｌｙ　ｓ、、−Ｔｙ　ｒ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｒｐ− Ｐｈｅ−ＮＨ，）が挙げられる。

ペプチドであるヒスチどジメチルエステル、Ｔｒｐ−Ｎｌｅ−Ａ　ｒ　ｇ　−Ｐ 　ｈ　ｅ−アミド（軟体心臓興奮神経ペプチド類似物）、ｐ−Ｇｌｕ−３ｅｒ− Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−アミド（いそぎんちゃく神経ペプチド）、黄体形成ホ ルモン放出ホルモン（ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌ ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ，）　、Ｌｙｓ”−パップレシン（Ｃｙｓ −Ｔｙ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇ　１　ｙ −ＮＨ，）、（Ｌｙｓ）、メチルエステル及び（Ｌｙｓ−（Ａｌａ）、）メチル エステルは、本発明の方法によってリポソーム内に装填すること力ｉできない。

本発明の方法によりリポソーム内に装填されたこのようなＣ末端置換アミノ酸又 はペプチドを含む医薬製剤も開示される。

装填方法は、アミノ酸誘導体又はペプチド誘導体を、膜を挟んで膜内外ポテンシ ャルを有するリポソームと混合することにより進行し、この膜内外ポテンシャル は、剤が正に帯電していれば、リポソームの内部ポテンシャルが外部媒体のポテ ンシャルに対して負であり、剤が負に帯電していれば、リポソームの内部ポテン シャルが外部媒体のポテンシャルに対して正であるようになっている。膜内外ポ テンシャルは、膜を挟んで一つ以上の荷電種の濃度勾配、例えば、Ｈ＋イオンを 生成することにより、作ることができ、この場合、濃度勾配はｐＨ勾配である。

一般に１本発明のリポソーム組成物は、とりわけ、卵ホスファチジルコリン（Ｅ ＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリ ン、シミリストイルホスファチジルコリン、ジアラチドノイルホスファチジルコ リンなどのリン脂質を含んでもよく、更に、多くのステロイド組成物及び他の組 成物を含んでもよい。

リポソーム組成物が更にステロイド組成物を含む場合は、コレステロールを含ん でもよく、５５：４５　（脂質ニステロイド脂質）の重量比で、好ましく用いる ことができる。

本発明は、膜内外イオン勾配、好ましくは膜内外ｐＨ勾配を示すリポソーム内に 、アミノ酸及びペプチドを有効に取り込むことを開示する。

この発明の膜内外ｐＨ勾配法により装填することができるアミノ酸誘導体及びペ プチド誘導体としては、アミノ酸誘導体であるリジンメチルエステル、リジンア ミド及びリジンエチルエステル並びにペプチドであるボンベシン（ｐＧｌｕ−Ｇ ｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　１ −Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ，）、ガストリン関連ペプチド（Ｎ− ｔ−ＢＯＣ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈ、ｅ−アミド）及び成長ホルモン放 出因子断片（Ｌｙ　５−Ｔｙ　ｒ−Ｔ　ｒ　ｐ　−Ｔ　ｒ　ｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ， ）が挙げられる。

ペプチドであるヒスチジンメチルエステル、（Ｌｙｓ）、メチルエステル及び（ Ｌｙｓ　−（Ａ、ｌ　ａ）　、）メチルエステルは、本発明の方法によってリポ ソーム内に装填することができない。

本発明のリポソームは、当該技術において公知の任意の方法で形成することがで きるが、好ましくは、Ｂａ１ｌｅｙ等、ＰＣＴ出願番号ＩＪｓ８６１０１１０２ ．１９８６年２月２７日公開、及びＭａｙｅｒ等、ＰＣＴ出願番号ｔＪｓ８８１ ００６４６．１９８８年９月７日公開、に記載されている方法により形成するの が好ましい。

これらの技術により、イオン化しうる剤をリポソームに装填することで、そうで ない場合に、中性ｐＨ及び／又は受動取り込み技術により得られることができる よりも高い濃度での水溶液中の剤の溶解度から予想されるよりも、かなり高い内 部濃度が達成される。

この技術では、膜内外イオン（ｐ　Ｈ）勾配がリポソームの内部膜及び外部膜の 間に生じ、そのイオン（ｐ　Ｈ）勾配により、リポソーム内に剤が装填され、そ れが取り込みを行わせる。例えば、Ｎａ＋、Ｃ１−１Ｋ＋、Ｌｉ＋、○Ｈ−１好 ましくはＨ＋のような一つ以上の荷電種について、リポソーム層を挟んで濃度勾 配を作ることによって、膜内外勾配が生じるので、そのイオン勾配により、膜を 越えてのイオン化しつる剤の取り込みが行われる。

本発明では、膜内外イオン（Ｈ＋）勾配を用いて、イオン勾配を作り、弱塩基窒 素基を有する傾向のある剤をリポソーム内に装填するのが好ましい。本発明にお いては、先ず、リポソームを緩衝水溶液中で形成するのが好ましい。最初の溶液 は、装填しようとする剤が、塩基性ｐＨで荷電種を生ずるか、あるいは酸性ｐＨ で生ずるかによって、酸性か塩基性のいずれかである。例えば、弱塩基性剤を装 填する場合、荷電種は、低いｐＨ１即ち約２．０〜５．０のｐＨ１好ましくは約 ４．０のｐＨで生成する。酸性内部緩衝水溶液を有するリポソームの形成後、リ ポソームに対して外部の緩衝液を、内部緩衝液のｐＨよりもかなり高いｐＨ１好 ましくは内部緩衝液よりも少なくとも約３．０〜４．ＯｐＨ単位高いｐＨに変え る。

外部緩衝液を変更することにより、リポソーム内への剤の蓄積を行うｐＨ勾配が 生ずる。一般に、剤は、荷電していない形態において、荷電した（弱塩基性の剤 の場合、プロトン化した）形態におけるよりもはるかに容易にリポソームの脂質 層を通り抜けるであろう。このようにして、外部緩衝液内の荷電していない剤は 、容易にリポソームを通り抜けて内部緩衝液に入り、プロトン化され、リポソー ム層を容易に通り抜けない“取り込まれた”プロトン化された分子として、リポ ソーム内に残るであろう。剤は、このように、内部緩衝液と外部緩衝液との間の ｐＨ勾配の関数として、リポソーム内に集まるであろう。

以下に詳細に述べるような代表的なリポソーム調製技術では、それらが形成され る際に、第一の緩衝水溶液がリポソームを取り囲み、リポソームの内側と外側の 緩衝液となる。濃度勾配を生じさせるためには、荷電種の濃度が内部緩衝液とは 異なるように、元の外部緩衝液を酸性又は塩基性にするか、あるいは外部緩衝液 を、異なる荷電種を有する新しい外部媒体と置換してもよい。外部媒体の置換は 、種々の技術、例えば新しい媒体で平衡化したゲル濾過カラム、例えばセファデ ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）カラムにリポソーム製剤を通すか、又は透析若し くは関連技術により行うことができる。

本発明においては、酸性（ｐＨ約３．０〜５．０）の第一の内部緩衝液及びｐＨ が好ましくは約６．５と８．０の間、好ましくは７゜４である第二の外部緩衝液 を用いて形成されるリポソーム組成物が好ましい。外部緩衝液のより塩基性又は 中性ｐＨと相対的に、内部緩衝液のｐＨを低くすることにより、リポソーム内に 剤を蓄積させるように作用する膜内外勾配が生成する。

本発明のリポソーム製剤に用いることのできる脂質には、合成又は天然のリン脂 質があり、とりわけ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノー ルアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロー ル（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ） 、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、カルシオリビンの単独又は組合せが挙げられ る。本発明において有用なリン脂質としては、シミリストイルホスファチジルコ リン（ＤＭＰＣ）及びシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ） も挙げることができる。他の実施態様では、ジステアリルホスファチジルコリン （ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）又は水素化大 豆ホスファチジルコリン（Ｈ２ＰＯ）を用いてもよい。シミリストイルホスファ チジルコリン（ＤＭＰＣ）とジアラチドノイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ ）とを同様に用いてもよい。

ＤＳＰＣ（６５℃のＴｃ）、ＤＰＰＣ（４５℃のＴｃ）、ＤＡＰＣ（８５℃のＴ ｃ）のように、脂質の転移温度（Ｔｃ）が高いため、これらのリポソームを作る ためには、それらのＴｃ前後又はわずかに高い温度、例えばＴｃよりも５℃まで 高い温度で、このような脂質を加熱するのが好ましい。

好ましい実施態様においては、卵ホスファチジルコリンが用いられる。本発明の 多数の実施態様においては、選ばれたリン脂質にかかわらず、リポソームにステ ロイド成分を加えてもよい。このようなステロイド成分は、例えば、コレステロ ール、コレスタノール、コレスタノール又はコレスタンよりなる群から選ばれて もよい。更に、コレステロールヘミスクシネート（ＣＨ３）のようなステロール の有機酸誘導体とともに、コレステロールのポリエチレングリコール誘導体（Ｐ ＥＧ−コレステロール）を、上記リン脂質のどれかと組み合わせて用いてもよい 。アルファートコフェロールヘミスクシネート（ＴＨ３）の有機酸誘導体を用い てもよい。ＣＨ３及びＴＨ３含有リポソーム並びにそれらのトリス形態は、一般 に、ステロール類を含むリポソームを製造する当該技術において公知の任意の方 法で作ることができる。

得られたリン脂質−スチロール混合物が、安定なリポソームになるのであれば、 上記のどのステロールを用いてもよい。特に、Ｊａｎｏｆｆ等、米国特許第４， ７２１，６１２号、１９８８年１月２６ＥＩ発行、名称゛′ステロイドのリポソ ーム”及びＪａｎｏｆｆ等、ＰＣＴ公開番号８７１０２２１９．１９８７年４月 ２３日発行、名称゛″アルフアトコフエロール基体とした媒体”の方法を参照の こと。これらの関連部分は、ここに参照のために記載されている。リポソームが 、剤の急速な放出を防ぐように設計されているある例においては、リポソームを 含む脂質の３０〜４５重量モル％に等しい量のコレステロールを、上記リン脂質 又はリン脂質／ステロイドの組合せの何れかと組み合わせて用いるのが好ましい 。

一般に、このような組成物は、蓄積された剤のリポソームからの好ましくない急 速な放出をきっと防ぐであろう。リポソームからの剤の急速な放出を防ぐ膜安定 化成分と脂質との任意の組合せを用いてもよく、当業者であれば、剤の急速な放 出を防ぐリポソームを製剤化するために、膜安定化成分とリン脂質を改変するこ とができるであろう。

本発明のこの態様においては、ホスファチジルコリンか、あるいは約４５重量モ ル％のコレステロールと約５５重量モル％のホスファチジルコリンの混合物のい ずれかをを用いるのが最も好ましい。

本発明のリポソームを形成するには、いくつかの方法を用いることができる。例 えば、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、安定複ラメラ小胞（ＳＰＬＶ）又は逆相蒸発 小胞（ＲＥＶ）を用いることができる。しかし、用いられるフィルターサイズに よって決まる大きさの大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を形成するフィルターから、Ｍ ＬＶを押し出すのが好ましい。一般に、３０．５ｏ、６０．１００．２００又は ８００ｎｍの細孔のポリカーボネートフィルターを用いることができる。Ｃｕ１ ｌｉｓ等、ＰＣＴ公開番号ＷＯ３６１０００２３８，１９８６年１月１６日（（ ４）関連部分は、ココニ参照のために記載されている）に記載されているこの方 法では、リポソーム懸濁液を押し出し装置に繰り返し通して、均一サイズ分布の リポソームの母集団とする。

例えば、直路（ｓＬｒａｉｇｈｔ−ｔｈｒｏｕｇｈ）膜フイルタ−（ヌグレオボ ア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）ポリカーボネートフィルター）又は蛇行路フィルタ ー（例えば、０．１ｕｍサイズのヌクレオボアフィルターメンブラフイル（ｍｅ ｍｂｒａｆ　ｉ　］　）フィルター（混合セルロースエステル））により濾過を 行ってもよく、あるいはホモゲナイゼイションのような別の粉砕技術により行っ てもよい。リポソームの大きさは、直径が０．０３から約２ミクロン以上まで変 わってもよく、好ましくは０．０５〜０．３ミクロン、最も好ましくは０．１− ０゜２ミクロンである。この大きさの範囲は、ＭＬＶ、５ＰＬＶ又はＬＵＶであ るリポソームを含むものである。

本発明において、好ましいリポソームは、０．１〜０．２ミクロンの単ラメラリ ポソームであるものである。

上に述べたように、室温よりも高い、ゲルから液晶までのＴｃを有するリポソー ムを形成するのに、多数の脂質を用いることができる。このような場合、加熱バ レル又は熱ジャケットを有するエクストルーダーを用いることができる。このよ うな装置は、ＬＵｖの押し出しをさせるリポソーム懸濁温度を高めるのに役立つ 。

熱ジャケットを備えたエクストルーダーで使用される脂質には、例えばＤＳＰＣ ，ＤＰＰＣ，ＤＭＰＣおよびＤＡＰＣ又はこれらの混合物があり、これらは、リ ポソームからの剤の急速な放出を防ぐために、ある実施態様ではコレステロール を含んでもよい。

一般に、ＤＳＰＣを含むリポソームは６５℃で、ＤＰＰＣを含むものは４５℃で 、ＤＡＰＣを含むものは８５℃で（脂質Ｔｃよりも５℃高い）押し出される。

示されたように１本発明で用いるのに好ましいリポソームは、大きさが約０．０ ６〜０．３ミクロンのＬＵＶである。本出願において規定されているように、小 胞の均一な母集団は、実質的に、同一サイズのリポソームを含むものであり、粒 子サイズのガウス分布を有していてもよい。このような母集団は、均一サイズ分 布であるといわれ、サイズに関して、単一モード（ｕｎｉｍｏｄａｌ　）であっ てもよい。゛単一モード″という用語は、粒子サイズの狭い多分散性を有する母 集団を意味し、粒子は単一の″モードパである。

リポソームの母集団は、準弾性光散乱法により測定した場合に、その母集団がガ ウス分布に近似し、二次多項式がサンプルの自己相関関数の自然対数に合致すれ ば、単一モードである［Ｋｏｐｐｅｌ、Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、、　５７ ．４８１４　（１９７２）］　、　コノ合致がびツｆ：、、　’Ｊ　Ｌ　でいれ ばいるほど、単一モード性（ｕｎｉｍｏｃｌａｌｉｔｙ）の程度はよくなる。こ の合致の厳密性は、サンプルのカイの２乗（ｃｈｉｏ）値が、どれだけｌに近い かにより請求めることができる。２．０以下のｃｈｉ’値は、単一モードの母集 団を示す。

本発明を実施するに際し、他の粉砕技術を用いてもよい。例えば、ホモゲナイゼ イションやミリング技術をうまく用いることができる。このような技術により、 サイズ分布に関して均−又は単一モードであるリポソームが得られる。上に述べ た特性を有する第一の緩衝水溶液をカプセル化するリポソームを調製してもよい 。

リポソーム調製中、脂質を懸濁させるために、有機溶媒を用いてもよい。本発明 での使用に適した有機溶剤には、脂質を可溶化する、各種の極性及び誘電性能を 有するものがあり、とりわけ、例えば、クロロホルム、メタノール、エタノール 、デメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化メチレン及びベンゼン：メタノール （７０：３０）のような溶剤混合物が挙げられる。その結果、脂質を含む溶液（ 脂質と他の成分とが全体に均一に分散されている混合物）が形成される。溶剤は 、一般に、それらの生物適合性、低毒性及び可溶化能に基づいて選択される。

本発明の一つの好ましい実施態様は、臨床部位（ｃｌｉｎｉｃａｌ　５ｉｔｅ） において、剤の高度に有効な取り込みが行われる３成分リポソームー剤処理系で ある。剤が、リポソームの内部が酸である膜ｐＨ勾配で装填されるものである場 合、システムの第一の成分（バイアル１）は、酸性水溶液又は緩衝液、例えば、 クエン酸緩衝液（３００ｍＭ、ｐＨ３，８〜４．２、好ましくは４．０）内のリ ポソームを含む。

システムの第二の成分（バイアル２）は、相対的に塩基性の緩衝液又は水溶液、 例えば、炭酸ナトリウム若しくはビス燐酸ナトリウム溶液又はｐＨ１０〜１２、 好ましくはｐＨ１１，５の塩化ナトリウム／ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（”ＨＢ Ｓ”）を含み、これはリポソーム製剤の外部水溶液又は緩衝液の一部となる。

第三の成分（バイアル３）は、取り込もうとする剤である。上記処理システムは 、上に述べたように、酸性媒体内のリポソームを含む第一バイアル、相対的に塩 基性の溶液を含む第二のバイアル及びアミノ酸又はペプチド（剤）医薬を含む第 三のバイアルの３バイアル系として、提供されることができる。リポソームの内 部緩衝液が相対的に塩基性の、即ちｐＨが８．５〜１１，５である膜勾配で装填 される剤に、同様の処理系を提供することができる。

このような場合、第一の成分は、相対的にアルカリ性の緩衝液内のリポソームを 含み、第二の成分は、相対的に酸性の溶液を含み、第三の成分は、取り込もうと する剤を含むことができよう。

リポソームをはさむｐＨ勾配の形成（第一バイアルと第二バイアルを混合するこ とにより）後、アミノ酸又はペプチドと混合する前に、リポソームを加熱しても よい。ある環境下、及び剤の急速な放出をできるだけ少なくするために、少なく とも３０モル％のコレステロールを含むリポソーム中に剤を装填しようとする場 合は、リポソーム組成物にとって及びアミノ酸又はペプチドの存在にとって適当 なある温度まで、リポソームを加熱して、装填を促進することが有利であろう。

装填は、例えば、４〜６０℃の温度で生ずることができる。

上記処理系を用いて、剤をリポソーム内に装填するためには、Ｍａｙｅｒ等、Ｐ ＣＴ公開番号ＷＯ３８１０６４４，２，１９８８年９月７日（その関連部分は、 ここに参照のために記載されている）に記載されている方法を、本発明の剤に使 うために改変してもよい。

リポソーム−剤搬送系においては、剤をリポソーム内に取り込むか又はリポソー ムと会合させ、その後、治療しようとする患者に投与する。剤が薬剤である例に ついては、Ｒａｈｍａｎ等、米国特許第３，９９３，７５４号；　５ｅａｒｓ、 米国特許第４，１４５，４１０号；　Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、米国 特許第４，２３５，８７ｉ号；　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ等、米国特許第４，１１４ ，１７９号；　Ｒｅｎｋｅ等、米国特許第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎ ｔａｉｎ等、米国特許第４，５８８．５７８号参照。明細書全体を通じて用いら れる場合、アミノ酸及びペプチドという用語と剤という用語は、互いに交換でき るものとして用いられる。

内部緩衝液として使用する緩衝液の選択は、装填するために選ばれる剤によって 変わるであろう。当業者であれば、特定の剤のイオン化された種の相対溶解度及 び内部緩衝液として使用する緩衝液を決めるための緩衝強度を評価することがで きるであろう。

本発明においては、必要な場合、溶液が医薬的に適合していれば、即ち、そこで その溶液を有害作用なしに患者に投与できれば、上に一般的に述べた特性を有す る任意の緩衝液を用いることができ、る。

代表的な内部緩衝液としては、とりわけ、クエン酸、シュウ酸、コハグ酸及びそ の他の好ましい有機酸塩が挙げられる。１００ｍＭから３００ｍＭまでの範囲の 濃度のクエン酸が好ましい。クエン酸緩衝液の濃度は、３００ｍＭであることが 最も好ましい。

代表的な外部緩衝液としては、とりわけ、ＮａＣ１，ＫＣＩ、リン酸カリウム、 重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ビスリン酸ナトリウム、硫酸カリウム、（ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）（”ＨＥ 　Ｐ　Ｅ　Ｓ″）、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ”）、Ｎ −（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（”Ｅ ＰＰＳ”）、２−［Ｎ−シグロへキシルアミノコエタンスルホン酸（”　ＣＨＥ Ｓ”　）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ″　−ビス［２−エタンスルホン酸］　（”　Ｐ 　Ｉ　ＰＥＳ”　）及びそれらの混合物を挙げることができる。本発明において 、好ましい外部緩衝液は、Ｎ　ａ　Ｃｌ　／　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓであり、更に好 ましくは、ｐＨ７，５の１５０ｍＭＮａ、ＳＣ２，２０ｍＭＨＥＰＥＳである。

本発明を利用する剤の装填効率は、一般に、２０％から１００％までの範囲であ り、好ましくは５０％以上である。一般に、本発明による剤の装填効率は、ヘン ダーソンーハッセルバッハの関係から期待される通りである。もちろん、全ての 剤が、ヘンダーソンーハッセルバッハの関係に従ってリポソーム内に容易に蓄積 するのではなく、ある剤（比較例１３．１４．１５参照）は、ある場合には、全 く蓄積しないようである。

本発明の方法により形成されるリポソームを、形成の種々の段階で、凍結乾燥又 は脱水してもよい。例えば、溶剤の除去後、剤の添加前、あるいは膜の水和によ るリポソームの形成前に、脂質膜を凍結乾燥してもよい。このような脱水は、脂 質又はリポソームを減圧下におくことにより実施することができ、それにより全 ての懸濁している溶剤を除去する。

リポソーム自体は、多くの任意の方法で脱水することができる。

Ｂａ１１ｙ等、ＰＣＴ公開番号８６１０１１０２．１９８６年２月２７日公開、 名称“リポソーム内への抗腫瘍剤のカプセル化”’；Ｊａｎｏｆｆ等、ＰＣＴ公 開番号８６１０１１０３．１９８６年２月２７日公開・名称パ脱水リポソーム” 　；　５ｃｈｎｅｉｃｌｅｒ等、米国特許第４２２９３６０号、」９８０年１０ 月２９日発行：及びＭａｙｅｒ等、ＰＣＴ公開番号８８１０６４４２．１９８８ 年９月７日公開（これらの関連部分は、ここに参照のために記載されている）の 方法により、親水性の剤の存在下で、リポソームを脱水してもよい。他方或いは それに加えて、水和リポソーム製剤を液体窒素内の周囲媒体に入れ、脱水工程前 にそれを凍結させることにより、水和リポソーム製剤を脱水してもよい。

前もっての凍結を伴う脱水は、Ｂａ１ｌｙ等、ＰＣＴ公開番号８６１０１１０３ ．１９８６年２月２７日公開（その関連部分は、ここに参照のために記載されて いる）の技術による製法において、糖類のような一つ以上の保護剤の存在下で行 うことができる。このような技術は、製剤の長期保存及び安定性を高める。例え ば、０．５：１から１００：１の範囲、好ましくは２０：１の糖：脂質重量／重 量比で、装填された剤を再水和中に保持するリポソームの能力に影響を与えるこ となく、剤を糖溶液と混合することができる。上記リポソーム製剤の脱水には、 他の適当な方法を用いてもよい。

リポソームを脱水したら、それらを使用するまで、長期間保存することができる 。保存に適した温度は、リポソームの脂質組成及びカプセル化された物質の温度 感受性によって決まるであろう。

例えば、アミノ酸及びペプチドは、熱に不安定であり、従って、このような剤を 含む脱水リポソームは、剤の効能が失われないように、冷蔵条件下、例えば約４ ℃で保存しなければならない。また、このような剤については、脱水工程を、室 温よりもむしろ低温で行うのが好ましい。脱水リポソームを使用する場合は、水 溶液、例えば蒸留水又は適当な緩衝液を単にリポソームに加え、再水和させるこ とにより、再水和を行う。溶液を穏やかに渦巻かせて、リポソームを水溶液中に 再懸濁させることができる。再水和は、室温又はリポソーム及びそれらの内部含 有物の組成に適した他の温度で行うことができる。

膜内外ｐＨ勾配を発生させるのに用いられる濃度勾配は、脱水の前かあるいは再 水和の後に、上述の外部媒体交換技術を用いて、生成することができる。例えば 、リポソームを、膜内外ｐＨ勾配の設定前に脱水してもよく、例えば、それらの 第一の外部媒体から脱水してもよい。再水和の際、リポソームを相対的に酸性又 は塩基性ｐＨの第二の外部媒体と混合することにより、ｐＨ勾配を設定すること ができる。ｐＨ勾配の設定と同時又はその後に、剤をリポソームと混合すること ができる。膜内外ｐＨ勾配を持った後、リポソームを脱水する場合、それらを中 性ｐＨの水溶液と混合して、リポソームを再水和してもよい。例えば、第一の媒 体としてクエン酸緩衝液を含むリポソームを用いる上記の場合、再水和工程は、 Ｎ　ａ　Ｃ１／　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液と剤、例えばリジンメチルエステルを 添加することにより進行するであろう。

リポソームが、相対的に塩基性の溶液（例えば、Ｎ　ａ　Ｃｌ　／　ＨＥＰＥＳ ）をすでに含み、従って、すでに膜内外ｐＨ勾配を有している場合は、水又は他 の中性水溶液及び剤を加えて、再水和する。最後に、膜内外ｐＨ勾配を有し、剤 を含有するリポソームを脱水した場合は、水又は他の水溶液を用いて、再水和が 進行する。

一方、必要であれば、第二の剤を添加してもよい。

反復投与及び徐放性製剤を必要とする多数の病状又は薬理学的状態の治療におい て、本発明のアミノ酸及びペプチド製剤を含むリポソームを、哺乳動物、特にヒ トの治療に用いることができる。

本発明の剤含有リポソームの投与形態によって、その化合物が搬送される器官の 部位及び細胞が決まるであろう。

本発明のリポソームは、単独で投与されてもよいが、一般には、目的とする投与 経路及び標準製薬プラクナイスに間して選択される製薬担体と混合して、投与さ れるであろう。製剤は、非経口で、例えば静脈内に注射してもよい。非経口投与 については、それらを、例えば、等優性が必要又は所望であれば、溶液を等優性 にするのに十分な塩又はグルコースのような他の溶質を含んでもよい無菌水溶液 の形で使用することができる。本発明のリポソームは、皮下又は筋肉内に用いて もよい。その他の使用法は、製剤の特性に応じて、当業者が想像できるものであ ろう。

経口投与形態については、本発明のリポソーム製剤は、錠剤、カプセル、ロゼン ジ、トローチ、粉末薬、シロップ、エリキシル剤、水溶液、懸濁液等の形で使用 することができる。錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン 酸ナトリウム及びリン酸の塩を挙げることができる。デンプン、潤滑剤、タルク のような種々の崩壊剤が、一般に錠剤に用いられる。カプセル形態での経口投与 については、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコール である。経口用に水性懸濁液が必要な場合は、活性成分を乳化、懸濁剤と組み合 わせる。もし所望であれば、ある種の甘味及び／又は着香剤を加えることができ る。

局所投与形態については、本発明のリポソーム製剤を、ゲル、オイル、エマルジ ョン等のような投与形態に混入してもよい。これらの製剤は、クリーム、ペース ト、軟膏、ゲル、ローションなどの直接塗布により投与することができる。病状 又は薬理学的状態の治療でのヒトへの投与については、処方する医者が、特定の ヒト治療対象者への新生物性剤の適当な投与量を最終的に決めるであろう。そし て、これは、使用する剤の薬物動力学と共に、個人の年齢、体重及び反応によっ て変わるものと予測することができる。

また、患者の病状の性質及び重さ又は薬理学的状態も、投与養生（ｄｏｓａｇｅ 　ｒｅｇｉｍｅｎ）に影響を与えるであろう。リポソーム形態での薬剤投与量は 、一般に、遊離薬剤で用いられる量程度であると予測されるが、ある場合には、 これらの限度範囲外の投与量を投与する必要があるかもしれない。

次の実施例は、説明の目的でのみ与えられるものであり、この発明の範囲を限定 するものと考えるべきではない。

実施例 原料及び方法 卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）をＡｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ 。

Ｉｎｃ、、　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　Ａｌａｂａｍａから入手した。ＩＣ−メ チルアミン及び３Ｈ−トリフェニルホスホニウムプロミドをＮｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから購入した。使用した他の全ての化学薬品は、Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　！’１０．から購入 した。

リジンメチルエステルは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から購入した 。

疎水性ペンタペプチド（Ｈ，Ｓ　−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−、Ａｌａ −ＣＯＯ；ここで、カルボキシル官能基は、メチルエステル又はアミドとなるよ うに変性した。）は、ｄｅ　Ｋｒｏｏｎ等、ＢＢＡ、　９８１．３７１　（＋９ ８９）の固相合成法を用いて合成した。

実施例１ リポソームの膜内外ｐＨ勾配によるリジンメチルエステルの装填−ＥＰＣ小胞 １、、Ｏｍ、１クエン酸（３００ｍＭ）緩衝液中、ｐＨ４，０で５０ｍｇのＥＰ Ｃを水和することにより、多重ラメラ小胞（ＮｉＬＶ）を製造した。ＭＬＶを液 体窒素中で凍結し、５０〜６０℃において、水中で融解し、５回の凍結融解を行 なった。

得られたＭＬＶを、Ｈｏｐｅ等、ＢＢＡ、　８１２．５５　（１９８５）に記載 されているように、Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ　Ｉｎｃ、（Ｖａｎ ｃｏｕｖｅｒ、　Ｃａｎａｄａ）から取得した装置を用い、２枚重ねの１１００ ｎ細孔のポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）から１０回吐出 した。得られた大挙ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、ＮＩＣＯＭＰ粒子サイザーを用い る車外性光散乱（ＱＥＬＳ）で測定した直径が１１０８ｎであった。

ｐＨ４，０の媒体中のＬＵＶを、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 　（ｐＨ７，５）（Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、′ＨＢＳ’）で前もって平衡化 したｌｏｃｍの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（中位）カラムに通し、外部／内部 のｐＨが７．５／４．０のｐＨ勾配を発生させた。

まず、ｐＨ勾配を示すＬＵＶ　０．２５ｍ１を添加した１、０ｍｌ　ＨＢＳ媒体 に、０．４７ｍｇのリジンメチルエステル（２゜０ｍＭリジンメチルエステル） を溶解することにより、リジンメチルエステルの取り込みを開始した。２３℃で リポソームをインキュベートし、このインキュベーション混合物から、選ばれた 時間（図１参照）にその一部の０．１　ｍｌを取り出し、１　ｍｌ（乾燥）　５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラムに通すことにより、取り込まれなかった物質を 除去し、２５０Ｏｒｐｍで１分間遠心分離した。

実施例２ ｐＨ勾配無しの対照 ｐＨ４，０の媒体中のしＵＶを、ｐＨ４，０！、：おいて、３００ｍＭクエン酸 緩衝液で前もって平衡化した１０ｃｍの５ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（中位）カラ ムに通して、実施例１の方法を繰り返し、ｐＨ勾配を発生させなかった。

ｐＨ７，Ｏの媒体中でＬＵＶを作り、１５０ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭ　ＨＥＰＥ Ｓ　（ｐＨ７，５）（Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、ＨＢＳ”）で前もって平衡化 した１０ｃｒｎの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（中位）カラムに通して、同様に この方法を繰り返し、ｐＨ勾配を発生させなかった。

実施例３ ＥＰＣＬＵＶに装填されたリジンメチルエステルの謂定リジンメチルエステルの 標識第一級アミノ基に対してＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）を用い 、Ｈｏｐｅ及びＣｕ１ｌｉｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２．４３６ ０　（１９８７）が用いた方法を改変することにより、実施例１．２のＬＵＶの 内側のリジンメチルエステル濃度を測定した。標識に用いた緩衝液は、ｐＨ１０ ，０の１００ｍＭＮａ）Ｉｃ○１．５０ｍＭ　Ｈ，ＢＯ，であった。　２．５ｍ ｌの緩衝液（ｐＨ１，０，０）を含む対照吸収セルを、比較光束内に置いた。サ ンプル吸収セルは、２．５ｍｌの緩衝液（ｐＨ１０゜０）を０゜５ｍＭ　ＴＮＢ Ｓと共に含み、次いで、リジンメチルエステルを含む小胞の一部（５０ｕｌ）を 添加した。得られた吸光度変化を、暗所で１時間インキュベートした後、４２０ ｎｍで測定した。両吸収セルにトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００（２０ ０ｕ１．０．５％）を加えて、小胞を可溶化し、Ｔ　Ｎ　Ｂ　Ｓに対して存在す る全ての第一級アミノ基を露光した。活性剤存在下の吸光度を、１００％標識を 示すものとした。

実施例４ ｐＨ勾配と膜ポテンシャルの測定 Ｈｏｐｅ等、ＢＢＡ、　８１２．５５　（１９８５）及びＭａｄｄｅｎ等、Ｃｈ ｅｗ、　Ｐｈｙｓ。

Ｌｉｐｉｄｓ、　５３．３７　（１９９０）に示されているように、”ｃ−メチ レンアミン及び″Ｈ−１リフェニルホスホニウムブロミド（’　Ｈ−ＴＰＰ）を それぞれ用い、ｐＨ勾配と存在する膜ポテンシャルの大きさを測定した。用いた 濃度は、１ｕＣｉ／ｍｌであった。蓄積したプローブの量は、液体シンチレーシ ョン計数により測定した。膜内外ｐＨ勾配は、Ｍａｙｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、　２７．２０５３　（＋９８８）に示されているように、ｐＨ＝１ｏ ｇ　（［メチルアミン］　ｉｎ／［メチルアミン］　ｏｕｔ）の関係を用いて計 算することができた。

膜ポテンシャルは、’Ｈ−ＴＰＰについて同様に計算した（Ｈｏｐｅ等、ＢＡＡ 、　８１２．５５　（＋９８５）参照）、。

実施例５ リン脂質濃度の測定 リン脂質濃度は、Ｆｉｓｋ及びＳｕｂｂａｒｏｗ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、、　６６゜３７５　（１９２５）の方法を改変して計算した。代表的なリン 脂質濃度は、約３．０ｍＭであった。

実施例６ ＥＰＣＬＵＶ内へのリジンメチルエステルの装填結果図１は、白丸で示されるよ うに、内部が酸性（ここでｐＨ１＝４．０、ｐ　Ｈｏ＝　７　、５　）の実施例 １の方法により、リジンメチルエステルが、ＥＰＣＬＵＶ内に急速に蓄積するこ とを示す。アミノ酸は、インキュベーションの最初の５〜１０分で、最高濃度に 急速に装填された。測定されたｐＨ勾配の対応する低下も認められ、黒丸で示さ れ、右輪の目盛りを用いて読みとられた。ここで、勾配は、３．５から１９Ｈ単 位まで低下した。残留ｐＨ勾配のこのような低下は、中性の膜を透過した後のこ のメチルエステルのプロトン化によるものである。取り込まれた最高濃度は、リ ン脂質１ｕｍｏｌ当りリジンメチルエステル約８５ｎｍｏｌであった。この取り 込みの高濃度は、リジンメチルエステルが漏出することなく、少なくとも２４時 間保持された。

リポソームがｐＨ勾配を示さず（上記実施例２参照）、内部及び外部浴液が共に ｐＨ４，Ｏ（４゜Ｏ／４．０）（白四角）である場合、又は両者がｐ）（’７． ５　（７，５／７．５）（白三角）である場合は、リジンメチルエステルは、は とんどＬＵＶ内に取り込まれなかった（ｐ）Ｉ勾配を有する小胞について認めら れたもののわずかｉｏ％程度）。

実施例７ リポソーム膜内外ｐＨ勾配によるリジンメチルエステルの装填−ＥＰＣ：コレス テロール小胞 ＥＰＣ４３ｍｇとコレステロール１７ｍｇとを１．Ｃ）ｍｌのクロロホルムに溶 解して、ＥＰＣ：コレステロール（５５：４５ｍｏ１％）を作成した。次いで、 窒素気流下でクロロホルムを除去した後、引き続いて減圧下に貯蔵した。２０ｍ １のクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）を用いて、実施例１の方法を使用し、凍結解 凍したＭＬＶを作り、次いで同様に押し出して、ＬＵＶを形成した。

ＥＰＣ：コレステロール小胞の場合、押出工程は、６５℃で生じた、 実施例１に開示されているようにして、２０℃において、ｐＨ勾配が設定され、 リジンメチルエステルが小胞内に装填された。

リジンメチルエステルの装填工程を４℃及び３７℃で行なった状態で、上記方法 を繰り返した。実施例３．４及び５に従って、ＥＰＣ：コレステロール小胞内へ のリジンメチルエステルの装填量を測定した。

図２は、？、５／４．Ｏ（外部／内部）のｐＨ勾配を示すＬＵＶ内へのアミノ酸 装填の時間経過のグラフである。取り込みの時間経過は、３７°Ｃ（白四角）、 ２０℃（白三角）及び４℃（白丸）の取り込みインキュベーション温度において 報告されている。非常に高い濃度（リン脂質１　ｕｍ０１当り約７０　ｎｍｏｌ ）の装填が、３７℃では１０分以内、２０℃では１時間、４℃ではおそらく２２ 時間以上後で達成された。取り込まれたリジンメチルエステルの量は、高温（３ ７℃）での長期間（２０時間を越える）後でさえ、まったく安定なままであるこ とが再度わかった。

実施例８ 実施例１の方法を用い、２３℃で１時間のインキュベーションを行なって、アミ ノ酸リジンエチルエステルをＬＵＶ内へ装填した。このアミノ酸誘導体の装填は 、リン脂質１ｕｍｏ、１当りペプチド３７８．Ｏｎｍｏｌの値で起こった。

実施例９ 実施例１の方法を用い、２３°Ｃで１時間のインキュベーションを行なって、ボ ンベシン（ｐＧ　１　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇｌｙ−Ａｓ ｎ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　１−Ｇｌｙ−Ｈｉ　ｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅ　 ｔ−ＮＨ，）をＬＵＶ内へ装填した。このべブチド酸誘導体の装填は、リン脂質 １ｕｍｏｌ当りペプチド３４．６　ｎｍｏｌの値で起こった。

実施例１０ 実施例１の方法を用い、ガストリン関連ペプチド（Ｎ−ｔ−ＢＱＣ−Ｔｒｐ−Ｍ ｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ，）を、ＬＵＶと共に、２３℃で１時間インキュベ ートした。このインキュベーション期間の後、リン脂質１ｕｍｏｌ当りペプチド ２５．１　ｎｍ０１が、ＬＵＶ内に装填された。

実施例１１ 実施例１の方法を用い、ペプチドである成長ホルモン放出因子断片（Ｌｙｓ−Ｔ ｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ，）７４ｕｇを、ＬＵＶと共に、６０℃で ２時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、リン脂質１ｕｍ ｏｌ当りペプチド１．９５．Ｏｎｍｏｌが、ＬＵＶ内に装填された。

実施例１２ 実施例１の方法を用い、ペプチドである成長ホルモン放出因子断片（Ｌｙ　５− Ｔｙ　ｒ−Ｔ　ｒ　ｐ−Ｔ　ｒ　ｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ，）　７４ｕｇを、ＬＵＶと 共に、２３℃で２時間インキュベートし、その結果を図３に示す。２時間のイン キュベーション期間の後、リン脂質１ｕｍｏｌ当りペプチド約５５　ｎｍｏｌが 、ＬＵＶ内に装填された。図において、白四角は、７．５／４．０　（外部／内 部）の初期ｐＨ勾配での取り込み過程を示し、黒四角は、残留ｐ、　Ｈ勾配を示 すが、それは右輪の目盛りを用いて読みとられた。白丸は、ｐＨ勾配がない場合 の取り込み経過を示し、内部及び外部溶液が、両者とも最初ｐＨ７，５であった 。

比較例１３ 実施例１の方法を用い、アミノ酸誘導体であるヒスチジンメチルエステル（Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，）　０　 、４８　ｍｇを、２３℃でＬＵＶとインキュベートした。１時間のインキュベー ション後、装填は起こらなかった（脂質１ｕｍｏｌ当りペプチドＯｎｍｏｌが装 填）。

比較例１４ 実施例１の方法を用い、ペプチドである（Ｌｙｓ）、メチルエステル０．３４ｍ ｇを、２３℃でＬＵＶとインキュベートした。

約１時間のインキュベーション後、装填は起こらなかった（脂質ｌｕｍｏｌ当り ペプチドＯｎｍｏｌが装填）。

比較例１５ 実施例１の方法を用い、ペプチドである（Ｌｙ　ｓ　−（Ａ　１　ａ）、）メチ ルエステル０．９５ｍｇを、２３℃でＬＵＶとインキュベートした。約１時間の インキュベーション後、装填は起こらなかった（脂質１ｕｍｏｌ当りペプチドＯ ｎｍｏｌが装填）。

試 躯 ミ　フ か　− 八　Ｅ ）　ａ コ　＼ 一女 １１ｓ ミベ Ｈ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　クラークーレウイス、イアンカナダ国　ブリティッシュコロン ビア州（７２）発明者　グリス、ビータ−、アールカナダ国　ブリティッシュコ ロンビア州ヴイ６アール　１エイチ４　ヴアンクーバー　ウェストファーストア ベニュー　３７３２

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）膜を挟んで、一つもしくはそれ以上の荷電種（ｃｈａｒｇｅｄｓｐｅ ｃｉｅｓ）の濃度勾配を有し、該濃度勾配が、ペプチドをリポソーム内に装填さ せるようにする膜内外ポテンシャルを発生させることができるリポソームを調製 する工程、及び（ｂ）アミノ酸又はペプチドをこのリポソームと混合する工程、 からなるＣ末端置換アミノ酸類はペプチドをリポソームに装填する方法。
2. ２．濃度勾配が、 （ａ）一つもしくはそれ以上の荷電種の第一の濃度を有する第一の媒体をリポソ ーム内にカプセル化し、そして（ｂ〕一つもしくはそれ以上の荷電種の第二の濃 度を有する第二の媒体中に該リポソームを懸濁させることにより形成される請求 の範囲１の方法。
3. ３．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲２の方法。
4. ４．アミノ酸又はペプチドが、リジンメチルエステル、リジンアミド、リジンエ チルエステル、ボンベシン、ガストリン関連ペプチド又は成長ホルモン放出因子 断片である請求の範囲１の方法。
5. ５．請求の範囲１の方法によりリポソーム内に装填されたＣ末端置換アミノ酸又 はペプチドを含む医薬製剤。
6. ６．アミノ酸又はペプチドが、リジンメチルエステル、リジンアミド、リジンエ チルエステル、ボンベシン、ガストリン関連ペプチド又は成長ホルモン放出因子 断片である請求の範囲５の医薬製剤。
7. ７．Ｃ末端置換アミノ酸又はペプチドをその中にカプセル化したリポソームを含 み、該リポソームが、それらの膜を挟んで膜内外ポテンシャルを有し、この膜内 外ポテンシャルは、剤が正に帯電していれば、リポソームの内部ポテンシャルが 外部媒体のポテンシャルに対して負であり、剤が負に帯電していれば、リポソー ムの内部ポテンシャルが外部媒体のポテンシャルに対して正であるようになって いる医薬製剤。
8. ８．膜内外ポテンシャルが、リボソーム膜を挟んで一つ以上の荷電種の濃度勾配 を生成することにより作られている請求の範囲７の医薬製剤。
9. ９．濃度勾配がｐＨ勾配である請求の範囲８の医薬製剤。
10. １０．アミノ酸又はペプチドが、リジンメチルエステル、リジンアミド、リジン エチルエステル、ボンベシン、ガストリン関連ペプチド類は成長ホルモン放出因 子断片である請求の範囲７の医薬製剤。