JPH05503211A - 人間プラスミノゲン活性化因子抑制因子１（ｐａｉ―１）の変異体、それらの製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名称 人間プラスミノゲン活性化因子抑制因子１　（ＦＡＩ−１）の変異体、それらの 製造および使用 本発明は、組み換え型ＤＮＡ技術を使用する遺伝工学分野、改質された酵素の設 計および製造、並びにこれらの改質された酵素の薬品中での使用に関するもので ある。

より特に、本発明は血清プロテアーゼに対する改変された特異性を有する人間プ ラスミノゲン活性化因子抑制因子（ＦＡ　ｌ−１）の変異体、並びに遺伝的技術 処理をなされた有機体、特に微生物、を使用する該変異体の製造方法、並びにプ ラスミノゲン活性化因子を用いる腺維素溶解／血栓崩壊治療における変異体の使 用に関するものである。

プラスミノゲン活性化因子、特に人間組織−型ブラスミノゲン活性化因子ｔ−Ｐ Ａ、またはウロキナーゼ−型プラスミノゲン活性化因子Ｕ−ＰＡ、またはプラス ミノゲン活性化因子作用を有する非−天然構造体、を用いての腺維素溶解治療は 、例えば深部静脈の血栓症または心筋梗塞の如き血管の血栓性閉鎖（凝血）の治 療用の有効な方法である。しかしながら、腺維素溶解／血栓崩壊冶療における重 大な問題は最初は成功を収めた血栓崩壊直後に凝血が再び生じること（再閉鎖） である。種々の研究では、再閉鎖は冠状動脈における血栓崩壊に関するｔ−ＰＡ 治療後の臨床例の１０−３３％で観察されていた（コリーン（Ｃｏｌｌｅｅｎ） 　他、１９８４　；ヴエルストレート（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）他、１９８８　 、ＴＩＭＩ研究グループ、１９８５：ヴエルストレート他、１９８７）。

腺維素溶解治療中の凝固システムの明白な活性化が酵素トロンビンの生成をもた らし、次にそれがフィブリノゲンからの不溶性蛋白質フィブリンの生成を促進さ せ（オーウエン（Ｏｖｅｎ）他、１９８８）そして血小板を活性化させ、それが 血小板の凝固および血小板のフィブリンへの結合を促進させる（ケリンズ（Ｋｅ ｒｉｎｓ）池、１９８８）という事実のために再閉鎖を誘発させている。抗凝固 剤であるヘパリンを投与した時でさえ再閉鎖が起きるということは、この抗凝固 剤に対する治療変更への強い要望があることを示している。

プラスミノゲン活性化因子抑制因子型ｌ　（ＦＡＩ−１）は組織−型プラスミノ ゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼ−型プラスミノゲン活性化因子 （ｕ−ＰＡ）の両者の生理学的抑制因子であると考えられている。ＰＡＩ−１は 培養された血管内皮細胞により製造され、そして血小板のアルファー粒子中に存 在しており、そこから次に活性化でそれが放出される（シュリーフ（Ｓｃｈｌｅ ｅｆ）およびロスクトッフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）　、１９８８参照）。全ＰＡ Ｉ−１ｃＤＮＡのクローニングおよびそれのヌクレオチド配列の測定により、４ ０２個のアミノ酸類からなるブレーＦＡＩ−１蛋白質のアミノ酸配列の予測が可 能である（バネケーク（Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ）他、１９８６）、変異体ＰＡＩ− １がシスチン残基を含有していないことが重要な点であり、それは二硫化物架橋 用の還元−酸化工程なしにバクテリアである大腸菌中の生物学的機能性ＦＡＩ− １を直接的に表示する可能性を暗示している（バネケーク他、１９８６）。

さらに、ＰＡＩ−１のアミノ酸配列と他の蛋白質のものとの間の比較によりＦＡ Ｉ−１がセリンプロテアーゼ抑制因子の蛋白質優性材（いわゆるセルピン類）に 属していることがわかっている（バネケーク他、２９８６）。この抑制因子材に 属する員が共通の祖先から伝わっておりそしてそれらのアミノ酸配列の顕著な相 同性の観点から同様な三次元構造を有することが推定される（カレル（Ｃａｒｒ ｅｌｌ）およびポスウェル（Ｂｏｓｗｅ１１Ｌ１９８６）。セルピン類はそれら の個々の目標プロテアーゼとの等モル不活性複合体を形成し、この複合体はドデ シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）抵抗性である。セルビン反応性の原則は分子の個 々のカルボキシ−末端部分、すなわち反応性部位ＰＬ−ＰＩ’　（ＦＡＩ−１に 関しては、それぞれ位置３４６におけるアルギニンおよび位置３４７におけるメ チオニン、アンドレアセン（＾ｎｄｒｅａｓｅｎ）他、１９８６参照）を基にし ており、それは目標セリンプロテアーゼに対する偽−基質として呈されている（ トラヴイス（Ｔｒａｖｉｓ）およびサルヴエセン（Ｓａｌｖｅｓｅｎ）、１９８ ３）。異なる目標プロテアーゼに対するセルビンの特異性の少なくとも一部は反 応性中心のおよび付近の配列により引き起こされており、それは異なるセルビン 間で大きく変動しておりそして分子の残部よりはるかに急速な進化変動を多分受 けているであろう（ヒル（Ｂｉｌｌ）およびハスチー（Ｈａｓｔｉｅ）　、１９ ８９）。セリンプロテアーゼとセルピンとの間の相互作用は、プロテアーゼの活 性中心内のセリン残基およびセルピンのＰ１残基により行われる。セリンプロテ アーゼとセルピンとの間の複合体の生成は最終的にはＰｌ−およびＰ１′−残基 間のペプチド結合の加水分解をもたらす。プロテアーゼによる真の基質の開裂の この機構とは対照的に、セルピン−プロテアーゼ複合体は蛋白質分解方法におい ては比較的安定な中間生成物であると推定されており、Ｐｌ−およびＰ１′−残 基間のペプチド結合のそれの加水分解は非常にゆっくり進行する（トラヴイスお よびサルヴエセン、１９８３）。

他のセルピン類と比較して、培養された血管内皮細胞により分泌されるＦＡＩ− １はそれが活性な立体配座および不活性な開裂された立体配座を有しているだけ でなく、はとんど潜伏形であると見いだされている（ヘクマン（Ｈｅｋｍａｎ） およびロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）　、１９８５　）という点で独特な特 徴を有している。変性剤（ヘクマンおよびロスクトフ、１９８５）または負に荷 電された燐脂質（ランバーズ（Ｌａ＋１ｂｅｒＳ）他、１９８７）を用いる処理 により、この潜伏形は再活性化される。ＦＡＩ−１の他の性質は、それの活性形 においてそれが内皮下層マトリックス中に沈着しており、そこでそれは結合性蛋 白質ピクトネクチンとの複合体を形成していることである（ミムロ（Ｍｉｍｕｒ ｏ）およびロスクトフ、１９８９）。最近では、ＦＡＩ−１とピクトネクチンと の二元複合体も血漿媒体中で見いだされている（ライマン（Ｖｉｍａｎ）他、１ ９８８　：デクラーク（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ）他、１９８８）。内皮下層マトリッ クス中または血漿中でのこれらの分子の会合がＦＡＩ−１の活性形の部分的安定 化をもたらすことが知られている（ミムロ他、１９８７　；デクラーク他、１９ ８８）。さらに、ピクトネクチンおよびＦＡＩ−１の両者は活性化された血小板 から分泌されており、そしてその後に複合体の形で見いだされる。この観察は、 ピクトネクチンがプロテアーゼ抑制の局部的表示調節因子として機能することを 示している。

セルピン類、特にＦＡＩ−１、のプロテアーゼ特異性の測定における別の研究の 一部として、反応性中心部中に置換基を含有している全長ＰＡＩ−１ｃＤＮＡか ら現在では変異体が製造されている。これらの変異体は大腸菌中で表示され、均 買性となるまで精製され、そして活性化されている。この研究は、反応性部位中 およびその付近における特異的変異がそれの目標セリンであるプロテアーゼｔ− ＰＡおよび通常はＦＡＴ−１の目標ではないセリンプロテアーゼトロンビンに対 するＦＡＩ−１の反応性に影響を与えているという明白な指示を与えていた。野 性−型酵素（すなわち天然ＦＡＩ−１）と比べて、当該変異体は特にピクトネク チンの存在下ではトロンビンに対する大きな反応性を示すようである。

得られた結果から、ピクトネクチンがセルピンの活性に関する蛋白質補助因子で あり、セルピンＰＡＩ−１の目標特異性に強く影響を与えているようである。以 下で定義されているＦＡＩ−１変異体はピクトネクチンの存在下ではかなり有効 なトロンビン抑制因子となりそして同時にｔ−ＰＡに対するはるかに小さい反応 性を示すという驚異的な発見により、以下で述べられているような腺維素溶解／ 血栓崩壊治療の問題を解決するための真の将来性が生じる。本発明に従う新規変 異体の諸性質の組み合わせの生理学的意義は以下で説明することができる。トロ ンビン活性の変調は内皮細胞表面で生じ、そしてトロンボモジュリン（エスモン （Ｅｓａ＋ｏｎ）　、１９８９）または抗トロンビンＩＩＩと結合されたヘパリ ン（ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）およびダムス（Ｄａｍｕｓ）　、１ ９７３）を含んでいる。これまでには、成長中の血小板に富んでいる血栓のとこ ろでのトロンビン活性の調節は記載されていない。最近、トロンビンで血小板を 活性化するとピクトネクチンおよびＦＡＩ−１の両者が放出されそして複合体と して単離できることが示されている。そのような環境では、複合体はトロンビン 活性の関連調節因子として機能することができる。このことは、ＦＡＩ−１がｔ −ＰＡおよびｕ−ＰＡの両者の主要抑制因子として作用するというそれの公知の 抗−腺維素溶解機能の他に未知の抗−凝固剤活性も示していることを意味する。

野性−型ＰＡＩ−１ではこの抗−凝固剤活性は比較的弱いが、ここに記載されて いる変異体はそれらの補助因子であるピクトネクチンの存在下では多少の程度の 差こそあれトロンビンの有効な抑制を行う能力を有している。

血漿は補助因子として行動する大量のピクトネクチン（血漿中のピクトネクチン の濃度は約３００μｇ／ｍ＋である）を含有しているため、この性質は血栓崩壊 治療において使用することができる。本発明に従うＦＡＩ−１変異体を静脈内投 与する時には、それがピクトネクチンと結合しそしてその結果として強力なトロ ンビン抑制因子になるが、同時にそれはＦＡＩ−１の典型的な目標であるプラス ミノゲン活性化因子の抑制因子としてははるかに無効に機能するであろう。本発 明に従う変異体の他の利点は、ＦＡＩ−１がフィブリンと結合するため（ムラヤ マ（Ｍｕｒａｙａｍａ）およびパン（Ｂａｎｇ）　、１９８７　；ケイジェル（ Ｋｅｉｊｅｒ）他、１９８８）、変異体は多分ピクトネクチンとの複合体の形で それら血栓（これは本質的にフィブリンおよび血小板からなっている）に向けら れそしてそこで変異体はその後トロンビンの活性を抑制しその結果として再閉鎖 を予防することである。

従って、本発明は主として人間プラスミノゲン活性化因子抑制因子１（ＦＡＩ− １）　、すなわち本質的にアミノ酸配列（−文字コードに従う）ＳＧＴＶＡＳＳ ＳＴＡＶＩＶＳＡＲＭＡＰＥＥＩ　ＴＭＤからなる反応性中心部が、全部または 部分的に、それの反応性中心が本質的にアミノ酸配列（−文字コードに従う）Ｅ ＧＳＥＡＡＡＳＴＡＶＶＩＡＧＲ３ＬＮＰＮＲＶＴＦＫＡＮからなっている抗ト ロンビンＩＩＩ　（ＡＴＩＩＩ）の対応する部分により置換されている変異体、 を提供するものである。

少なくともＦＡＩ−１の位置Ｐ１およびＰ１′におけるアミノ酸類ＲＭが対応す る位置におけるＡＴＩＩＩのアミノ酸類Ｒ３により置換されている変異体が好適 であり、少なくともＰＡＩ−１の位置Ｐ２−Ｐ２’におけるアミノ酸類ＡＲＭＡ が対応する位置におけるＡＴＩＩＩのアミノ酸類ＧＲＳＬにより置換されている 変異体がさらに好適である。少なくともＦＡＩ−１の位置ｐ３−ｐ３’における アミノ酸類ＳＡＲＭＡＰが対応する位置におけるＡＴＩＩＩのアミノ酸類ＡＧＲ ３ＬＮにより置換されている変異体が最も好適である。

この好適性のために、本発明が反応性中心ＰＬ−ＰＬ’に関する対称的置換が起 きている変異体にだけ関連しているという印象を与えるかもしれないが、これは 決してそうではな（そして本発明は多少とも非対称性である変異体も包括してい る。

上記の反応性中心の部位はＡＴＩＩＩおよびＰＡＩ−１の両者に関して表１に指 定されている。本発明に従う変化は反応性中心部分、すなわち表１中の２個の箱 （ＥＶＮＥおよびＲＰＦＬ）の間の部分、に制限されている。

ＰＩＰＩ’ ＡＴＩＩＩ　ＥＶＮＥ　ＥＧＳＥＡ＾ＡＳＴＡＶＶＴＡＧＲ５ＬＮＰＮＲＶＴＦ ＫＡＮ　ＲＰＦＬＰＡＩ−Ｉ　ＥＶＮＥ　５ＧＴＶＡＳＳＳＴＡＶＴＶＳＡＲＭ ＡＰＥＥ−−−ＩＩＭＤ　ＲＰＦＬ本発明は変異体自体に関するだけでなく、少 なくも一部が本発明に従う新規なＦＡＩ−１変異体に対してコード付けしている ような組み換え型ポリヌクレオチド類も包含している。本発明に従う組み換え型 ポリヌクレオチド類は変異した遺伝子自身からなることもでき、または媒介体部 分および挿入部分からなることもでき、挿入部分は本発明に従うＰＡｌ−１変異 体をコード付けするヌクレオチド配列を含んでいる。「組み換え型ポリヌクレオ チド類」という語は、組み換え型ＤＮＡおよび組み換え型ＲＮＡの両者を含んで いる。当技術の最近の現状では、組み換え型ＤＮＡは例えば特異的宿主有機体中 でのクローニングおよび／または表示用に適している媒介体を基にしている組み 換え型プラスミドの形で含まれているであろう。媒介体として適している多種の 宿主有機体、例えば大腸菌バクテリア用の種々のｐＵＣプラスミド類、が知られ ている。

そのような組み換え型ポリヌクレオチドにより転換された宿主有機体をその後Ｐ Ｉ−１変異体の製造方法で使用することができる。ＰＡｆ−１変異体のこの製造 方法も本発明の範囲内に入る。

本発明に従う変異体の驚異的性質の上記の生理学的意義の観点では、本発明はさ らに本発明に従うＦＡＩ−１変異体を１種以上の薬学的に許容可能な担体および ／または助剤と組み合わせて含んでいる薬学的に調合物、並びに再閉鎖の発生を 予防するためのプラスミノゲン活性化因子を用いる腺維素溶解／血栓崩壊治療に おける本発明に従うＦＡＩ−１変異体の使用も包括している。

本発明を下記の実験部分および対応する図面を参照しながらさらに親図１は、Ｐ 、ｌ−１およびそれの変異体のｔ−ＰＡ抑制作用の滴定結果を示している。種々 の量の種々の抑制因子を１時間にわたり３７℃において二鎖ｔ−ＰＡ　（１，５ ｎｍ）を用いて５０μｍの合計量の中で培養した。次に０．５ｍＭの合成基質Ｈ −Ｄ　−ｉ　１　ｅ−ｐ　ｒ　ｏ−ａ　ｒ　ｇ　−ｐ−ニトロアニリン（Ｓ　２ ２８８）を加え、そして４０５ｎｍにおける吸収の増加が培養時間に対してプロ ットされている線状プロットから残基ｔｐ活性を測定した。図１は、試験した種 々の抑制因子に関して加えられる抑制因子の量（六ノグラム）によって残基ｔ− ＰＡ活性（％）がどのように変動したかを示している。培養された内皮細胞（Ｅ ＣＣＭ−ＰＡ４−１）の調整培地から得られたＦＡＩ−１に関する結果は四角に より表示されており、組み換え型の野性−型ＰＡＩ−１は丸により表示されてお り、変異体ＰＡＴ−ＩＰ３−Ｐ３’ＡＴＨＩは三角により表示されており、そし て変異体ＰＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩＩＩは菱形により表示されている。

図２は、野性−型ＦＡＩ−１および本発明に従う変異体の両者によるトロンビン の抑制に対するピクトネクチンの効果を示している。終わりまで、ピクトネクチ ン対（変異体）ＰＡＩ−１のモル比をトロンビン抑制率に対してグラフＡ中にプ ロットした。丸は、３．７５ｎＭの野性〜型ＰＡＩ−１を０．１５ｎＭトロンビ ンおよび指定量のピクトネクチンと共に６０分間培養した時の結果を示している 。三角は０．７５　ｎＭの変異体ＰＡ■−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩＩＩを用いた同 様の実験に関する結果を示しており、四角は０．７５ｎＭの変異体ＰＡＩ−ＩＰ ３−Ｐ３’ＡＴＩＩＩを上記濃度のトロンビンおよびピクトネクチンと共に培養 した時の結果を示している。

図２のグラフＢは、０．１５ｎＭのトロンビンを１時間にわたり３７０Ｃにおい て領７５ｎＭの変異体ＦＡＩ−ＩＰ３−Ｐ３’ＡＴＩＩＩと共に０．８ｎＭのピ クトネクチンの存在下または不存在下で培養した実験に関するものである。残存 トロンビン活性を以下に記載されている方法で測定し、そしてピクトネクチンの 存在下では約５０％においてそしてピクトネクチンの不存在下では１００％にお いて固定させた。兎のポリクローン性抗血清（４ｍｇ／ｍｌ）を精製されたピク トネクチン（プレイスネル（Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ）他、１９８５）に対して隆起 させ、そして硫酸アンモニウム沈澱およびＤＥＡＥ−セフ７セル上でのクロマト グラフィーにより部分的に精製した。対照として、精製された人間ヴオン・ウイ レブランド因子（ダコバソツ、グロストラップ、デンマーク）に対して隆起させ た兎の免疫グロブリン類を使用した。ピクトネクチンを加える前に抗血清を指定 された希釈度で反応混合物に加え、そして残存トロンビン活性を測定した。

抗血清の不存在下であるが０．８ｎＭのピクトネクチンの存在下での残存トロン ビン活性は任意に１００％に固定されていた。三角は抗−ピクトネクチンが存在 している場合の結果を示しており、菱形は抗−ヴオン・ウィレブランドが存在し ている時の結果を示している。

実験部分 大腸菌からのＦＡＩ−１およびＦＡＩ−１変異体の表示および精製Ｐ、ｌ−１の 反応性部位Ｐｉ−ＰＬ’のアミノ酸残基およびその付近のアミノ酸残基がトロン ビン抑制因子である抗トロンビンＩＩＩ　（ＡＴ■ＩＩ）のものにより置換され ている２種の置換変異体を製造した：ポック他、１９８２、カレルおよびポスウ ェル、１９８６参照。第一変異体は抗トロンビンＨＩのＰｉ−ＰＩ’配列を含ん でいたが、ＦＡＩ−１蛋白質の残部は未変更のままであった。第二変異体は抗ト ロンビンＩＩＩのＰ３−Ｐ３′配列を含んでいたが、これもＦＡＩ−１蛋白質の 残部は未変更のままであった。ＦＡＴ−１およびＦＡＩ−１変異体の形質転換細 胞大腸菌における表示に関しては、厳密に規則化されたトリプトファンプロモー ター−オペレーターを使用し、それは１リツトルの培養された細胞当たり１０− ４０ｍｇの高収率をもたらす。細胞の溶解後に、ＰＡＩ−１およびそれから誘導 された変異体を三段階精製方法を用いて精製し、そこではＱ−セファロース・フ ァスト・フロー・クロマトグラフィーおよび不動化された抗−ＰＡＩ−１モノク ロ一ン性抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーを行った。非−還元性条件 下での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０重量／容量％のポリアクリルアミ ドゲル、その中に０．２重量／容量％の５ＤＳ）上での電気泳動および銀着色に よる蛋白質の分析は、単独蛋白質帯を示した（結果はここには示されていない） 。

予期されていた如く、大腸菌中のグリコジル化が存在しないために、組み換え型 蛋白質の見掛は分子量は培養された内皮細胞の調整培地からのグリコジル化され たＦＡＩ−１（ＥＣＣＭ−ＰＡＡ−１；ランバーズ（Ｌａｌｌｂｅｒｓ）他、１ ９８７参照）のものよりわずかに低かった。培養された血管内皮細胞の調整培地 から単離された精製された人間ＦＡＩ−１に対して向けられているマウスのモノ クローン性抗体を使用する免疫汚染分析においては、蛋白質着色中と同じ模様が 観察された（これらの結果はここには示されていない）。

精製された抑制因子を使用して二次率定数を目標血清プロテアーゼｔ−ＰＡおよ び通常は目標ではない血清プロテアーゼトロンビンと共に測定した。調合物を使 用して、反応速度定数および抑制機構に対する内皮細胞マトリックスおよび血漿 からのＰＩ−１結合蛋白質であるビトロネクチンの影響も試験した。

ｔ−ＰＡの抑制 ｔ−ＰＡに対する精製されたＦＡＴ−１、ＦＡＩ−１変異体およびＥＣＣＭ−Ｐ ＡＩ−１の抑制因子能力を、酵素を１時間の比較的長期間中に増加させた量の種 々の抑制因子と共に培養し、その後に残存ｔ−ＰＡ活性を測定することにより、 測定した。図１に示されている如く、抑制因子活性は全ての試験した４種の抑制 因子に関して事実上同じであり、そのことはグアニジン−ＨＣｌ誘発活性化と匹 敵する応答を示している。

精製されたＥＣＣＭ−ＦＡＩ−１、ＦＡＴ−１およびＰＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’Ａ ＴＴＩＩに関する二次会合速度定数は事実上同じであった（それぞれ３４．３． ２および２．５Ｘ１０７Ｍ−１秒一つ。この観察は、ＦＡＩ−１のグリコリル化 がｔ−ＰＡとの相互作用にとって必須ではないことを示している。さらに、Ｐ１ ′位置におけるメチオニン残基のセリンによる置換は変異体ＰＡ　Ｉ−Ｉ　Ｐ　 １−Ｐ　１’ＡＴＩＩＩの性質の観点ではｔ　−ｐＡの抑制に本質的に影響を与 えていないようである。一方、ＦＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＨＩ抑制因子はｔ− ＰＡ抑制に関してＦＡＩ−１より２５−５０倍も低い二次速度定数（０，８４Ｘ 　１０’Ｍ−’秒−１）を有しており、これはｔ−ＰＡに対する特異性に関する ＰＬ−Ｐｉ’と隣接する残基の重要性を強調している。さらに、ＦＡＩ−１より モル過剰のピクトネクチンの存在はいずれの抑制因子中でもｔ−ＰＡを用いる抑 制因子の二次速度定数に影響を与えないようであり、これはＥＣＣＭ−ＦＡＩ− １に関してこれまでに報告されている観察（デクラーク他、１９８８）と一致し ている。

トロンビンの抑制 ＦＡＴ−１並びにＦＡＩ−１／抗トロンビンＩＩＩハイブリツド類、すなわちＦ ＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩＩＩおＪ：びＰＡ　Ｉ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＩＩＩ 、の二次速度定数をトロンビンを用いて測定する前に、ＦＡＩ−１の結合性蛋白 質がＦＡＩ−１またはＦＡＩ−１変異体およびトロンビンの間の相互作用に影響 を与えたかどうかを検査した。驚くべきことに、ピクトネクチンはＦＡＩ−１の トロンビン抑制能力を相当増加させたようであり、そして変異体中で、特に変異 体ＰＡｒ−ＩＰ３−Ｐ３’ＡＴＩＩＩ中で、顕著であった。はぼ等モル濃度のピ クトネクチンおよびＦＡＩ−１においては、図２のグラフＡに示されている如（ 、トロンビンの半分の最高抑制が観察された。ピクトネクチンの代わりに牛血清 アルブミンを使用した時には、トロンビン抑制における増加は観察されず（結果 は示されていない）、そして精製されたピクトネクチンに対して隆起されている ピクトネクチンおよび親和性精製されたポリクローン性抗体の両者の存在下でも トロンビン抑制における増加は観察できながった（図２のグラフＢ参照）。従っ て、Ｐｌ−１およびそれの変異体によるトロンビンの抑制に対するピクトネクチ ンの影響はｔ−ＰＡ上の抑制に対する影響とは非常に顕著に異なっている。後者 の場合には、ピクトネクチンはそれの半値期間を２−３倍延長させることにより ＦＡＩ〜１の活性形の安定化だけをもたらし、それの抑制因子能力は増加させな かった。

次に、最適濃度のピクトネクチンの存在下または不存在下でのＦＡＩ−１、ＰＡ Ｔ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩＩＩおよびＰＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＩＩＩに関す るトロンビンを用いる二次速度定数を測定した。結果は表２に示されている。そ れは、ＰＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＩＩＩがＰＡｒ−１より１０倍はど良好であ るかまたは速いトロンビンの抑制因子であることを明らかに示しており、それは 抗トロンビンＩＩＩのＰ３−Ｐ３’残基がトロンビン抑制にとって重要であるこ とを示している。それとは対照的に、明らかに、Ｐｌ’残基すなわちＦＡＩ−１ の場合にはメチオニンまたはＰＡｒ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩｒｌの場合にはセＩ ）ンはｔ−ＰＡ抑制におけるものと同様な方法ではトロンビン抑制においてあま り重要ではない。ＦＡＩ−１およびそれから誘導される変異体の両者のトロンビ ンとの会合速度はピクトネクチンの存在下では１００−２００倍に増加し、それ １ｔＰＡＩ−１、ＦＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩＩｒおよびＥｃｃＭ−ＰＡｌ− １に関する１、６−２．９ｘｌＯ５Ｍ−’秒−１およびＰＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ ＡＴＨＩに関する１、　８　ｘ　１０６Ｍ−１秒−１の匹敵するｋＩ値を生じた 。これらの結果も大腸菌源のＦＡＩ−１および内皮細胞がら生じたＰＡｌ−１の 明白な同一性能を示している。

特にピクトネクチンの存在下では、変異体蛋白質ＦＡＩ−ＩＰ３−Ｐ３’ＡＴＩ ＩＩは有効なトロンビン抑制因子として機能するようである。蛋白質ピクトネク チンはＦＡＴ−１によるトロンビンの抑制用の補助因子として作用するようであ る。

トロンビンとの複合体生成 トロンビン抑制に対するピクトネクチンの影響がプロテアーゼとセルビンとの間 の５ＤＳ−安定性複合体の生成の投与量依存性増加によるものであるかどうかを 測定するために、１２４１　Ｑｌｌ識の付いたトロンビンをＰＡＩ−１または有 効なトロンビン抑制因子であるＰＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＩＩＩおよび増加し た濃度のピクトネクチンと共に培養した。混合物を次に非−還元性条件下での５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動およびその後のフルオログラフィ ーにより分析した（結果はここでは示されていない）。増加した濃度のピクトネ クチンはトロンビンおよび２種のセルピン類のそれぞれとの間の５ＤＳ−安定性 複合体の生成を増加させた。９０％以上のトロンビンが３＠過剰のＰ、１−ＩＦ ５−Ｐ３’ＡＴＨＴの条件下でトロンビンおよびピクトネクチンに対して最適濃 度において複合体中で見られた。例えばグアニジン−ＨＣｌを用いるＦＡＩ−１ の活性化は複合体生成の予備条件であり、その理由は活性化が省略された時には 複合体化されたトロンビンは見られないからである（データはここでは示されて いない）。従って、ピクトネクチンによるトロンビンとＦＡＩ−１およびそれか ら誘導された変異体との間の会合速度における増加はトロンビンと抑制因子との 間の５ＤＳ−安定性複合体の比較的有効な生成によるものであるようである。

使用された実験条件下では変異体ＰＡ　ｌ−１Ｐ３−Ｐ３’ＡＴＩＩＩがｔ−Ｐ Ａのものより３倍はど良好なトロンビンの抑制因子であるという事実により、Ｐ Ａｌ−１の反応性中心部分の大部分がＡＴＩＩＩの対応する部分により置換され ている人間プラスミノゲン活性化因子抑制因子１の別の変異体が少なくとも腺維 素溶解／血栓崩壇冶療における見込みのある助剤であることは当然である。

ビンの抑制に関する二次速度定数（ｋｌ）誘導体　ピクトネクチン　ｋｌ（Ｍ− １秒−リＰＡ　Ｉ　−１１，１＋／−０，２Ｘ　１０３ＰＡＩ−１＋　２．２＋ ／−０，４ｘｌＯ’ＰＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’Ａ７３　３．１　＋／−１，Ｏｘ　 １０３ＰＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴ３　＋　２．９＋／−０，６ｘ１０５ＰＡ　 Ｉ−Ｉ　Ｐ　１−Ｐ　１’ＡＴ３　１．３　＋／−０，５ｘ　１０’ＰＡＩ−Ｉ ＰＩ−Ｐ１’ＡＴ３　＋　１．８　＋／−０．４Ｘ１０’二次速度定数（ｋｌ） を以下に記載されている工程に従い測定した。

物質 制限エンドヌクレアーゼ類はニューイングランド・バイオブールたはベテスダ・ リサーチ・ラボラトリーズから購入した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはファ ーマンア（アップサラ、スエーデン）から得られ、そしてＤＮＡポリメラーゼの レナウ・フラグメントはベーリンゲル・マンハイム・バイオケミカルズから得ら れた。Ｍ１３ｍｌ）１８ａｍ４ＤＮへの複製形（ＲＦ）は英国コルチェスターの アングリアン・バイオテクノロジー・リミテッドから得られた。配列ＤＮＡポリ メラーゼはユナイテッド・ステーブ・バイオケミカルズから購入された。カザミ ノ酸ＭＣＬ＝トリプトファン欠落）はディフコから得られた。合成基質であるＨ −Ｄ−イソロイシン−プロリン−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（８２２８８ ）およびＨ−Ｄ−フェニルアラニンーピペコリルーアルギニンーｐ−ニトロアニ リド（Ｓ　２２３８）はケビヴイツルム（ストックホルム、スエーデン）から得 られ、モしてＱ−セファローズ・ファスト・フローはファーマンア（アップサラ 、スエーデン）から得られた。アンピシリンおよび膵臓ＤＮＡ５ｅＩはシグマ・ アンド・カンパニーから得られ、そしてアルカリ性フォスファターゼと結合され た山羊の抗−マウス■ｇＧはプロメガから得られた。大腸菌トリプトファンオペ ロンのプロモーター−オペレーターを含有しているプラスミドｐＭＢＬ、１１は オランダ、リーズウィークのメディカル・バイオロジカル・ラボラトリ−ＴＮＯ から得られ、そして大腸菌に１２菌株１０４６　（ｒｅｃＡ−）はオランダ、ウ トレヒト州立大学のファバゲン・コレクションから得られた。セファローズと共 有結合された人間ＦＡＩ−１に対して向けられたマウスのモノクローン性抗体Ｍ ＡＩ−１３はバイオプール（ウメア、スエーデン）から購入された。

蛋白質 ポラス黒腫誘発性の二鎖ｔ−ＰＡ　（９１０００１Ｕ／ｍｇ）はバイオブール（ ウメア、スエーデン）から購入された。明白な均質性となるまで精製された人間 トロンビンはザ・ネザーランズ・レッド・クルス、輸血協会の中央研究所、血液 凝固部門から得られた。ｐ−ニトロフェニルｐ′−安息香酸グアニジノ（チェー ス・アンド・シャク、１９７０）１用いる精製トロンビンの活性部位滴定は５、 Ｏｍｇ／ｍｌの濃度を生じ、この値はブラッドフォード工程に従う４．５ｍｇ／ ｍ＋の蛋白質濃度の測定値と良く一致している。トロンビンにはイオドゲン方法 を用いて＋２５１標識が付けられており、１６μＣｉ／μｇの蛋白質の特異的放 射活性を生じた。ピクトネクチンは人間血漿から１９８５年にブレイスナー（Ｐ ｒｅｉｓｓｎｅｒ）によりこれまでに記載されている如くして明白な均質性にな るまで精製した。ＦＡＩ−１は、培養された転換大腸菌細胞の溶解物からの組み 換え型ＦＡＴ−１の精製に関して以下に記載されている三段階工程を用いて培養 された人間の―静脈内皮細胞の調整培地から精製された。

一般的方法 プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファージＭ１３ＤＮＡ単離、制限フラグメン ト単離、核酸との酵素反応およびバクテリア性転換を含む標準的な分子−生物学 的技術をマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他（１９８２）により記載されている 如くして行った。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他、１９７７のンデオキシ鎖−終結 方法を使用して配列ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列測定を行った 。自動式合成器（アプライド・バイオシステムズ、モデル３８１Ａ）上での固相 燐アミダイド化学法により合成オリゴヌクレオチド類を合成した。

表示プラスミド類の製造 人間ＰＡＩ−１蛋白質およびそれの変異体にコード付けしそして転換大腸菌中の 生物学的に機能性であるＦＡＩ−１，蛋白質の表示用に適しているプラスミド類 は下記の如くして製造された。全長の人間ＰＡＩ−１ｃＤＮＡは発明者（バネコ ーク他、１９８６）によりこれまでに記載されているプラスミドｐＵＣ８／ＰＡ ｒｅｘから得られた。全長のＰＡＩ−１ｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列および誘 導されたＦＡＩ−１アミノ酸配列はこれまでに報告されている（バネコーク池、 １９８６）。プラスミドｐＵＣ８／ＰＡＩｅｘを制限エンドヌクレアーゼΔｐａ Ｌ１と共に培養し、そして生成したフラグメントをＤＮＡポリメラーゼＩのレナ ウ・フラグメントを用いてプラントエンド（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）にした。次に 、生成したＤＮＡ調合物を制限エンドヌクレオチドＢｇ±ＩＩと共に培養し、そ して生成したフラグメントをアガローズゲル電気泳動により分離した。全部のＦ Ａ　Ｉ−１コード付は配列を含有している希望するＡｐａＬｌ（プラントエンド 化された）−ＢｇｌＩＩフラグメント（約１３００塩基対）を標準的工程（マニ アチス他、１９８２）を使用して同定し、単離し、そしてゲルから精製した。プ ラスミドｐＭＢＬＩＩを大腸菌中の種々の組み換え型蛋白質用の表示媒介体とし た使用した。表示媒介体の選択はここに記載されている発見に関して特に重要で はない。大腸菌に関して多くの他の良く制定されている表示媒介体もここで使用 されている媒介体と同等に良く機能することができる。媒介体ｐＭＢＬ１１は大 腸菌トリプトファンプロモーター−オペレーター調節因子およびぺ一ターラクタ マーゼ用の遺伝子を運んで、抗生物質であるアンピンリンに対する抵抗性を与え た。ｔｒｐＥ遺伝子の第６コドンすなわちトリプトファンオペロンの最大のプロ モーター−ブロキシマルジーンの直後に、制限エンドヌクレアーゼ類ｘｈ旦■、 旦呈±目およびＢａｍＨＩに対する独特の制限部位を含有している多重クローニ ング部位（５’ＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＴＣＣ３’）を加えた。ｐＭＢ Ｌｌｌを制限エンドヌクレアーゼ旦呈±冊を用いて開裂させ、次にＤＮＡポリメ ラーゼＩのレナウ・フラグメントを用いてプラントエンド化させ、そしてントを 電気泳動後にアガローズゲルから単離し、そして上記の約１３００塩基対長さの 八ｐａＬ１　（プラントエンド化された一Ｂｇ工冊フラグメントに配位させて、 プラスミドｐＭＢＬ１１／ＦＡＩ−１を生成した。関連する縮合された制限部位 のヌクレオチド配列は以上で略記されているＤＮＡ配列方法により制定された。

オリゴヌクレオチド−指定された変異生成制限部位 ＥｃｏＲＩ−ＢｓｍＩ　−３ｆ　ｉ　ｒ−Ｎｓ　ｉ　Ｉ−Ｎｃｏ　Ｔ−３ａ　］ 　１を含有している（「上部」菌株の）配列５’　ＧＡＡＴＴＣＧ＾＾ＴＧＣＣ ＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＣ３’を有す るリンカ−分子の２種の菌株を合成しそしてファージＭ１３ｍｐ１８μｍ４ＲＦ ＤＮＡの多重クローニング部位のＥｃｏＲｒ−３ａ　ｌ　Ｉ部分を置換するため に使用した。全長の人間ＰＡＩ−１ｃＤＮＡからの（３３０塩基対）　Ｓａｌ　 ｌ−Ｎｓ　ｉ　Ｉ制限フラグメント（それぞれ位置１０４５および１３７５に相 当する）をこの改質されたＭ１３ｍｐ１８ａｍ４ＲＦ中に挿入した。生成した単 −鎖鋳型上での部位−指定された変異生成はクラマー（Ｋｒａｍｅｒ）他、１９ ８４に従い行われた。ＦＡＩ−１のＰ１′（メチオニン）が抗トロンビンＩＩＩ の対応する残基（セリン）により置換されているＦＡＩ−１の誘導体（ポック、 １９８２　；カレルおよび、１９８６）に対するｃＤＮＡコード付けを作成する ために、下記の合成オリゴヌクレトオチド。

５’　ＧＴＣＡＴＡＧＴＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧ ＡＴＣＡＴＣ３’を合成して、最終的にはＰＡＩ−ＩＰＩ−Ｐ１’ＡＴＩＩＩと 示されている変異体ｃＤＮＡを生成した。ＦＡＩ−１のＰ３、Ｐ２、Ｐ１′、Ｐ ２’およびＰ３’が抗トロンビンＩＩ丁の対応する配列のアミノ酸残基により置 換されているＦＡＩ−１の誘導体に対するｃＤＮＡコード付けを作成するために 、下記の合成オリゴヌクレトオチド：５’　ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＡＧ ＴＣＧＣＣＧＧ＾＾ＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧ ＡＣ３’を合成して、最終的にはＰＡＴ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＩＩＩと示されて いる変異体ｃＤＮＡを生成した。全部変異された５ａｌＩ−ＮｓｉＩ制限フラグ メントのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列化により変動させた。最後に、変異Ｎｓ ±ｌ−３ａｌＩフラグメントを単離して、表示プラスミドであるｐＭＢＬ１１／ ＰＡＩ−１の未変異の対応するフラグメントを置換して、それぞれプラスミド類 ｐＰＡＩ−１／ＰＬ−Ｐｉ’−ＡＴＩＩＩおよびＰＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴｌ ＩＩを生成シタ。ｐＡＩ−１の反応性中心付近のアミノ酸配列並びにＦＡ　Ｉ　 −１／Ｐ　１−Ｐ　Ｌ’−ＡＴＩＩＩおよびＰＡＩ−ＩＦ５−Ｐ３’ＡＴＩＩＩ の７ミ／酸Ｗ換を、「野性−型ＪＰＡＩ−１と比較して、表３に表示する。

嚢−−Ｊ ＦＡＩ−１、ＦＡＩ−１／ＰＩ−ＰＬ’−ＡＴＩＩＩおよびＰＡＴ−ＩＦ５−Ｐ ３’ＡＴＩＩＩの反応性中心付近のアミノ酸配列 誘導体　Ｐ４　Ｐ３　Ｐ２　Ｐｉ　ＰＩ’　Ｐ２’　Ｐ３’　Ｐ４’ＰＡＩ−１ ｖａｔ　ｓｅｒ　ａｌａ　ａｒｇ　ｍｅｔ　ａｌａ　ｐｒｏ　ｇｌｕＰＡＩ−Ｉ 　ＰＩ−ＰＩ’＾ＴＩＩＩ　ｖａｌ　ｓｅｒ　ａｌａ　ａｒｇ　ｓｅｒ　ａｌａ 　ｐｒｏ　ｇｌｕＰＡＩ−Ｉ　Ｐ３−Ｐ３’＾ＴＩＩＩ　ｖａｌ　ａｌａ　ｇｌ ｙ　ａｒｇ　ｓｅｒ　ｌｅｕ　ａｓｎ　ｇｌｕ反応性中心（Ｐｉ−ＰＬ’）を構 成している残基の制定はこれまでに記載されている（アンドレアセン他、１９８ ６）。表３では、アミノ酸残基は三文字コードで表示されている。野性−型ＰＡ Ｉ−１と変異体蛋白質ＦＡ　Ｉ−１／ＰＬ−ＰＬ’−ＡＴＩＩＩとのアミノ酸配 列間の差は、５ｅｒ−３４７によるｍｅｔ−３４７の置換である。変異体蛋白質 ＰＡＩ−ＩＰ３−Ｐ３’ＡＴＩＩＩはＰＡＩ−１と比べて位置Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１ ′、Ｐ２’およびＰ３’において異なるアミノ酸類を含有しているが、分子の残 部は野性型ＦＡＩ−１と同一である。

上記プラスミド類の１種を含有している大腸菌に１２菌株１０４６を、１００μ ｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５０μｇ／ｍｌのＬ−トリプトファンを含有し ているＬＢ（マニアチス他、１９８２）中で一夜成長させた。−夜の培養物を同 じ媒体中で１００倍に希釈し、そして約６×１０８個の細胞／ｍｌの密度に達す るまで培養した。細胞を遠心により集め、Ｍ９媒体（マニアチス他、１９８２） で１回洗浄し、そして最後に０．５％のグルコース、１μｇ／ｍｌのトリアミン 、１００μｇ／ｍｌのアンピンリンおよび０．２％のカザミノ酸類が補充されて いるＭ９媒体中に再懸濁させた。次に、トリプトファンオペレーターの低下を基 にした表示を３７℃において１６−２０時時間待させそして細胞の遠心により終 結させた。

大腸菌溶解物からのＦＡＩ−１およびＦＡＩ−１変異体の精製２５ｍ１の培養物 からのバクテリアペレットを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ｍＭの ＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０１（容量／容量）％のツイーン−８０ を含有している２、５ｍｌの緩衝液中に懸濁させ、そして０℃において３０秒間 超音波処理を３回行った。溶解物を３０．ＯＯＯｘｇにおいて１０分間遠心し、 そして１／１００容量のＩ　Ｍ　Ｍｇ　ＣＩ　２を添加後に１０ｔｔｇ／ｍ１の 膵臓ＤＮＡ５ｅＩと共に３７℃において３０分間培養した。次に硫酸アンモニウ ムを２５（重量／容量）％の最終的濃度となるまで加え、そして精製したペレッ トを廃棄した。さらに４５（重量／容量）％までの硫酸アンモニウム添加ペレッ トを２．５ｍｌの２０ｍＭｈリスーＭＣＩ、ｐＨ８，０、０．１（容量／容量） ％ツイーンー８０中に呼局させ、そして同じ緩衝液に対して一夜透析した。ＦＡ Ｉ−１またはそれの誘導体を含有している溶液をバッチ式に室温において１５分 間にわたり２ｒｎｌのＱ−セファローズ・ファスト・フロー樹脂上に吸着させ、 それを次にカラム中に充填し、１０ｍ１の２０ｍＭトリス−ＨＣＩ　（ｐＨ８， ０）　、０．　Ｉ　Ｃ容量／容量）％ツイーンー８０で洗浄し、そして抑制因子 を５ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、０．１　（容量／容量） ％ツイーンー８０．２００ｍＭのＮａＣｌで溶離した。最終的精製段階用に、溶 離液をバッチ式で４℃において１２時間にわたり１ｍｌのセファローズと共有結 合されている抗−ＰＡＩ−１モノクロ一ン性抗体ＭＡＩ−１３の！ｆｉ液と共に 培養した。再び、樹脂をカラム中に充填し、１０カラム容量の２０ｍＭトリス− ＨＣｌ　（ｐＨ８，０＞　、０．１　（容量／容量）％ツイーンー８０．１Ｍの ＮａＣｌで洗浄し、そして３ｍｌの１００ｍＭグリシン（ｐＨ３，３）　、０． １　（容量／容量）％ツイーンー８０で溶離し、そして３００μｍの１Ｍトリス −ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）中に直接集めた。

ＦＡＩ−１またはそれの変異体の最終的な均質調合物は主として潜伏立体配座で あった。

ＦＡＩ−１、ＦＡＩ−１変異体の活性化、およびそれらの個々の活性の滴定 ＰＡｒ−１またはＰＡｆ−１変異体（２０−３０ｕｇ／ｍＩ）を、室温において ４Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ヘクマン（Ｈｅｋｍａｎ）およびロスクトフ（Ｌｏｓ ｋｕｔｏｆｆ）　、１９８５）と共に２時間培養することにより、活性化した。

次に試料を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、１０ＱｍＭのＮａＣ ｌ、０１（容量／容量）％のツイーン−８０に対して一夜透析した。透析後に、 濃度を１０μｇ／ｍ＋に調節し、モしてアルギニンを５０ｍＭの最終的濃度とな るまで加えて、活性立体配座を安定化させた。増加した量の活性化されたＦＡＩ −１またはＦＡＩ−１変異体を３７℃において１．５ｎＭの二鎖ｔ−ＰＡと共に 培養した。次に、発色基質３２２８８　（０，５ｍＭ）を加え、そして残存ｔ− ＰＡ活性を４０５ｎｍにおける吸収増加の経時的線状プロットから測定した。

ｔ−ＰＡまたはトロンビンを用いるＦＡＩ−１およびＦＡＩ−１変異体の二次速 度定数の測定 種々の抑制因子を用いるｔ−ＰＡの抑制に関する二次速度定数（ｋｌ）は下記の 如くして測定された。１．５ｎＭの二鎖ｔ−ＰＡ（実験中ではＰＡＩ−ＩＦ５− Ｐ３’ＡＴＨＩを用いて１５ｎＭ）を３７℃において２ＱｍＭのトリｘ−ＨＣＩ 　（ｐＨ８，０）　、１００ｍＭのＮａＣ１，０１（容量／容量）％のツイーン −８０中で２ｎＭのＥＣＣＭ−ＰＡＩ−１（内皮細胞の調整培地から誘導された ）、ＦＡＩ−１、ＦＡＩ−ＩＰＩ−ＰＬ’ＡＴＩｆｌまたは２０ｎＭの活性ＰＡ Ｉ−ＩＰ３−Ｐ３’ＡＴＩＨと共に培養した。指定された時間（５秒間−１６分 間）において、反応混合物を１．２ｍＭの５２２８８で４０倍に希釈することに より反応を停止させた。残存ｔ−ＰＡ活性をカリ−２１９分光器中で測定された ４０５ｎｍにおける吸収の初期増加から測定した。二次速度定数（ｋｌンは二次 反応用の標準式を用いて酵素よりわずかに過剰の抑制因子の条件下で計算された ： ここでＥＯおよびＩＯはそれぞれ酵素および抑制因子の初期濃度であり、そして Ｅｔは時間ｔにおける酵素濃度である。

ＦＡＩ−１またはＦＡＩ−１変異体によるトロンビンの抑制用の二次速度定数は 上記のｔ−ＰＡの抑制と同様にして測定された。この目的用には、２．５ｎＭの トロンビンおよび１１０−４０ｎの１種の抑制因子の活性成分を使用した。設定 時間において、Ｑ、５ｍＭの発色基質５２２８８を用いる３０倍希釈により反応 を停止させた。ある実験では１０ｎＭのＦＡＩ−１またはそれの変異体の添加の 直前に５５ｎＭのピクトネクチンを加えた。

ＦＡＩ−１およびＰ、ｌ−１変異体とトロンビンとの複合体生成アイオドゲン工 程を使用して１２５Ｉで標識が付けられているトロンビンを２０μｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１（容量／容 量）％のツイーン−８０の中で１時間にわたり３７℃においてピクトネクチンと 共に、ＦＡＩ−１と共に、またはピクトネクチンおよびＰＡＩ−１と共に、培養 した。ピクトネクチンは３、５　ｎＭおよび７ＱｎＭの濃度で使用され、そして 抑制因子は０．７５ｎＭおよび７．５ｎＭの濃度で使用された。標識の付いたト ロンビンの量は全ての場合とも２．５ｎＭであった。反応混合物に５μｍの０． ２５Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，８）　、１０　（重量／容量）％のＳＤＳ、 ４０（容量／容量）％のグリセロール、０．０５（重量／容量）％のブロモフェ ノールブルーを加え、そして最終的混合物を１０（重量／容量）％の５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル（ラエンリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）　、１９７０）上での電 気泳動により分析した。トロンビンはフルオログラフィーにより可視化された。

参考文献 アンドレアセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）他、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅ ｔｔ、　）、２０９　（１９８６Ｌ２１３−２１８゜ポック（Ｂａｃｋ）他、ヌ クレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）　、１ ０　（１９８２）　、８１１３−８１２５゜カレル（Ｃａｒｒｅｌｌ）およびポ スウェル（Ｂｏｓｗｅｌｌ）　、プロテイナーゼ抑制因子（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓ ｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）　（編集、パレットおよびサルヴエセン）、エルセ ヴイア・サイエンス・パブリッシャーズ、アムステルダム、オランダ、１９８６ ．４０３−４２０頁。

チェース（Ｃｈａｓｅ）およびショウ（Ｓｈａｖ）　、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ ｏｌ、、１９（１９７０）、２０−２７゜ コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）他、組み換え型人間組織型プラスミノゲン活性化因子を 用いる冠状血栓溶解・将来性のある不規則化された擬−調節試験（Ｃ。

ｒｏｎａｒｙ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｒｅｃｏｗｂｉｎａｎｔ 　ｈｕＩＩｌａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｅ　ｐｌａｓｍｉ獅盾■ ｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ＋　ａ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ、　ｒａｎｄｏｍｉ ｚｅｄ　ｐｌａｓｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｒｉａ戟B ）、サーキュレーンヨン（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）　７０　（１９８４）　、 １０１２゜デクラーク（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ）他、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、２６３　 （１９８８）、１５４５４−１５４６１゜ エスモン（ＥＳＩＩＩＯｎ）、止血および血栓症における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓ ｓ　ｉｎ　Ｉ（ａｅ−ｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｆｆｌｂｏｓｉｓ）　 、　９　（１９８９）　、　２９−５５゜ヘクマン（Ｈｅｋｍａｎ）およびロス クトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２６０　（ １９８５）　、１１５８１−１１５８７゜ケイジャー　（Ｋｅｉｊｅｒ）他、フ ィブリツリシス（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）　２、補１（１９８８）、１１９ 　（要約）。

ケリンズ（Ｋｅｒｉｎｓ）他、人間における組織プラスミノサン活性化因子を用 いる冠状血栓症中の血小板活性化に関する証明（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｐ ｌａｔｅｌｅｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｔ ｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎB ｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎ　ｍａｎ）　、Ｃ１１ｎ、　Ｒｅｓ、、３６ （１９８８）、Ａ４（要約）。

クラマー（Ｋｒａｍｅｒ）他、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１２　（１９８４）　、９４４１−９４５６゜ レンツ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　、オーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７７　（１ ９７０（，６８０−６８５゜ ランバーズ（Ｌａｍｂｅｒｓ）他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２　（ １９８７）、１７４９２−１７４９６゜ マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド。

スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ −、ニューヨーク、１９８２゜ ミムロ（Ｍｉｍｕｒｏ）およびロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）　、Ｊ、　Ｒ ｉａｌ、　Ｃｈｅｌｗ、、２６４　（１９８９Ｌ　９３６−９３９゜ミムｏ　（ Ｍｉｍｕｒｏ）他、ブランド（Ｂｌｏｏｄ）　、７０　（１９８７）　、７２１ −７２８゜ モリセイ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）　、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１−１７ 　（１９８１）、３０７−３１０゜ ムラヤ７　（Ｍｕｒａｙａｍａ）およびパン（Ｂａｎｇ）　、Ｔｈｒｏｍｂ、　 Ｆｌｅｍｏｓｔ、５８（１９８７）、４４６　（要約）。

オーエン（Ｏｖｅｎ）他、組織プラスミノサン活性化因子またはストレプトキナ ーゼを用いる血栓症治療が一時的なトロンビン活性を誘発する（Ｔｈｒｏｍｂｏ ｌｙｔｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｗｉｔｈ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓＩＩｌｉｎｏ ｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｒ　５ｔｒｅｐ狽盾■ ｉｎａｓｅ　１ｎｄｕｃｅｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｔｈｒｏｍｂｉｎ　ａｃｔ ｉｖｉｔｙ）　、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７２　（１９８８）　、６１６−６ ２０゜バネケーク（Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ）他、ＩＪＢＯＪ、、５　（１９８６） 　、２５３９−２５４４゜ ブレイスナー（Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２３１　 （１９８５）　、３４９−３５５゜ ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）およびダムス（Ｄａｍｕｓ）　、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、２４８　（１９７３）、６４９０−６５０５゜サン が−（Ｓａｎｇｅｒ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ Ｓ＾、７４　（１９７７）、５４６３−５４６７゜ シュリーフ（Ｓｃｈｌｅｅｆ）およびロスクトフ（Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）　、ヘ モスタンス（Ｉｌａｅｌ！１ｏｓｔａｓｉｓ）　、１８　（１９８８）　、３２ ８−３４　Ｌ。

ＴｒＭＩ研究グループ、１９８５、心筋梗塞における血栓症（ＴＩＭＥ）試験（ Ｔｈｅ　ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　１ｎｆａｒ ｃｔｉｏｎ　（ＴＩＭＩ）　ｔｒｉａｌ）、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、 、３１２：９３２゜トラヴイス（Ｔｒａｖｉｓ）およびサルヴエセン（Ｓａｌｖ ｅｓｅｎ）　、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５２　（１９８３）、６ ５５−７０９゜ヴエルストレート（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）他、組み換え型人間 組織−型ブラスミノゲン活性化因子を用いる急性冠状血栓症・初期潜伏および再 閉塞速度に対する維持注入の影響（Ｉｎｉｔｉａｌ　ｐａｔｅｎｃｙ　ａｎｄ　 １ｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　１ｎｆｕｓｉｏｎ　ｏｎ　 ｒｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｒａｔｅ）　、Ａｔｎ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉｏｌｏ、 ６０　（１９８７）、２３１゜ ヴエルストレート（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）他、Ｖｅｒｇｌｅｉｃｈｅｎｄｅ　 ｒａｎｄｏｍｉｓｉｅｒｔｅ　Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇ　ｚｕｒ　Ｗｉｒｋｓ ａｍｋｅｉｔ　ｖａｎ　ｒｅｋｏｍｂｉｎａｎｔｅｍ　Ｇｅｗｅｂｅ−Ｐｌａｓ ｍｉｎｏｇｅｎ| Ａｋｔｉｖａｔｏｒ　ｉ、ｖ、　ｕｎｄ　５ｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ｉ、ｖ 、　ｂｅｉ　Ｐａｔｉｅｎｔｅｎ　ｍｉｔ　ａｋｕｔｅｍＨｅｒｚｉｎｆａｒｋ ｔ、　Ｋ１１ｎ、　１ｌｏｃｈｅｎｓｃｈ１５５　（補ＸＨ，１９８８）　、７ ７゜ライ７　：／　（ｆｉｍａｎ）池、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、２４２　（１９ ８８）、１２５−１２８゜ 残存ｔ　−Ｐ　Ａ活↑４Ｂ　（％） 〔ビトロネクチンＶＣ枳血り因子］ ＦＩＧ、　２ 国際調査報告 １１１１．１１．１１．、ｌｌ−ム＠＠１４１＋４＋−−・ｐｃτ、’ＮＬ９０ １０Ｏ１４Ｓ国際調査報告 ＮＬ　９０００１４５ ＳＡ　４０Ｂ１８

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．本質的にアミノ酸配列（一文字コードによる）【配列があります】 からなっている反応性中心の部位が、全部または部分的に、反応性中心の部位が 本質的にアミノ酸配列（一文字コードによる）【配列があります】 からなっている抗トロンビンＩＩＩの対応する部分により置換されている、人間 プラスモノゲン活性化因子抑制因子１（ＰＡＩ−１）の変異体。
2. ２．少なくともＰＡＩ−１の位置Ｐ１およびＰ１′におけるアミノ酸類ＲＭが対 応する位置に配置されているＡＴＩＩＩのアミノ酸類ＲＳにより置換されている 、請求項１に記載の変異体。
3. ３．少なくともＰＡＩ−１の位置Ｐ２〜Ｐ２′におけるアミノ酸類ＡＲＭＡが対 応する位置に配置されているＡＴＩＩＩのアミノ酸類ＧＲＳＬにより置換されて いる、請求項１に記載の変異体。
4. ４．少なくともＰＡＩ−１の位置Ｐ３〜Ｐ３′におけるアミノ酸類ＳＡＲＭＡＰ が対応する位置に配置されているＡＴＩＩＩのアミノ酸類ＡＧＲＳＬＮにより置 換されている、請求項１に記載の変異体。
5. ５．少なくとも一部が請求項１−４のいずれかに記載のＰＡＩ−１変異体に対し てコード付けしていることを特徴とする、組み換え型ポリヌクレオチド。
6. ６．挿入部分が請求項１−４のいずれかに記載のＰＡＩ−１変異体に対してコー ド付けしているヌクレオチド配列からなっていることを特徴とする、媒介部分お よび挿入部分からなる組み換え型ポリヌクレオチド。
7. ７．請求項６に記載の組み換え型ポリヌクレオチドを用いて任意の祖先の遺伝子 操作によりＰＡＩ−１変異体を表示する能力を獲得している有機体を培養しそし て生成したＰＡＩ−１変異体を単離することによる、請求項１−４のいずれかに 記載のＰＡＩ−１変異体の製造方法。
8. ８．請求項１−４のいずれかに記載のＰＡＩ−１変異体並びに１種以上の薬学的 に許容可能な担体および／または助剤からなる、薬学的調合物。
9. ９．再閉鎖の発生を予防するためのプラスモノゲン活性化因子を用いる腺維素溶 解／血栓崩壊治療における、請求項１−４のいずれかに記載のＰＡＩ−１変異体 の使用。