JPH05503282A - 乳頭腫ウイルス誘発腫瘍の予防及び治療のための薬理組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳頭腫ウィルス誘発腫瘍の予防及び治療のための薬理組成物 本発明は、乳頭腫ウィルス（パピローマウィルス、ｐａｐｉｌｌｏＩＩＩａｖｉ ｒｕｓ）によって誘発される腫瘍に対して有用な新しいワクチン組成物、より詳 しくはヒト乳頭腫ウィルスＨＰＶ−１６型、同ＲＰＶ−１８型、同ＨＰＶ−３１ 型、同ＨＰＶ−３３型、同ＨＰＶ−３５型、同ＨＰＶ−３９型及び同ＨＰＶ−４ ５型に対する上記ワクチン組成物に関する。

乳頭腫ウィルスは、ＤＮＡウィルスの一つのグループを表わしており、約７９０ ０塩基対（ｂｐ）の、蛋白核と環状ＤＮＡゲノムとを有している。乳頭腫ウィル スの多くの型、ウシ（ＢＰＶ）及びヒト（ＨＰ　Ｖ）が同定されており、之等の 内のいくらかのゲノムは完全に配列化され７い、（１）。

上記ウィルスにつき行なわれた基礎的研究より、ポリオーマウィルス及びＳＶ４ ０ウィルスゲノムから類推して、それらのゲノム内で初期領域（ｅａｒｌｙ　ｒ ｅｇｉｏｎ）と後期領域（ｌａｔｅ　ｒｅｇｉｏｎ　）とは区別されると導かれ た。後期領域はカプシド（ｃａｐｓｊｄｅ　、）の主要成分をコードする２つの 読取フレームＬ１及びＬ２を含んでいる。初期領域は少なくとも読取フレームＥ １、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅｌ及びＥ８を含む。之等読取フレームによりコ ードされる各蛋白は、異なる機能を有している。之等蛋白の３種は、感染細胞の 腫瘍誘発（オンコジーン）の形質転換過程に伴われる。ＢＰＶ−１のＥ５蛋白は 、かなりの形質転換力を有し、細胞をインビトロで独立して形質転換でき（２） 、初期領域の３′部分にコードされている。

ＢＰＶ−１（７）Ｅ６蛋白及びＨＰＶ−１６のＥ７蛋白は、初期領域の５′部分 にコードされており、之等は腫瘍誘発の形質転換の誘導及び維持に伴われる。之 等蛋白は、３３アミノ酸からなるペプチド（３）の連続重複による通常の母遺伝 子に由来すると考えられる。Ｅｌの形質転換力はＨＰＶ−１６及び１８（４）・ （５ン・（６）で論証されている。

他の初期蛋白の内で、Ｅｌ及びＥ２はウィルスの複製及び／又は発現に役割を有 するが、Ｅ４及びＥ８についての機能は知られていない。

ヒトにおいて、ＨＰＶは皮膚の良性感染から、いぼ及び悪性腫瘍に広がる病理状 態に関連している。２等ウィルスは標的組織、殊に生殖器表皮の上皮細胞、口腔 及び気道に高度に特異的である（７）。疫学的データーは、ある種のＨＰＶの、 子宮頚部及び下通路（］ｏｗｅｒ　ｐａｓｓａｇｅｓ）（最も頻繁な婦人の致命 的腫瘍）での役割を強く示唆しテイル。ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８ＤＮＡは 外陰部癌細胞を起源とする殆どの生検で見出されており、まれにはＨＰＶ−３１ 、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５及びＨＰＶ−４５も検出されている。

ＨＰＶウィルスに関連する病理状態は、それらの遺存及び回帰性のために、治療 掌上の問題を惹起する。上記病態の処置に既に外科的、化学療法、抗ウィルス剤 及び免疫療法（８）の多くのアプローチがなされている。

特に、欧州特許公開公報ＥＰ−Ａ−０１３３１２３号には、乳頭腫ウィルスによ る感染に対するワクチン化のアプローチが記載されている。これは遺伝子工学手 法によるウィルス性カプシド蛋白の製造、即ち該ウィルスの後期領域に対応する 構造蛋白質の製造と、その免疫試薬としての利用からなっている。上記公報に記 載の手段は、ウィルス自体による感染に対する保護に係わるものであり、理論的 には進展可能な感染の全ての形態に対応している。

本発明は、より正確には、ＨＰＶによる予定された感染からの悪性腫瘍に対する 予防及び治療のための活性ワクチンの製造に係わるものである。

本発明は乳頭腫ウィルスにより誘発される腫瘍の形成が該ウィルスの初期遺伝子 （ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ　）の発現によるものであるとの認識を基礎としてい る。

本発明の主題は、予防及び治療有効成分として、乳頭腫ウィルスの初期蛋白（ｅ ａｒｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）の基本領域（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇｉｏｎ ）を少なくともコードする外来ＤＮＡ配列を含む組換えポックスウィルスの少な くとも一種と、その高等細胞での発現のための調節因子とを含むことにより特徴 付けられる薬理組成物にある。

上記蛋白の基本領域とは、抗腫瘍性免疫の誘発が可能な蛋白配列の一部を意味す ると理解できる。

本発明のワクチン組成物は、目的の変化に応じて使用できる。これは予防的に、 あらゆるウィルス感染の前に、もしくは良性疾患を引き起こす感染の後に、他の 組織が攻撃され癌組織に転換される事態を回避するために、悪性腫瘍の出現の予 防に使用できる。また本組成物は治療的に強力に、既に確立された腫瘍を消失さ せるために、もしくは補足的に、即ち腫瘍除去の代替として使用できる。上記使 用形態は、ヒト及び他の動物の両者に関しており、殊に家畜のＢＰＶウィルスに よる感染の予防に関している。上記組換えポックスウィルスは、また適当ならば 、そのヒト及び動物への接種のための薬理的に許容されるビヒクルと共に利用す ることもできる。

既になされており且つ上述したような認識の点より、子宮頚部癌のケースにおけ るＨＰＶの１６．１８．３１．３３．３５．３９及び４５型による感染の頻度に 着目すレバ、本発明はとりワケ、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、 ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９及びＨＰＶ−４５に対して有効なワ クチン組成物に関している。

本発明の主題は、ポックスウィルスが１６．１８．３１．３３．３５．３９又は ４５型ＨＰｖウイルス、殊にＢＰＶ−１６ウイルスの非−構造蛋白の少なくとも 一つをコードするＤＮＡ配列を少なくとも一つ含むものである、上述したワクチ ン組成物にある。

上述したように、パピローマに属するウィルス、殊にＢＰＶ−１及びＨＰＶの構 造は、ウィルスの作用機序に非常に特異的な蛋白機能及びウィルス性ゲノムの維 持機能に対応可能な、少なくとも７つの読取フレームを含んでいる。従って、人 体で同時に数種の蛋白を発現する薬理組成物を製造することは有利である。これ は、所望の蛋白を発現するポックスウィルスの数種を用いるか又は選択された蛋 白に対応する外来ＤＮＡ配列の数種を含む唯一のポックスウィルスを用いて製造 できる。

通常、組換えポックスウィルスは高等細胞での蛋白の発現に必要な因子の組み合 わせ、即ち一般に遺伝子の転写プロモーター及び宿主細胞中での翻訳開始のため の領域を含んでいる。上記プロモーターは用いられるポックスウィルスの遺伝子 のプロモーターであるのが好ましい。

考慮できる全てのポックスウィルスの内で、ワクチニアウィルスが好適に選択で きる。これは組換えワクチニアウィルスにより発現された抗原が、感染された細 胞の表面に正しく出現し、細胞型の免疫応答を誘導することが既に確立されてい るからである。腫瘍細胞の除去が細胞性免疫に含まれることが知られているので 、上記事実は特に好ましい。

ポックスウィルスがワクチニアウィルスの場合、プロモーターとしては、ワクチ ニアウィルスの７．５に蛋白の遺伝子のものを用いるのが好ましい。該プロモー ターをコードする配列は、ウィルスの非必須領域（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ 　ｒｅｇｉｏｎ）　、例えばワクチニアウィルスノ場合は、チミジンキナーゼ遺 伝子（ＴＫ）を挿入されていてもよく、かくしてＴＫ−組換えウィルスの選別が 可能となる。

一般には、生ウィルスがヒト及び動物に接種される。

また、その表面に選択された蛋白が存在している死滅した組換えウィルスや、組 換えワクチニアウィルスにより感染された細胞培養物から精製された蛋白をヒト 及び動物に注入することもできる。

本発明の薬理組成物は、ワクチン分野で公知の方法に従って製造することができ 、薬剤適用量は広範囲から選択できる。これは特に患者の状態や経験者に評価で きる他のパラメーターに依存している。

本発明は以下の実施例により説明され、該実施例は、一方でウシ乳頭腫ウィルス （ＢＶＰ−１）で形質転換された細胞を注入された動物におけるワクチン化の結 果を、他方でヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ−１６）で転換された細胞を注入され た動物におけるワクチン化の結果を示しテイル。特に、ＨＰＶ−１６（７）Ｅ５ 、Ｅ６及びＥ７蛋白の読取フレームに対応するＤＮＡのクローニング及びシーフ ェンシングと、２等蛋白を発現する組換えウィルスを用いて得られたワクチン化 の結果を示している。

本発明の詳細は図面に付随され、各図は以下のことを示している。

−第１図は、ウシ乳頭腫ウィルスＢＰＶ−１ゲノムの初期領域の読取フレームＥ １、Ｅ２、Ｅ５及びＥ６の生成物の免疫沈降物の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル結果を示 す。

−第２図は、ウシ乳頭腫ウィルスＢＰＶ−１の読取フレームＥ１、Ｅ２、Ｅ５、 Ｅ６及びＥ７の生成物を発現する組換えワクチニアウィルス（ＶＶｂＥｌ、ＶＶ ｂＥ２、ＶＶｂＥ５、ＶＶｂＥ６及びＶＶｂＥ７）又はコントロール組換えワク チニアウィルスＶＶ−Ｏ（ＢＰＶ−１蛋白を発現しない）を用いてワクチン化し た動物及びＢＰＶ−１で形質転換したＦＲ３Ｔ３細胞（ＦＲ３Ｔ３ＢＰＶ−１− ６）を用いた試験における腫瘍の進展の遅延期間を示す。

−第３図は、ウシ乳頭腫ウィルスＢＰＶ−１の読取フレームＥ５、Ｅ６及びＥ７ の生成物を発現する組換えワクチニアウィルス（ｖＶｂＥ５、ＶＶｂＥ６及びＭ Ｖ　ｂ　Ｅ　７）又は上記ＶＶｂＥ５−ＶＶｂＥ６結合物もしくはＶＶｂ　Ｅ　 ５−ＶＶｂ　Ｅ　７結合物或はコントロール組換えワクチニアウィルスＶＶ−０ （ＢＰＶ−１蛋白を発現しない）を用いてワクチン化した動物及びＢＰＶ−１で 形質転換し？：ＦＲ３Ｔ３細胞（ＦＲ３Ｔ３−ＢＰＶ−１−３）を用イタ試験ニ オケる腫瘍の進展の遅延期間を示す。

−第４図は、バクテリオファージＭ１３Ｅ７／Ｅ６（ＨＰＶ−１６）の構造の概 略図を示す。

−第５図は、バクテリオファージＭ１３Ｅ５　（ＨＰＶ−１６）の構造の概略図 を示す。

一第６図＋１、！取７レー４Ｅ５　（ＨＰＶ−１６）の相補ＤＮＡ配列を示す。

−第７図は、ヒト乳頭腫ウィルスＨＰＶ−１６ゲノムの初期領域の読取フレーム Ｅ６及びＥ７の生成物の免疫沈降物の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル結果を示す。

−第８図は、ヒト乳頭腫ウィルスＨＰＶ−１６の読取フレームＥ６の生成物を発 現する組換えワクチニアウィルス（ＶＶｈＥ６）を用いてワクチン化した動物並 びにＨＰＶ−１６及びラットオンコジーンで形質転換した一次ラット（ｐｒｉｍ ａｒｙ　ｒａｔ　）細胞を用いた試験における腫瘍サイズの変化を示す。

−第９図は、ヒト乳頭腫ウィルスＨＰＶ−１６の読取フレームＥ７の生成物を発 現する組換えワクチニアウィルス（ＶＶｈＥ７）を用いてワクチン化した動物並 びにＨＰＶ−１６及びラットオンコジーンで形質転換した一次ラット細胞を用い た試験における腫瘍サイズの変化を示す。

実施例１　：　ＢＰＶ−１の初期蛋白を発現する組換えワクチニアウィルスによ る、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ−１）誘発腫瘍の進展阻害 ａ）ＢＰＶ−１の初期蛋白発現ワクチニアウィルスの構築 プラスミドｐＭ６９　は、プラスミドｐＭＬ２（９）のＨｉｎｄｌＩＩ及びＢａ ｍＨＩサイトに、ＢＰＶ−１ゲノムノ初期領域を、ＨｌｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨ Ｉ断片として挿入されている。

読取フレームＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７を含むサブ断片を、制限酵素（第 １表参照）による消化により切断し、バクテリオファージＭ１３ＴＧ１３０又は Ｍ１３ＴＧ１３１α０に導入し、次いでプラスミドｐＴＧ１８６　ｐｏｌｙ（１ １）へのトランスフェクションに先だって、ミュータジェネシス（ｏｌｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ ｓｉｓ　）に供した。之等の工程を第１表に示す。

第１表における以下の各記号は次のことを意味する。

［ａ］：下線を付したヌクレオチドがＢＰＶ−１の親配列に合致しない塩基を示 すことを意味する。

［ｂ］：　クローニングにおいて用いた翻訳開始コドンと制限酵素サイトに下線 を付して示しである。

［Ｃ］：読取フレームＥ５を含むプラスミドｐ　Ｍ　６９のＥｃｏＲＩ　−Ｂａ ｍＨＩ断片をバクテリオファージＭ１３７Ｇ１３１に所望のオリエンテーション にて導入することはできない。クローンは逆のオリエンテーションにて得られて おり、ここで２つの独立したプラスミド断片をクローン化した。従って上記オリ ゴヌクレオチドーダイレクテイツドミュータジエネシスはＤＮＡの他のストラン ドに対応する。

［ｋ］：制限酵素消化により製造され、クローニング前にＥ、ｃｏｌｉ［）　Ｎ 　ＡポリメラーゼＩのクレノー断片で処理された末端を意味する。

ｎａ：　用いなかった。

、に オリゴヌクレオチド−ダイレクチイツト　ローカライズド　ミュータジエネシス は、開始コドンに翻訳開始コンセンサス配列を導入させて、ワクチニアウィルス へのトランスファーの後に正しい発現を与える。各ケースにおいて、合成オリゴ ヌクレオチドが、翻訳の開始を決定する配列の直前に、単一の制限酵素サイトを 導入した。

読取フレームＥ１の場合、ＢＰＶ−１ゲノムにおける制限酵素サイト（開始ＡＴ Ｇに関連する一１１位のＮｒｕＩサイト）の存在及び翻訳開始領域の準−コンセ ンサス配列（ＧＣＧＴＡＴＧＧ）の存在のために、ローカライズド　ミュータジ エネシスを行なう必要はない。３−位のヌクレオチドＧは、翻訳開始にはほぼＡ と同様に有効である。

−次ひよこ胎児細胞（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｂｉｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ　ｃｅｌｌｓ ）を、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（ギブコ社）中で３７℃で培養した 。同時に温度感受性ワクチニアウィルスを感染させ、ＢＰＶ−１及び野生型ワク チニアウィルスＤＮＡの挿入部を有する発現／トランスファーベクターをトラン スフェクトさせた。選別後、挿入配列の発現がワクチニアウィルスの７．５にプ ロモーターの支配下にあるワクチニア組換え体を標準法により単離した。

ＢＰＶ−１のＥＩ、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７初期蛋白を発現するワクチニアウ ィルス組換え体（Ｖ　Ｖ）を、ソレソれＶＶｂＥｌ、ＶＶｂＥ２、ＶＶｂＥ５、 ＶＶｂＥ６及びｖｖｂＥ７と呼ぶ。

ｂ）　組換えウィルス感染細胞におけるＥｌ、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６及びＥｌの発現 １０％ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むダルベツコ−変性イーグル培地ＭＥＭ、 ＢＭＥ　（ギブコ社）上のＢＨＫ−２１細胞を、細胞当り約２０プラークフオー メーシヨンユニツト（ｐ　ｆ　ｕ）の多重度にて、６種の組換えウィルスのそれ ぞれで感染させた。

３７℃で１時間後、新鮮な培地を加え、細胞を２時間培養した。培地をすて、細 胞を一度洗浄した。メチオニン及び／又はシスチンを含まず且つ５％の透析した ウシ胎児血清を含むＭＥＭ、ＢＭＥ培地を次いで加えた。

［Ｓコール−メチオニン及び／又は［８］−Ｌ−シスチン（アマジャム社）の０ ．５〜１　ｍ　Ｃｉ　／ｚｌヲ用いて、３７℃で３時間標識した。かくして標識 された細胞を、アプロチニン（ＩＩＵ／ｙＡ’、バイオシス社（Ｂｉｏｓｙｓ。

Ｆｒａｎｃｅ）　）を含む２０ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，２）、１５０ｍＭ 　ＮａＣ１（ＴＳ緩衝液）で２度洗浄し、かき集め、ＳＴＥ緩衝液［２０ｍＭ） リスＨＣＩＩ　（ｐＨ７，２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ！、１ｍＭＮａ２　ＥＤ ＴＡ、１％アブロチニンコ中での２度の遠心分離により洗浄した。細胞をＲＩＰ Ａ緩衝液［５０ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、１５０ｍＭ　ＮａＣ１１ １ｍＭ　ＮＡ２　ＥＤＴＡ、１％トライトンＸ−１００，１％Ｎａデオキシコー レビー、０．１％５ＤＳｌ中に溶解するか又は分留して、ＢＰＶ−１蛋白のサブ 細胞局在性（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を決定した 。

ディビス（Ｄａｖｉｓ　）の方法（１２）に従って、免疫沈降及び５ＤＳ−ＰＡ ＧＥを行なった。読取フレームＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６及びＥｌに対応する細菌 融合蛋白（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に対するラビ ットポリクローナル抗血清を、常法（例えば、参考文献（１３）及び（１４）参 照）に従って製造した。

ＶＶｂＥｌを感染させた細胞は、６９−ｋＤ核蛋白を生産し、これは抗−Ｅ１抗 血清により特異的に認識された（第１図、縞１、縞２は非−免疫抗血清を用いた 免疫沈降に相当する）。ＶＶｂＥ２で感染させた細胞は、Ｅ２と交叉反応性を示 す４８−ｋＤポリペプチドを高レベルで含有し、ＢＰＶ−１の読取フレームＥ２ によりコードされる主要なトランスアクチベーション蛋白に相当した（第１図、 縞３及びコントロール縞４）。該ポリペプチドは、ＢＰＶ−１により形質転換さ れた細胞のＥ２蛋白で述べたこと（１５）と一致して、試験した全ての細胞のサ ブフラクションにおいて検出される。ＶＶｂＥ６は、抗−Ｅ６抗血清により特異 的に沈降する１５．５−ｋＤ蛋白をコードし、ＢＰＶ−１により形質転換された 細胞のＥ６蛋白と同様（１６）に、細胞質フラクションに５０％以上の割合で局 在した（第１図、縞６及びコントロール縞？）　。ＶＶｂＥ５で感染させた細胞 は、ＢＰＶ−１のＥ５蛋白の局在特性（１７）の、細胞膜に関連する７、５−ｋ Ｄポリペプチドを生産した（第１図、縞７及びコントロール縞８）。抗−Ｅ７抗 血清につき行なった免疫沈降試験では、交叉反応性は認められない。にもかかわ らず、発現ベクターの解析の結果、正しいオリエンテーションにおける読取フレ ームＥ７の存在が明らかとなり、従ってＥｌは確かに生産されるが、未知の理由 により、用いた抗血清によっては沈降しないと考えられた。

ｃ）ＢＰＶ−１誘発腫瘍細胞に対するワクチン化４週齢雌ラット（フィッシャー ）の各群に、異なる組換えウィルスを、皮内もしくは腹腔的接種した（１００μ ）中１０　ｐｆｕの投与量）。１２日後、各群ラットに同量を増強注入（ｂｏｏ ｓｔｅｒ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　）　ｌ、、第１６日及び第１７日の間に、参考 文献（９）・（１８）に記載のプロトコールに従って、ＢＰＶ−１で形質転換さ れたフィッシャーラット３Ｔ３同遺伝的系統（ＦＲ３Ｔ３）細胞（ＦＲ３Ｔ３− ＢＰＶ−１−６と呼ぶ）を試験接種した。

上記目的には、２×１０　細胞を、血清を含まないＭＥＭ、ＢＭＥ培地２００μ ｌの容量で、皮下注入した。

結果を第２図に示す。

−ＶＶ−Ｏでワクチン化した全動物は、平均４３日の潜伏期間の後、腫瘍の進展 が見られた。

−ＶＶｂＥｌ又はＶＶｂＥ２でワクチン化した動物は、腫瘍の進展における変化 はなかった。

−ＶＶｂＥ５、ｖｖｂＥ６及びＶＶｂＥｌでワクチン化した動物は、腫瘍の出現 が有意に遅延された。加えて、数種の場合、腫瘍の進展は認められず（試験後２ ５０日以上）、これは図の上の口に示される。

上記試験を繰返し、参考文献（９）・（１Ｂ）に記載のプロトコールに従い、Ｂ ＰＶ−１で形質転換されたＦＲ３Ｔ３系細胞（ＦＲ３Ｔ３−ＢＰＶ−１−３と呼 ））ニラき試験接種を行なった。ＶＶｂＥｌ及びＶＶｂＥ２は試験しなかった。

ＶＶｂＥ５、Ｅ６及びＥ７のみ試験し、２群のラットには、各抗原の蓄積的効果 を検出するために、２種の組換えウィルス、即ちＶＶｂＥ５及びＶＶｂＥ７又は ＶＶｂＥ５及びＶＶｂＥ６を、同時に接種した。第３図より、ＶＶｂＥ５及びＶ ＶｂＥ７でワクチン化した効果が確認される（図の上の口が腫瘍の進展の認めら れなかった動物に相当する）。一方、ＶＶｂＥ６は、この状況では有意な効果は 認められなかった。加えて、ＶＶｂＥ５、ＶＶｂＥ７組み合わせでは、著しい蓄 積的効果は見られなかった。

実施例２：ＨＰＶ−１６ウイルスゲノムのクローニングＣａ５ｋｉ系細胞（ＡＴ ＣＣ１５５０）は、染色体に統合されたＨＰＶ−１６ウイルスゲノムを含んでい る。

半融合（Ｓｅｍｉ−ＣＯｎｆｌｕｅｎｔ）　（：、　Ｂ　Ｓ）＜　ｊ細胞の入っ た７５０７７２３１０個から、以下の方法により、全ゲノムＤＮＡを精製した。

即ち、細胞をかき取って回収し、遠心分離及び洗浄し、次いでＴＥ緩衝液［１０ ｍＭトリス（ｐＨ７，５）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ］　＋Ｑ、５％ＳＤＳの１５１ １中に取り出した。プロトコールＫ　（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）　（７，５■ ／１５ｚＡ’）による３７℃下１６時間の処理の後、ＤＮＡを４℃で保存した。

この方法により、ＤＮＡ０．６■を含む溶液１　ｄを得た。

上記ＤＮＡ７０μｇを酵素ＭｂＯＩで部分消化（１０分、４０単位）させ、次い で蔗糖リニアグラジェント（２０％−４０％）に付した。遠心分離（ＳＷ２８０ −ター、２５００Ｏｒｐｍ、１６時間、２０°Ｃ）後、フラクション５００μｌ を集めた。１０〜２０ｋｂの大きさのＤＮＡを含むフラクション（フラクション ２３−２６）を合ゎせてＴＥ緩衝液に対して透析し、次いでエタノールで沈殿さ せた。この方法によりＤＮＡ５μｇを得た。

上記−ＤＮＡのクローニングベクターを得るために、バクテリオファージλＥＭ ＢＬ３０１ＤＮＡ（１９）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、フェノール／クロロ ホルム抽出及びエタノール沈殿の後、得られるＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁させ た。

Ｃａ５ｋｉ細胞のゲノムＤＮＡ及びバクテリオファージλＤＮＡを、次いで通常 のプロトコールに従い連結させた（ベクタ−１μｇ１ゲノムＤＮＡ２μｇ）。Ｄ ＮＡをアマジャム社より市販のキットを用いてパックした後、全０．７５ｘｌＯ 個の各クローンを得た。之等のバクテリオファージを、ＨＶＰ−１６ウイルス配 列から演鐸される合成オリゴヌクレオチド［（ＥＭＢＩ、）ＰＡＩ６コを用いて 選別するために、直径１４ａｎのディツシュ１８個上のＥ、　ｃｏｌｉ　Ｑ３５ Ｂ株を用いてＬＢＭ培地に覆った。

組換えバクテリオファージＤＮＡのスクリーニングを、通常の方法に従い行なっ た。オリゴヌクレオチド１８１７　（配列、　５’　ＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡ ＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧ　３’　。

読取フレーム：Ｅ７）及び１８１８　（配列：５°ＧＴＧＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡ ＧＣＣＴＣＴＧＣＧＴＴＴ　３’　、読取フレーム二Ｅ５）を３２　ｐで放射活 性的に標識し、混合し、６倍濃度のＳＳＣ緩衝液中で、５５℃下に１６時間を要 して、ファージＤＮＡにトロセルロースフィルター上に転写）とハイブリダイズ させた。フィルターを次いで同条件下に洗浄して、１０個の陽性シグナル（１− １０）を得た。２等シグナルに対応するペトリディッシュの部分をＬＢＭ緩衝液 １１１に取り出した。之等の懸濁液を再度直径１０ｃｍのベトリディッシュに重 ね（ディツシュ当り懸濁液２−１０μｌ）、オリゴヌクレオチド１８１７及び１ ８１８をそれぞれ用いて二次スクリーニングを行なった。最初の分離物４及び５ から得られるファージに対応するシグナルが最も強く、之等２つのクローンを引 き続く試験のために選択した。

サブクローン４−１．４−２．５−１及び５−２から単離したバクテリオファー ジで感染させたＥ、　ｃｏｌｉ　Ｑ３５ａ株のミニカルチャーを調製した。２等 クローンのＤＮＡを、選別された組換え体の分析のために精製し、制限酵素Ｐｓ ｔＩで消化させた。

１％アガロースゲル上電気泳動の後、上記ＤＮＡをサザーン法（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ’ｓ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）　ニ従い、ニド０−１１Ｆルロース膜上に転写し た。該膜を次いで、上記と同様にしてポリヌクレオチドキナーゼの作用により、 　Ｐで標識した２つのオリゴヌクレオチド１８１７及び１８１８とインキュベー トした。ハイブリダイゼーション及び膜洗浄の後、膜をオートラジオグラフィー にがけた。

１０６３及び１７７２ｂｐの大きさのＤＮＡに相当する２つのバンドのそれぞれ が目視観察でき、このことがらクローン４−１．４−２．５−１及び５−２はＨ ＰＶ−１６ウイルスゲノムを有することが確認された。

以下の試験のために、バクテリオファージ５−１を選んだ。このクローンのＤＮ Ａを大量に得るために、Ｅｃｏｌｉ　Ｑ３５８感染株５００ｚｌから、通常のプ ロトコールに従いＤＮＡを調製した。かくしてＤＮＡ８００μｇを得た。酵素Ｐ ｓｔＩで消化させた後、ＤＮＡをエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲ ル電気泳動に供し、ＵＶランプを用いて観察可能とした。１０６３及び１７７２ ｂｐの大きさに対応するゲルバンドを切出し、「ジェネクリー＞　（Ｇｅｎｅｃ ｌｅａｎ）Ｊキット（バイ第１０１社（ＢｉｏｌＯＩ　Ｉｎｃ））を用いてＤＮ Ａを抽出した。コ（７）ＤＮＡを次いでＰｓｔｌサイトを開いたバクテリオファ ージＭ１３７Ｇ１３０に連結し、コンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２株に 形質転換した。

組換えバクテリオファージＭ１３ＤＮＡをミニカルチャー（１，５ｚＡ’）から 精製し、制限酵素で消化させて分析した。１０６３ｂｐＨＰＶ−１６バンドを含 むクローン（Ｍ１３Ｅ５）及び１７７２ｂｐＨＰＶ−１６バンドを含むクローン （Ｍ１３Ｅ７／Ｅ６）を選別した。

シーフェンシングの作業を制限するため、また所望のＤＮＡは読取フレームＥ５ 、Ｅ６及びＥ７に対応するものであるため、Ｅ６及びＥ７蛋白（Ｍ１３Ｅ７／Ｅ ６）及びＥ５蛋白（Ｍ１３Ｅ５）に対応するＰｓｔＩ制限酵素断片領域のみを、 下記配列の合成オリゴヌクレオチドを用いて、シーフェンスした。

Ｍ１３Ｅ７／Ｅ６用配列： ５’　ＡＴＣＴＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＣ３’　及ヒ５’　ＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴ ＡＣＡＡＡ　３’Ｍ１３Ｅ５用配列： ５’　ＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＣ３’第４図に、バクテリオファージＭ １３Ｅ７／Ｅ６の構造を、また第５図にバクテリオファージＭ１３Ｅ５の構造を それぞれ示す。Ｅ７につき得られた配列は、ＰＰＨ１６データーのライブラリー に含まれる配列と全て相同性を有することが判った。Ｅ６については、Ｅ６の開 始ＡＴＧに関連する２つのミューティジョン、即ち＋４６位のＡに代わるＧ及び ＋２６４位のＴに代わるＧ１が観察された。Ｅ５の配列は第６図に示す通りであ り、データーライブラリーに含まれる配列とは数個の塩基の違いが認められた。

実施例４：Ｅ６、Ｅ７及びＥ５を有するＤＮＡ断片の転移ベクターへのクローニ ング 上記３つの読取フレームをコードするＤＮＡを、組換えワクチニアウィルスに統 合する前に、之等をその遺伝子の上流及び下流に単一の制限酵素サイトを持つよ うに修飾し、また良好な翻訳及び合成蛋白を高レベル化するために、開始ＡＴＧ 周辺の配列を改良する必要がある。

ａ）　読取フレームＥ６ オリゴヌクレオチドーダイレクテイツド　ローカライズド　ミューダジエネシス （アマジャム　キット）の手法を用いて、２つのオリゴヌクレオチドにより、Ｅ ６のコード配列の上流及び下流のそれぞれに、５ａｌＩ制限酵素サイト及びＳｐ ｈ　ｒ制限酵素サイトを設けた。上記２点ミューティジョンは、下記オリゴヌク レオチドを用いて同時に行なった。

５’　ＧＴＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＡＡ ＡＧＡＧ　３’５’　ＣＡＴＧ（：ＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ３’ＡＴＧに関 する−３位ヌクレオチドＡは、ヌクレオチドＴに代えて５ａｌＩサイトとして同 時に導入した。

得られたバクテリオファージを、制限酵素による消化及びシーフェンシングによ り分析した。引き続く試験のために、Ｍ１３ＴＧ１１８１と命名したクローンを 選択した。５ａｌＩ　−５ｐｈＩ制限酵素断片を次いで、５ａｌＩ及びＳｐｈ　 Ｉサイトで開裂させた（ｐＴＧ２１９８）ベクターｐＴ　Ｇ　１８６　ｐｏｌｙ （１１）に、クローン化した。このベクターは、ＤＮＡのワクチニアウィルスゲ ノムへの導入を可能とする。

ｂ）　読取フレームＥ７ 下記オリゴヌクレオチドを用い、ロー力うイズド　ミューダジエネシスにより、 Ｅ７蛋白のコード配列の上流に、ＰｓｔＩ制限酵素サイト及び−３位ヌクレオチ ドＡを導入した。

５’　ＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧ　 ３’数種のクローンを得た。３５０−ｂｐＰｓｔＩ制限酵素断片を有するその一 つを、ミューチージョンに対応する領域にシーフェンスした。この配列は期待し たミューチージョン（Ｍ１３ＴＧ１１８２）に対応した。上記ＰｓｔＩ制限酵素 断片を、次いでプラスミドｐ　ＴＧ　１８６ｐＯ］）’の開裂ＰｓｔＩサイトに 導入した（ｐＴＧ２１９９）。

Ｃ）　読取フレームＥ５ 下記オリゴヌクレオチドを用い、ロー力うイズド　ミューダジェネシスにより、 読取フレームＥ５の開始ＡＴＧの上流にＰｓｔＩ制限酵素サイトを導入した。

５’　ＧＴＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＣＡＡＡＴＣＴＴ ＧＡＴ　３’また下記オリゴヌクレオチドを用いて、停止コドンの下流にＥｃｏ ＲＩ制限酵素サイトを導入した。

５’　ＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＡＴＡＡＴＴ ＧＴＴＧ　３’上記２のミューチージョンは同時に導入した（アマジャムキット ）。引き続く試験のために選んだクローンをＭ１３７Ｇ３１．５１と命名した。

Ｐｓｔｌ　−ＥｃｏＲＩ制限酵素断片を、次いでプラスミドｐＴＧ１８６ｐｏｌ ｙの開裂ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩサイトに導入した（ｐＴＧ３１８０）。

実施例５：組換えワクチニアウィルスの構築上記したように、読取フレームＥ６ 、ＥＪ及びＥ５をワクチニアウィルス（コペンハーゲン種）に導入させるために プラスミドｐＴＧ２１９８．２１９９及び３１８０を用いた。コード配列がワク チニアの７．５にプロモーターの支配下にある組換えウィルスを、ＶＶｈＥ６、 ＶＶｈＥ７及びＶＶｈＥ５と呼ぶ。

１０％ウシ胎児血清を含むＭ　Ｅ　Ｍ、Ｂ　Ｍ　Ｅ培地上のＢＨＫ−２１細胞を 、細胞当り約２０ｐ　ｆ　ｕの多重度にて、３種の組換えウィルスのそれぞれで 感染させた。

前述したプロトコールに従卯インキュベーションの後、細胞を回収し、ＨＰＶ− １６の蛋白のサブ細胞局在性を決定するために、溶解し分別した。

Ｅ６及びＥ７遺伝子の発現は、蛋白（［３５Ｓコシスチンで標識した）の免疫沈 降により証明された。

読取フレームＥ６及びＥＪに対応する細菌融合蛋白に対するポリクローナル抗体 を、文献（２０）及び（２１）に記載の通常の方法に従い調製した。

ＶＶｈＥ６で感染させた細胞は、抗−Ｅ６抗血清により特異的に認識される１８ −ｋＤ細胞質蛋白を生産した（第７図、縞１、縞２は非−免疫血清での免疫沈降 に対応する）。ＶＶｈＥ７で感染させた細胞は、同様に抗−Ｅ７抗血清により特 異的に認識される］、９〜２Ｏ−ｋＤ細胞質蛋白を生産した（第７図、縞３、縞 ４は非−免疫血清での免疫沈降に対応する）。

Ｅ５については、利用できる抗血清がないので、ワクチニアウィルスへの発現ブ ロックＥ５の組込みは、サザーンの手法に従うＤＮＡ分析により調べた。

実施例５：ＨＰＶ−１６誘発腫瘍の進展に対するＶＶｈＥ６及びＶＶｈＥ７によ るワクチン化の効果 ４週齢雌ラット（フィッシャー）の各群に、それぞれ異なる組換えウィルスの５ ｘｌＯｐｆｕ　（１００ｔｌ／）を皮内注射してワクチン化した。１２日後、同 量の増強注入を行なった。

１６日と１７日の間に、−次ラット細胞（ＲＥＯＩ系統）における １）サルのレトロウィルスのＬ　Ｔ　Ｒ”の支配下にあるＨＰＶ−１６ゲノムを 含むプラスミドと、２）確立された細胞系統又は不死の遺伝子を発現する細胞系 統のみを形質転換させるＧ４１８及びＥＪ−ＲＡＳ耐性遺伝子をコードするプラ スミドとの同時形質転換により得られた細胞系統を用いて試験を行なった。

血清を含まないＭＥＭ、ＢＭＥ２００μ！中の２×１０　細胞を皮下注射した。

第８図及び第９図より、以下の結果が得られた。

−　ワクチン化しなかったコントロール動物では、形質転換細胞の接種１０日後 に腫瘍の進展がみられた（破線）。

−ＶＶｈＥ６でワクチン化した動物では、全７ケースの内、２ケースで腫瘍の進 展はなかった（１００日以上）。腫瘍が出現した３ケースでは、非常に有意に腫 瘍の進展が減速され、また２動物では腫瘍の出現が遅延された（１０日の代わり に２４及び３４日）。最後に２つのケースでは、腫瘍の進展はコントロール群の 動物のそれと同様であった。

−ＶＶｈＥ７でワクチン化した動物では、前７ケース中３ケースにおいて腫瘍の 進展はなかった（１００日以上）。他の４ケースでは、１０日から腫瘍が出現し たが、その進展は有意に遅延された。

上記ワクチンの予防効果を調べるために、２群の動物で腫瘍の進展のなかったも のをとり、再度最初の接種試験の８０日後に、最初の投与量の１０倍量、即ち２ ×１０　細胞を試験した。上記条件下、コントロール動物は４日後に腫瘍の進展 がみられた。

−ＶＶｈＥ６でワクチン化した動物は、コントロール動物と同様に腫瘍の進展が みられた。

−これに対して、ＶＶｈＥ７で予めワクチン化した動物では同条件でも腫瘍の進 展は見られなかった（１００日以上）。

以上の結果より、上述したように、ＨＰＶ−１６誘発腫瘍の進展に対する予防に おけるＥ７抗原の重要な役割が明らかである。

上記結果を証明するため、他の細胞系統を用、いて更に２つの試験を行なった。

即ち、上記と同様にして組換えウィルスの皮内注射により４週齢雌ラットの各群 をワタチン化した。上記組換えウィルスでワクチン化した動物に、前述したプロ トコールに従い調製した一次うット細胞（ＲＥ３１）の２×１０　もしくは１０ 　を試験した。

腫瘍を拒否した動物数もしくは腫瘍出現の遅延が観察される動物数を第２表の最 初の部分に示す（第１試験）。

この表において、ｖｖＯはＨＰＶ蛋白を発現しないコントロール組換えワクチニ アウィルスに対応する。その後、第１回目で腫瘍を拒否したラットを、−次細胞 （ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｅｌｌ）　（７）　ヨリ高濃度（２×１０　又は１０５に 代わって、２×１０５）を用いて再度試験した。得られた結果を第２表の２番目 の部分に示す（第２試験）。

第２表 ラット当り２Ｘ１０　ＲＥ３１系細胞注入による第１試験ＶＶｈＥ６　３／１８ 　５／１８　８／１８ＶＶｈＥ７　３／１７　５／１７　９／１７ＶＶＯＯ／１ ７　０／１７　０／１７ ラツト当り１０ＲＥ３１系細胞注入による第１試験ＶＶｈＥ６　７／２０　１／ ２０　８／２０ＶＶｈＥ７　５／２０　０／２０　５／２０ＶＶＯ１／２０　０ ／１７　１／２０ ラット当り２ｘｌＯＲＥ３１系細胞注入による第２試験ｖｖｈＥ６　２／４　０ ／４　２／４ ＶＶｈＥ７　３／４　１／４　４／４ Ｖｖｏ　Ｏ１５０１５０１５ 他の一連の試験において、ワクチン化ラットの試験に用いた一次ラット細胞系統 を、 １）それ自身のプロモーターの支配下にあるＨＰＶ−１６ゲノムを含むプラスミ ド、 ２）確立された細胞系統又は不死の遺伝子を発現する細胞系統のみを形質転換さ せるＧ４１８及びＥＪ−ＲＡＳ耐性遺伝子をコードするプラスミドで同時形質転 換させた。かくして、ＲＥ６０４系統を得た。第３表に上記試験条件下に得られ た結果を示す。

第３表 ラット当り２ｘｌＯＲＥ６０４系細胞注入による試験ＶＶｈＥ６　０／３０　６ ／３０　６／３０ＶＶｈＥ’７　７／４０　１０／４０　１７／４０ＶＶｂＥ６ ／ＶＶｈＥ７　０／１０　２／１’０　２／１０ＶＶＯＯ／３０　０／３０　０ ／３０ 上記結果より、ＨＰＶ−１６誘発腫瘍の進展に対する予防におけるＥ７及びＥ６ 抗原による作用の重要性が明らかである。

全ての細胞系統において、Ｅ７蛋白の発現が免疫沈降により確認された。Ｅ７抗 原による予防作用は、従って試験した系統にはよらない。

下記種は、１９８９年２月２４日に、バスチュール研究所（ハＩＪ　）　（Ｐａ ｓｔｅｉｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　（Ｐａｒｉｓ）　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ）　１．：寄託された。

−Ｅ、ｃｏｌｉ　ｐＴＧ２１９８　Ｎｏ、ｌ−８３７−Ｅ、ｃｏｌｉ　ｐＴＧ２ １９９　Ｎｏ、ｌ−８３８−Ｅ、ｃｏｌｉ　ｐＴＧ３１８０　Ｎｏ、Ｉ−８３９ 参考文献 （１）　ＰＦＩＳＴＥＲ，Ｈ，（１９８７）、　Ｔｈｅ　Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉ ｄａｅ：Ｔｈｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ　（ｅｄｉｔｏｒｓ、ｓａｌ ｚｍａｎ、Ｎ、Ｐ、ａｎｄＨｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、）　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、１−３８Ｐａｐｉｌ１−３８Ｐａｐｉｌｌｏ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

（４）　ＫＡＮＤＡ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８Ｂ）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６ ２，６１０−６１３（５）　ＶＯＵＳＤＥＮ、に、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８ Ｂ）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓ、　３．１−９（６）　ＢＥＤＥＬＬ、Ｍ、Ａ 、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６旦３６３５−（７）　Ｚ ｕｒ　ＨＡＵＳＥＮ、Ｈ，ａｎｄ　５ＣＨＮＥＩＤＥＲ，Ａ、（１９８７）、　 ＴｈｅＰａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅ ｓ　（ｅｄｉｔｏｒｓ。

Ｓａｌｚｍａｎ、Ｎ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、）　Ｐｌｅｎｕｍ 　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　ｐ、２４５−２６３ （８）　ＷＥＣＫ、Ｐ、に、　ａｎｄ　ＷＨＩＳＮＡＮＴ、Ｊ、に、（１９８７ ）、　Ｔｈｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｓｅｓ　（ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｓａｌｚｍ ａｎ、Ｎ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｈｏｗｌｅｙ。

Ｐ、Ｍ、）　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、３９３− ４０２（１２）ＤＡＶＩＳ　Ｇ、ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｂａ５ｉｃ　ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）（ １３）ＡＮＤＲＯＰＨＹ、Ｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｔｈｅ　Ｐａｐ ｏｖａｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ　（ｅｄｉ ｔｏｒｓ、Ｓａｌｚｍａｎ、Ｎ、Ｐ、ａｎｄＨｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、）Ｐｌｅｎ ｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ、７９−８５（１４）ＳＣＨＬＥＧＥ Ｌ、Ｒ，ａｎｄ　ＷＡＤＥ−ＧＬＡＳＳ、Ｍ、（１９８７）、Ｔｈｅｐａｐｉｌ ｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ　（ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｓａｌｚｍａｎ、Ｎ、Ｐ、ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ、Ｐ、Ｍ、）Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ、 ８７−９１（１５）ＳＣＨＩＬＬＥＲｅｔ　ａｌ、（１９８４）、ＰＡＮＳ　８ １，７８８０（１６）ＡＮＤＲＯＰＨＹ、Ｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．．４４２−（１７）ＢＵＲＣＫＨＡＲＤＴ、Ａ、ｅｔ 　ａｌ、（１９８７）、ＥＭＢＯＪ、６．２３８１−（１Ｂ）　ＧＲＩＳＯＮＩ 、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１３５．４０６−４１ ６（１９）ＬＡＴＨＥ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｇｅｎｅ　５７，１９ ３−２０１（２０）ＡＮＤＲＯＰＨＹ、Ｅ、Ｊ、ａｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｅ ＭＢＯＪ、６．９８９−９９２（２１）ＳＨＯＴＫＩＮ　ａｎｄ　ＷＥＴＴＳＴ ＥＩＮ（１９８６）、ＰＡＮＳ、８３．１６８９−（２２）ＳＴＯＲＥＹ、Ａ、 ｅｔ　ａｌ、（１９８Ｂ）、ＥＭＢＯＪ、７．１８１５−１８２０ＷＯＷｂＥＩ 　ＷｂＥ２　ＷｂＥ５　ＷｂＥ６　ＷｂＥ７ＶＯＶＶｂＥ５　ＷｂＥ８　ＷｂＥ ７　ＷｂＥ５　ＷｂＥ６ＷｂＥ６　ＷｂＥ７ （１）　（２）　（３）　（４）　ｋＤａ１０ン、二」 ４Ｉｅて堂ｎ佃叩つ堺由婁（特許法第１８４条の８）請求の範囲 １．　乳頭腫ウィルスもしくは該蛋白の基本的ドメインから得られたＥ５、Ｅ６ 及びＥ７蛋白から選択される蛋白をコードする外来ＤＮＡ断片をゲノムに挿入さ れた組換えポックスウィルスを含み、該ＤＮＡ断片がその哺乳動物での発現のた めの制御因子の支配下にあることを特徴とする乳頭腫ウィルス感染もしくは腫瘍 の予防及び治療のための薬理組成物。

２、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７蛋白から選択される蛋白をコードする外来ＤＮＡ断片を ゲノムに挿入された組換えポックスウィルスを含み、該ＤＮＡ断片がその哺乳動 物での発現のための制御因子の支配下にある請求の範囲第１項に記載の薬理組成 物。

３、ＨＰＶ−１６型乳頭腫ウィルスから得られるＥ５、Ｅ６及びＥ７蛋白から選 択される蛋白をコードする外来ＤＮＡ断片をゲノムに挿入された組換えポックス ウィルスを含む請求の範囲第２項に記載の薬理組成物。

４、　乳頭腫ウィルスから得られるＥ５、Ｅ６及びＥ７蛋白から選択される蛋白 をコードする外来ＤＮＡ断片をゲノムに挿入された組換えポックスウィルスを含 む請求の範囲第２項もしくは第３項に記載の薬理組成物。

５、　乳頭腫ウィルスから得られるＥ５蛋白をコードする外来ＤＮＡ断片をゲノ ムに挿入された組換えポックスウィルスを含む請求の範囲第２項〜第４項のいず れかに記載の薬理組成物。

６、　乳頭腫ウィルスから得られるＥ６蛋白をコードする外来ＤＮＡ断片をゲノ ムに挿入された組換えポックスウィルスを含む請求の範囲第２項〜第４項のいず れかに記載の薬理組成物。

７、　乳頭腫ウィルスから得られるＥ７蛋白をコードする外来ＤＮＡ断片をゲノ ムに挿入された組換えポックスウィルスを含む請求の範囲第２項〜第４項のいず れかに記載の薬理組成物。

８、　翻訳開始領域の一３位がＡもしくはＧを含む請求の範囲第１項〜第７項の いずれかに記載の薬理組成物。

９、ポックスウィルスが生きているか又は死滅したものである請求の範囲第１項 〜第８項のいずれかに記載の薬理組成物。

１０、ヒトもしくは他の動物への注入投与を可能とする薬理的に許容される担体 を含む請求の範囲第１項〜第９項にいずれかに記載の薬理組成物。

国際調査報告 ”＝　ＰＯＴ’／ＦＲ９０１００１５１

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．予防及び治療有効成分として、乳頭腫ウイルスの非構造蛋白の基本領域を少 なくともコードする外来ＤＮＡ配列を含む組換えボックスウイルスの少なくとも 一種と、その高等細胞での発現のための調節因子を含むことを特徴とする薬理組 成物。
2. ２．外来ＤＮＡ配列発現のための制御因子が遺伝子の転写プロモーター及び宿主 細胞での翻訳開始領域を含む請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. ３．翻訳開始領域の一３位がＡもしくはＧを含む請求の範囲第２項に記載の組成 物。
4. ４．乳頭腫ウイルスウイルスが生きているか又は死滅したものである請求の範囲 第１〜３項のいずれかに記載の組成物。
5. ５．ＤＮＡ配列が少なくともＨＰＶ−１６ウイルスの初期蛋白の少なくとも一つ を含む請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の組成物。
6. ６．初期蛋白がＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７から選ばれる請求の範囲 １〜５項のいずれかに記載の組成物。
7. ７．初期蛋白がＥ６、Ｅ７及びＥ５から選ばれる請求の範囲第６項に記載の組成 物。
8. ８．初期蛋白がＥ７蛋白である請求の範囲第７項に記載の組成物。
9. ９．初期蛋白が第６図に示されるコード配列のＥ５蛋白である請求の範囲第７項 に記載の組成物。
10. １０．乳頭腫ウイルスの初期蛋白をコードするＤＮＡ配列が用いた乳頭腫ウイル ス遺伝子のプロモーターの支配下にある請求の範囲１〜９のいずれかに記載の組 成物。
11. １１．乳頭腫ウイルがワクチニアウイルスである請求の範囲第１０項に記載の組 成物。
12. １２．プロモーターがワクチニアウイルスの７．５ｋ蛋白のための遺伝子のプロ モーターである請求の範囲第１０項に記載の組成物。
13. １３．乳頭腫ウイルスの初期蛋白をコードするＤＮＡ配列が用いたウイルスの非 必須領域にクローン化されている請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の組 成物。
14. １４．非必須領域がＴＫ遺伝子である請求の範囲第１３項に記載の組成物。
15. １５．ヒト及び動物への注入投与を可能とする薬理的に許容されるビヒクルを含 有する請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の組成物。