JPH05503354A - キレート試薬結合化合物を精製する方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 チし」凭し！λヨ８１を外 キレート試薬結合化合物を精製する方法１吋座上１ 本発明は生物分子を標識することに係わる。特に本発明は、１１１識反応に次い で、標識生物分子を未結合の標識試薬から分離することに係わる１本発明は、生 物分子がタンパク質であり、標識試薬が放射性核種である場合に特に適している 。特に用途があるのは、免疫診断及び免疫療法の分野である。

Ｗ遣 生物分子は、放射性核種、毒素、ビタミン、蛍光化合物及びキレート化剤を含む 種々の試薬のいずれかで標識することができる。標識試薬は、例えば代謝標識ま たはニックトランスレーションによって生物分子の構成要素として取り込むこと もできるし、共有結合または他の分子間力によって生物分子に付着することもで きる。後者のカテゴリーの標識方法の例としては、蛍光色素のインチオシアネー ト誘導体を使用して抗体を蛍光性にすること、ビオチンの光活性誘導体を使用し て核酸を標識すること、及び酸化的反応または酵素仲介反応を使用してタンパク 質上のチロシン残基のところにヨウ素を結合することを挙げることができる。

標識操作は、生物分子と標識試薬を混合するだけの簡単なものとし得る。

米国特許第４，７０７，３５２号は、生物分子に結合させたキレート化剤からな る非標識化合物を、放射性金属を結合させたイオン輸送材料と接触させるステッ プを含む標識方法を開示している。前記イオン輸送材料の放射性金属に対する親 和性は前記キレート化剤の前記金属に対する親和性よりも低い、実施例において は、１ｆｆＮｉが付加されたイオン交換樹脂を含むカラムが使用されている。キ レート試薬結合体をカラムに通し、放射性標識キレート試薬結合体として溶出さ せる。標識方法を実施するための成分はキット内に含むことができる。

標識反応の結果として、全ての反応物質、特に未反応標識試薬を、標識生物分子 、即ち生成物から分離することにより、生成物を精製することが望ましいことが 多い、未結合標識試薬の存在は、無関係な分子と会合することにより（非特異的 結合）またはバックグラウンドの一因となることにより、結果を混乱させ得る。

多くの標識試薬は小分子または元素であるなめ、生成物を未結合試薬から分離す る一般的方法は、サイズまたは重量の分別に依存する。！０ち、サイズ排除クロ マトグラフィーまたは透析を使用することができる。生成物と反応物質との間に 電荷の差があるときには、イオン交換クロマトグラフィーが適した分離方法であ る。

イオン交換樹脂とサイズ排除樹脂とを組み合わせた放射性標識抗体を精製する方 法が、米国特許第４，４５４，１０６号に開示されている。９ｃｍのカラムは、 粒子を質量で１．５００〜２５，０００ダルトンに分画し得るゲル濾過媒体７ｍ ｌの上に２００〜４００メツシユ力チオン交換樹脂１ｍｌを重ね、更にその上に イオン遅滞樹脂１ｍｌを重ねて製造されている。カラムは、２００ｍＭ塩化ナト リウム及び１０ｍＭ　ＭＥＳからなるｐ　Ｈ６，０ノ１ｕｌｌ液で平衡化されて いる。関連米国特許第４，４７２，５０９号において、テクネチウム標識抗体を 精製するのに適した床は、カチオン交換樹脂の下方で且つゲル濾過媒体の上方に アニオン交換樹脂１ｍｌを含むように改良された上述の３成分床である。

Ｍｕｋｋａｌａら（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９＞１７６　：　３１９ −３２５）は、架橋キレート試薬を使１　用し、ＩｇＧをＥｕ”で標識した１反 応混合物を、１．５（ｘ５ｃｍ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃ ｉＫ　ａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；デキストランビーズ）′　カラムと １．５Ｘ３０ｃｍ　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ＧＦ２０００（Ｒｅａｃｔｉｆｓ　Ｉ ＢＦ；ポリアクリルアミトビｔ　−ズ）カラムとを組合せたものに通すことによ り、標識抗）　体生成物を反応物質から精製した。

Ｅｓｔｅｂａｎら（Ｊ、Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ（１９８７）Ｃ２８：８６１−８７０ ）は、”’Ｉｎ１ＩＩＩ抗体を精製する１　４つのプロトコルをＩＩ！操作の終 了時点において比較した。

；　彼らは、単一の標識調製物を４つの等蓋部分に分割した。

１つのアリコートは過剰なＥＤＴＡ溶液で処理し、そのあと分離することはしな かった。別のアリコートは、１×８ｃｍ　ゲル排除（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５ ０ｆｉｎｅ）カラムに通しな、第３のアリコートは７．５ｍｍＸ３０ｃｍ　ＨＰ ＬＣ（ＴＳＫ　３０００）カラムに注入し、最後のアリコートは、まず０５０カ ラムで、次いでＴＳＫ　３０００カラムで順次処理した。ＥＤＴＡ処理において 最低の結果が得られ、Ｇ−５０カラムではかろうじてそれよりよい結果が得られ 、ＨＰＬＣ精製した標識抗体は、ＥＤＴＡ精製アリコートの３倍の腫瘍：肝比を 有し、Ｇ−５０／ＴＳＫ　３０００の組合せにおいて最高の結果が得られた。

Ｅｓｔｅｂａｎらは、広範囲に使用されているＥＤＴＡ法は、夾難物を含まない 調製物を生成する上で無効であり、バックグラウンドを最小化したいならば他の 精製方法を考慮すべきであると結論した。

米国特許第４．７７５，６３８号は、抗体を放射性標識するための単一バイアル 方法を開示している。該方法は、内側表面を触媒で被覆した密封容器内に放射性 同位元素を導入し、前記容器内に抗体を導入し、混合物をインキュベートし、抗 体に結合しなかった放射性同位元素を吸収するイオン交換樹脂を前記容器中に導 入し、混合物を取り出し、樹脂を上清から分離することからなる。好ましい樹脂 は、ＡＧ　１−Ｘ８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＞のようなアニオン交換体である。この方 法は主に放射性ヨウ素化方法に向いているが、発明者らは、放射性同位元素の抗 体への触媒仲介結合及びその後の前記標識抗体の精製は、キレート化による”Ｇ 　ａ及びＩＩＩＩｎｓ識に適用し得ると推測した。

当業者が使用可能な分離方法は多様であるにもかかわらず、全般的な制約によっ て、高感度を要求する方法において標識生物分子を使用することは制限される。

この制約とは、当分野における多くの現行方法の未結合標識試薬を除去する効率 が幾分低いことである。明らかな例は、ラジオイムノシンチグラフィーとして公 知の方法である、悪性細胞成長をその場で検出するなめに放射性標識抗癌抗体を 使用することである０本発明には直接関与しない種々の理由により、少量の抗体 しか悪性軸取に結合しないことが多い。

従って、理想的な条件下でさえシグナルを識別するのは困難である。高バックグ ラウンドのために診断が不可能となることも珍しくはない、従って、検出を保証 または増強する１つの方法は、未結合放射性核種を有意に含まない標識抗体を使 用することである。

ゲル排除クロマトグラフィーの使用に対する別の制約は、ＩｇＭ抗体がカラムマ トリックスに非特異的に、またときには不可逆的に結合する傾向にある０例えば Ｈａｌｐｅｒｎ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ（１９８８）２９：１６８ ８−１６９６を参照されたい。

別の制約は、はとんどの方法が長時間を要することであ・　る、放射性核種、特 に放射性金属の多くは、数日でなければ多くは数時間という短い半減期を有する 。従って、迅速に精製すれば、標識生物分子調製物の特異的活性は高くなる。

更に、前出の分離方法は他の欠点がないわけではない。

多くは高値な装置や熟練した技術者を必要とし、生物学的夾ｍ￥１１ｉを含み易 く、精密なモニタリングを必要とし、大規模化の余地がないなどの欠点がある。

かかる装置は、放射能漏洩の場合には汚染除去が困難でありしかもコストがかか り得る。

上記問題点の解決が動機となって本発明が提供された。

本明細書に開示するのは、現行方法を使用して得られるより高い割合で、標識生 成１１Ｊと未結合反応物質から分離する方法である１本発明の方法は、単純であ ること及び安価であることを含む幾つかの理由により有利である。更に該方法は 、生物学的夾雑物を含みに＜＜、生物分子の生物学的活性に影響せず、高い集約 収率を与え、標準的な病院的検査室において看護スタッフが使用し得、使用後の 廃棄が容易であり、長期保存寿命を有し、種々の標識試薬及び生物分子との使用 に適用可能である。

免吋曵ｌ刀 本発明は、標識反応後、標識生物分子、即ち生成物を全ての未結合または弱結合 標識試薬から分離する方法に係わる１本発明は、前記未結合ｗｌｉ試薬を捕獲す るためにキレート試薬付着マトリックスを使用することを教示する。この方法は 、単純であること、未結合標識試薬の除去が高度に効率的であること、及び経済 的であることを含む幾つかの利点を与える０本発明を実施するための試薬は、病 院及び核医学研究所において応用場面に使用されるキット形態に容易に適応可能 である。

区１立星員ｌｌ贋 図１は、本発明を実施するための複数の容器の使用を示す。

図２は、複数の隔室を有する単一容器を含む別の実施態様を示す。

図３は、キレート試薬付着マトリックスを製造する方法を示す。

図４は、キレート試薬付着マトリックスを製造する別の方法を示す。

１吋ゑ註１ 本明細書及びフレイムに使用される全ての用語は当業者には周知である。しかし ながら、かかる用語に与えられる範囲を含む本明細書及びフレイムの明確で且つ 一貫性のある理解のために、以下の定義を与える：１蔓圀ｌ：生物学的実在物中 でまたはそれと適合性のエレメントまたは化合物。

し＝生物分子への標識試薬の物理的付着。

ｔｋ二ＩＬＩ：高親和性で金属イオンを結合する試薬。

キレート化剤としても公知である。

！ＬＪ（Ｃｏｎ　ｊ　ｕ　ｇ　ａ　ｔ　ｅ　）　：組成物。動詞としては、結合 する。

１慝工１：親物質を修飾すること。

１１試１：生物分子と反応させると、生物分子が検出、追跡またはモニターされ 得るように生物分子上に付加特性を試写する物質。

ボ１　々ノボｉ　ルボ　シレート：複数のアミノ基及び複数のカルボキシル基を 特徴とする、しばしばキレート化剤として使用される化合物。

１處〕：反応物質間の反応により得られる物質。

【Ｌ春Ｉ：反応の成分０例えば生物分子を標識試薬と混合して結合体を生成する 場合、生物分子及び［識試薬は反応の２つの反応物質であり、結合体は生成物で ある６１幕皇ｉｚ　：別の物質に物理的に結合しなかった反応物質６ 本発明は、未結合標識試薬を捕獲するために、不活性マトリックス、好ましくは 粒状マトリフックスに結合させたキレート試薬またはキレート化ポリマーを使用 することに係わる６キレート化剤は、多くの標識試薬がそうである低分子量化合 物に対して高い結合活性及び高い親和性を有するものが選択される。適当なキレ ート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミ ン五酢Ｍ　（ＤＴＰＡ）＋ポリアザ大環状化合物、ベンジルＤＴＰＡ、ベンジル ＥＤＴＡ、ＬｉＬｏ、ＩＤＡＣ、ポリアミノポリカルボキシレートの他の活性化 誘導体、ある種の抗生物質、クラウンエーテル、他の大環状化合物、例えばトラ ンスフェリン、アポフェリチン及びメタロチオネインのような天然キレート化タ ンパク質、並びにジアゾ化芳香族アミンを挙げることができる。キレート化ポリ マー及び他の多官能キレート試薬は、上述のものよりずっと有効となり得る。

適当なマトリックスとしては、ガラス、ポリスチレン、アミン誘導ポリマー、シ リカ、アガロース、シリカプロビルアミン、コポリマー及び他の樹脂を挙げるこ とができる。

所定のマトリックス−キレート試薬の組合せを用いると、キレート化剤をマトリ ックスに付着させるのに複雑な反応を必要としない０例えばポリスチレン及びガ ラスは、小分子、タンパク質などに対する固有結合能を有する。しかしながら、 アミン誘導ポリマービーズまたはアミン誘導ポリマー被覆ガラスピーズの場合に は、キレート試薬はビーズに化学的に結合され得る。

キレート試薬はマトリックス上で合成することができる。

例と挙げると、まず、市販のアミン誘導ビーズをカラムに充填する。ビーズを単 純なカルボキシメチル化によってイミノニｆｆｌ：Ｍ基に結合し、カラムをＭ衝 液でフラッシュする。

ビーズをアンモニアで処理し、カラムとフラッシュし、もう一度カルボキシメチ ル化ステップを実施する。所望の数のカルボキシレート基が得られるまで上記過 程を繰り返す。

本発明は、金属で標識した生物分子を必要とする方法に特に適している。キレー ト化剤の架橋を使用して生物分子を標識すること、即ち、キレート化剤を生物分 子に結合し、次いで結合体に金属を、金属がキレート化剤によって結合されるよ うに付加することは珍しくない、適当な金属としては、α線及びβ線放射性核種 、γ放射体、Ｘ線放射体、陽電子放射体、常磁性金属イオン、発光金属及び蛍光 金属を挙げることができる。使用し得る元素及び同位体の範囲を更に例示するた めに、適当な候補として、５ａｐｅ、”Ｆ　ｅ　、　”Ｃｏ　、”Ｆ　ｅ　、’ ″Ｓ　ｃ　、”Ｓ　ｃ　−４７Ｓ　ｃ、＋２Ｊ　、　１２ｓ　工　、１３ＯＩ　 、　１コｌｉ、ｌコＩ　Ｉ　、１３５　Ｉ　、＠＠Ｒｂ　、１）４Ｃｓ　、　１ °’Ｒｈ　、　２°コｐｂ　、　′３フＣｓ　、　１ココＢａ　、　”Ｙ　、９ ０Ｙ、　”２Ｅｕ、’フＧａ　、　”Ｇａ　、　”Ｃｒ　、　”５Ａ　ｃ　、　 コ２Ｐ　、７２Ａｓ　、　１５コＳｍ　、　”’Ｒｅ　、　”’Ａ　ｕ　、”’ Ｒｈ　、　フ”Ｓｅ　、９フＲｕ　、　ＩＯｏＰｄ　、　１ｏｏｐ　ｄ　、＋１ １３　ｂ　、　１２冒Ｂａ　、　１９７）１　ｇ　、２１１Ａｊ、２１２Ｂｉ、 ２１２ｐｂ、２１コＢｉ、””Ｒｅ、１４”Ｐｒ、ＩＱ？Ａ　ｓ　、Ｉｌｌ　Ｉ 　ｎ　、＠フＣｕ　、　？ＳＢ　ｒ　、　”Ｂｒ　、　”ｃ　、　”ｃ　、１３ Ｎ、”ｏ、コ５Ｓ、１・Ｆ、Ｐｒ、Ｎｄ、””Ｇｄ、＋５ｉＨＯ１”’Ｉ　ｒ、 Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、う９烏Ｔｃ、目２Ｉ ｒ、及び２ｇ’Ａｍを挙げることができるが、キレート試薬を使用する場合には 種がカチオンであるのが好ましい。

同種のキレート化剤を生物分子及びマトリックスの両方に結合させると、特定の 利点が発揮される。親和性に差がないので、一旦生物分子に結合した標識試薬が 分離操作によって引き離される可能性はわずかしかない、キレート試薬をマトリ ックス及び生物分子に結合する組合せを具体的に説明する助けとするために、式 ： 〔式中、ＢＭは生物分子であり、 Ｍはマトリックスであり、 Ａは第１のキレート試薬であり、 Ｂは第２のキレート試薬であり、 Ｌは標識である〕 を考える。

Ｋは結合親和性を表わすとすると、下記のような幾つかの比較条件が表わされ得 る。

（１）Ａ＝Ｂ （２）Ａ＃Ｂ　且つ　ＫＡ＝Ｋｌｌ 捕獲方法の別の実施態様においては、 Ｍ−Ｃ−Ｌ 〔式中、Ｃは第３のキレート試薬である〕で表される追加成分をあわせて３種の キレート試薬が使用され、ＢＭ−Ａ−Ｌ、Ｍ−Ｂ−Ｌ及びＭ−Ｃ−Ｌは該方法に おいては同時に使用される６キレート試薬Ｂ及びＣは、両方が同じマトリックス に結合されるか、または各々が別個のマトリックスに結合されるかのいずれかで ある。後者の実施態様に係わる比較条件としては下記のものを挙げることができ る。

＜５）Ａ＝Ｂ　且つ　ＫｃくＫＡ （６ンに、＜ＫＡ　且つ　Ｋ。＜ＫＡ （７）Ｋ、＝ＫＡ　且つ　Ｋｃ＜ＫＡ 上述したように、同じキレート試薬が生物分子及びマトリックスに結合している 比較条件（１）は好ましい組合せである。比較条件（２）は比較条件（１）と機 能的に等価である。比較条件（３）によって表される精製効率は、ＫユがＫＡよ りどのくらい低いかに従う１Ｍ−Ｂ−Ｌの量の増加とともに、見掛けの不足が補 填され得る。比較条件（４）は、ＫＡかに、よりずっと小さいのでなければ容認 可能である。比較条件（５）、（６）及び（７）は、所定のキレート試薬を用い ると予想外の利益がもたらされ得る。

Ｉｆ識操作は、１つ以上の密封反応容器内または複数の隔室をもつ単一反応容器 内で実施することができる０図１は、第１の反応バイアルと、キレート試薬付着 マトリックスを含む第２のバイアルと、第３の生成物バイアルとを含む複数の容 器を必要とする実施態様を示す、放射性標識は第１のバイアル内で行われ、反応 混合物は第２のバイアルに移され、そこで混合物はキレート試薬−マトリックス 結合体と接触し、次いで例えばシリンジによって上清が取り出され、その上清は 、場合によっては濾過して、第３のバイアル内に収集される。

図２は、複数の隔室を有する単一容器が表されている別の実施態様を示す、前記 隔室は、第１の隔室（１）がら、キレート試薬付着マトリックスを含む隣り合っ た第２の隔室（ＩＩ）への反応混合物の移送を可能にする手段によって相互に分 離されている。この実施態様においては、例えば止めコックのような弁デバイス が隔室を分離している。止めコックの等傷物としては、破裂可能な非透過性膜、 可動ストッパー及び切込み線入りガラス（ｓｃｏｒｅｄ　ｇｌａｓｓ）を挙げる ことができる。未結合反応試薬がキレート試薬−マトリックス結合体によって反 応混合物がら除去された後にその反応混合物を受取る第３の隔室（ＩＩＩ）を前 記第２の隔室に取り付けることができる。

第３の隔室は、密封２隔室容器を使用する（本発明に使用し得る密封２隔室容器 の例は、Ｉｎ　ｒｅｓ　ｏｎｎ。

ｙ１副、１６０　ＵＳＰＱ　２３７に示されている）、標識反応は第１の隔室内 で行われるが、そこには例えばシリンジによって反応物質が導入される。第２の 隔室は、キレート試薬−マトリックスを含んでいる。標識反応が完了したら、第 １の隔室と第２の隔室とを分離しているストッパ一手段を破壊し、第２の隔室内 で反応物質をキレート試薬−マトリックスと接触させる。未結合標識がキレート 試薬−マトリックスによって捕獲されるのに十分な時間の後、上清中の標識生物 分子をシリンジを使用して取り出すことができる。操作全体が密封された無菌容 器内で行われるが故に、上清は患者に直接投与することができる。キレート試薬 に結合させるマトリックス、例えばポリマービーズの寸法は、大きすぎてシリン ジに入らないように選択する。

適当なマトリックスを選択し、キレート化剤と結合させる１図３は、間接的結合 によってビーズを調製する例である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とジエチレ ントリアミン五酢Ｍ　（ＤＴＰＡ）とを結合させる。ＨＳＡ−ＤＴＰＡ結合体を 粒状ポリマーマトリックス（Ｐ）に付着させてＰ−ＨＳＡ−ＤＴＰＡを形成する 。別の反応バイアルにおいて、キレート試ｆｆ１（Ｃ）（Ｌ）、この実施例にお いては好ましくはＤＴＰＡをモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）と結合させる。Ｍ ｏＡｂ−ＣＨＬ結合体をインジウム（Ｉｎ（１１１））で標識する。図中、未結 合標識試薬はＩ　ｎ　（’１１１）と示してあり、標識抗体はＭｏＡｂ−ＣＨＬ 、−１ｎ　（１１１）と示しである。Ｐ−ＨＳＡ−ＤＴＰＡを反応混合物に加え 、Ｉｎ（１１１）をキレート化によって捕獲する６図４は、ビーズとキレート試 薬とを直接結合させる別の実施態様である。アルキルアミン誘導の粒状ポリマー マトリックス（Ｐ−ＮＨ・・・）をＤＴＰＡと結合してＡＭ−ＤＴＰＡを形成す る０図３に示したのと同様に、ＡＭ−ＤＴＰＡは反応混合物からＩｎ（１１１） を捕獲する。

マトリックスへの非特異的結合を更に最小化するために、結合体を、タンパク質 または炭水化物材料に暴露して非特異的部位をブロックすることもできる。適当 なブロック物質としては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、血清、ポ リビニルピロリドン、デキストラン及びフィコールを挙げることができる。キレ ート試薬−マトリックス結合＃を完全に洗浄し、適当な量を第１の容器または前 記複数隔室付き容器の隔室内に入れる。

生物分子は、好ましくはマトリックスに結合させたのと同種のキレート化剤と結 合させる。結合ステップに次いで。

生物分子を、例えば沈澱またはゲル排除クロマトグラフィーによって未結合キレ ート化剤から分離する。得られた溶液を第２の容器または前記複数隔室付き容器 の別の隔室に入れる０通常は市販業者から購入される標識試薬を生物分子含有溶 液中に導入し、適当なインキュベーション条件下でキレート化を進行させる。次 のステップにおいては、標識試薬溶液を、キレート試薬−マトリックス結合体を 含む容器または隔室に移す。Ｉｋ終濃混合物周期的に混合しながらインキュベー トする。標識生物分子を含む上滑を取り出す。

或いは、エフェクター分子として作用する生物分子、例えば抗体または核酸１０ −ブは、それ自体が検出可能な物質で標識する必要はない０代わりに、前記エフ ェクター分子を第１の結合パートナ−分子で標識し、検出可能なａｍ物質を第２ の結合パートナ−分子に結合させ、前記第１及び第２の結合パートナ−分子を相 互に反応させて結合体を形成する。この別の標識方法はプレターゲット（ｐｒｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）として公知である１例えば、組織反応ストレプトアビジン 結合抗体は、放射性標識ビオチンを使用して可視化することができ、ポリＡテー ルを含むハイブリダイズ核酸プローブは、アルカリ性ホスファターゼ結合ポリＴ オリゴヌクレオチドや、ＮＢＴ／ＢＣＩ　Ｐのごとき適当なホスファターゼ基質 を用いて可視化することができる。第１の抗体例においてはストレプトアビジン 及びビオチンが第１及び第２の結合パートナ−分子であり、第２の核酸例におい てはポリＡ及びポリ下ポリヌクレオチドが第１及び第２の結合パートナ−分子で ある。結合パートナ−分子として使用し得るポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ビニ ルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、並びに、ポリア クリル酸及びポリメタクリル酸と反応するポリ−Ｎ−ビニルピリジンを挙げるこ とができる。

以下の非限定的な実施例によって本発明の態様を更に説明する。

実施例１ ２ステツプ法において、ポリスチレンビーズをＤＴＰＡと結合させた。５０ｍＭ リン酸！！衝溶液、ｐ　Ｈ７，２中のヒト血清アルブミン（）（ＳＡ）を１００ 倍モル過剰のＤＴＰＡ二無水物と一緒に室温で１５分間インキュベートした。

混合物をＧ−５０カラムに通すことにより、未結合のＤＴＰＡを除去した。

Ｈ３Ａ−ＤＴＰＡ溶液を１４　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌに調整し、約４０個の１７４ インチ球状非多孔質ビーズを溶液に加えた。

混合物を静かに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。液体をデカント し、ビーズを蒸留水で洗浄し、真空下に乾燥した。

実施例２ 乾燥クロロホルム中の０．１ｍｇ／ｍｌ　ＤＴＰＡ無水物溶液を調製し、所望の 量のＤＴＰＡを含むアリコートを反応容器に加えた。室温で窒素ガスを用いて蒸 発させることによりクロロホルムを除去した。０．０５Ｍ重炭ｗ１緩衝液中の抗 体（約０．５ｍｇ）溶液、ｐＦ（７，０を前記反応容器に加え、無水物対タンパ ク質のモル比を７：１とした。溶液を振盪しながら１公開インキュベートし、５ ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムに通すことにより結合抗体を回収した。

実施例３ １．０Ｍアセテートを使用し、最終ｐＨ６，０を有するアセテート中０．５Ｍの 放射性核種溶液を調製した。放射性核種溶液を抗体−ＤＴＰＡ結合体に、０．１ ｍｌの２５％ヒト血清アルブミンと一緒に加え、混合物を頻繁に振盪しながら５ 〜３０分間インキュベートした。

実施例４ 総容積０．７５ｍ１の酢ｗｉ／クエン酸Ｉｆ衝液中にＮ’Ｉｎを含む溶液にＨ３ Ａ−ＤＴＰＡビーズを約３０分間で加えた。溶液を除去し、ビーズに結合した放 射能を測定した。

ビーズ数と結合した放射能の量とには正の相関がある。

更にＩＭＭＣＩでビーズを洗浄すると、結合した全ての放射能が除去され、ビー ズを再使用することができた。

実施例５ Ｈ３Ａ−ＤＴＰＡを、前述のごときクエン酸／酢酸Ｍ衝液中の”ｌＩｎで標識し た。アリコートを取り出し、過剰のＤＴＰＡで処理した。前記ＤＴＰＡ処理した アリコートを薄層クロマトグラフィーで分析し、遊離ｌ１ｌＩｎの割合を測定し た。アリコートは１２．２％の遊離１１１１ｎを含んでいた。５つのＨ３Ａ−Ｄ ＴＰＡビーズをＨ８Ａ−ＤＴＰＡ”’Ｉｎ溶液に加え、混合物を室温で３０分間 インキュベートした。この混合物からアリコートを取り出し５過剰のＤＴＰＡで 処理し、遊離１１１１ｎをＴＬＣによって分析した。前記第２のアリコートは３ ．９％の遊離１ｌＩＩｎを含んでいた。

実施例６ ＬｉＬｏは、ＯＴＣ／Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅで開発された新規のキレート試薬であり、係属米国特許出願第０７／３５８ ９１７号に記載されている。このキレート試薬をアミン誘導（ＡＭ）ビーズに、 水またはリン酸＃１ＩＩＦ！ｌＩ液、ｐＨ７，２中に調製したＬｉＬｏ飽和溶液 ５ｍｌに６０個のＡＭビーズを泰露することにより付着させた。ＮａＯＨを使用 して混合物のｐＨを７，５〜８，５に調整した。溶液をＮ温で一晩撹拌した。

液体をデカントし、ＩＭＨＣＩをビーズに加えた。混合物を室温で１０分間イン キュベートした。このステップで、ＬｉＬｏ結合ＡＭビーズに結合した遊離金属 が除去される。

ビーズを０．１Ｍ　ＨＣＩを用いて繰り返し濯いだ０次いで蒸留水を用いて、洗 液がｐＨペーパーに対して中性になるまで濯いだ、ビーズを真空下に乾燥し、デ シケータ−内に保管した。

実施例７ 酸洗浄した反応バイアル内で、２００μＣｉの塩化インジウムを、１５μｌの酢 酸Ｗｆｒ液（０，６Ｍ、ｐＨ５，５＞及び１５μｌのクエン酸！Ｉ！衝液（０， ０６Ｍ、ｐＨ５，５）と混合した。この溶液に抗体−ＤＴＰＡ結合体（リン酸緩 衝溶液、ｐ　Ｈ７，２中に１５７μｇ）を加え、混合物を室温で約３０分間イン キュベートした６次いで、約１ｍｌのリン酸緩衝溶液（０，０５Ｍ、ｐＨ７，２ ＞を加えた６反応混合物のアリコートを過剰のＤＴＰＡ溶液で処理し、反応混合 物中の未結合のインジウム−１１１の割合を測定した。

残りの反応溶液に、８つのＡ　Ｍ　−Ｌ　ｉ　Ｌ　ｏビーズを加えた。

ビーズと一緒に３０分間インキュベートした後、反応溶液のアリコートを過剰の ＤＴＰＡで処理した。クロマトグラフィー分析を実施して、未結合のインジウム −１１１の割合を測定した。結果は下記の通りである。

実施例８ ＩＤＡＣ−２は、ＯＴＣ／ＢＲＩで開発された新規のキレート試薬であり、係属 米国特許出願第０７／３５８９１７号に記載されている。実施例７に記載の方法 に従って、ＩＤＡＣ−２をＡＭビーズに結合した。

上記開示内容は、可能性及び好ましい実施態様を説明することで本発明を詳細に 記載したが、本発明の範囲及び主旨から逸脱せずとも、変更、改良がなされ得、 また他の用途も可能であることは当業者には明らかであろう１本発明の範囲は添 付のフレイムによって示され、フレイムと等価の意味及び範囲内にあるいかなる 変更も本発明の範囲内に含まれる。

ｌｆｆ１応・バイアル　２　ビーズ１古むバイアル　３　生成物パイアルステッ ブエ　ラ戸Ａ及び゛ｉ成１勿バイアルの九）臭Ｆユｇｕｒｅ　ｌ Ｈ６Ａ　＋　ＤＴＰＡ　Ｉ　Ｈ５Ａ−ＤＴＰＡＦｉｇｕｒｅ　３ 国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．結合及び未結合の標識試薬を含む混合物から未結合標識試薬を捕獲する方法 であって、前記混合物を、未結合標識試薬を結合し得るキレート試薬一マトリッ クス結合体と接触させるステップを含む方法。
2. ２．前記混合物中の前記結合標識試薬が、生物分子またはポリマーに結合してい る請求項１に記載の方法。
3. ３．前記生物分子が、ペアチドまたはタンパク質である請求項２に記載の方法。
4. ４．前記タンパク質が、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントであ る請求項３に記載の方法。
5. ５．前記生物分子が、核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである 請求項２に記載の方法。
6. ６．前記標識試薬が放射性核種である請求項１に記載の方法。
7. ７．前記標識試薬が、蛍光体、発光体または常磁性体である請求項１に記載の方 法。
8. ８．前記キレート試薬が、ポリアミノポリカルボキシレートまたはシクロポリア ザカルボキシレートである請求項１に記載の方法。
9. ９．前記キレート試薬が生物分子である請求項１に記載の方法。
10. １０．前記マトリックスが粒状である請求項１に記載の方法。
11. １１．前記マトリックスが誘導される請求項１に記載の方法。
12. １２．前記マトリックスが、容器の内側表面からなる請求項１に記載の方法。
13. １３．前記マトリックスが膜である請求項１に記載の方法。
14. １４．キレート試薬一マトリックス結合体を含む容器を具備するキット。
15. １５．更に、キレート試薬−免疫グロブリン結合体を含む第２の容器を具備する 請求項１４に記載のキット。
16. １６．前記容器が複数の隔室を有しており、前記キレート試薬−マトリックス結 合体が１つの隔室内にあり、キレート試薬−免疫グロブリン結合体が第２の隔室 内にある請求項１４に記載のキット。
17. １７．未結合標識試薬を除去することにより、末結合標識試薬を実質的に含まな い標識生物分子組成物を調製する方法であって、 （ａ）生物分子及び標識試薬を反応混合物中で接触させるステッア、 （ｂ）ステッア（ａ）の混合物を、実質的に全ての未結合標識試薬を結合するの に十分な量の、末結合標識試薬を結合し得るキレート試薬−マトリックス結合体 と接触させ、それによって、結合標識試薬を含む固相と標識生物分子を含む液相 とを生威するステップ とを含む方法。
18. １８．前記生物分子が免疫グロブリンである請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記標識試薬が放射性金属である請求項１７に記載の方法。
20. ２０．前記キレート試薬一マトリックス結合体が、粒子に付着させたポリアミノ ポリカルボキシレートからなる請求項１７に記載の方法。
21. ２１．前記標識生物分子を含む液相を、シリンジによって前記固相から分離する 請求項１７に記載の方法。
22. ２２．前記ステッア（ａ）及び（ｂ）を別個の反応容器内で実施し、反応物質を シリンジを用いて導入及び回収する請求項１７に記載の方法。
23. ２３．前記ステップ（ａ）及び（ｂ）を、単一容器の別個の隔室内で実施し、前 記隔室が、隔室間の内容物の移送を可能にする手段によって相互に連結されてい る請求項１７に記載の方法。
24. ２４．更に、前記第２の隔室に連結されている第３の隔室を含んでおり、前記第 ２及び第３の隔室が、隔室間の内容物の移送を可能にする手段によって相互に連 結されている請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記隔室間の内容物の移送を可能にする手段が、着脱自在の遮断手段によ って遮断されている請求項２３に記載の方法。