JPH05503708A - ＧＰＩｂαフラグメント及び組換えＤＮＡ発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＰＩｂαフラグメント及び組換えＤＮＡ発現ベクター関連出願の参照 本出願は、１９９０年１１月１４８１こ出願された米国特許出願第０７／６１３ ．０８３号の部分継続出願であり、前記米国特許出願第０７／６１３，０８３号 は、１９８７年ＩＩ月１７日こ出願された米国特許出願第０７／１２１゜４５４ 号の部分継続出願である、１９９０年１月４８ｉ：出願された米国特許出願第０ ７／４６０，６７４号の部分継続出願である。

上記米国特許出願第０７／４６０，６７４号に記載されかつ請求された発明は、 フォノ・ウィルブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子（ｖＷＦ）の血 小板膜の糖蛋白質１ｂ（ＧＰＩｂ）への結合を阻害するのに有用な蛋白質群に関 する。本出願は、上記出願の主題に関連し、更にｖｌｌｆＦのＣＰ［ｂαへの結 合を阻害するのに有用なペプチド及びポリペプチド、例えば、上記出願ぐ　６７ ４）で言及されているペプチドやポリペプチドをコードする新規なりＮＡ発現ベ クターに関する。

発明の分野 本発明は、（１）巨核球系統の細胞の表面で発現した血小板膜の糖蛋白質１ｂ及 びＧＰＩｂに対するフォノ・ウィルブランド因子の結合を阻止するペプチド及び ポリペプチド、（２１血小板の活性化、凝集及び表面接着を防止するためにこれ らのペプチド及びポリペプチドを使用すること、及び（３）血栓症防止のために これらのペプチド及びポリペプチドを使用することに関する。本発明はまた、（ ４１ｖＷのＧＰＩｂへの結合を阻害するペプチド及びポリペプチドであって、そ のペプチド及びポリペプチドが血小板膜蛋白質【ｂα（ＧＰＩｂα）のアミン末 端領域又はその配列サブセットを含むペプチド及びポリペプチドをコードする組 換えＤＮＡ発現ベクター及ヒ５）かかるベクターによって形質転換された宿主細 胞に関する。これらのベクターは、例えば、血小板の活性（ＩＺ、凝集及び表面 接着の阻害並びに血栓症の防止に使用できるペプチド及びポリペプチドの産生に 有用である。

例えば、外傷、手術又は病気のような状態によって、血管の内皮表面（ｌｉｎｉ ｎｇ）か破壊されて、内皮下結合組織が血液に晒されると、初期止血応答として 一次止血と呼ばれる血小板の栓の形成か起こる。この過程の重要な出来事の一つ は、晒された内皮下組織に血小板か接着することである。ｖＷＦは、血小板膜の 表面に見られるＧＰＩｂ受容体と、血管の内皮下層に見られる内皮下コラーゲン 繊維とに結合することによって、この接着に介在する。ｖｌｖＦによるこの作用 によって、例えば小さい血管における高い流速によって起されるような、損傷を 受けた又は病気の組織でしばしば見られる高い訂断応力の条件下において、血小 板の接着か起こる。この作用は、毛細管、小動脈及び小静脈からの血液の喪失を 防止するのに非常に重要である。

ｖＷＦ及びＧＰＩｂの間のこの重要な相関関係は、パーナート・ソウリエ（Ｂｅ ｒｎａｒｄ−３ｏｕｌｉｅｒ）症候群の出血性体質によって示唆される。この症 候群は、ＧＰ［ｂの量の減少又は機能異常、従ってｖＷＦがＧＰＩｂに結合しえ ないことによって著しく血小板接着が減少することによって特徴付けられる異常 である。

ｖｉｌｌＦ−ＧＰ［ｂ相互作用の阻害によって、−次止血が阻害ざ氏また血管の 閉塞が重要な役割を負っている病気を予防するのに有用な、抗血栓症状態を引き 起こすことが予想される。ＧＰ［ｂの蛋白質分解フラグメント及び、本発明のベ クターを使用して製造したペプチド及びポリペプチドは、ｖＷのＧＰＩｂへの結 合を阻害することによって抗血栓症剤として作用し得る。

技術的な背景に一ついて説明すると、ＧＰＩｂは、約１６０　ｋＤａの見掛は分 子量（ｍｏ１ｅｃυＪａｒ　ａｓｓ）を有する２つの鎖からなる分子である。Ｃ Ｐ［ｂは、約２２ｋＤａの分子量を育する軽１（ベータ又はＧＰＩｂβ）に対す るジスルフィド結合により連結されている約１４５　ｋＤａの分子量からなる重 鎮（アルファ又はＧＰｌｂα）からなる。ＧＰＩｂは一体の膜蛋白質であり、上 記アルファ鎖及びベータ鎖の両方ともトランスメンプレイン（ｔｒａｎｓｍｅｍ ｂｒａｎｅ）ｉＩ域を有する。内因性のカルシウム依存性血小板プロテアーゼに よる蛋白質分解によって、ＧＰＩｂαのアミノ末端部分から蛋白質分解フラグメ ントが生じる。このフラグメントは、グリコカリジン（ｇｌｙｃｏｃａｌｉｃｉ ｎ）として知られており、１４０　ｋＤａの近似の分子量を有するほぼ全体のＧ ＰＩｂα鎖からなっている。このフラグメントは、ＧＰＩＩ＞αの細胞外領域か ら由来し水溶性である。従って、親分子から分断されると、このフラグメントは 放出される。

ヒトＧＰＩｂαポリペプチドをコードする完全なｃＤＮＡは、ＬｏｐｅｚらのＰ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：５６１５−５６１７　（１９８７）と いう、先行技術にならない文献で決定されている。便宜上、ここでは上記Ｌｏｐ ｅｚらのアミノ酸番号付系に従う。また、ＧＰＩｂαの遺伝子は、プローブとし て部分的なｃＤＮＡを使用して、ゲノム性コスミトライブラリーからクローン化 された。イントロンを含めたその配列はＷｅｎｇｅｒニよって決定された（Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ ｏｎｎｕｎｉｃａｊｉｏｎｓ、　１５６（１）：３８９−３９５　（１９８８） 。ここでは、Ｗｅｎｇｅｒのヌクレオチド番号付系に従う。

予艶されるＧＰＩｂα配列は、１６個のアミノ酸からなるシグナルペプチド（λ Ｉｅｔ　−”−Ｐｒｏ−’）及びこの後に続く６１Ｏ個のアミノ酸からなる成熟 ペプチド又はポリペプチド領域（Ｈｉｓ’−Ｌｅｕ”’）からなる。表１に示さ れるように、４５ｋＤａのトリプシン分解フラグメントの完全な配列は、Ｈｉｓ ’乃至へ、ｇ２１０又はＡｒｇ２１２を含む。本出願においては、ＧＰ［ｂα及 びグリコカリジンは、同一のアミノ末端を存し、大きさかほぼ同一であるので、 グリコカリジンフラグメント及びＣＰＩｂαフラグメントに関する言及において は、等価のものとみなされる。

トリプシンは、残基Ａ、ｇｌ　Ｉ　’／Ａｌａ”　Ｉ　ｌ及び／又はＡｒｇ川／ 用ｈｒ”’の間でグリコカリジンを分裂させて、２種類のフラグメント、即ち、 一つは４５ｋＤａの見掛は分子量を有し、アミノ末端残基Ｈｉｓ’乃至Ａｒｇｔ Ｉ又はＡ、ｇ２１３から延びているフラグメント、及び他のものは、８４ｋＤａ の見掛は分子量を有し、炭水化物に大変富み、かつＡｉａ２１１又は７ｈｒ！１ １から始まるグリコカリジンのカルボキシル末端半分を提供するフラグメントを 生しさせる。４５　ｋＤａフラグメントは、１本鎖種及び２本鎖種からなる。後 者は、残基１ｙｓ！！？及びＡ１ａ２３１の間てトリプシンによる付加的な開裂 により生じ、この場合、１以上の鎖間ジスルフィド結合によって結合された、見 掛は分子量かそれぞれ３５ｋＤａ及び７　ｋＤａの２種のポリペプチドとなる。

１本鎖種及び２本鎖種の相対的な割合は、グリコカリジンのトリプシン開裂の程 度による。例えば、酵素対基質比か１２００　（ｗ＋’ｗ＞て１８時間消化する と、２本鎖種か優先的に生じる。この種の２本の鎖は、ジスルフィド結合の還元 及びそれによって生じるスルフヒドリル基を、例えばモル過剰のジチオトレイト ールて処理し及びヨードアセトアミドでＳ−カルボキンイミドメチル化すること によって末端をブロックすることにより、分離することかできる。

発明の要旨 上記米国出願第０７／４７０．６７４号に記載されるように、以下の表１に示さ れるアミノ酸配列から選択されたグリコカリジンの４５ｋＤａアミノ末端トリプ シン分解フラグメントのペプチドを含み、かっ血小板膜糖蛋白質［ｂ及び／又は 巨核球系統細胞の表面に発現するＧＰＩｂへのフォン・ウィルブランド因子の結 合を阻害するペプチドか提供される。

表１ 更に、本発明は、上記表１に記載のアミノ酸配列から選択されたグリコカリジン の４５ｋＤａアミン末端トリプシン分解フラグメントの配列サブセットであって 、ＧＰＩｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現したＧＰ［ｂへのｖＷｌ”の 結合を阻害するサブセントを含む。

更に、本発明は、ＧＰ［ｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現したＧＰｌｂ へのｖＷＦの結合を阻害し、以下のペプチドからなるペプチド群から選択された ペプチドを含む。

更に好ましいペプチドは、ＧＰｌｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現した ＧＰ［ｂへのｖＷＦの結合を阻害するペプチドのアミノ酸の配列サブセットのペ プチドである。

更に、本発明は、一般式：　（ＫＲ）、（ｎは２〜ＩＯ）又はＲ，（ｎは２〜２ ０）で示されるペプチド、及びＧＰＩｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現 したＧＰ［ｂへのｖＷＦの結合を阻害するこれらの誘導体を含む。

本発明は更に、効果的な量の上記ペプチド又はサブセット又はここで記載される 池のポリマーにより、血小板の活性化、表面への血小板の接着及び血小板相互の 凝集を阻止する方法を提供する。

更に、本発明は、上記ペプチド又はサブセット若しくはここに記載される池のポ リマーの効果的な量を患者に投与することを含む、その患者における血栓症を治 療する方法を提供する。

上記米国出願゛６７４の親出願に記載されるように、ＧＰＩｂαポリペプチドを コートする完全なｃＤＮＡはＬｏｐｅｚらによって決定されている。かかる情報 によれば、ヌクレオチド配列は、４５　ｋＤａフラグメントからペプチドを発現 させるために適当なベクターに挿入することができる。従って、本発明の更に別 の特徴によれば、ＧＰｌｂαへのｖＷＦの結合を阻害するペプチド又はポリペプ チドをコードする組換えＤＮＡ発現ベクターが提供される。このベクターは、Ｇ Ｐ［ｂαのアミノ末端領域のＨｉｓ’〜Ｌｅｕ１１６のアミノ酸配列、又はその 配列サブセットをコードするヌクレオチド配列を含む。特に好ましいのは、ＧＰ ｌｂαのＨｉｓ’〜Ｔｈｒ　２　＊　４のアミノ酸配列を含むペプチドをコード するヌクレオチド配列を含むベクターである。

本発明は、更に、カルボキシル末端領域において及びそれを越えて、グリコカリ ジンの４５　ｋＤａのトリプシン分解フラグメントを含むペプチドをコードする 組換えＤＮＡ発現ベクターであって、適当な形質転換された宿主細胞において発 現させた場合に、上記４５　ｋＤａフラグメントの生物的活性を育するペプチド を産生ずるベクターに関する。

本発明は、また上記ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。特に、好ましい 宿主細胞は哺乳類の宿主細胞である。

本発明の別の特徴は、グリコカリジンの４５ｋＤａｌ−リブジン分解フラグメン トの生物活性を育するペプチド又はポリペプチドを製造する方法であって、その ペプチドを発現する条件下で上記形質転換宿主細胞を保持する方法に関する。

本発明の更に別の特徴は、全長ＧＰｌｂαポリペプチド（Ｈｉｓ’　−Ｌｅｕ” ’　）又はそのサブフラグメントを発現する方法であって、全長ポリペプチドを コードするＤＮＡ配列を構成し、そのＤＮＡ配列を、前記適当なプラスミド又は ベクターに挿入し、その変性プラスミド又はベクターで宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換宿主細胞を、全長ポリペプチド又はそのフラグメントをその宿 主細胞内で発現するような条件下で保持する方法に関する。

図面の簡単な説明 図１は、ＧＰＩｂαの４５　ｋＤａアミノ末端領域のペプチドサブフラグメント の、血小板ＧＰＩｂ受容体へのりストセチン依存性及びボトロセチン（ｂｏｔｒ ｏｃｅｔｉｎ）依存性ｖＷＦ結合に対する阻害効果を示す図である。

図２は、残基位ｆｔ２７１〜２８５からなるＧＰ［ｂαペプチドフラグメントの 、血小板ＧＰｌｂ受容体へのポトロセチン依存性（Ａ）及びリストセチン依存性 （Ｂ）ｖＷＦ結合に対する阻害効果を示す２種類の図を示す。

図３は、残基位１２５１〜２７９からなるＧＰ［ｂαペプチドフラグメントの、 血小［ＧＰＩｌ）受容体へのボトロセチン依存性及びリストセチン依存性ｖＷＦ 結合に対する阻害効果を示す図である。

図４は、ｐＭＷ＋及びｐ＆ＩＷ２形質転換細胞によって産生されたＧＰＩｂαポ リペプチドの、コンフォーメーション依存性抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体へ の反応性を示すドツトプロット図である。

図５は、宿主細胞内におけるｐ！ＪＩＩ１２ポリペプチドの細胞内プロセッシン グを示すイムノプロットである。

図６は、ｐｌＪＷ２により産生されたＧＰｌｂα抗原かホトロセチン誘起結合分 析において機能的に活性であることを示す図である。

発明の詳細な説明 本開示の目的のために、アミノ酸の受け入れられている略記表示を使用した。

その記号は以下の表２に示す。

表２ 一文字及び三文字によるアミノ酸の略執Ｄ　ＡＳＰ　アスパラギン酸 Ｅ　ＧＬＵ　グルタミン酸 Ｆ　ＰＨＥ　フェニルアラニン Ｃ；　ＧＬＹ　グリシン ＨＨｌｓ　ヒスチジン Ｌ　ＬＥＵ　ロイノン Ｍ　ＭＥＴ　メチオニン Ｎ　ＡＳＮ　アスパラギン Ｐ　ＰＲＯプロリン Ｑ　ＧＬＮ　グルタミン ＲＡＲＧ　アルギニン Ｓ　ＳＥＲセリン Ｗ　ＴＲＰ　トリプトファン Ｙ　ＴＹＲチロシン Ｂ　ＡＳＸ　Ａｓｐ又はＡｓｎで、区別なしＺ　ＧＬＸ　Ｇｌ　ｕ又はＧｉｎで 、区別なしＸ　Ｘ　未決定又は不定梨のアミノ酸 定義 ここで池に規定されている場合を除いては、以下の用語は指定された意味を示す 。

コドン： ｍＲＮＡを通してアミノ酸、翻訳開始信号又は翻訳終結信号をコードする３ヌク レオチドのＤＮＡ配列（トリブレット）。例えば、ＤＮＡヌクレオチドトリブレ ットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡ及びＣＴＧは、アミノ酸ロイシン （ＬＥＵ）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡは翻訳終結信号であり、そし てＡＴＣ，はメチオニン（ＭＥＴ）をコードする翻訳開始信号である。

構造遺伝子： 対応するメソセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を通して、特定のポリペプチドに 特存のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。構造遺伝子は、−次生成物として 、例えば、転写ＲＮＡ　（ｔＲＮＡ）又はリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）とし てＲＮＡを有することもできる。

転写・ 構造遺伝子からＲＮＡを産生ずる工程。

翻訳− ｍＲＮＡからポリペプチドを産生ずる工程。

コート化（ｃｏｄｉｎｇ）配列（暗号化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）　ＤＮＡ）適当な 読粋において、蛋白質のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列。本発明においては、 コード化配列の合成又は使用とは、５’　−ＣＧＧ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−３’　（ これは３゛−ＧＣＣ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−５’　の相補的ストランドを有する）で 示されるように対応する相補的ストランドであって、トリペブチｈ’ＮＨｔ−ａ ｒｇ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ＣＯＪをコードするコード化配列の合成又は使用を必然 的に含み得るものと理解される。−重鎖ストランドの議論又は権利請求は、他の ストランド及び技術の実施にとって適当で、有用でありかつ必要なものとしての その対応する二本鎖ストランドへ言及し又は権利請求しているものと見なされる 。

ｃＤＮＡ　： ｍＲＮＡテンプレートに存在する配列から酵素的に合成されたＤＮＡ分子又は配 列。

転写ストランド： ｍＲＮＡを産生するために、ＲＮＡポリメラーゼによって、ヌクレオチド配列“ ３゛−５°て読まれるＤＮＡ配列。このストランドは、非コード化ストランドと も呼ばれる。

非転写ストランド 転写ストランドのアンチパラレルの表現であり、チミン塩基か存在する（ｍＲＮ Ａのウラシル塩基に代わり）ことを除いては、ｍＲＮＡの塩基配列と同一のスト ランド。これは、　「コード化」と呼ばれる。この理由は、ｍＲＮＡと同様に、 ５゛→３゜を調べた場合に、翻訳のコドンが直接認識できるからである。このス トランドは、　「コード化（ｃｏｄｉｎｇ）」ストランドとも呼ばれる。

発現 構造遺伝子によって生産物を産生ずる工程。蛋白質の生産物の場合には、転写と 翻訳との組合せか必要である。

組換えＤＮＡ分子： 末端−末端で結合された、異なるゲノムからのＤＮＡのセグメントからなり、あ る種の宿主細胞に感染し、そこに保持される能力を有するか又は有するように修 飾され得る分子。

生物学的活性： 生物学的な意味で（即ち、ある生物体又はｉｎ　ＶｉｔｒＯの模擾において）分 子によって実行される又は引き起こされる活動の１以上の機能又は効果。ＧＰＩ ｂαのアミノ末端領域の特徴的な生物学的活性は、ｖＷＦへの結合能力、即ちｉ ｎ　ｖｉｔｒ。

において、例えば、リストセチンの存在下における血小板の凝集によって示さ− れる活性である。

還元条件： ｖＷＦ又はそれから由来するポリペプチドを含む溶液における、　「還元」剤の 存在に言及。この還元剤は、ｖＷＦのジスルフィド結合の分裂を起こさせる。し かし、当該技術に典型的な使用方法に合わせて、還元剤、例えば、ジチオトレイ トール（ＤＤＴ）は、含まれる硫黄原子の酸化状態に実質的な変化を与えないで 、ｖｌｌ／ＦシスティンとＤＤＴとの間でジスルフィド結合を形成させることに よって、ｖｌｌｌＦジスルフィド結合を分裂させる。

ファージ又はバクテリオファージ： 細菌に対するウィルスであり、その多くは、蛋白質の外皮又はコート（カプシド ）内に収容されたＤＮＡ配列からなる。

遺伝子の上流にあって、その転写を促進するＤＮＡ配列。

プラスミド： プラスミドか宿主細胞において複製するように、完全なレプリコンを存する非染 色体性の二重１１ＤＮＡ配列。プラスミドが原核又は真核宿主細胞内に置かれた 時に、その細胞の特性か、プラスミドのＤＮＡの結果として変化　（形質転換） してもよい。例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔり遺伝子を有するプラスミ ドか、予めテトラサイクリン感受性の細胞を形質転換して、テトラサイクリンに 耐性の細胞に変える場合。プラスミドによって形質転換された細胞は、ｒ形質転 換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｖｇｌｎｔ）　Ｊと呼ばれる。

クローニング又はクローン化、 無性繁殖又はＤＮＡ？Ｊｊ製によって、一群の生物体、又はその一つの生物体か ら誘導されたＤＮＡ配列又は池の高分子、乃至はその配列を得る工程。

発現プラスミド クローニングすべきＤＮＡ、例えばｖＷＦ構造遺伝子か挿入されたプラスミド。

そこに挿入されたＤＮＡ配列は、それから得られた＋ｎＲＮＡの翻訳を調節する 配列を含んでもよく、また、発現プラスミドの構築又は更なる修飾を有利にする 制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでもよい。発現プラスミドは、宿主において 暗号化されたポリペプチドの発現を指示し、通常暗号化された構造遺伝子のＤＮ Ａ配列の上流に転写プロモーターを含む。発現プラスミドは、宿主染色体のＤＮ Ａ中に一体化してもしなくてもよい。本発明においては、一体化したプラスミド は、それても発現プラスミドと呼ばれる。

ウィルス発現ベクター ウィルス性発現ベクターは、ＤＮＡが天然の生物学的工程を経て、細胞に感染し 得るウィルス粒子中に梱包されてもよいことを除いては、発現プラスミドと類似 している。

下流 構造遺伝子の転写ストランドのヌクレオチドは、もしそのヌクレオチドかその遺 伝子の他の領域の後にＲＮＡポリメラーゼによって通常読まれるのであれば、そ の池の領域の下流にあると言うことができる。非転写ストランドの相補的ヌクレ オチド又はＤＮＡの二重鎖形内の対応する塩基対は、下流とも呼ばれる。

更に、構造遺伝子内における転写及び翻訳の方向に言及すると、その遺伝子の上 流（即ち、５゛）に付加された制限エンドヌクレアー配列は、蛋白質のアミノ末 端をフード化する配列の前にその遺伝子が付加されたことを意味し、一方、構造 遺伝子の下流（即ち、３°）に形成された修飾は、その遺伝子かカルボキシ末端 コード化領域の先にあることを意味する。

糖蛋白質［ｂα又はＧＰｌｂα： ここでの糖蛋白質［ｂαに対する全ての言及は、ヒトＧＰ［ｂαにも適用される ものと理解される。

成熟卵１ｂα。

トランスメンプレイン蛋白質として血小板で典型的に見出されるアミノ酸配列Ｈ ｉｓ’−Ｌｅｕ””からなるポリペプチドを意味する。更に、哺乳類細胞で発現 させる時に、成制Ｐ［ｂαは通常グリコジル化される。ヒト糖蛋白質［ｂα遺伝 子によって暗号化されるアミノ酸配列に関して、ある種の突然変異又は多形（ｐ ｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）か記載された。トレオニン／メチオニン多形は、成東 円ｂα配列における１４５の位置に知られている。更に、例えば、成熟ポリペプ チドのカルボキシ末端領域（７）１３個のアミノ酸配列（Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒ ｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ 　Ｔｈｒ）は、ヒト人口の約半分において２倍繰り返される。発見された又は発 見されるかも知れないこれらの多形に対して、かかるコード化ポリペプチドの殆 どは本発明の実施において効果的であると期待される。

シグナルペプチド（配列）。

小胞体の膜を横切って細胞の分泌通路にポリペプチドを転移させる信号を送る新 たに翻訳されたポリペプチドにおけるアミノ酸配列。シグナルペプチドは、蛋白 質の初め（アミノ末端）に典型的に生じ、その中心における約５〜１５の疎水性 アミノ酸の長さを含み、２０〜４０アミノ酸の長さを有する。典型的には、シグ ナル配列は、小胞体への転移の過程の間又はそのすぐ後に蛋白質から蛋白質分解 的に分裂される。シグナルペプチドをフードする遺伝子又はｃＤＮＡの部分もま た、ソゲナル配列と言う。

用語［ペプチドｊ及び「ポリペプチド」は、相互に置き代えてここで使用される 。

本発明の実施においては、精製グリコカリジンを試験で使用して、フォノ・ウィ ルブランド因子の完全な血小板への結合を阻害する際の化合物の効果を評価した 。

精製グリコカリノンは、（１１セフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ■）ビーズに 不溶化された小麦麦芽凝集素を使用するアフィニティークロマトグラフィー、続 いて（２）グリコカリジンに対してかつセファロースビーズに不溶化されたモノ クローナル抗体（ＬＪ−Ｐ３）を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィ ーに基づく、２段Ｆ！操作によって製造される。

古くなった血小板濃縮物を、グリコカリジンの精製のために出発物質として使用 した。室温（２２〜２５°Ｃ）で２５分間２３００ｇで血小板を沈降させ、上澄 を除去し、１０面のトリス塩基及び１５０ｄｌのＮａＣ１からなり、ＨＣＩ（ト リス緩衝塩水：ＴＢＳ）によってｐＨ７，４に調整されかっ２國のＥＤＴＡを含 む緩衝液に血小板ベレットを再懸濁することによって血漿成分を除去した。この 操作を２度行った。最初の洗浄の後に、懸濁液を１分間６００ｇで遠心分離を行 い、汚染性赤血球細胞のほとんどを含むペレットを、洗浄操作を続ける前に捨て た。最後の遠心分離の後に、２１Ｎｃａｃ　ｌ　！及びＯ，１ｍＭのフェニルメ チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むＴＢＳに血小板を再懸濁した。

ついで、それらの血小板を音波処理（血小板懸濁液を氷の上に保持して約１００ ワツトで各１５秒の３個のパルス）によって粉砕した。懸濁液を室温で３時間及 び４°Ｃて１６〜１８時間、常に連続的に攪拌しながら放置した。この後、懸濁 液中の粒状物を、１２°Ｃで２０分間＋０００００．ｇで遠心分離を行うことに よって除去した。澄んだ上澄は、シアノーゲンブロミドで活性化しかつｔａのＥ ＤＴＡと０．１−のＰＭＳＦと０．０２％のアジ化ナトリウムとを含むＴＢＳで 平衡にした、セファロースビーズに結合した小麦麦芽凝集素のカラム（直径２− ６ａｎ、高さｌＩＣｌ１１）にかけた。ビーズの体積の２倍の体積の緩衝液に添 加した１００鯛のＮ−アセチルグルコサミンで結合蛋白質を溶出する前に、その 緩衝液でカラムを２度洗浄した。全操作は、室温で行った。溶出物質は、シアノ ーゲンブロミドで活性化したセファロースビーズに結合した精製１ｇＧからなる モノクローナル抗体カラム（直径５ａｏ、高さＺ５ｃｍ）に直ちにかけた。使用 したモノクローナル抗体（ＬＪ−Ｐ３）は、ＧＰ［ｂαのグリコカリジン部分に 特異性を育し、その調製、特性及び精製については、ハンダ（Ｈａｎｄａ）らの Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６１：１２５７９−１２５８５　（１９８ ６）に記載されている。カラムは、１００ｍＭのトリス塩基、５００ｍの１Ｃｌ ｔ、ｌ−のＥＤＴＡ、０．１−のＰＭＳＦ、及び０．０２％のアジ化ナトリウム からなりかつＨＣＩでｐＨ７，４に調整された緩衝液で平衡化した。このカラム は、ビーズの体積の３倍の体積の緩衝液で洗浄した。結合グリコカリジンは、１ 面のＥＤＴＡ及び０．１−のＦＭＳＦを含む５０−ジエチルアミン、７０〜８０ ｍ１で溶出した。この工程の間、カラムを通る流速は、溶出が２０〜２５分間て 完了するように制御した。全操作は、室温で行った。溶出グリコカリジンは、６ ｇのグリシン中に集め、ジエチルアミンの高ｐＨを中和した。精製物質は、ＴＢ Ｓに対して充分透析し、アクワシド（ＡｑｕａｃｉｄｅＯ）で濃縮し、再びＴＢ Ｓに対して透析した。精製グリコカリジンは、−７０°Ｃで了りコートで貯蔵し た。

精製グリコカリジンを、Ｎ−１−シルーＬ−フェニルアラニンクロロメチルケト ンで前処理したトリプシンで消化した。酵素−基質比を１：２００とし、３７° Ｃで１６〜１３時間反応か進むようにした。温室の終わりに、２倍のモル過剰の （ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオライドでトリプシン活性を阻 害した。トリプシン消化によって生じたグリコカリジンの４５　ｋＤａフラグメ ントを、直列に配置した、１つのＧＦ４５０及び２つのＧＦ２５０デュポンシー パックス（２ｏｒｂａｘ＠）カラム（直径９．４皿×長さ２５ａｏ）を使用する ゲルパーミェーション高性能液体クロマトグラフィーによって精製した。カラム を、２００菌の（ＮＨｔ）２ｕｐｏ、てＩ＋）１７．４で平衡化した。流速は１ 　ｍｌＺ分とした。この操作は、室温で行った。４５ｋＤａフラグメントは鋭い ピークとして溶出し、これを収集し、アクワシドで濃縮し、ＴＢＳで充分に透析 し、使用するまで一７０°Ｃでアリコートで保存した。

精製グリコカリジンを使用して、ＧＰｌｂαのこの蛋白質分解フラグメントかＶ 訃の天然の血小板への結合を阻害できるのを示した。分析系は、″ゝｌ−ｆｆ識 Ｖ訃及び新鮮な又はフォルマリン固定血小板の使用に基づく。リストセチンを使 用して、ｖｉｌｌＦのＧＰＩｂへの結合を誘起した。攪拌せずに、３７°Ｃで３ ０分培養した後、フリーのｖＷＦリガンドからの結合血小板の分離を、タイロー ド（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液における２０％サクロースによる遠心分離、及びその 後における、Ｒｕｇｇｅｒｉ　らのＪ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　７２： ｌ−１２（＋９８３）に記載の結合放射能測定によって行った。非特異性結合は 、選択したポイントに対して、４０倍過剰の非標識化ＷＷＦの存在下における結 合をＪ１定することによって評価した。結合等温式は、ＭｕｎｓｏｎのＭｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９２：５４２−５７６　（１９８３）に記載のコン ピータ支援プログラム「リガンド」を使用して、５ｃａｔｃｈａｒｄ型分析方法 によって、（非特異性結合の評価を含めて）結合パラメータを測定することによ って評価した。

１ｍｇ／ｍｌの過剰の最終濃度におけるグリコカリジンは、＋２５Ｉ−標識ｖＷ Ｆの天然ＧＰＩｂへの結合を完全に防止する。７つの異なるグリコカリジン調製 物に対して、結合を５０％阻害する濃度（ＩＣ６゜と呼ばれる）は平均で１５０ μｇ／ｍ！であっプこ。

次に、グリコカリジンにおける頑固ジスルフィド結合の全てをモル過剰のジチオ トレイトールで処理して還元し、得られたスルフヒドリル基をＳ−カルボキシイ ミドメチル化によって保護した。得られた還元されかつアルキル化されたグリコ カリジンは、リストセチンの存在下で、血小板上の完全なＧＰＩｂに対するｖＷ Ｆの結合を防止する特性を保持することが分かった。この還元されアルキル化さ れたグリコカリジンは、頑固ジスルフィド結合に依存する二次構造を失ったため に、この実験は、ｖＷＦへの相互作用の機能かグリコカリジンの一次構造内の特 定の領域に依るものとすることかできることを示す。

グリコカリジンの４５ｋＤａ　トリブソン分解フラグメントを、高性能液体クロ マトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びその分子量に基づき蛋白質を分離するゲルバー ミエーソヨン力ラムを使用することによって精製した。トリプシン消化に使用し た条件のために、４５ｋＤａフラグメントは本質的に二本鎖種からなっている。

このグリコカリジンの精製された蛋白質分解フラグメントを使用して、血小板の ＧＰＩｂへのｖＷＦの結合をブロックする能力を試験した。４５ｋＤａフラグメ ントは、約３．５μＭのｔＣＳ。で、血小板、即ち、ＧＰＩｂに対するｖＷＦの リストセチン媒介結合を完全に阻害した。

同様の実験において、グリコカリジンをトリプシンで消化し、ジスルフィド結合 をジチオトレイトールで還元して、得られたスルフヒドリル基をヨードアセトア ミドでＳ−カルボキシイミドメチル化した。３５ｋＤａのアミノ末端フラグメン トをゲルパーミェーションＨＰＬＣで精製して、リストセチン媒介分析において 血小板ＣＰＩｂへのｖｌ！／Ｆの結合に関する阻害効果を調べた。そのＩＣ１ｏ は、親の非還元４５ｋＤａフラグメントのそれと同様であることか分かった。全 グリコカリジンで得られたこれらの結果から、グリコカリジンのアミン末端領域 の一次構造が、その分子の天然の三次元コンフォーメーソヨンの維持に依存しな い機能を育する、ある種のｖＷＦ結合ドメインを含むことが分かる。

これらの知見に従って、各々が１５個のアミノ酸残基からなり、グリコカリジン の４５ｋＤａのアミノ末端フラグメントの配列を代表する重複ペプチドを合成し た。以下のペプチドか、０，５凶のＩＣ５６値又はそれよりもよい値において血 小板ＧＰＩｂへのｖｌｌ／Ｆの結合を阻害することか分かった。（ここで、−文 字の記号は、アミノ酸残基の特定に使用したものである。）ＤＫＲＮＬＴＡＬＰ ＰＤＬＰＫＤＴＴ。

ＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴＩ　： ＰＰＤＬＰＫＤＴＴＩＬＨＬＳＥ （これらの３種のペプチドは相互に重複し、グリコカリジンの残基ＡＳＰ　”〜 ＧＬＵ”の配列を含む。） ＰＧＬＬＴＰＴＰＫＬＥＫＬＳＬ　（残基ＰＲＯＩ４′〜しＥＵｌｓｓ）　；Ｋ ＱＧＶＤＶＫＡＭＴＳＮＶＡＳ　（残基ＬＹＳ！２’−５ＥＰ２４’）　：ＧＤ ＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥ； ＥＥＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲＴＶ。

（これら２種のペプチドはＧＬＹ”〜ＶＡＬ”’を含む。）これらの結果により 、グリコカリジンのアミノ末端領域内に、ｖＷＦ結合に対する機能的関連性を有 する多重ドメインの存在か示される。

阻害活性を育するより長いペプチドの重複領域に対応する配列を有する、より短 いペプチドか合成された。これらのより短いペプチドの２つは、阻害活性を存す ることか分かった。それらの配列は、ＰＰＤＬＰＫＤＴＴ　（グリコカリジンの 残基ＰＲＯ”〜ＴＨＲ”　）及びＥＥＤＴＥ　（残基ＧＬＵ”　”〜Ｇ１．．Ｕ ”’）である。

これらの２つのペプチドは、個々に試験した場合に、０．５−より大きい［Ｃｓ 、値を有していた。これらを０．５ａｌＪの濃度で組み合わせると、ＶｌｌＦＯ ）ＧＰＩｂへの結合を完全に阻害した。この実験により、グリコカリジンの一次 配列における異なる非隣接ドメインか、相乗的に共同してｖＷＦ結合部位、従っ て、ｖＷＦ結合活性を提供できることか分かる。グリコカリジンの４５ｋＤａア ミノ末端トリプンン消化フラグメントの配列及びそのサブセット（上記の通り） は、血小板ＧＰＩｂへのｖＷＦ結合を阻害する能力のある物質を設計するのに有 用な情報を含む。

一般式（ＫＲ）、（但し、ｎは２〜７）及び一般式Ｒ１１のペプチドもまたＶＷ Ｆ（７）ＧＰＩｂへ（７）相互作用ヲ阻害する。一般式Ｒ，ＲＧＤＶ又１１　（ ＫＲ）、ＲＣ；ＤＶのペプチドは、ＧＰＩｌｂ／ｌ１ｌａへのフィブリノーゲン の結合を阻害することか示された（米国特許第４．６８３．２９１号、　「血小 板結合阻害剤（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」 ）。後者のペプチドは、現在ｖｌｌｌＦ−ＧＰＩｂ相互作用の阻止において（Ｋ Ｒ）、類似物と同じ効果のあることが分かり、従って、二官能性抗血小板剤の群 を代表する。

生体におけるｖｉｌｌＦのＧＰＩｂへの結合を開始させる機構は、未だ分かって いない。

通常、ｖＷ及びＧＰＩｂは、重大な相互作用を起こすことなく、循環中に共存し ている。露出した又は損傷を受けた内皮下層との接触によって、結合か引き起こ される。多分、ｖｉｌｌＦが、血管壁と接触した時に、変形した形態（複合体を 形成し得る）を持つと考えられる。５ａｋａｒｉａｓｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、 　２″７９：６３６−６３８　（１９７９）；５ｊｅｌら、Ｂｌｏｏｄ、６５： ８５−９０　（１９８５）：　及びＴｕｒｉｔｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、６５：８２ ３−８３１　（＋９８５）を参照。結合に必要なフンフォメーションの変化は、 血小板か他の血液成分と接触することにより又は血小板が損傷を受けた血管にお いて高剪断応力に晒されることによって、ＧＰＩｂ内で誘発される。Ｍｏａｋｅ らＢｌｏｏｄ、　７１：１３６６−１３７４　（１９８８）。

ｖＷＦとＧＰｌｂとの相互作用は、いくつかの方法によって立証することができ る。

結合は、リストセチンの存在下に立証することかできる。このリストセチンは、 高分子間の過剰の負電荷密度を減少させることによって作用すると考えられる糖 ペプチドの抗生物質である。ＨｏｗａｒｄらのＴｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　 Ｈａｅｍｒｒｈ、　２６：３６２−３６９　（１９７１）及びＣｏ１１ｅｒらの Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６０：３０２−３１２　（１９７７）を番 孔この相互作用はまた、ある種の蛇毒である蛋白質、ボトロセチンの存在下で生 じることがある。ＲｅａｄらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　’ｉ’５：４５］４−４５１８　（１９７８）を参照。ｖＷＦと ＧＰＩｂとの相互作用はまた、ｖｌｌｌＦ分子から末端の（負を苛した）シアル 酸炭水化物残基を除去することによって高められ辱る。Ｄｅ　＆ｒｃｏらのＪ、 　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６８：３２１−３２８　（１９８１）を参照。

公知の標準ｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合分析及び結合阻害分析のｉｎ　ｖｉｖｏ相関は 今だ不明である。ｉｎ　ｖｉｊｒｏ結合機構の詳細な検討によって、ｉｎ　ｖｉ ｖｏ機構又はその重要な特徴を最終的に特定することができるかも知れない。異 なる実験系で測定された、ｖｌＶＦのＧＰＩｂへの結合には、高分子の異なる官 能性ドメイン又はコン７す一メーション状態か含まれる。従って、ＧＰｒｂに由 来しかつｉｎ　ｖｉｖｏにおいてｖＷＦ結合の治療的阻害剤として特に有用なこ れらのペプチドが、１以上のｉｎ　ｙｉｔｒ。

分析系においてｖＷＦ結合の重要な阻害を示すペプチドとなり得る。

更に、ＧＰＩｂのドメイン、特にｖＷＦ結合をもたらすその４５　ｋＤａアミノ 末端フラグメントのドメインは、アミノ末端ポリペプチドの直線配列に沿って交 互に隣接している必要はないが、ｖＷＦへのその結合は、アミノ末端フラグメン トがその天然の三次構造を持ったときに、基部に近い（ｐｒｏｘｉｍａｌ）位置 になるような、４５　ｋＤａポリペプチド全体に分散しているペプチド配列によ って達成される。

上記仮定に鑑みて、本出願の基礎を形成する更に発展的な仕事が行われた。

以下に示すように、ｖＷＦ結合阻害活性を増大させるポリマーか開示される。

本発明は、グリコカリジンのアミノ末端部分の多重天然配列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ 　ｎａｊｉｖｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）から構成した合成ペプチド又はポリペプチ ドを範囲どして含む。

このフラグメントは、−次構造においては基部に近くはなく、その三次構造はＧ ＰＩｂの三次元結合ドメインを模擬する結合ドメインの役割をする三次コンフォ ーメーションを有し、ｖｉｌｌＦに対して高い親和性を有する。

更に、本発明は、ＧＰｌｂからのアミノ酸配列の多重ドメインであって、ペプチ ドの特徴を有しても有さなくてもよいリンカ−によって連結されている多重ドメ インを有する治療用ポリマーを包含する。

本発明の実施においては、ｖＷＦと血小板との相互作用の阻害剤として、以下の 表３で特定される以下のポリマーを使用することか好ましい。

表３ ペプチド　グリコカリジン中の 残基位置 上記ペプチドの内、（ａｌ又は…を使用すると、特に好ましい。特に、（ａｌの 使用は最も好ましい。

これらのペプチド並びに本発明の範囲内における他のポリマーは、血小板の活性 （Ｌ凝集又は表面への接着の阻害又は潜在的な治療用抗血栓剤として単独に又は 池の１以上のポリマーとの組み合わせで（共有結合しているかどうかは問わない ）使用することかできる。

上記（ａｌ〜…のペプチドのアミノ酸配列の配列サブセットを含み、かっＧＰ［ ｂ及び／又は巨咳球系統の細胞表面に発現したＧＰＩｂに対するｖＷＦの結合を 阻害するペプチドをその範囲として含む。

本発明の別の特徴によれば、本発明の範囲には、ペプチド又は他のポリマーのン ステインダイマーか含まれる。このようなダイマーは、ペプチド又はポリマーの システィン残基が、ジスルフィド橋を通して他のペプチド又はポリマーのシステ ィン残基に共存結合によって結合している化合物である。本発明で使用できる好 ましいンステインダイマーは、５ＤＫＦＰＶＹＫＹＰＧＫＧＣＰＴＬＧＤＥＧＤ ＴＤＬＹＤＹＹのペプチドのダイマーである。本発明で使用するｖＷＦ結合分析 のｉｎ　ＶｉｔｒＯ条件下で、好ましいダイマーはｖＷＦ結合を阻害する上で特 に効果的であった。

本発明の更に好ましい特徴においては、ＧＰＩｂ及び／又は巨核球系統細胞の表 面で発現したＧＰｌｂへのｖＷＦの結合を阻害し、カリ以下のドメインを有する ポリマーか含まれる。

ドメイン八−本発明のペプチド又はそのペプチドのアミノ酸配列のサブセントを 構成する一連のアミノ酸 ドメインＢ−本発明のペプチド又はそのペプチドのアミノ酸配列のサブセットを 構成しかつ上記ドメイン八と同一であっても異なってもよい一連のアミノ酸：及 び ドメインＣ−ドメイン八とドメインＢとを結合するリンカ−上記ポリマーのセグ メントを結合するリンカ−は、例えば、メチレン、ビニル、アミノ酸及びデキス トランのようなモノマー単位又はポリマー単位を含むことかできる。本発明の実 施で使用する好ましいポリマーは、ドメインＡか上記（ａ）のペプチドを含み、 ドメインＢか上記−のペプチドを含むものである。更に好ましくは、ドメインＡ か上記（ａｌのペプチドのアミノ酸配列のサブセ・ントを含み、ドメインＢが上 記…のペプチドのアミノ酸配列のサブセントを含むポリマーを使用することであ る。

上記型のポリマーは、ポリマーに望ましい機能的な特性、例えば改良された結合 性又は溶解性を提供する１又は２以上の付加的なドメインを含むことかできる。

更に、本発明は、ＧＰＩｂ及び／又は巨咳球系統細胞表面に発現したＧＰｆｂに 灯するｖＷＦの結合を阻害し、かつＧＰｌｂα鎖のアミノ酸の１以上の配列を含 む合成ポリマーをその範囲として含む。このアミノ酸配列は、天然コンフォーメ ーションにおけるＧＰ［ｂα鎖の表面又はその近くに通常位置し、ｖＷＦと相互 作用できる。

本発明はまた、本発明のペプチド又は他のポリマーの誘導体をその範囲に含む。

かかる誘導体は、付加的なポリマー配列の付加によって又は、例えばアセチル、 グリコジル又はエステル部分なとの官能性基の付加によって修飾されているペプ チド又はポリマーを含む。

血小板へのｖＷＦの結合を阻害する多くの重複するＧＰｌｂαペプチドの有用性 に関して本発明を評価するために、グリコカリジンの４５ｋＤａアミノ末端トリ プシン分解フラグメントのアミノ酸配列に基づくペプチドをＨｏｕｇｈｔｏｎら のＰｒｏｃ。

Ｎａｔ［、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　８２：５１３５　（１９８５）に 記載のように合成した。Ｖｉｃｅｎｔｅら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２ ６８（３４）：　１８４７３−１８４７９　（＋９８８）を番孔ペプチドの固相 合成の周知の操作において、所望のペプチドは、ベンズヒドリルアミン又はクロ ロメチル化樹脂（架橋ポリスチレンに由来し、化学品供給会社から市販されてい る）のような不溶性支持体から出発して構成される。所　。

望のペプチドのカルボキシル末端にあって、αアミノ窒素及び他の反応性部位に 保護基を有するアミノ酸は、公知のペプチド結合技術を使用して、溶液から樹脂 に結合される。αアミノ基上の保護基を除去しくもし存在すれば、他の保護基を そのまま残し）、次いで所望の配列の次のアミノ酸（適当な保護基を存する）を 結合するなど。所望のペプチドか完成した時に、そのペプチドを樹脂支持体から 分離し、全ての保護基を除去し、ペプチドを回収する。適当な保護基には、αア ミノ基に対してはα−ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル：システィンのチオール 基、アスパラギン酸のβ−カルボン酸基、グルタミン酸のγ−カルボン酸基並び にセゾン、トレオニン及びチロシンのヒドロキシ基に対してはベンジル、４−メ トキシベンジル又は４−メチルベンノル：ヒスチジン及びトリプトファンの環窒 素並びにリジンのε−アミン基に対してはベンジロキシカルボニル基若しくはそ の２−クロロ−又は３．４−ジメトキシ誘導体：アスパラギン及びグルタミンの アミド窒素に対してはｐ−ニトロフェニル、及びアルギニンのグアナジン基に対 してはニトロ又はトシルが挙げられる。

本発明のクローニングの特徴に関しては、ＧＰＩｂα又はそのフラグメントは以 下の戦略によりクローニングされる。もしｃＤＮＡか利用できれば、［ｎＲＮＡ のＰＣＲのためにオリゴヌクレオチドを選択することかできる。このことは、適 当なしベルのｄＮＡを発現する細胞系を使用できることを前提とする。ｍＲＮＡ か稀少なものと考えられる場合には、特定のＰＣＲ増幅を実行する前に、所望の メツセンジャーを増幅するためにサブトラクション・ハイプリタイゼーション法 を使用することもできる。可能なイントロン配列の存在を簡単に測定できるか又 はクローンの後の使用に対して何ら影響を与えないと仮定すると、ゲノムＤＮＡ から所望の配列を増幅するのにオリゴ体を使用することができる。

蛋白質に対する抗体か利用できるならば、ｍＲＮＡを含むポリソームを析出させ 、ｍＲＮＡを精製し、複製して引き続いてクローン化できる２重鎖ｃＤＮＡにす ることができる。細胞系か蛋白質を豊富に産生するならば、まず発現ベクターを 使用してｃＤＮＡライブラリーを構成し、次いでこのライブラリーを発現クロー ンに結合する抗体によってスクリーニングすることができる。

蛋白質配列か利用できる場合には、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリー ニングするのに使用できるオリゴヌクレオチドを選択することができる。アミノ 酸のコドンの使用が正確に分からないので、オリゴヌクレオチドの混合セットを 選択する必要かあろう。

本発明の好ましい態様の実施に必要な要素には、以下のものがある。

（Ａ）　ＧＰＩｂαポリペプチドの残基、Ｈｉｓ’　〜しｅＵ″。又はＨｉｓ’ 　〜Ａｌａ”２　ドメインをコードするＤＮＡ配列、 （Ｂ）上記ドメインの真核細胞中での発現を指示することのできる発現プラスミ ド又はウィルス発現ベクター、及び °　（Ｃ）その発現を行うことのできる真核宿主細胞。

そのように発現したＧＰ［ｂαポリペプチドは、シグナルペプチドの新生ＧＰｌ ｂαポリペプチドへの接着かないｔこめに、宿主細胞から分泌されないことか予 想される。そこで発現した蛋白質の精製及びその薬学的に有用な量の抽出は、宿 主細胞の培地にポリペプチドか分泌されるようになっている場合に比へて困難で あると考えられる。このような発現系はそれでも患者におけるｖＷＦの適当な機 能の試験のような診断分析の目的にとっては有用であることが期待される。

従って、本発明の好ましい実施の態様においては、適当な宿主細胞に挿入される ＧＰＩｂαをコードするＤＮＡ配列か提供される。この適当な宿主細胞において は、そのＧＰｌｂαコード配列の残基１−６１０又はｌ−３０２をコードする配 列の上流にＧＰＩｂαシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が挿入されてい る。

他の蛋白質種に対応するシグナルペプチドは、ＧＰｌｂαの分泌を生じさせるの に同等の効果を有することか分かった。ｖｏｎ　Ｈｅｉ　ｊｎｅ、　Ｇ、のＪ、 　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、　１８４：９９−１０５　（１９８５）参照。

シグナルペプチドは、残基１．−６１０又はｌ−３０２ＧＰｌｂ（α）ポリペプ チドのアミノ末端に結合すると、ポリペプチドか細胞から最終的に分泌されるた めに処理され得る型のポリペプチドとして細胞構造によって認識されるようにし 、同時に成％Ｐ［ｂαポリペプチドからシグナルポリペプチドか分断される。

広範囲の発現プラスミド又はウィルス発現ベクターかＣＰＩｂαポリペプチド又 はそのアミノ末端領域の発現に対して適している。発現系の選択の上で重要な要 因の一つは、クローニングしたＧＰＩｂα挿入物に隣接して高効率の転写プロモ ーターを提供することである。

発現プラスミド又はウィルス発現ベクターを選択する上での重要な別の要因は、 安定した形質転換真核性宿主細胞に対する連続的な選択を行えるように抗生物質 耐性遺伝子マーカーを提供することである。

本発明の実施において適当なプラスミドとしては、ｐＣＤＭ８　、ｐＣＤＭ８” ”　、ｐｃＤＮＡＩ、　ｐｃＤＮＡ１″＊０、ｐ肪Ｗ′。及汎ｃ／ＣＩＪＶが挙 げられる。本発明で使用するのに好ましいプラスミドには、ｐｃＤＭ８””　、 ｐｃＤＮＡ冑’　、Ｉ）！ＩＩＡＭ”’及ηｃ／Ｃ！ｉｆ”／がある。ＧＰＩｂ αポリペプチドをコードするＤＮＡ又はそのフラグメントは、細菌系においてポ リペプチドを発現するプラスミド又はベクターに挿入することかできる。

本発明の実施に適する数種のウィルス発現ベクター系があり、レトロウィルスに 基づくもの及びバキュロウィルスに属するＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏ ｒｎｊｃａ核多角体ウィルスに基づくものか含まれる。

本発明の実施に適合する水続的な細胞系を含む代表的な宿主細胞には、ＣＨＯ− に１チヤイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ・６１）；Ｃ０５−１ 細胞、即ち、５Ｖ−４０で形質転換したアフリカ緑ザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ−Ｃ ＲＬｌ　６５０）；ΔＴＴ２０マウス下垂体細胞：ＲＩＮ−５Ｆラント膵臓β細 胞：培養昆虫細胞、即ち、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　；又 は酵母（Ｓａｒｃｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。実施例９及び１０は、ＧＰｌｂ αポリペプチド又はそのアミノ末端ドメインを発現するのに使用される好ましい 操作の詳細な説明を含む。

治療組成物 本発明の１以上のポリペプチドを配合して、治療、診断又はその他の使用のため の薬学製剤を調製することができる。例えば、静脈投与用の薬学製剤を調製する ためには、組成物を、生理学的に適合性のある物質、例えば塩化ナトリウム（例 えば、０．０５０５−２１）、グリシジなどを含み、かつ生理学的条件に適合す る緩衝化されたｐＨを有する水に溶解する。この水及び生理学的に適合性を有す る物質は薬学的に許容し得るキャリヤーを含む。

本発明の４５ｋＤａポリペプチドについては、血栓症の予防又は治療のため投与 する量は、患者か血栓症に罹っている症状によって異なるが、特定の患者に対し て直ちに決定することが出来る。

匹倦 抗体、特にコンフォーメーション依存性抗体は、高分子の構造及び機能を分析す る上で有力な手段である。高分子相互作用をブロックすることによって、抗体は また重要な治療上の有用性を有し得る。従って、本発明は、ＧＰＩｂαポリペプ チド又はその１以上の配列サブセットを含むポリペプチドに対して特異性のある 抗体を含む。この抗体は、本発明のポリペプチドによって動物を免疫し、生した 抗体を分離することからなる工程によって製造される。本発明のポリペプチドで 動物を免疫するために適する多くのプロトコールか知られている。

！裡便 以下の実施例は、本発明のペプチド又はポリペプチドの生物学的活性及び本発明 を実施するのに有用な例示的なりローエング方法を説明する。

実施例１ ｖＷＦの血小板に対するリストセチン誘起結合の阻害本発明のペプチドの阻害活 性を試験するために、最終濃度がｌＸ１０”＃でフォルマリン固定血小板を使用 した。分析されるペプチドを種々の濃度で加えた。最終容積の３分のｌのｖｌｌ ｌＦ不足血漿を添加し、次いで最終濃度５μｇ／ｍｌで”　’　１−Ｖｌｌ／Ｆ を添加した。リストセチンを１．０■／ｍｌの濃度で添加した。室温で３０分温 温室た後、混合物を２０％サクロース、３００μｌを通して、１２０００ｇで４ 分間遠心分離を行うことによって、結合及び遊離い止りガントを分離した。血小 板ペレットを次いで混合物の残分から分離して、血小板結合放射能を測定した。

非特異性結合は、５０倍過剰の非標識ｖＷＦの存在下でかつペプチドの不存在下 における”’［−ｖＷＰの残留結合として定義される。

所定のペプチドによる％阻害率は、ペプチド不存在下における特定のｃｐｍを割 ることによって産出した。試験したペプチドに対するＩＣ５０値（５０％結合を 阻害するペプチド濃度）を以下の表４に示す。

表４ （ＫＲ）ｔ　９及び１５μｌ１ｌ（２つの実験）（ＫＲ）ｓ　１３μＭ （ＫＲ）３　１２０μＭ （ＫＲ）ｔ　２００μＭ （ＫＲ）４ＧＤＶ　１６　ｕＭ （Ｒ）ＩＧＤＶ　６μＭ ＹＲＧＤＶ　＞６００μ＆ｌ　（Ｆｌｌｌ害が見られず）試験した濃度では、い ずれのペプチドに対しても完全な阻害は見られなかった。

実施例２ 新鮮な血小板に対するアシアロｖＷＦの結合の阻害１１雇１のクエン酸三ナトリ ウム及び２−のＥＤＴＡの溶液に血液を取り出すことによって、新鮮な血小板を 調製した。富血小板血漿を次いで、分画遠心処埋によって調製した。血小板の量 をｌＸｌ０”／ｊ’に調節した。ペプチドを種々の濃度まで添加し、１！ｓ１− アシアロ−ｖＷを最終濃度か５μｇ／ｍ　Ｉ！まで添加した。室温で３０分温冒 した後、３００μ！の２０％サクロースを通して、１２０００ｇで４分間混合物 の遠心分離を行って、結合及び遊離リガンドを分離した。血小板ベレットを次い で混合物の残りから分離して、血小板結合放射能を測定した。非特異性結合は、 ５０倍過剰の非標識ｖＷＦの存在下でかつペプチドの不存在下での１２１１−ア ンアローｖＷＦの残留結合として期してされる。

所定のペプチドによる％阻害率は、種々の濃度のペプチドを添加した時の特有の ｃｐｍを、ペプチド不存在下における特有のＣｐｍで割ることによって産比した 。試験したペプチドに対するＩＣ，。値（５０％結合を阻害するペプチド濃度） を以下の表５に示す。

表５ （ＫＲ）７　１．５μＭ （ＫＲ）ｓ　１．７μＭ （ＫＲ）２　２３　μＭ （ＫＲ）、ＧＤＶ　１５　ｕＭ （Ｒ）　５ＧＤＶ　３．５　ｕＭ （Ｒ）　、　、　７　μＭ 以下の表６で示すように、完全な阻害は以下の濃度で見られた。

表６ （ＫＲ）、　１２及び１５μム（ （ＫＲ）ｓ　６及び７μＭ （ＫＲ）３　６０及び１２０μ入１ （ＫＲ）、ＧＤＶ　４４　ｄ （Ｒ）ＩＧＤＶ　２４　ｕｋｌ 実施例３ 本発明のペプチドの阻害活性を、洗浄した血小板を使用して評価した。Ｔｒａｐ ａｎｉ−しｏｍｂａｒｄｏらのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：１９ ５０−１９５８　（１９８５）に記載のように調製した血小板を、最終濃度３　 Ｘ　１０　”ｉｌｌ：、ｍ節した。種々の濃度のペプチド及び、０．８μｇ／ｍ 　ｌの最終濃度の精製ｖＷＦを、３７°Ｃ１５分間血小板とともに温置した。リ ストセチンを次いて１．　Ｏｒｒｃｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。反応混合物 を、ソリコン化したガラスキュベツトに準備し、次いでルミ（Ｌｕｍｉ）アブリ ボメータ−（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ　Ｃｏｒｐ、製）に３７℃で置き、１２０Ｏ ｒｐｍて血小板懸濁液を一定して攪拌した。凝集は、攪拌血小板懸濁液を通る光 透過率の増大をモニターすることによって定量した。

ペプチドのＩＣ５ｅｔ　（凝集曲線の初期傾斜の％減少率によって判断した場合 において、５０％凝集を阻害する濃度）を以下の表７に示す。

表７ （ＫＲ）７　３μＭ （ＫＲ）！　５０μＭ （ＫＲ）＋　２５０μＭ １００μＭの濃度において、以下のペプチドが、表８に示すような程度で凝集を 阻害した。

表８ （ＫＲ）７８２％阻害 （ＫＲ）ｓ　５０％阻害 （ＫＲ）、　重要な阻害はなかった。

（１？）、ＧＤＶ　７０％阻害 実施例４ アンアローｖＷＦ誘起凝集の阻害 本発明のペプチドの阻害活性は、ｌ１ｍのクエン酸三ナトリウムの抗凝集剤に取 り出した血液を分画遠心処理することによって調製した富血小板血漿を使用して 測定した。血小板数を３ＸＩＯ”＃に調整した。５５μｈ（の濃度のペプチドを 、３７°Ｃ１５分間富血小板血漿とともに温置した。アシアロ−ｖｉｊｌＦを１ ５℃ｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。反応混合物を、シリコン化したガラスキュ ベツトに準備し、次いでルミ（Ｌｕｍｉ）アブリボメーター（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌ ｏｇ　Ｃｏｒｐ、製）に３７°Ｃで置き、＋２０Ｏｒｐｍで血小板懸濁液を一定 して攪拌した。凝集は、攪拌血小板懸濁液を通る光透過率の増大をモニターする ことによって定量した。

ペプチドによる凝集の阻害は、以下の表９に示す。

表９ （ＫＲ）７　１ｏ　ｏ％阻害 （ＫＲ）ｓ　ｓ　８％阻害 （ＫＲ）　、　重要な阻害はなかった。

（Ｒ）ＩＧＤＶ　９２％阻害 実施例５ ＧＰｌｂα受容体部位の特定 ＧＰ［ｂαの鎖のアミノ末端細胞質外領域（残基１〜２９３）か、ＧＰ［ｂ複合 体の他の成分又は池の血小板膜成分の不存在下でｖＷＦと相互作用するドメイン を含むことは以前に立証されている。Ｖｉｃｅｎｔｅら。

本発明の研究は、この相互作用の受容体部位を特定することにある。この４５　 ｋＤａの結合フラグメントの全アミノ酩配列は、ｖｌｌ／Ｆ結合阻害分析に使用 される、一連の２７の重複する合成ペプチドとして再生された。

ｖＷＦの血小板への結合阻害率（％）は、Ｒｕｇｇｅｒｉ　らの方法に従って調 製された１２ｓＩ標識ｖＷＦを使用して測定された。ＤｅＭａｒｃｏらのＪ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６８：３２１−３２８　（１９８１）も参照。リ ストセチン及び／又はボトロセチンによって誘導される、ｖＷＦノ血小板への結 合（及びその阻害）は、ＭａｃＦａｒ　１ａｎｅらのＴｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔ ｈ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、　３４：３０６−３０８　（１９７５）の方法に従っ て測定した。この方法は、フォルムアルデヒドで固定した洗浄血小板を利用する 。図１の上部には、−文字表記のＧＰＩｂαのアミノ末端領域のアミノ酸配列か 示されている。Ｔ、は、４５　ｋＤａドメインの起点を提供する、トリプシン開 裂部位を示す。配列の上の数字は、合成ペプチド配列における第一残基を示す。

その配列の下の同一数字は、そのペプチドにおける最終残基を示す。棒で示した 部分は、以下の研究において使用したより長いペプチド（２９残基）の配列を示 す。図１の下方の図は、リストセチン依存性（黒の捧）及びボトロセチン依存性 （斜線の捧）のＧＰｌｂ−［ＸへのｖＷＦ結合に関して試験した全てのペプチド の阻害効果を棒グラフとして示す。

２μｇ／ｍｌの”Ｊ−ｖ１１１Ｆ濃度で；５００μｍｏｌ／ｌの最終濃度で使用 する各ペプチドは、図１の上部図で使用する同一の数字によって特定される。こ こで、リストセチン依存性結合は５群のペプチド（主に、番号３−４．７−９． １４．２１及び２３−２５で特定されるもの）によって阻害さね〜一方、ボトロ セチン依存性結合は、７−ＩＯ及び１９−２５のペプチドによってのみ大きく阻 害されたことを明記すべきである。ペプチド２５は、両分析系に基づくと、阻害 剤として最も期待されるものである。

実施例６ ＧＬＹ２７１　、ＧＬｔｐ　＊　Ｉフラグメントの活性分析実施例５て議論した ように、図１は、グリコカリジンの配列ＧＬＹ”　”　−ＧＬＵ”　”を代表す るペプチド２５がｖＷＦ結合の阻害剤として非常に有望であることを示している 。

更に、２μｇ１０Ｉｌの一定の”’Ｉ−ｖＷＦ濃度及び、図２の横座標に示され るような種々のペプチド濃度で実験を行った。上部図は、ボトロセチンの存在下 での残留ｖＷＦ結合３点決定値の平均及び範囲を示す。下部図は、リストセチン の存在下での５点決定値の平均及び範囲を示す。残留結合は、各実験値から、飽 和量の抗ＧＰ［ｂモノクローナル抗体ＬＪ（ｂｌの存在下での測定値を引いた後 算出した。

１００％の結合は、ペプチドの代わりに、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝剤の存在下 で測定したものであった。

実施例７ ＳＥＰ１ｓ’〜ＴＹＲ””フラグメントの活性分析（実施例５に対応する）図１ から、ペプチド２３〜２５が、合成ペプチド２６に対して改善された結合を示す ことが分かった。ペプチド２６及び２５のアミノ酸配列は重複するので、ペプチ ド２６の末端部分を削除したペプチドを構成することによって、重要な阻害活性 を示すペプチドが生成するものと考えられる。従って、グリコカリジンの配列ｓ ＋：Ｒ１ｌ　Ｉ〜ＴＹＲ”’を構成する合成ペプチドを構成し、試験した。

２μｇ／ｒｎ１の１″’　１−ｖＷＦ濃度を使用して、実施例６と同様にして結 合阻害実験を行った。２つの別個の結合試験の平均及び範囲を図３に示す。

上記実験で言及した種々のペプチドを比較すると、元の２６の合成ペプチドの内 最も活性の強いのは、２５であり、４２０μＭの濃度でｖＷＦのリストセチン誘 起結合の５０％を阻害し、５３０μＭの濃度でｖＷＦのポトロセチン誘起結合の ５０％を阻害することか分かった。対照的に、残基２５１〜２７９を有するこの 実施例でのペプチドは１７０μＭの濃度でリストセチン誘起結合の５０％を阻害 した。

ＷＷＦと結合する高い可能性を有しく選択されたドメインか、天然のＧＰＩｂα 鎖の表面に生しるために）かつ特定のグリコカリジンドメインと結合する不活性 リンカ−配列を使用する合成ポリペプチド阻害剤をデザインするための基礎は、 Ｅｍｉｎｉ　らのＪ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５５：８３６−８３９　（１ ９８５）の方法によって示されている。

これらの表面可能性（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）インデックス の計算によれば、ペプチド２５の１５のアミノ酸の内１３及びこの実施例のペプ チドにおける１２個の位置か４より大きい表面可能性インデックスを有すること が分かる。

本実施例のペプチドが二重化できるシスティンを含み、ダイマーが逆相）ｔＰＬ ｃて示されるようにν訃結合分析における温度、ｐＨ及び時間の条件の下で実際 上優先的な形態であるので、そのような二重化によって、非二重化ペプチドと比 較して、ｖＷＦへの結合を高めるペプチド構造の変化を生しるものと考えられる 。

実施例８ 複合合成ポリマーの設計 図１及び実施例５から、ペプチド８及び２５が、多量性（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ）　ｖｌ！／Ｆ複合体を最大限に阻害するように、ｖＷＦ結合領域及び不活性ス ペーサー又はリンカ−配列を含む複合合成ポリマーを設計するための効果的なド メインを提供することか分かる。

実施例９ 安定な哺乳類の形質転換体におけるＧＰＩｂα（Ｈｉｓ’−Ｌｅｕ”’　）発現 Ｌｏｐｅｚらの公開さたＧＰＩｂαのｃＤＮＡ配列に基づいて、２つのフランキ ングオリゴヌクレオチドを合成して、ヒトゲノムラムダ（λ）ファージライブラ リーをスクリーニングするプローブとして適当であると考えられるＧＰｌｂα遺 伝子の領域をポリメラーゼ・チェイン・リアクシジン（ＰＣＲ）で増幅させた。

従って、ヒトゲノムＤＮＡを、５ａｉｋｉ　らの５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８ ７−４９１　（１９８８）の方法に従って、ＰＣＲにて酵素的に増幅した。この 操作は、サブセグメントを増幅するための二本ＭＧＰＩｂαＤＮＡ配列と、その サブセグメントの両端をフランクする２つの一本鎖オリゴヌクレオチドブライマ ーとを使用する。ブライマーオリゴヌクレオチド（ＤＮＡポリメラーゼ及びデオ キシリボヌクレオチド三燐酸の存在下）を、増幅するＤＮＡよりも遥かに高濃度 で添加した。多数回の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、オリゴヌクレオチド アニーリング及び合成を行った後に蓄積する大多数のポリヌクレオチドは、クロ ーニングによる増殖のために適した所望の二本１１ｃＤＮＡサブセグメントを提 供する。

ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔ　１ｃｕｓ）を使 用して、ＤＮＡサーマルサイクラ−（ｔｈｅｒｎｍｌ　ｃｙｃｌｅｒＸコネチカ ット州ノーウオーシノーウオークエルマー（Ｐｅｒｋｉｎε１ｍｅｒ）社又はカ リフォルニア州バークレーのシータス（Ｃｅｔｕｓ）社）で行った。１．０μｇ のヒトゲノムＤＮＡと、１．０μｇの各合成オリゴヌクレオチドブライマーと、 ５０蘭のＫＣＩ、Ｉ　Ｏ菌のトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、１．５−のＭｇＣ Ｉｚ、０．１％のゼラチン（カリフォルニア州すッチモントのバイオラド（Ｂｉ ｏＲａｄ）社）及び２００−の各ｄＮＴＰからなる緩衝剤とを含む１００μｌの 体積中で反応を行った。ＰＣＲの条件は、９４°Ｃて３０秒、５２°Ｃで３０秒 、及び７２°Ｃで１分という３５サイクルであった。増幅したフラグメントは、 ２％アガロースゲルを通して電気原動することによって精製及び分離を行った。

鵬ｎ１ａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、＋６４−１７０　（１９８２）、ニ■ ーヨーク州コールド・スプリングＨハーバ−のＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａ ｒｂｏｒ　、Ｌａｂ、参照。

具体的に説明すると、モデル３８０Ｂ自動系（カリフォルニア州フォスターシテ ィ−のアプライド・バイオシステムズ製）を使用して、ホスホールアミダイト（ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法（ＳｉｎｈａらのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、　２４：５８４３　（１９８３））に従って、以下のオリ ゴヌクレオチドを合成した。

選択したオリゴヌクレオチドは以下の通りである。

オリゴヌクレオチド（Ａ）は、（ＧＰＩｂα遺伝子に対してＷｅｎｇｅｒらの番 号付系を使用して）ヌクレオチド６４４〜６７４に対する非転写ストランドＤＮ Ａ（コード化ストランド）と間等である。

オリゴヌクレオチド（Ｂ）は、３゛−５°で示さ法転写ストランド（非コード化 ＤＮＡ）と等価である。対応するコード比類は、小文字により５゛−３で示され る。ヌクレオチドの位置は、Ｗｅｎｇｅｒらに従う。

Ｔ４キナーゼを使用して、増幅させたフラグメントの各末端にホスフェート基を 付加した。Ｔ、リガーゼを使用して、フラグメントのプラント末端を連結させて 、Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージの二重鎖複ｇ！塁の多重クローニング配列 中にＳｍａ１部位を形成した。ウィルスの安定な一本鎖（＋）型を分離てきる能 力は、その中てのクローン化配列の一体化を証明するのに特に有用である。Ｌｌ ｅＳＳｉｎｇのＪ、　Ｍｅｊｈ、　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＹ　、　＋０１：２０− ７８　（１９８３）及びＹａｎｉｓｈ−ＰｅｒｒｏｎらのＧｅｎｅ　３３F １０３−１０９　（１９８５）番孔従って、ＧＰｌｂαＤＮＡ挿入物は、Ｍ１３ ｍｐ１．８の一本鎖（＋）塁を使用する、一本鎮ジデオキシ法（サンガーらのＰ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４ ６７　（１９７７））を使用することによって、完全に配列特定かできた。

Ｍ１３ｍｐ１８での配列特定によって、ＧＰＩｂα挿入物か長さ３０１の塩基対 であることか分かった。このことは、対応ｃＤＮＡ領域（Ｌｏｐｅｚら）かイン トロン境界を含まないことを示した。３０１塩基対（ｂｐ）フラグメントを次い でニック翻訳に掛けて、′２ｐ−ｗ識ヌクレオチドを導入し、フラグメントを放 射能凛識プローブに変えた。ＲｉｇｂｙらのＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１ ３：２３７　（１９７７）参照。

ヒト細胞ＤＮＡのＥｃｏＲ［部分消化物を使用して、ヒトゲノムλフアージライ ブラリー（カリフォルニア州う・ホラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）にあるストラタジー ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製のラムダＦｉｘ　”を使用して）を調製した。こ のライブラリーは、宿主としてｌ：、　ｃｏｌｉ株Ｌε３９２を使用する、Ｂｅ ｎ　ｔｏｎらの５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０−１８２　（１９７７）に記載 のハイブリダイゼーション及びプラーク精製操作に従ってスクリーニングした。

３０１ｂρフラグメントによるスクリーニングによって、プラーク精製の４サイ クルの後、６種のポジティブクローンを分離した。

各ポジティブクローンに対するライブラリースクリーニングを行うためにλファ ージの適当な希釈物を、一定の攪拌の下で３７°Ｃｌ２Ｏ分間細菌と一緒に温度 した。融解アガロースをこの混合物に添加し、全体の内容物を、硬い寒天基を有 するペトリ皿上に広げた。ペトリ皿を３７°Ｃで一夜温！した。ニトロセルロー スフィルターをベトリ皿の表面に丁寧に置くことによって、得られたバクテリオ ファーノブラークのインプリントを作成した。ファージ粒子及びＤＮＡは、毛細 管現象によってプラークパターンの正確な複製の形でフィルターに転写した。Ｄ ＮＡは、ＮａＯＨで変性した後、焼くことによりフィルターに不可逆的に結合さ せ、次いて”Ｐ−ｆｆ識プローブに／ゾブリダイズした。非結合プローブは洗浄 して取り除き、フィルターをフィルムに暴露した。ハイブリダイゼーンジンに対 してボッチイブなプラークは、フィルムを元の寒天プレートと整合させることに よって特定した。これらのプラークは個々に採取し、増幅した。

一般に、ファージの初期の種付濃度は、個々のプラークを採取できず、その代わ り幾つかのファージ種を含む領域が採取されるようなものであった。この混合物 は、増幅し、低密度で再度種付して、どの初期ポジティブ体が本当のポジティブ 体であるのかを決めるために再スクリーニングし、また各ポジティブ体をプラー ク精製した。このような再スクリーニングを３回行った後、個々にポジティブな ハイブリダイズ化ファージを分離し、更に特徴付を行った。

次いて、精製λＤＮＡは、１ｍｎ１ａｔｉｓらの操作（７６−８５頁）に従って 、それぞれの細胞溶解Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＬＥ　３９２サンプルからファージを析 出させることによって、各λクローンから分離した。

６種のポジティブλクローンからのＤＮＡ、１μｇのサンプルをＥｃｏＲＩてｔ 肖化した。ＥｃｏＲＩ消化物は、次いてアガロース中での電気泳動によって分子 量に基づく分離を行った後、ニトロセルロースへ転写し、２ｔＰ−標識３０１ｂ ｐフラグメントを使用するオートラジオグラフィーで特定した。サザーンのＪ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：５０３　（１９７５）参照。約６０００塩基対 のＥｃｏＲ［フラグメントか認識された。

可視化しかつアガロースゲルから抽出した約６０００塩基対フラグメントは、Ｅ ｃｏＲｆ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−プラスミド（カリフォル ニア州う・ホラのストラタジーン製）にクローン化した。次いで、プラスミドは 、Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＸＬ−Ｉ　Ｂｌｕｅ　（ストラタノーン製）で増殖させた。

プラスミドは、アルカリ細胞溶解操作（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−ＤｏｌｙのＮｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７：１５１３　（＋９７９））によっ て宿主Ｅ、　ｃｏｌｉから回収した後、！１ｌａｎｉａｔｉｓら（１，４２）に 従ってＣｓＣ１／エチジウムブロマイド平衡遠心操作によって精製した。

そのように分離したプラスミドをＢａｍＨｌ及びＢｇｆ［＋て消化して、２１６ １塩基対フラグメント（Ｗｅｎｇｅｒらの番号付系を使用すると、ヌクレオチド ５０３〜２６６３）を形成した。このフラグメントは、開！ＥＴ’コドン（ヌク レオチド５３７〜５３９）の上流から、ＬＥＵ”　’コドン（ヌクレオチド２４ １２〜２４１４）及びＴＧＡ翻訳終結コドン（２４１５〜２４＋７）の下流まで 伸びている。

このフラグメントのＢａｍＨ１部位は、ヌクレオチド５０２〜５０７に対応し、 そのＢｇｊ’＋１部位は、ヌクレオチド２６５８〜２６６４に対応する。

次いで、２１６１ｂｌ＋フラグメントは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　−（ カリフォルニア州う・ホラのストラタジーン製）のＢａｌｌ１）ｔ［部位中に、 ＥＬａｍ）［−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントとしてクローン化した。隨ｍ１１及び Ｂｇ／１１制限部位は同一の内部配列：ＧＡＴＣ／ＣＴＡＧを含むので、Ｂｇｊ ７１１制限処理部位をＢａｍＨ［部位にアニールしても良い。フラグメントをＴ 、ＤＮＡリガーゼによって連結しても、影響されるＢｇｌ［１末端の一体性は復 元しなかった。３０１塩基対プラークとのハイブリダイゼーション及びアガロー ス上のサイズ化を繰り返した。これらのプラスミドは、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＸＬ− Ｉ　Ｂｌｕｅにおいて増殖した。

制限地図の作成を行って、ε、　ｃｏｌｉ　ｎ−Ｉ　Ｂ！ｕｅ　（ストラタジー ン製）のクローンの選択を行った。このクローンにおいては、含まれるｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−プラスミド内のＧＰｌｂαＤＮＡが不活性な配向を有し ているために、ポリリンカーのＸｈｏ［部位が挿入物の上流（５゛）にあり、Ｎ ｏｔ１部位かその下流（３′）にある。布ｏ１−Ｎｏｔｌ　フラグメントは、適 当な発現プラスミドを作るように以下のように使用される。

アミノ配糖体性抗生物質耐性に基づく選択操作は、適当なＧＰ［ｂα発現プラス ミドを保持する形質転換体に対して連続的に選択するように設計した。

ｐｃｐｖ８ベクター（Ｓｅｅｄらによって開発され（Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８ ４０−８４２　（１９８７）　）かつカリフォルニア州すンディエゴにあるイン ビトロゲン（ｒｎｖｉ　ｔｒｏｇｅｎ）から入手可能）は、カリフォルニア州う ・ホラにある５ｃｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｏｕｎ ｄａｔｉｏｎ　（７）Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｏ’Ｔｏｏｌ博士によって修正されて、 ネオマイシン耐性遺伝子（ホスホトランスフェラーゼＩＤを含むようにされた。

この遺伝子は、２０００塩基対ＢａｍＨｌフラグメントの一部として、ｐＣＤＭ ８のＢａｍＨＩ制限部位にクローン化した。ネオマイシン（ｎｅｏ）遺伝子によ って生産される蛋白質はまた、池のアミノ配糖体抗生物質、例えばＧｅｎｅｔｉ ｃｉｎ＠Ｇ４］８サルフェート（メリーランド州がイサースブルグ（Ｇａｉ　ｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ）にあるＧｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　 ＩｎＣ１製）に対する耐性を付与する。

ネオマイシン耐性マーカーを含む幾つかの他の好適な発現ベクターか市販されて いる。その例として、ｐｃＤＮＡ　１″”　（カリフォルニア州すンディエゴに あるインビトロジエン製）　、Ｒｃ／Ｃ１１ｌＶ（カリフォルニア州すンディエ ゴにあるインビトロゲンＥｊ）及びｐＭＡＡｆ”’　（カリフォルニア州バロア ルトにあるクロンチク（Ｃ１，ｏｎｚｅｃｈ製）か挙げられる。必要に応じて、 ＧＰｌｂαフラグメントは、これらの他の発現ベクターにおける発現能力に関し て、異なる制限処理又は修飾をしてもよい。

ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−プラスミドからのＸｈｏｌ−Ｎｏｔ［フラグメ ントを、Ｘｈｏｌ及びＯｔｉて制限処理したｐｃＤＩ＋１８″′＠０中に挿入し た。アンピシリン感受性Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＸＳ−１２７細胞（カリフォルニア州 う・ホラにあるインビトロゲン製）を、ＨａｌｌａｈａｎのＪ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、　１６６：５５７−５８０　（１９８３）の方法に従って、得られた連 結ＤＮＡ混合物で形質転換した。

得られたコロニーからのプラスミドは、制限地図作成及びＤＮＡ配列特定によっ て特徴付け、意図する挿入物を含むコロニーを特定した。このような一つのプラ スミド（ｐＭＷｌと命名）を、ε、　ｃｏｌｉ株ＸＳ−１２７中に維持し、哺乳 動物細胞形質転換操作のために選択した。

スーパーコイル化したプラスミド（＃１）は、哺乳動物細胞の形質転換に使用す る前に、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙのアルカリ細胞溶解操作によって、宿主ε 　ｃｏｌｉから回収し、次いてＭａｎｉａｔｉｓら（１，４２）に従う、ＣｓＣ １／エチジウムブロマイド平衡遠心分離によって精製した。

標準燐酸カルシウム介在トランスフェクション操作によって、ｐＷＩをＣＨＯ− Ｋｌチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ　−６１）に導入した 。ＣｈｅｎらのＭｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７（８）：２７４５−２７５２　（１９８７）参照。

ＣＨＯ−Ｋｌ細胞は、１０％の熱不活性牛脂児血清（ＦＣＳ：　Ｇｉｂｃｏ製） と、０．５閘の各非必須アミノ酸（？ＪＥＡＡ供給会社、即ち、メリーランド州 つネーカースビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉ　１ｉｅ）にあるウィッチツカ−（Ｗｈ ｉ　ｔｔａｋｅｒ）製）と１５ｍＭのし一グルタミンとを追加したダルベツコ変 性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　 ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）　（ＤＭＥＲＪＸメリーランド州ガイサースブルグにあるＧ ｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、製）において、５％ ＣＯ７雰囲気下、３７°Ｃで集密化（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｃｅ）するまて成長さ せ、以下の考案したようにトリプシン処理し、そして形質転換前に、６０−組織 培養皿当たり、１．２５Ｘ１０’細胞の密度（集密の約２５９６）において２４ 時間サブカルチャーを行った。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞は、これらの条件下で、ＤＭＥ Ｍ／Ｉ　Ｏ％ＦＣＳにおいて約１６時間の倍加時間を有している。

形質転換を達成するために、ｐＭＷＩプラスミドを、ＢｉｒｎｂｏｉｒＤｏｌｙ の方法に従って、Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＸＳ−１２７の培地から回収した。１０請ｇ のプラスミドを、Ｃｈｅｎらの方法に従って、燐酸カルシウム溶液において各６ ０皿皿中の細胞に適用した。細胞は、プラスミドとともに温室した後、５％Ｃｏ ｔ雰囲気下、３７°ＣてＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に保持した。

約４８時間の後処理トランスフェクション及び５％ＣＯｔ雰囲気、３７℃での成 長の後、以下のように、細胞をトリプシン処理した。各皿の成長培地は、０゜２ ５％のトリプシン及び０，２％（Ｗ／Ｖ）のＥＤＴＡを含む燐酸緩衝塩水の溶液 　（３７酬のＮａＣ１と、２７請のＫＣＩと、４．３−のＮａ、）ｔＰＯ，’　 ７ＨｔＯ／　１．４　ｔｒｙ　ＫＪＰＯ４とを含み、ｐＨ７，４）、３ｍｌで置 換した。トリプシン処理は、３分間行った。トリプシン含有培地を除去し、更に １５分間インキュベーター中に置きその後、細胞を１０％ＦＣ３を含有するＤＭ ＥＭに再懸濁した。各皿からの細胞を２０群に分広約１．２Ｘ１０’細胞／６０ ｍｍ皿の密度（集密状態の約２％）で種付けした。

プラスミドＤＮＡを一体化した安定な形質転換体の製造は、ジエネティシン（Ｇ ｅｎｅｔ　１ｃｉｎ＠）Ｇ４１８サルフエートを、０．８　ｍｇ／ｍｌの濃度ま で６０１ｍ皿に添加することによって達成することができる。成長は、５％ＣＯ □雰囲気下、３７°Ｃて！４日間続けた。生き延びた独立のコロニーを、クロー ニングリングを使用して１２ウエルプレートに移転し、０．８　ｍｇ／ｍｌのジ エネティシンを追加したＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにて、更に７日間成長させた。

このような条件下で、プレート当たり３〜７の生き延びたコロニーは、１０〜１ ４日で明らかになった。約１００の安定な形質転換体は、始めに集密状態の約７ ０％のプレート密度において、約５ＸＩＯ’の細胞を含む、各元の６０ｒｒＭの 皿から分離した。

ＬＪ−Ｐ３抗ＧＰｆｂαモノクローナル抗体によるスクリーニングに基づけば、 Ｇ４１８サルフエート耐性細胞系の５０％より多くの細胞系か、成１ＮＰＩｂα ポリペプチドに対応する抗体を産生ずる。各クローンの一体化の特定の部位によ って、すべての場合に発現か阻害される。安定な形質転換体は、ジエネティソン ６４１８サルフェート（０，８ｍｇ／ｍｌ）を含有する培地で培養し、維持して 、連続選択を行った。

組換え成煕円ｂαポリペプチドを発現するコロニーは、緩衝剤中ての細胞溶解の 後で、ニトロセルロース上のドツト・プロット分析によって検出した。比較例と して、組換え細胞抽出物を、非トランスフエクンジンＣＨＯ−Ｋｌ細胞からの抽 出物と比較した。

細胞抽出物を調製するために、非トランスフェクション又はトランスフェクショ ンＣＨＯ−Ｋｌ細胞を３，５蘭のＥＤＴＡて採取し、ｐＨ７，５の、０．２５Ｍ トリスＨＣＩに再懸濁した（ｌＯ′細胞／μｌ）。凍結及び溶解を３サイクル行 うことによって細胞を溶解し、１２０００ｇで遠心分離を行い、細胞残骸を除去 した。得られた上澄は、細胞抽出物として一７０℃で保存した。

分泌されたＧＰＩｂα抗原を含む培地のサンプルを調製するために、ＦＣ５含有 培地で成長させた、８０％集密の非トランスフェクション又はトランスフェクシ ョンＣＨＯ細胞を、血清のない媒体で一度洗浄し、次いてし一グルタミン及び非 必須アミノ酸を補充した、血清のない媒体を供給した。２４時間後、培地を収集 し、１２０００ｇで遠心分離して、細胞残骸を除去した。対応する上澄を集め、 使用するまで保存した。ＧＰｌｂαの天然コンフオーメーンジンを認識するモノ クローナル抗体しＪ−１ｂｌ　（Ｈａｎａｄａら）及びＬＪ−Ｐ１９を、−次抗 体として使用した。ＦｒａｋｅｒらのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｎｍｕｎ、、　８０：８４９−８５７　（１９７８）の方法によっ て標識した、二次抗体（１！’ｌ−ラビント抗−マウスＩｇのを、ニトロセルロ ースシート上で２５°Ｃ１２時間温賞した。洗浄後、ニトロセルロースをオート ラジオグラフィーで展開して、ＧＰ［ｂαα凍原発現するコロニーを特定した。

ｐｈｒｔｎ＝形質転換細胞からの抽出物は、還元性又は非還元性条件下で５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した時に、７９ｋＤａのおおよそ の見掛は分子量を有する糖蛋白質［ｂα抗原を副成分として含む。このバンドは 、グリコジル化のない、全長の糖蛋白質１ｂα鎖（残基１−６１０で、シグナル ペプチドを有さない）を示した。７９　ｋＤａポリペプチドは、抗ＧＰ［ｂαモ ノクローナル抗体ＬＪ−［Ｂａ１と反応する。この抗体は、還元墾又は非還元型 を問わず、変性（α）ポリペプチドのアミノ末端領域に、そのエピトープを有す る。相対的に少割合のこの種類のポリペプチドは、その面前の非安定性及び急速 な蛋白質分解プロセシングを示す。適正に組み上からない、オリゴ体の膜複合体 （例えば、ＧＰＩｂα・ＧＰＩｂβ・ＧＰｌｂｌＸ）は、小胞体を越えて転送さ れず、細胞内で分解される。従って、同時に（β）及び（ＩＸ）遺伝子の発現な くして、（α）遺伝子を発現することは、（α）ポリペプチド又はその生物学的 に活性な形態を分離するには至らないと考えられる（Ｌｏｐｅｚ、　Ｊ、Ａ、ら のＣ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８２（４）：　５９７ａ　（１９９０）：　Ｋｒａ ｎｇｅｌ、　Ｍ、Ｓ　らのＣｅ１１．１８：９７９−９９１　（＋９７９）：　 Ｗｏｏｄｓ、　Ｃ，Ｍ、らのＣｅ１１．B ４０：９５９−９６９　（１９８５）；　！＋Ｉｉｎａｍｉ、　Ｙ、らのＰｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：Q６８８− ２６９２　（＋９８７）参照）。

予想させるように、７９ｋＤａポリペプチドは、ｐｌａｔ形質転換細胞からの培 地には検出されなかった。その代わり、かかる培地から分離された主要なＧＰＩ ｂ　（α）ポリペプチドは、ＧＰＩｂαの適切なグリコジル化アミノ末端ドメイ ンの特徴的な４５　ｋＤａのおおよその見掛は分子量を有する。この種のポリペ プチドかｐＭＷｌ形質転換細胞の培地中に存在することによって、ＧＰＩｂαの アミノ末端ドメインか分泌性蛋白質としてプロセシングされ、全長のＧＰ［ｂα ポリペプチドの通常の蛋白質分解作用にも係わらず、ＧＰ［ｂα複合体の他の成 分の組み立てかなくても、構造的な完成域に達することか分かる。

しかしなから、全長のポリペプチドを更に実質的に発現し、それを適当に折り畳 みかつグリコジル化することを許容する、安定した細胞系か見出されることか期 待される。以下で説明するように、Ｈｉｓ’〜Ａ　ｌａ　２　ｅ　ｔフラグメン トは、天然の糖蛋白質１ｂαに存在する三次構造の構造プロセソングドメインに 組み立てられるようにする、十分な一次配列情報を含む。おおよそＨｉｓ’から おおよそＡ１ａｆｆｏ！までのアミノ酸配列と、Ａｌａ３０２のカルボキン末端 側における付加的なＣＰｌｂα配列とを含むポリペプチドの発現によって、４５ 　ｋＤａフラグメントの生物学的活性を育するポリペプチドをも生しさせること か期待される。

実施例１０ 安定な哺乳類形質転換体におけるＨｉｓ’　％　Ａｌａ”’　ＧＰ［ｂαフラグ メレトの発現この実施例は、）ｔｉｓ’におけるアミノ末端と、Ａｌａｏｌｌに おけるカルボキシ末端とを有する成馬円ｂαポリペプチドのフラグメントをコー トするＤＮＡ配列が、培養嗜乳類細胞で発現できかつ分泌し得る条件を示す。

以下の部分は、ＤＮＡのプライマーによって指示される増幅に関する。２１６１ 塩基対フラグメント（Ｗｅｎｇｅｒらに従うと、ヌクレオチド５０３〜２６６４ ）をそのＢａｒｎ８１部位に含むｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳを、５ａｉｋｉ 　らの方法及び上記実施例９の全般的な操作に従って、ＰＣＲで酵素的に増幅し た。

モデル３８０Ｂ自動化システム（カリフォルニア州フォスターシティ−にあるア プライド・バイオシステム製）を使用して、５ｉｎｈａらのホスフォールアミダ イト法によって以下のオリゴヌクレオチドを合成した。

ＧＰｌｂα遺伝子に対するＷｅｎｇｅｒらの番号付系を受用して、ヌクレオチド を示す。

オリゴヌクレオチド（Ｃ） オリゴヌクレオチド（Ｄ） （ヌクレオチド位置　１４７０〜１４８９）オリゴヌクレオチド（Ｃ）は、非転 写（コート化）ストランドＤＮＡと等価である。大文字で示されているオリゴヌ クレオチド（Ｄ）は、転写（非コード化）ストランドＤＮＡと等価である。オリ ゴヌクレオチド（Ｄ）に対応するコード化ストランドは、５’−３’で示され、 暗号化されたアミノ酸は標準３文字記号で示される。

増幅した二本鎖ＤＮＡ配列３゛〜部分的ＡＩａ３ｏｔ□コドンにＢａｍＨＩリン カ−を添加して、コドンを完成させ、またＤＮＡかＢａｆｆ１ｌ（１挿入物とし て機能するようにさせた。ＲｏｂｅｒｔｓらのＮａｔｕｒｅ、　２６５：８２− ８４　（１９Ｔ７）番孔増幅フラグメントは、Ｍ１３１１１ＰＩ９バクテリオフ ァージの二本鎖複製梨の多重クローン配列内のＢａｍ８１部位にクローン化した 。ウィルスの安定した一本ｉｊｌ　（＋）型を分離できる能力は、その中にクロ ーン化配列か一体化されていることを証明するのに特に青用である。例えば、Ｍ ｅｓｓｉｎｇ及Ｍａｎｉ　５ｈ−Ｐｅｒｒ叩らを参照。

従って、ＧＰＩｂαＤＮＡ挿入物は、ＭＩ３ｍｐ１９の一本鎖（＋）梨を利用し て、サンガーらの一重鎖ジデオキシ法によって、完全に配列か特定さｔｚ　ＧＰ Ｉｂαフラグメントが、ヌクレオチド５０２〜１４８９によって代表されかつ開 始メチオニンのコドンと、シグナルペプチドの残りの１５残基と、及び成剤（円 ｂαポリペプチドのアミノ末端領域の残基ｌ〜３０２とを含むＧＰＩｂαＤＮＡ の領域に対する正確なコート化配列を含むことを確認した。

ＭＩ３ｍｐ１９における配列特定によって、ｐＣＤＭ８…プラスミドがらの発現 にとって適切な、Ｂａｍ８１部位における挿入配向を有する多くのクローンが確 立された。このようなりローンの一つのＧＰＩｂα配列は、ＥｃｏＲＩ（５’　 ）−Ｘｂａｌ（３’　）フラグメントとしてＭ１３＋ｎｐ１．９から除去した。

このＥｃｏＲ［（５’　）−Ｘｂａｌ（３’　）フラグメントは、次いでｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−のポリリンカー領域にクローン化した。この第２の挿 入物のＸｈｏｌ（５’　）−Ｎｏｔｌ（３’　）フラグメントは、次いでｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−から除去し、ｐｃＤｈ＋ｓ　”°０にクローン化し、 声」の挿入で使用した操作（実施例９）に従ってＸｈｏ及ＵＦｊｏｔｌで制限処 理した。

アンピシリン感受性Ｅ、　ｃｏｌｉ株５Ｘ−１２７細胞（カリフォルニア州すン ジエゴのインビトロゲン製）をＨａｎａｈａｎの方法に従って、生成した結合Ｄ ＮＡ混合物で形質転換した。

得られたコロニーからのプラスミドは、制限地図及びＤＮＡ配列特定によって特 徴付を行い、意図する挿入物を含むコロニーを特定した。かかる一つの適当なプ ラスミド（ρＭＷ２と表示）を、Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＸＳ−１２７に維持し、哺乳 類細胞形質転換操作のために使用した。

スーパーコイル化したプラスミド（ｐＭｉｌ１２）は、形質転換用の哺乳類細胞 に使用する前に、ＢｉｒｎｂｏｉｒＤｏｌｙのアルカリ細胞溶解操作、次いで実 施例９に従うＣｓＣ１／エチジウムブロマイド平衡遠心分離操作によって、宿主 Ｅ、　ｃｏｌｉから回収した。Ｃ）１０−Ｋｌ細胞の形質転換は、またｐＭＷ１ プラスミドに対する実施例９の操作に従って行った。

実施例１１ ｐＡＩＷｌ及びｐＷ２プラスミドて産生したポリペプチドにおける天然三次構造 の証明（ｐＡＩＷｌ及びｐＭＷ２を含む）安定した形質転換体細胞におけるＧＰ ｌｂα抗原の存在は、ＣＨＯ−Ｋｌを含む皿からの細胞溶解物又は培地（実施例 ９と同様に調製）をニトロセルロースに適用することによって証明した。

１０μ！アリコートの細胞溶解物又は培地をニトロセルロース膜（０，４５ミク ロンの孔サイズ　カリフォルニア州すッチモントにあるバイオ−ラド（Ｂｉｏ− Ｒａｄ）製）上にスポットとして滴下し、乾燥した。蛋白質ブロック溶液である 、「プロット（Ｂｌｏｔｔｏ）　Ｊ　（ＰＨ７，３の燐酸緩衝液中で、５　ｍｇ ／ｍ　ｌの脂肪のない乾燥ミルク、０．２５ａｌＪのフェニルメチルスルホニル フルオライド、Ｏ，１５ＭのＮａＣ１）中に、一定の攪拌の下で、２２〜２５° Ｃで２時間、膜を浸漬して、非特異性相互作用を阻害した。

上記膜は、天然ＧＰＩｂαコンフすメーシコン要求モノクローナル抗体（５〜１ ０μｇ／′ｍｌのしＪ−１ｂｌ又はＬＪ−ＰＩ３）とともに、２２〜２５℃で２ 時間温室した。

膜は、プロットで３回洗浄した後、＋２’ｔｅｌｌ！識ウサギ抗−マウス［ｇＧ 　（０，０８〜０．１６メ＋　ｌ　ｌ　２　Ｓ　／ドツト）の溶液に移し、２２ 〜２５°Ｃで２時間温室した。

乾燥及びオートラジオグラフィー操作（コダソクＡＲフィルムを使用）前に、プ ロットで３回洗浄した。

図４は、ｐｌ＆１及びｐＭＷ２形質転換細胞からの細胞抽出物又は培地を使用し てＬＪ−Ｉｂｌ及びＬＪ−ＰＩ３−次抗体による結果を示す。非形質転換ＣＨＯ 細胞からの細胞抽出物及び培地は、コントロールとして使用した。図４は、細胞 溶解物又は培地から分離したものかどうかによらず、ｒｌｂαｌ又１計１ｂα２ 抗原（それぞれ、ｐＭＷｌ及びｐＭＷ２形質転換体から産生）が、天然ＧＰ［ｂ α中に存在する三次フンフォメーンヨノのドメインを提供することを示す。同様 の結果が、別のフンフォメーション依存性抗ＧＰｌｂαモノクローナル抗体ＬＪ −Ｐ　３を使用することによって得られた。

実施例１２ ｐｋｌＷ２プラスミドで産生されたＧＰＩｂαポリペプチドの細胞内プロセシン グ代表的な細胞系からのｐＷ２形質転換Ｃ）１０−Ｋｌ細胞によって産生された ポリペプチドは、Ｈａｎｄａらの操作に従って免疫プロット（ウェスターンプロ ット）により還元条件下で特徴付を行った。ＢｕｒｎｅｔｔらのＡ、　Ａｎａｌ 、　Ｂｉｏｃｈｅａ、　１１２：１９５−２０３　（１９８＋）　も参照。

ｐＷ２ポリペプチドのジスルフィド結合は、電気泳動の前に、変性剤の不存在下 で３７°Ｃ，１時間、３０−のジチオトレイトールて処理することによって還元 した。電気＊動は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド１０％ゲル（ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で行い、蛋白質サンプルをクーマン−（ＣｏｏｌＴＩａｓ ｓｉｅ）ブリリアントブルーて染色した。複製ゲルからの蛋白質バンドは、３℃ 、１８時間、３５０ミリアンペア／ゲルの条件下で、ニトロセルロース（０，４ ５ミクロンの孔サイズ：カリフォルニア州すッチモンドにあるバイオ−ラド（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ）製）に移した。ＧＰＩｂα抗原材料は、先ずＬＪ−１ｂａｌモノ クローナル抗体とともにニトロセルロースを温置して可視化した。この抗体のエ ピトープは、ＧＰ［ｂαの還元された３５ｋＤａアミノ末端フラグメントに対し て予め同定されたものである（Ｖｉｃｅｎｔｅ　ら）０ 免疫反応バンドは、Ｆｒａｋｅｒらの方法で標識した、二次抗体としての、＋２ ５Ｉウサギ抗−マウスＩｇＧを使用して、可視化した。

ｐＭＷ２プラスミドで形質転換したＣＨＯ−Ｋｌ細胞からの、還元性条件で実施 だ抽出物は、不完全にプロセシングされた先駆炭水化物を多分前する、約６０ｋ Ｄａの見掛は分子量の顕著な先駆ポリペプチド種を示した（図５）。同様な条件 下で試験した培地からのポリペプチドは、アミノ末端４５　ｋＤａのトリプシン 分解フラグメントの公知の重量に対応する、約４５　ｋＤａの見掛は分子量のバ ンドとして示された。血小板からの抽出物は、予想された全長＋４５ｋＤａのＧ Ｐ＋ｂαポリペプチドを示した。

実施例１３ ４プラスミドで産生したＧＰＩｂ　（α）ポリペプチドへのｖＷＦのポトロセチ ン誘イルブランド因子の血小板へのｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合を調節すること（Ｒｅ ａｄらのＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７５：４５１４−４５１８　（１９７８ ））及びポトロセチンがＶＷＦに対して、（成熟サブユニットの）アミノ酸配列 位置４４１〜７３３を含むその領域、従ってＧＰＩｂ結合ドメインにおいて結合 することが証明されている。Ａｎｄｒｅｗｓ、　Ｒ，Ｋ。

らのＢｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ、　２８：８３１７−８３２６　（１９８９） 参照。この実施例は、ｐＭＷ２プラスミドによって安定して形質転換したＣＨＯ −Ｋｌ細胞から産生されたＨｌＳＩ−Ａｌａ３０２ポリペプチドか機能的に活性 であることを示す。

ｐＷ２形質転換ＣＨＯ−にｌ細胞（集密又はそれに近い状態）からの培地（ＦＣ ８のないＤＭＥＩＪ）、５０μｌを、円形ニトロセルロース膜（８ｍｍ径）とと もにマイクロタイターウェルに入楳室温で３０分温温室た。２０蘭のへペス（Ｈ ｅｐｅｓ）、ｐＨ７，４，１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び６％の牛血清アルブミン の溶液（ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ）でフィルターを２度洗浄した。非特異性相互作用 によるバックグラウンドを最少にするために、ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡによるブロッ クを４°Ｃで２日間、続けた。

分析を始めるために、モノクローナル抗ＧＰ［ｂα抗体の３０μｌ体積（図６で 具体的に示す最終濃度となるように）を、培地て被覆したニトロセルロース膜と ともに室温で１５分温温室た。１０μｌの”’ｒ−ｖＷＦと、１０μｌのポトロ セチン（ミズーリ州セントルイスにあるシグマ製）からなる混合物を、室温で５ 分子め温置し、マイクロタイターウェルに添加して、更に１５分温温室た。得ら れたポトロセチン濃度は５μｇ／ｍ　ｌであった。フィルターをＨＥＰＥＳ／Ｂ ＳＡで４度洗浄した。結合＋１８１放射能を、各ニトロセルロースフィルターに 対して測定し、ｒｉｂα２へのポトロセチン誘起ｖＷＦ結合を測定した。

図６は、Ｈｉｓ’−Ａｌａ３６”　ＧＰＩｂαポリペプチドの機能活性を示す。

抗ＧＰＩｂαモノクローナル抗体ＬＪ−［ｂｌ　（１００μｇＪｏ１１　）及び ＬＪ−ＰＩＯ（１００μｇ／ｍｌりは、ＬＪ−［ｂｌ及びＬＪ−ＰＩＯかＧＰ［ ｂα−ＶＷ相互作用の公知の阻害剤であることから予想されるように、ｒｉｂα ２ポリペプチド−ｖＷＦ相互作用を実質的に阻害した。ＬＪ−［ｂｉは、ＧＰ［ ｂαの天然のコンフォメーション依存性エピトープを認識する。１（ａｎｄａら 及びＶｉｃｅｎｊｅらを参照。

図６はまた、モノクローナル抗体ｒＬＪ−Ｐ　３　Ｊ及びｒ２２９Ｊがｒｌｂα ２−ｖＷＦ相互作用を阻害しないことを示す。抗体ＬＪ−Ｐ　３及び２２９が各 々ＧＰＩｂα及びＶ訃のエピトープを育するとしても、それらがｖＷＦの血小板 への結合を非常に弱くしか阻害しないので、このことは予想されたことである。

実施例Ｉ４ この実施例は、２１１ｗ２プラスミドで安定して形質転換したＣＨＯ−Ｋｌ細胞 によって産生されたＨｉｓ’−Ａｌａ”’ポリペプチドか機能的に活性であるこ とを示す。分析を実施するために、酵素結合免疫濾過技術（ＥＬＩＦＡ）に使用 する装置を、組換えｐＭＷ２ポリペプチドの不溶化と組み合わせて使用した。４ ５　ｋＤａＧＰ［ｂαフラグメントを、９６ウエルサンプル適用プレートと減圧 室との間においたニトロセルロース、！（０，４５μの孔サイズ）上に不溶化し た。市販の濾過材料及びポンプ材料を使用した。

４５　ｋＤａフラグメントの不溶化は、ｐＭＷ２形質転換ＣＨＯ細胞からの培地 、２００μ！容積か５分間にわたってニトロセルロース膜を通して減圧吸引され るようにすることによって行った。膜の蛋白質結合容量は、２０ｄＭのへベス、 ｐＨ７４，１５０國のＮａＣ１及び１％鹸Ｖ牛血清アルブミンを含むＨＥＰＥＳ ／ＢＳＡ緩衝剤（カリフォルニア州う・ホラにあるカルバイオケム（Ｃａｌｂｉ ｏｃｈｅｍ）製）の３回連続２００μｌアリフートをその膜に通すことによって 飽和させた。

上記操作の完了後、非特異的相互作用によるバンクグラウンドを最少化するため に、予めリストセチン（ミズーリ州セントルイスにあるシグマ化学社製）ととも に温室した”　’　［−ｖｌｌｌＦを含むＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ　、　５０　ｔｔ 　１体積を、５分間にわたって再度ニトロセルロース膜を通して減圧吸引した。

５０μｌのアリコートでの予温室は、種々の濃度のりストセチン（０−１■／ｍ ｌ）及び特定の量の＋２’［−ｖＷ　（１，Ｉ　３　ｘ　１０　”　ｃｐｍ／ｍ ｇの特異的活性を有する。、　２５　ｔｔｇ／ｃａｌ　）を使用して、３０分、 室温で行った。

膜を乾燥し、各適用ウェルの位置に対応するディスクを切取り、γシンチレーノ ジンスペクトロメータで計量し、結合放射能を測定した。ディスクを切取る前に 、膜のす一トラジオグラフを操り、ウェルからウェルへの放射能漏れのないこと を＠認した。

結合した＋２１１−訃放射能は、予温室混合物で測定しこりストセチン濃度の関 数として測定した。コントロール（リストセチンなし）においては、ウェル当た り、はんの約１００カウント／分（ｃｐｍ）か検出され、１．　Ｏ〜２．０ｍｇ ／ｎ＋Ｉ！のりストセチンて予温室したウェルについては、約８５０　ｃｐｍか 記録された。

同様の実験を、ホトクセチンとともに１！’Ｉ−ｖＷＦを予温室（５０μｇ／ｍ １体積）することによって行った。ホトクセチンかない場合、バックグラウンド に対して実質的に何もカウントは記録されなかった。予温室することによって、 約０．５μＪｒｎｌ及び約２１００ｃｐｍ／ウェル以上のポトロセチン濃度が記 録された。

結合放射能は、予温室ポトロセチンの０及び約０．２５μｇ７′１の間で、鋭く 立ち上かり、２０００ｃｐｍ／ウェルに近づいた。

使用ペプチド（５００Ａ１ｍｏ１．、、’ｆｆｉ　Ｓペプチド濃度（ｍｏｌ／ｌ ） ペプチド濃度（ｍｏ　ｌ／’　ｌ　） ＬＪ−Ｉｂｌ　ＬＪ−ＰＬ９ 細胞抽出物　培地　血小板細胞溶解物 結合”５１−Ａ’Ｆ（ｎｇ／ウェル） 要約書 本発明は、血小板膜種蛋白質１ｂ及び／又は巨核球系統細胞表面に発現する糖蛋 白＊ｌｂへの７オニハウイルブランド因子の結合を阻害するペプチド又は他のポ リマー、及び血小板の活性（１，血小板の表面への接着、血小板の凝集又は血栓 症を阻害する方法に関する。本発明はまた、血小板膜種蛋白質１ｂへの）Ａ−ン ・ウィルブランド因子の結合を阻害するペプチドをコード化する組換えＤＮＡ発 現ベクターであって、血小板膜種蛋白質［ｂのアミン末端領域の）ｉｉｓ’〜Ａ ｌａｓｏｔのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列又はその配列サブセ ットを含むベクター、該ベクターで形質転換した哺乳類宿主細胞、並びにグリコ カリジンの４５ｋＤａフラグメントの同定特性を有するペプチドを製造する方法 又は全長ＧＰ［ｂαポリペプチド（Ｈｉｓ’　−Ｌｅｕ”’　）又はそのサブフ ラグメントを発現する方法に関する。

国際調査報告 １−１１８＋＋＋１ｌｄｌ’“ｌ　Ａ″１°’−”　”　ＦＣｒ／１ｊｉｌ／１ ｌＩＥ１７１１・ ｌｔ＋／ｅ１．ｌｌａ？＋。−’＋ｉｕ＋ｕｕ＋＋＋１＋、１１ＰＣＴ／Ｕ９９ １１０００８７ ｃｏｎｕｎｕａｔユｏｎ　ｏｆ　Ｐａｒｔ　Ｖｒ　０ｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　 ｗｈｅｒｅ　ｕｎｉｔｙ　ｏｆ　１ｎｖｓｎｔｉｏｎ　ｉｓＬａａＸｉｎｇ ｖ７繋“：；：買：。７°頴北宝、りら中３９沼、■ｇ話゛マｇ　：１１ｒｏｍ ｂｏτ；＝ｓｕｂｃｌａａｓ　ＩＬ　ｃｌａｉｍｓ　ｆコＯ−３コ）ＶＩ？ｒ　 Ｔｈ５ｊ　ｇｒｏｕｐ　ｃｏｍｐｒ１ｓ１ｎｇｔｈ＠ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｌａ ｓｓｉｆｉｅｄ　ｈｎ　ｃｌａｓｓ　５３０１υｂｃｌｅｓｉ３８７．１ｃ１ａ ユｍ６５１−ＸＸ　Ｔｈａｔ　ｇｒｏｕｐ　ｃｏｍｐｒｉ、ｓｉｎｇ　ｔｈｅ　 ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａｐｏｌＹｐｅｐｔｉｄ＠ｃ ｌａｓｓｉｆｉｓｄｉｎＣ１ａｎｓ４３５Ｓｕｂｃｌａｍｍ２４０．２ｆｃ１． ａｉｍｓ６ロー６７１　ａｎｄ　ｅａｃｈ　５ｐｅｃｉｅ　ｏｆ　ｐｓｐｔｌｄ ｅ　１ｎｃｌｕｄｓｄ　ｉｎ　ｔｈ＠ｃｌａｉ＋＋＋ｓ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血小板膜糖蛋白質１ｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現する糖蛋白質 １ｂへのフォン・ウィルプランド因子の結合を阻害するペプチドであって、以下 のペプチドの群： 【配列があります】 から選択させるペプチド。 ２．アミノ酸配列：ＮＬＤＲＣＥＬＴＫＬＱＶＤＧＴを有し、グリコカリシンの アミノ末端の残基６１〜７５を構成する請求項１記載のペプチド。 ３．アミノ酸配列：ＱＶＤＧＴＬＰＶＬＧＴＬＤＬＳを有し、グリコカリシンの アミノ末端の残基７１〜８５を構成する請求項１記載のペプチド。 ４．アミノ酸配列：ＴＬＤＬＳＨＮＱＬＱＳＬＰＬＬを有し、グリコカリシンの アミノ末端の残基８１〜９５を構成する請求項１記載のペプチド。 ５．アミノ酸配列：ＱＴＬＰＡＬＴＶＬＯＶＳＦＮＲを有し、グリコカリシンの アミノ末端の残基９７〜１１１を構成する請求項１記載のペプチド。 ６．アミノ酸配列：ＬＫＴＬＰＰＧＬＬＴＰＴＰＫＬを有し、グリコカリシンの 了ミノ末端の残基１３６〜１５０を構成する請求項１記載のペプチド。 ７．アミノ酸配列：ＮＣＥＩＬＹＦＲＲＷＬＱＤＮＡを有し、グリコカリシンの アミノ末端の残基２１０〜２２４を構成する請求項１記載のペプチド。 ８．アミノ酸配列：ＱＤＮＡＥＮＶＹＶＷＫＱＧＶＤを有し、グリコカリシンの アミノ末端残基２２１〜２３５を構成する請求項１記載のペプチド。 ９．アミノ酸配列：ＳＮＶＡＳＶＱＣＤＮＳＤＫＦＰを有し、グリコカリシンの アミノ末端残基２４１〜２５５を構成する請求項１記載のペプチド。 １０．請求項１記載のペプチドのアミノ酸配列の配列サブセット又はその誘導体 を有し、血小板膜糖蛋白質１ｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現する糖蛋 白質１ｂに対するフォン・ウィルプランド因子の結合を阻害するペプチド。 １１．請求項１又は請求項１０記載のペプチドの誘導体であって、付加的なペプ チド配列を有する誘導体。 １２．血小板の活性化又は凝集及び／又は血小板の表面への接着を阻害する方法 てあって、前記活性化、凝集又は接着を阻害する効果的な量の請求項１、１０又 は１１記載のペプチドと前記血小板を接触させることを含む方法。 １３．患者の血栓症を阻害する方法であって、前記患者に、前記血栓症を阻害す る効果的な量で、請求項１、１０又は１１記載のペプチドを投与する方法。 １４．請求項１記載の２以上のペプチドを含む組成物。 １５．請求項１又は１１記載のペプチドの誘導体であって、エステル化、アセチ ル化又はグリコシル化形態である誘導体。 １６．血小板膜糖蛋白質１ｂ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現する糖蛋白 質１ｂに対するフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害するポリマーであって 、以下の多重ドメイン： ドメインＡ−ＧＰｆｂａの４５ｋＤａアミノ末端フラグメントのアミノ酸配列の サブセットを構成する、一連のアミノ酸、ドメインＢ−ＧＰＩｂαの４５ｋＤａ アミノ末端フラグメントのアミノ酸配列のサブセットを構成し、ドメインＡの一 連のアミノ酸と同一でも異なっていてもよい一連のアミノ酸、及びドメインＣ− ドメインＡとドメインＢとを結合するリンカー、を含むポリマー。 １７．ドメインＡとドメインＢとが同一である請求項１６記載のポリマー。 １８．ドメインＡとドメインＢとが異なる請求項１６記載のポリマー。 １９．前記リンカーが、モノマー又はポリマー基を含む請求項１６記載のポリマ ー。 ２０．前記リンカーが、アミノ酸の配列を含む請求項１９記載のポリマー。 ２１．前記ドメインＡが、ＱＶＤＧＴＬＰＶＬＧＴＬＤＬＳ又はＴＬＤＬＳＨＮ ＱＬＱＳＬＰＬＬを含み、ドメインＢがＳＤＫＦＰＶＹＫＹＰＧＫＧＣＰＴＬＧ ＤＥＧＤＴＤＬＹＤＹＹを食む請求項１６記載のポリマー。 ２２．前記ドメインＡがＱＶＤＧＴＬＰＶＬＧＴＬＤＬＳ又はＴＬＤＬＳＨＮＱ ＬＱＳＬＰＬＬのアミノ酸配列のサブセットを含み、前記ドメインＢがＳＤＫＦ ＰＶＹＫＹＰＧＫＧＣＰＴＬＧＤＥＧＤＴＤＬＹＤＹＹのアミノ酸配列のサブセ ットを含む請求項１６記載のポリマー。 ２３．血小板膜糖蛋白質１ｈ及び／又は巨核球系統細胞の表面に発現する糖蛋白 質Ｉｂに対するフォン・ウィルプランド因子の結合を阻害する合成ポリマーであ って、糖蛋白質１ｂα鎖の１以上のアミノ酸配列を含み、前記配列がその天然の コンフォメーションにおける前記１ｂα鎖の表面で又はその付近に通常位置し、 かつフォン・ウィルプランド因子と相互作用することができる合成ポリマー。 ２４．血小板の活性化又は凝集及び／又は血小板の表面への接着を阻害する方法 てあって、前記血小板を、前記活性化、凝集又は接着を阻害するのに有効な量の 、請求項１５記載の誘導体と接触させることを含む方法。 ２５．患者における血栓症を阻害する方法であって、前記患者に、血栓症を阻害 するのに効果的な量の、請求項１５記載の誘導体を投与することを含む方法。 ２６．血小板の活性化又は凝集及び／又は血小板の表面への接着を阻害する方法 であって、前記血小板を、前記活性化、凝集又は接着を阻害するのに有効な量の 、請求項１６記載のポリマーと接触させることを含む方法。 ２７．血小板の活性化又は凝集及び／又は血小板の表面への接着を胆害する方法 であって、前記血小板を、前記活性化、凝集又は接着を阻害するのに有効な量の 、請求項２３記載のポリマーと接触させることを含む方法。 ２８．患者における血栓症を阻害する方法であって、前記患者に、血栓症を阻害 するのに効果的な量の、請求項１６記載のポリマーを投与することを含む方法。 ２９．患者における血栓症を阻害する方法であって、前記患者に、血栓症を阻害 するのに効果的な量の、請求項２３記載のポリマーを投与することを含む方法。 ３０．血小板の活性化又は凝集及び／又は血小板の表面への接着を阻害する方法 であって、前記血小板を、糖蛋白質ＩｂαのＳｅｒ２５１〜Ｔｙｒ２７９フラグ メントと接触させることを含む方法。 ３１．患者における血栓症を阻害する方法であって、前記患者に、糖蛋白質［ｂ αのＳｅｒ２５１〜Ｔｙｒ２７９フラグメントと投与することを含む方法。 ３２．前ドメインＢが、【配列があります】、【配列があります】、【配列があ ります】、【配列があります】、【配列があります】及び【配列があります】か らなる群から選択されたペプチドを含む請求項１６記載のポリマー。 ３３．前記ドメインＡが、【配列があります】、【配列があります】、【配列が あります】及び【配列があります】からなる群から選択されるペプチドを含む請 求項１６記載のポリマー。 ３４．ｐＭＷ又はｐＭＷ２の同定特性を有するｐＣＤＭ８■■■ベースの発現プ ラスミド。 ３５．請求項３４記載のプラスミドで形質転換した宿主細胞。 ３６．血小板膜糖蛋白質Ｉｂに対するフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害 するポリマーをコードする組換えＤＮＡ発現プラスミド又はウィルス発現ベクタ ーであって、前記プラスミド又はベクターが、血小板膜糖蛋白質Ｉｂαのアミノ 末端領域の約Ｈｉｓ１から約Ａｌａ３０２までのアミノ酸配列をコードするヌク レオチド配列又はその１以上の配列サブセットを含むプラスミド又はベクター。 ３７．前記ヌクレオチド配列が、約Ｈｉｓ１から約Ｔｈｒ２９４までのアミノ酸 配列をコードする請求項３６記載のプラスミド又はベクター。 ３８．前記ヌクレオチド配列が、約ＧＬＹ２７１から約ＧＬＵ２６５までのアミ ノ酸配列をコードする請求項３６記載のプラスミド又はベクター。 ３９．前記ヌクレオチド配列が、また約Ｇｌｎ７１〜Ｓｅｒ８５のアミノ酸配列 をコードする請求項３８記載のプラスミド又はベクター。 ４０．前記ヌクレオチド配列が、約Ｓｅｒ２５１から約Ｔｙｒ２７９のアミノ酸 配列をコードする請求項３６記載のプラスミド又はベクター。 ４１．前記ヌクレオチド配列が、更にシグナルペプチドをコードする請求項３６ 記載のプラスミド又はベクター。 ４２．ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＭ８■■■、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡｌ■■■、ｐ ＭＡＭ、ｐＭＡＭ■■■又はＲｃ／ＣＭＹから由来する、請求項３６記載のプラ スミド。 ４３．請求項３６記載の発現プラスミド又はウィルス発現ベクターで形質転換し た哺乳類宿主細胞。 ４４．グリコカリシンの本質的に４５ｋＤａのトリプシン消化フラグメントを含 むポリペプチドを発現しかつ分泌することのできる、請求項４３記載の宿主細胞 。 ４５．グリコカリシンの４５ｋＤａトリプシン消化フラグメントの生物学的活性 を存ずるポリペプチドを産生させる方法であって、以下の工程：前記４５ｋＤａ フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現を、哺乳 類細胞において指示することのできる、安定で、染色体外の複製可能なプラスミ ド又はウィルス発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が更に、前記アミ ノ酸配列の一部として、前記４５ｋＤａフラグメントに対して本来のものではな くかつ前記４５ｋＤａフラグメントのカルボキシ末端に配位するアミノ酸をコー ドする、プラスミド又はベクターを提供し、前記哺乳類細胞を、前記プラスミド 又はベクターで形質転換し、前記形質転換哺乳類細胞を、前記ポリペプチドを発 現するような条件下で保持する、 ことを含む方法。 ４６．前記プラスミドがｐＭＷ１及びｐＭＷ２からなる群から選択される請求項 ４５記載の方法。 ４７．前記ヌクレオチド配列が、全Ｈｉｓ１−Ｌｅｕ■■■グリコカリシンＩｂ αポリペプチドをコードする請求項４５記載の方法。 ４８．更に、前記ポリペプチドを回収する工程を含む請求項４５記載の方法。 ４９．前記ヌクレオチド配列がまた、Ｇｌｎ７１〜Ｓｅｒ８５のアミノ酸配列を コードする請求項４０記載の発現プラスミド又はウィルス発現ベクター。 ５０．レトロウイルス又はバキュロウィルスに基づく請求項３６記載のウィルス 発現ベクター。 ５１．本質的に残基約Ｈｉｓ１から残基約Ａｌａ３０２のアミノ酸の配列又はそ の１以上の配列サブセットからなるグリコカリシンｌｂαのフラグメントをコー ドするＤＮＡ配列。 ５２．ポリペプチドの発現を指示することができかつ請求項５１のＤＮＡ配列の 上流に転写プロモーターを含む、発現プラスミド又はウィルス発現ベクター。 ５３．請求項５２記載の発現プラスミド又はウィルス発現ベクターであって、前 記糖蛋白輿ＩｂαをコードするＤＮＡ配列の上流にあって、適当な読枠でシグナ ルペプチドをコードする配列を含み、前記シグナル配列が、真核細胞からの分泌 を指示し又は促進することのできるプラスミド又はベクター。 ５４．請求項５２記載の発現プラスミド又はウィルス発現ベクターで形質転換し た組換え真核又は原核宿主細胞。 ５５．約残基Ｈｉｓ１から約残基Ａｌａ３０２のアミノ酸配列又はそのサブフラ グメントを含む成熟糖蛋白質Ｉｂαのフラグメントに対応するＤＮＡから、生物 学的に活性なポリペプチドを産生させる方法であって、以下の工程：（１）ＤＮ Ａ配列であって、その第１の領域が前記フラグメント又はサブフラグメントをコ ードし、その第２の領域がシグナルペプチドをコードし、前記第２の領域が前記 第１の領域の上流に位置しかつそれと適当な読枠となっている、ＤＮＡ配列を構 成し、 （２）前記ＤＮＡ配列を適当なプラスミド又はベクターに挿入して、発現プラス ミド又はウィルス発現ベクターを含む構成物であって、前記フラグメント又はサ ブフラグメントを真核細胞内で発現させかつそこから分泌させることを指示する ことができる構成物を創製し、（３）真核宿主細胞を前記発現プラスミド又はウ ィルス発現ベクターで形質転換し、そして （４）前記形質転換宿主細胞を、前記フラグメント又はサブフラグメントを該宿 主細胞内で発現させかつそこから分泌させるような条件下で保持し、前記条件が また、１以上のコンフォメーション依存性糖蛋白質Ｉｂα特異性抗体によって認 識される三次構造を有するフラグメント又はサブフラグメントを生成させる、 ことを含む方法。 ５６．前記フラグメント又はサブフラグメントのグリコシル化を行う請求項５５ 記載の方法。 ５７．糖蛋白質ＩｂαのＨｉｓ１−Ｔｈｒ２９４又はＨｉｓ１−Ａｌａ３０２フ ラグメント又はその１以上の配列サブセットから本質的になる生物学的に活性な ポリペプチドであって、組換えＤＮＡ分子のクローン化を利用する方法によって 産生されるポリペプチド。 ５８．血小板糖蛋白質Ｉｂαによって提供される三次構造のドメインを有する請 求項５７記載のポリペプチド。 ５９．前記フラグメント又はサブセットフラグメントが、糖蛋白質Ｉｂβ又はＩ Ｘの同時発現のなしに、生物学的に活性な構造に組み込まれる請求項５５記載の 方法。 ６０．前記宿主細胞が、分泌のためのプロセシングすべき蛋白質として、前記糖 蛋白質Ｉｂαフラグメント又はサブフラグメントを認識する請求項５５記載の方 法。 ６１．血小板へのフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害するのに有効な請求 項５７又は５８記載の１以上のポリペプチド構造及び薬学的に許容されるキャリ ヤーを含む治療組成物。 ６２．血小板の活性化及び／又は凝集を阻害する方法であって、前記血小板を、 効果的量の請求項６１記載の組成物と接触させることを含む方法。 ６３．血小板の表面への接着を阻害する方法であって、前記血小板を、効果的量 の請求項６１記載の組成物と接触させることを含む方法。 ６４．患者の血栓症を阻害する方法であって、前記患者に、効果的量の請求項６ １記載の組成物を投与することを含む方法。 ６５．糖蛋白質Ｉｂα又はその１以上の配列サブセットを含むポリペプチドに対 して特異性を有する抗体であって、動物を請求項５７又は５８記載のポリペプチ ドで免疫し、次いでそれから特定の抗体を分離する方法によって産生される抗体 。 ６６．全長ＧＰＩｂ（α）ポリペプチドＨｉｓ１−Ｌｅｕｓ１０又はそのフラグ メントを発現させる方法であって、以下の工程： （１）前記全長ポリペプチド又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を構 成し、 （２）前記ＤＮＡ配列を適当なプラスミド又はベクターに挿入して、発現プラス ミド又はウィルス発現ベクターを含む構成物であって、前記全長ポリペプチド又 はそのフラグメントの細胞内での発現を指示することのできる構成物を創製し、 （３）前記発現プラスミド又はウィルス発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、 そして （４）前記全長ポリペプチド又はそのフラグメントを発現する条件下で前記形質 転換宿主細胞を保持する、 ことを含む方法。 ６７．前記全長ポリペプチドＨｉｓ１−Ｌｅｕ■■■又はそのフラグメントが、 糖蛋白質Ｉｂβ又はＩＸの同時発現がなくても、発現する請求項６６記載の方法 。