JPH05503717A - アントラサイクリン―結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アントラサイクリン−結合体 本発明は、治療上有用なアントラサイクリンと、たとえばポリクローナルおよび モノクローナル抗体または天然もしくは合成の蛋白もしくはペプチドのようなキ ャリヤとの結合体、その製造方法、それを含有する医薬組成物、並びにある覆の 哺乳動物腫瘍を治療する際のその使用に関するものである。さらに本発明は、新 規なアントラサイクリン誘導体およびその製造に関するものである。

過去、永年にわたり多（の細胞毒性の高いアントラサイクリンが合成されている 。たとえば、糖部分のＣ−３′位置に結合したモルホリノ環またはモルホリノ置 換環を有するものは、実験上でのネズミ腫瘍に対し有望な抗腫瘍活性を示してい る［Ｂｉｏｔｃｔｉｖｅ　＊ｏｌ＠ｃｕｌｅＡ、５５−１０１．ｙｏｌ　６、編 集者１．Ｗ＋１１１１ｍ　Ｌｏｙａ。

Ｅｌｙ＋目ｅ＋　１９８８参照］。

本発明の範囲は、アントラサイクリン（たとえばモルホリノ誘導体）の高い能力 を利用してその治療効果を向上させると共にその毒性作用を減少させるべく、た とえばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体または蛋白もしくはペプチド のようなキャリヤまたは合成による他のキャリヤとのアントラサイクリン結合体 を提供することにある。

酸感受性アセタール結合の存在を特徴とする本発明の結合体は ［式中、部分Ａ−０−は少なくとも１個の第一もしくは第二ヒドロキシル基を有 する式Ａ−０−Ｈのアントラサイクリンの残基であり；ａは１〜３０の整数であ り；Ｗは式２：の残基であり、ここでＢは必要に応じペテロ中断されたＣＩ〜Ｃ ６アルキレン基を示し：ｍは０もしくは１であり；Ｃ１〜Ｃ６アルキレン基はた とえばメチレン、エチレン、エチリデンもしくはｎ−プロピレンのようなＣ，− Ｃ６アルキレン基とすることができ、アルキレン基を中断する異原子は酸素もし くは窒素とすることができ、好ましくはＢは−ＣＭ２−０−ＣＨ２＋、−ＣＨ− ＮＨ−ＣＨ−、−ＣＨ−、−Ｃ３Ｈ６−もしくは−Ｃ６Ｈ１２−を示し、Ｚはス ペーサ基であり、Ｔはキャリヤ部分である］ を有する。好適Ｚ基は次の通りである：（ｉ）−ＮＨ＝および−Ｔ−Ｚは少なく とも１個の遊離アミノ基を有する式Ｔ−ＮＨ２のキャリヤの残基を示すか、また は（ｉｉ）　−ＮＨ−［Ｄコ、−Ｎ＝ＣＨ−（ここでｄは０〜２の整数であり、 ［Ｄ］は−ＮＦ（−Ｃｏ　（ＣＨ２）、Ｃ０−ＮＨ−（ｎは２もしくは４である ）を示す）およびＴ−Ｚは少なくとも１個のホルミル基を有する式Ｔ−ＣＨＯの キャリヤの残基か［式中、［Ｄコおよびａは上記の意味を有する］αピペラジニ ルカルボニル部分もしくは基およびＴ−Ｚは弐Ｔ−［Ｃ０ＯＨ］　（ここでａは 上記の意味を有する）のキャリヤの残基からなる。

上記式１において、アントラサイクリングリコシドＡ−０−Ｈは好ましくは式３ ・ の化合物から誘導される。式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシもしくはメトキン 基であり： （ＪＩＲ２はヒドロキシ基であり、Ｒ４およびＲ５の一方は水素原子でありかつ ＲおよびＲ５の他方はヒドロキシ基、或いはＲは沃素原子でありかつＲ５は水素 原子、或いはＲ４とＲ５との両者は水素原子であるか、または（ｂ）　Ｒは水素 原子であり、Ｒ４およびＲ５の一方はヒドロキシ基を示しかっＲおよびＲ５の他 方は水素原子であり：さらにＲ３はアミノ基であるか或いは窒素原子がＣ−３′ に結合したモルホリノ（ＭＯ）または３−シアノ−４−モルホリノ（ＣＭ）もし くは２−メトキシ−４モルホリノ（ＭＭ）環に含まれる窒素原子を示す： アントラサイクリンは、アントラサイクリン化合物のＣ−１４もしくはＣ−４′ 　−位置にてヒドロキシル基を介しキャリヤに結合することができる。１具体例 において、位置Ｃ−１４（式３′）にてアントラサイクリンに結合したキャリヤ は部分Ａ−［式中、Ｒ１およびＲ２は上記の意味を育し、Ｒ４およびＲ５の一方 は水素原子でありかつＲ４およびＲ，の他方はヒドロキシ基であり、或いはＲは 水素もしくは沃素原子であり、Ｒ５は水素原子である］。

他の具５体例において、Ｃ−４’（式３″）にてヒドロキシ基を介しアントラサ イクリンに結合したキャリヤは部分Ａ−０−［式中、ＲおよびＲ２は上記の意味 を有する］典型的には、キャリヤは腫瘍関連抗原に結合しうるポリクローナル抗 体もしくは抗原結合部位を含むその断片：腫、癌細胞集団で優先的もしくは選択 的に発現される抗原に結合しうるモノクローナル抗体もしくは抗原結合部位を含 むその断片；腫瘍細胞に優先的もしくは選択的に結合しうるペプチドもしくは蛋 白：および高分子キャリヤから選択される。

したがって好ましくは、結合体のキャリヤ部分子−ＮＨ２もしくはＴ−［Ｃ０Ｏ Ｈ］　は腫瘍関連抗原に対し発生したポリクローナル抗体から；或いは腫瘍細胞 集団で優先的もしくは選択的に発現された抗原に結合するモノクローナル抗体か ら；または腫瘍細胞に優先的もしくは選択的に結合する天然もしくは組換ペプチ ドもしくは蛋白、または成長因子から：或いはたとえばポリリジン、ポリグルタ ミン酸、ポリアスパラギン酸、並びにその同族体および誘導体、またはたとえば デキスタランもしくは他の高分子炭水化物同族体およびその誘導体のような天然 もしくは合成の高分子キャリヤから：またはたとえばＮ−（２−ヒドロキシプロ ピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）から誘導されるような合成共重合体ｊ１． 　Ｋｏｐｅｃｒｋ、　Ｍｘｅ＋ｏｍｏｌｅｅｏｌ！＋。

Ｈ，Ｂｅａｏｉｔ　＆　Ｐ、Ｒ＋ｗｐｐ、編：　５０５−５２０（１９８２）Ｐ ｅｒＨｍｏｎ　Ｐｒｅ＋５Ｏｘｆｏｒｄ、　ＥＢｌｘｎｄ　、参照］から：また は肺組織につき標的ドラッグキャリヤとして有用であるポリ（ＧｉｕＮｘ、　Ａ ｌ１．　ＴＹｒ）のようなポリ　（アミノ酸）共重合体［Ｒ，Ｄｕｎ＋＋ｎ等、 １００ＴＩＩＩＩ　ｏｒＢｉｏｘｃｔｉｖ＋＊ｎｄ　Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　Ｐ ｏ［７！Ａｅ＋１．Ｖｏｌ　４，１ｕｌｌ　ｊ９１１９参照］から誘導される。

さらに、キャリヤ部分は上記キャリヤの１部、たとえば抗体のＦａｂまたはＦ（ ａｂ’）２断片または組換ＤＮＡ技術により得られる上記ペプチドもしくは蛋白 の部分から誘導することもできる。

上記抗体および可能な各治療用途の代表例は次の通りである：抗Ｔ−細胞抗体Ｔ 　１０１　ＣＲｏｙ＋ｔｏｎ、　Ｉ等、１．ｌ！ｌ１ｍｕａｏ１．１９Ｂ０．　 １２５　。

７２５　］　； 抗ＣＤ５抗体０ＫＴ１（オルト）　ＡＴＣＣＣＲＬ　８０００（慢性リンパ球白 血病）： 抗トランスフエリンリセプタ抗体○ＫＴ、（オルト）ＡＴＣＣＣＲＬ　８０２１ 　（卵巣腫瘍など）。

抗黒色腫抗体　ＭＡｂ　９．２．２７　［Ｂｏｉｏ！、Ｔ、Ｆ等、Ｐ＋ｏｃ、Ｌ ｔｌＡｃｓｄ、Ｓｃｉ、［ＩＳＡ　１９８２　、７９．１２４５］　（黒色腫） ；抗癌マーカー抗体、たとえば 抗−ＣＥＡｌｌ１６　Ｎ５−３ｄ　ＡＲＣＣＣＲＬ　８０１９、抗α−胎児蛋白 ＯＭ　３−１．Ｉ　ＡＴＣＣＨＢ　１３４（さらに肝癌）、 ７９１Ｔ／３６　ＣＥｍｂｌ＋ｔｏｎ、１１．Ｉ　等、Ｂｒ、１．Ｃｘｎｃｓ＋ 　１９８１．４３．５Ｈ］（同じく骨肉腫）、 ８７２、３　［０，Ｓ、　？ｔ、　Ｎｏ、　４．５２２．９１８１１９８５）コ 　（結腸癌および他の引１　： 抗卵巣癌抗体ＯＶＢ　３　ＡＴＣＣＨＢ　９１４７　；抗乳癌抗体（ＨＭ　Ｇ　 Ｆ抗原） ［Ａｂｏａｄ−Ｐｉ＋ａｋ、　Ｅ等、ＣｔＩＩｃｅｔ　Ｒｅ＋、１９８８　、４ ８．３１８８］　；抗膀胱岩ＩＧ３．１０　ＣＹＯ，Ｄ、　Ｓ、等、Ｅａｒ、Ｉ σ＋ａ１．１９８？、１３．１９８　］。

上記成長因子および天然もしくは組換体の蛋白の代表例はＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤ ＧＦ、ＴＧＦ−α、α−Ｍ　Ｓ　、インターロイキン、インターフエロン、ＴＮ Ｆ、メラノトロピン（ＭＳＨ）などである。好ましくはキャリヤＴ−ＣＨＯは、 炭水化物部分を有し、Ｆｃ領域に優先的に位置し、米国特許第４、６７１．９５ ８号（１９８７年６月９日）に記載されたように化学的もしくは酵素的方法によ りアルデヒド基まで選択的に酸化されるポリクローナルもしくはモノクローナル 抗体から誘導される。

さらに、キャリヤＴ−ＣＨＯは適する高分子キャリヤのホルミル化からまたはそ の酸化から、或いは適する糖蛋白の炭水化物残基をアルデヒド基まで酸化して誘 導することもできる。

さらに本発明は式１の化合物の製造方法をも提供し、この方法は ［式中、Ａ１−０−は少なくとも一個の第一、もしくは東二ヒドロキシル基を有 ると共にモルホリノ誘導体により保護もしくは置換された糖部分の７ミノ基を有 するアントラサイクリンの残基であり、Ｗは上記の意味を有する］の誘導体を式 ５ ［式中、Ａ’−０−およびＷは上記の意味を有し、Ｌはアミド結合（たとえばＮ −オキソスクシンイミド、Ｎ−オキシスルホスクシンイミドまたは２．４−ジニ トロフニノキシもしくは２゜３．４．５．６−ペンタフルオロフェノキシまたは ｔ−ブトキシカルボニルオキシ）を形成する活性化基を示す］の活性化誘導体ま で変換させ； （ｂ）（ｉｌ上記式５の得られた化合物を上記の式Ｔ−ｉＮＨ２の化合物と縮合 させるか、または （１１）式５の活性化化合物を弐ＮＨ−ＣＤ］　、−ＮＨ２の誘導体、たとえば ヒドラジン（ｄ＝ｏ）もしくはコハク酸（ｄ−１かつｎ＝２）またはアジピン酸 （ｄ−１かつｎ＝４）ジヒドラジドとしてと反応させ、必要に応じ得られた式６ ：［式中、Ａ’−０−１Ｗ、ｄおよび［Ｄ］は上記の意味を有するコの誘導体を 保護解除すると共に、これを上記式Ｔ−ＣＨＯもしくはＴ−１：ｃＯＯＨ］　の 化合物と縮合させるか、または（ｉｉｉ）式５の化合物を１，４−ピペラジンと 反応させ、かつ得られた式７： Ｃ式中、Ａ’−病ｐＯ−およびＷは上記の意味を有する］の化合物を必要に応じ 縮合剤の存在下に上記式Ｔ　［Ｃ０ＯＨ］　の化合物と縮合させて式１の結合体 を生成させ、ここで必要に応じ存在する未反応の活性化カルボニル基は医薬上許 容しつるアミンにより反応終了させうることを特徴とする。

たとえば、本発明による方法の工程（りにて式４の誘導体から式５のＮ−オキシ スクンニミジル誘導体まで変換する活性化法は、たとえば酢酸エチルもしくはＮ 、Ｎ−ジメチルホルミアミドのような溶剤中でのＮ、Ｎ′−ジシクロへキシルカ ルボジイミドの存在下における式４の誘導体とＮ−ヒドロキシスクシンイミドま たはその水溶性３−置換ナトリウムスルホン酸塩との反応である。この場合、式 ５においてＬは残基：［式中、Ｒは水素原子またはナトリウムスルフェート基を 示轟 す〕 を示す。

上記式５の誘導体および式Ｔ−ＮＨ２のキャリヤから出発して式１の結合体を製 造する縮合法は、アミド型の共有結合を形成しつると共にキャリヤの構造に適合 した条件で行なわれる。

好適条件はｐＨ７〜９．５の緩衝水溶液の使用、４〜３７℃の温度、数時間〜数 日間であり得る。

たとえば式５の化合物と抗体Ｔ−ＮＨ２との間の縮合（ｂ）［ｉｌの条件は次の 通りである。１■／ｄのモノクローナル抗体を含有するｐＨ８の０１Ｍ燐酸ナト リウム水溶液と０．１Ｍの塩化ナトリウム水溶液とを３０倍モル過剰のＮ、Ｎ− ジメチルホルムアミド中化合物６の１０％ｗ　／　ｖ溶液で２０℃にて２４時間 処理する。

この結合体をセファデックスＧ−２５カラム［Ｐｈｓ＋ｍｓ＋ｉ＊　ＦｉｎｓＣ ｈ＋＋ｌ１ｃ１１．　Ｐｉ＋ｃ＊ｌ＊ｖｚ７、Ｎ、Ｉ］でのゲル濾過により精製 し、ＰＢＳ　（燐腋塩緩衝塩水）で溶出させる。

上記誘導体６を式Ｔ−ＣＨＯのキャリヤと縮合させる式１の結合体の製造方法は 、ヒドラゾン型の共有結合を形成しうると共にキャリヤの構造に対し適合しうる 条件で行なわれる。好適条件はｐＨ４〜７３の緩衝水溶液の使用、４〜３７℃の 温度１数時間〜数日間であり得る。

式６の化合物と抗体Ｔ−ＣＨＯとの間の力・ツブリングｊｂ）ｊｉｉ）に関する 条件は次の通りである。１■／ｄのモノクローナル抗体を含有するｐＨ６の　０ ．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液とを３０倍モル過 剰の同じ緩衝液中５％ｙ　／　ｖ溶液で２０℃にて２４時間処理する。この結合 体をゲル濾過により上記したように精製する。

上記誘導体６もしくは７と式Ｔ　［Ｃ０ＯＨ］　、のキャーツヤとを縮合させる ことによる式１の結合体の製造方法（よ、アミド型の共有結合を形式しつると共 にキャリヤの構造↓二対し適合しやる条件で行なわれる。

好適条件はｐＨ７〜９５の緩衝水溶液の使用と４〜３７”Ｃの温度と数時間〜数 日間の時間とであり得る。他の条件番よ室Ｉｉζこおける１〜３時間の乾燥ジメ チルホルムアミドもしく（ヨシメチルスルホキシドの使用である。弐６もしくは ７の化合物と弐Ｔ［ｃｏ−Ｅ］。

（式中、Ｅはたとえばｐ−ニトロフェニルのような適する活性化用カルボニル基 を示す）の活性化されたキャリヤとの間に関する好適条件は、５〜５０■／ｆｆ １１！の化合物６もしくは７を当量の化合物ＴＣＣ○−Ｅ］　で１〜２４時間に わたり室温で処理して含有する、たとえばジメチルホルムアミドのような乾燥極 性溶剤である。ここで、時間としての「数時間〜数日間」は４時間〜５時間であ ってよい。

一般式４，５．６および７の誘導体およびその製造も新規であり、本発明の範囲 内である。化合物４，５．６および７は有用な中間体であると共に治療上活性な 抗腫瘍剤でもある。式４の誘導体は、 （り必要に応じ保護された上記式Ａ−０−Ｈを有するアントラサイクリン（ただ しアントラサイクリンＡ−０−Ｈにおける糖部分のアミノ基は保護アミノ基の形 態である）を式８：［式中、Ｂおよびｍは上記の意味を有し、Ｒは保護基である コ！ のジヒドロピランカルボキシル誘導体と縮合させ：＜ｂ＋得られた中間体から各 保護基を除去することにより式［式中、Ｗは上記の意味を宵し、ただしアントラ サイクリン残基Ａ−０−における糖部分のアミノ基は遊離アミノ基の形態である ］ の誘導体を生成させ： （Ｃ）（ｉ）式４′のアントラサイクリンにおける糖部分の遊離アミノ基をモル ホリノ誘導体まで変換させるか、または（！ｌ）式４′の前記アントラサイクリ ンにおける前記遊離アミノ基を保護する ことからなる方法により製造される。

式４′の中間誘導体およびその製造も新規であり、本発明の一部を構成する。こ れら誘導体は有用な中間体でありかつ／または治療上活性な抗腫瘍剤である。適 切に保護された一般式Ａ−０−Ｈのアントラサイクリンから上記一般式４の誘導 体への変換は、上記式８の化合物での処理により行なうことができる。

さらに本発明は式４′の誘導体の製造方法をも提供し、この方法は （り必要に応じ保護された上記式Ａ−０−Ｈのアントラサイクリン（ただしアン トラサイクリンＡ−〇−Ｈにおける糖部分のアミノ基は保護アミノ基の形態であ る）を上記式８のジヒドロビランカルボキシル誘導体と縮合させ：（ｂ）得られ た中間体から各保護基を除去することからなっている。

典型的には保護されたアントラサイクリンＡ−０−Ｈと化合物８との反応を行な うのに好適な条件は、触媒としてｐ−トルエンスルホン酸のようなスルホン酸を たとえば塩化メチレンのような無水非極性溶剤にて室温で数時間〜１日間の時間 にわたり使用し、次いで緩やかにアルカリ処理して保護基を除去することを包含 する。

誘導体８はエナンチオマ混合物である。しかしながら、酸触媒で行なわれるアン トラサイクリンのヒドロキシル基とのエーテル化反応はＸおよびｙで示される２ 種のみのジアステレオマを与え、これはアセタールＣ−２′位置および−（Ｂ） 、−Ｃ（０）　ＯＲ基を有する他の位置の両者に環未確認配置（ＲもしくはＳ） を有する。

式Ａ−０−Ｗ−ＯＲの得られた化合物は上記したように加！ 水分解および保護解除によって式４の化合物まで変換される。

式８の出発化合物の規程かは新規であり、本発明の範囲内である。

式８の好ａ誘導体は次の化合物を包含する：（８Ａ）２−エトキンカルボニル− ３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン［ｍ＝Ｑ、Ｒ−ＣＨ１］、 ！　２コ （８Ｂ）２−　（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ビラン−２−イル）メチルオキシ酢 酸エチル ＣＢ　＝　ＣＨＯＣＨ、ｍ　＝　Ｌ　、Ｒ＝　Ｃ２Ｈ＝　コ　、（８Ｃ）２−　 （３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ビラン−２−イル）メチルオキシ酢酸メチル ［Ｂ　ＣＨＯＣＨ、ｍ　＝　１　、　Ｒ＝　ＣＨ３コ　、（８Ｄ）２−　（３， ４−ヒドロ−２Ｈ−ビラン−２−イル）メチルチオ酢酸エチル Ｌ　Ｂ　＝　ＣＨＳ　−ＣＨ、ｍ　＝　１　、　Ｒ＝　Ｃ２Ｈｓ　コ　、２　２ 　！ （８Ｅ）２−　（３’、４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ 酢酸エチル ［Ｂ　＝　ＣＨ−ＮＨＣＨ、ｍ＝　１．　Ｒ＝　Ｃ２Ｈ５］。

２　２　Ｉ 一般式８の化合物は幾つかの方法で製造Ｔることができる０たとえば、これは入 手しうる式Ｈの　３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボン酸ナトリウム 塩［ＣＡ　Ｓ　１６６９８−５２−５　］から或いは弐Ｍの対応のメタノール誘 導体ＣＣＡ　Ｓ　３７４９ｉ６−８］から出発して容易に製造することができる ：より詳細には、化合物８Ａは化合物Ｈをたとえばジメチルホルムアミドのよう な無水極性溶剤中で文献［“Ｍ＆ｃｒｏ鳳ｏ１ｅｃａｌｃ＋“Ｖｏｌ　１２．Ｎ ｏ　１．９５−９．Ｉａｌｌ−Ｆｅｂ　１９７９　］に記載されたように沃化エ チルと反応させて製造される。メチルオキシアセテート８ＢはアルコールＭを乾 燥ジメチルホルムアミド中で１００℃にて２当量の水酸化ナトリウムもしくはカ リウムの存在下にクロル酢酸と反応させ、次いで混合物を冷却すると共に沃化エ チルで処理して製造することができる。

弐８Ｃ−Ｈの化合物は、弐Ｍのスルホン酸エステルを沃化すトリウムで置換して 製造された式Ｍのヨード誘導体と３−ヨードプロピオン酸エチル、４−ヨードブ タン酸エチルもしくは７−ヨードへブタン酸エチルとのヴエルツ縮合によって製 造することができる。メチルアミノアセテート８Ｆは、アルコールＭのスルホン 酸エステルを乾燥トルエン中で６時間にわたりエチルグリシンと共に還流させて 製造される。

本発明に使用するための式３の出発アントラサイクリンは位置Ｃ−４′　もしく はＣ−１１に遊離ヒドロキシル基を有するものを含有する。たとえば次の通りで ある：ダウノルビシン（３ａ：Ｒ＝ＯＣＨ３，Ｒ２＝Ｒ５＝Ｈ。

Ｒ−ＮＨ２，Ｒ４＝ＯＨ）。

４−デメトキシダウノルビシン（３ｂ　：Ｒ，＝Ｒ２＝Ｒ５＝Ｈ。

Ｒ＝ＮＨ２，Ｒ４＝Ｏ）り。

４′　−二ビダウノルビンン（３ｃ：Ｒ＝ＯＣＨ３，Ｒ２＝−Ｌ Ｒ＝Ｈ，Ｒ３＝ＮＨ２，Ｒ５＝ＯＨ）。

４’　−Ｆ＊＋ンド−１−ソ／ｌ、ビシン（３ｄ　：　Ｒ＝ＯＣＨ３，Ｒ２＝Ｏ Ｈ，Ｒ＝Ｒ＝Ｈ，Ｒ＝ＮＨ２）。

４′　−デオキシ−４′−イオドドキソルビンン（３ｅ　：　Ｒ１＝ＯＣＨ、Ｒ ＝ＯＨ，Ｒ−＝Ｈ，Ｒ＝Ｊ、Ｒ３冨ＮＨ２）。

さらに第二および第一ヒドロキシ基の両者を有するもの、たとえば次の通りであ る： ドキソルビシン（３ｆ　：　Ｒ＝ＯＣＨ、Ｒ２＝Ｒ４＝ＯＨ。

＝１３ Ｒ−＝　Ｈ、Ｒ＝　Ｎ　Ｈ２）　。

コ３ ４′　−エピドキソルビシン（主ｇ：Ｒ１＝ｏＣＨ３，Ｒ２＝Ｒ，＝ＯＨ，Ｒ＝ Ｈ，Ｒ３＝ＮＨ２）（Ｃｆｉらは全ｒ上記特許公報に開示してされているＣＦ、 Ａ：ｅｓｍｏｎｅ　ｒＤＯＸＯＲ［ＩＢｌｃ、ＩＮ　ＪＭ＋ａｉｃｉｎ＋ｌ　Ｃ ｈ＋ｍｉ＋＋！７　ｖｏｌ　１７．Ｎｏｖ　Ｔｏ＋に、Ｎ、Ｙ、１９８１参照コ 　。

たとえば、最初からヒドロキシル基を有するアントラサイクリン、たとえば化合 物３ａ−ｅにより代表される化合物はそのＮ　−トリフルオロアセチル同族体ま で変換され、次いで上記したように一般式８のジヒドロビランカルボン酸エステ ル誘導体と反応させて化合物４　（ａ−ｅ）　（Ａ−Ｚ）　にこで（ａ−ｅ）は 式３’　（ａ−ｅ）および３’　（ｄ）のアントラサイクリンの残基を示し、（ Ａ−Ｚ）は式８の化合物をアントラサイクリンのＣ−４′　もしくはＣ−１４位 置にてヒドロキシル基に縮合させて誘導された一般式２の残基を示す］ を与える。

Ｃ−４′およびＣ−ｔｔの両位置にヒドロキシル基を有するアントラサイクン、 たとえば化合物３　（ｆ、ｇ）により代表されるものは、Ｃ−１４位置のヒドロ キシル基にてＣ−４′の他のヒドロキシル基を一次的に保護した後に式８の化合 物と選択的に縮合させて４　（ｆ、ｇ）（Ａ−Ｚ）および４’　（ｆ、ｇ）（Ａ −Ｚ）口式中、（ｆ、ｇ）は式３’　（ｆ、ｇ）（Ｃ−！４におけるピラニル化 ）または３’　（ｆ、ｇ）（Ｃ−４’　におけるピラニル化）のアントラサイク リンの残基を示し、（Ａ−Ｚ）は上記と同じ意味を有する］として示されるよう な一般式４および４′の誘導体を与える。

残基−０−ＷがＣ−１４ヒドロキシ位置で結合した上記の誘導体４および４′は 、式８の化合物を上記と同じ条件で一般式９：〔式中、Ｒは上記と同じ意味を有 し、Ｒ４およびＲ５の一方はアセトキン基であり、ＲおよびＲ５の他方は水素原 子であるコ の保護されたＣ−４′　ヒドロキシル基を有するアセドラサイクリン誘導体と反 応させて製造される。

たとえば、一般式３（Ｒ＝ＮＨＣｏＣＦ３）、たとえば３（ｆ、ｇ）のＮ−トリ フルオロアセチル誘導体は先ず最初にオルト蟻酸トリエチルとの反応に際しＣ− ９およびＣ−１４位置が９．１４−エチルオルトホルメートとして、文献［Ｈ， Ｕｍｓ！ｘｖｘ等、１、Ａｎｔｉｂ、ｙｏｌ　０ＸＩ１１１１ｏ、１２．１５８ １　ｆ１９８０）］　１．：Ｅ載された手順にしたがい保護され、次いで無水酢 酸とピリジンとを用いてフェノール基とＣ−４′　ヒドロキシル基とでアシル化 され、その後に塩酸水溶液によりＣ−１４ヒドロキシル位置が保護解除されて式 ９の６．　１１．　４’　−トリー〇−アセチルーＮ−トリフルオロアセチルド キソルビンン誘導体を生成させ、これを上記と同じ条件下に式８の化合物と縮合 させて、メタノール中でのモルホリンによるフェノール基の保護解除およびメタ ノール中でのナトリウムメチラートによるＣ−４′におけるヒドロキシル基の保 護解除の後に化合物ＩＧを得る。最後に、０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液によ る化合物１．０の処理は、誘導体４′を与える。この方法を反応式Ｉに示す。

Ｓｃｈｅｍｅ　Ｘ 他面において本発明は、上記特許公報に記載された標準法にしたがい上記のよう に合成されたＣ−４′　もしくはＣ−１４が置換されている一般式４　’　（Ｒ ＝　？’ｌ　Ｈ２）の誘導体からの、−般式４　（ＭＯ）　、４　（ＣＭ）およ び４（ＭＭ）のモルホリノ（ＭＯ）並びにモルホリノ誘導体（ＣＭ）および（Ｍ Ｍ）の製造方法をも提供する。

より詳細には、４−モルホリノ４　（ａ−ｇ）　（Ａ−Ｚ）（ＭＯ）および３− シアノ−４−モルホリノ４（ａ−ｇ）（Ａ−Ｚ）（ＣＭ）化合物の製造は文献［ Ｅ、　Ｍ、　Ａｃ＋ｏｎ等、１．ＬｄＣｂｓｍ、　１９８４．２７６３８］　に 記載された手順にしたがう。２−メトキシ−４−モルホリノ誘導体４　（ａ−ｇ ）（Ａ−Ｚ）（ＭＭ）は１９８７年６月９日付は米国特許策４．６７２．０５７ 号に記載された方法にしたがって製造される。式４’　（ａ−ｇ）（Ａ−Ｚ）の 化合物における残基−Ｗは上記モルホリノ誘導体の製造を阻害しないことは強調 すべきである。

モルホリノ誘導体（ＭＯ）の製造方法によれば、水に溶解された化合物４’　（ ａ−ｇ）（Ａ−Ｚ）を先ず最初に２−オキシエチルージアルデヒド（＋１）　： と反応させ、次いでシアノ硼水素化ナトリウムと反応させてモルホリノ誘導体を 得る。

たとえばシアン化ナトリウムを添加してシアノ硼水素化物での還元の反応条件を 変化させることにより、シアノモルホリノ誘導体（ＣＮ）が回収される。

２−メトキシ−４−モルホリノ誘導体（Ｍ　Ｍ　）の製造は、水中に溶解された 化合物４’　（ａ−ｇ）（Ａ−Ｚ）を１−メトキシ−２，２′−オキシジアセト アルデヒド（＋２）　：で処理し、次いでシアノ硼水素化ナトリウムで処理して 行なわれる。

本発明の式１の結合体は、ヒドロニウムイオン触媒による加水分解または「イン ビボ」での酵素切断に際し親ドラグＡ−０−Ｈを放出するアセタール結合を有し ているので、宵月な治療剤となる。

悪性腫瘍においては正常組織と対比して高い糖分解速度が生ずることは周知であ る。これはラクテート生成の増大、したがって腫瘍におけるｐＨの低下をもたら すＣＨ９Ｍ、　Ｒｔｏｓａ等、２゜Ｎｘｌ＋ｕｌｏｒ＋ｅｈ、Ｔ！ｉｌ　Ｂ、２ ３ｒ１９６８０１６１参照］。さらに式４．４’。

６および７の化合物は履瘍組成内に細胞毒性のアントラサイクリンを放出しつる 。

本発明は化合物の作用に２種の特異性を与える。蔦１の特異性は抗原認識による 腫瘍組織における結合体の優先的な局在化であり、第２の特異性は優先的酸切断 による、活性型薬剤の腫瘍組織に対する優先的放出である。

上記方法により製造される結合体は次の種々異なる化学−物理的方法によって特 徴付けられる。

初期分子量の保持および凝集体形成の欠如は、クロマトグラフゲル濾過法［Ｙａ 、　Ｄ、　Ｓ　等、１σ＋ｏ１．旦０　、、．４１５．１９０コと、それと同時 的および独立した、種々異なる波長でのアントラサイクリンおよび抗体の検出と によって、またゲル電気泳動法によって評価される。

得られる化合物の全体的な電菊分布は、クロマトグラフィオン交換法によって評 価される。

アントラサイクリン濃度は、親アントラサイクリンから得られる標準検量曲線に 対する分光光度測定によって評価される。

蛋白濃度は、たとえばビンンコン酸分析［５ｗ１ｔｈ、　Ｐ、　Ｋ等、Ａ＋＋Ｊ １．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５（１、７６，１９８５］　またはブラッドフォード染 料分析［Ｂ＋１ｄｌｏ＋ｄ、　ｉｆ、　）１．　、＾ｎｚ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　７２．２４Ｌ１９７６］のような比色分析によって評価される。

結合工程の後における抗体の抗原結合活性の保持は、Ｅ・ＬＩＳＡ法［Ｙｏ、　 ［１，Ｓ　等、１．［Ｉ＋ｏ１．１４０　、４１５．１９８８コおよび細胞蛍光 分析法［Ｇｚｌｌｅｇｏ、Ｉ等、１１．１．ｃｔｎｃｃｒ３３．７３７．１９８ ４コによって評価される。

親薬物と対比した結合体の細胞毒性保持の評価は、最大細胞毒性作用を示すのに 充分長い培養時間の後に標的細胞にょるＨ−チミジン吸収の阻止試験によって評 価される［Ｄｉｌｌｍａｎｎ。

ＲＯｏ　等、　Ｃ■ｃｅｔ　Ｒ＋ｓ、　４ｇ、４０９７．　１９８８　コ　。

抗原陰性細胞ラインと対比した抗原陽性に対する結合体の選択的細胞毒性の評価 は、短い培養時間後の、「抗原陽性」対「抗原陰性」の細胞ラインによるＨ３− チミジン吸収の阻止試験により評価される［　Ｄｉ　ｌ　１ｍｔａＩｌ、　Ｒ， Ｏ，等、Ｃｚｆｉ＋ｅｒ　Ｒｅｓ、　１８゜６０９６．１９８８　］　。

結合体の酸感受性は、適する緩衝溶液における化合物の培養後に上記クロマトグ ラフ法によって評価される。

或いは、抗体部分（１２５ｒ）および／またはアントラサイクリン部分（’Ｃ） における結合体の放射能標識、およびＨＰＬＣ分析法が血漿中での安定性の評価 に用いられる。

化合物の治療効果および親薬物と比較したその治療効果の改善は、ヒト移植腫瘍 の動物モデルで評価される。ヒト腫瘍の異種移植片を有するヌードマウスを適す る均等な投与量の結合体、遊離薬物、抗体、または薬物と抗体との物理的混合物 にて処理し、腫瘍成長を記録すると共に異なる処理群で比較する。

免疫グロブリン結合体は医薬上許容しうるキャリヤもしくは希釈剤との医薬組成 物として処方される。任意の適するキャリヤもしくは稀釈剤を使用することがで き、適するキャリヤもしくは稀釈剤は生理学的塩水溶液およびリンガ−氏デキス トロース溶液等である。

本発明の結合体は抗腫瘍剤として宵月である。したがって哺乳動物（たとえば人 間または動物）を、これに医薬上有効量の上記式１の結合体を投与する方法で処 理することができる。人間または動物の症状をこの方法で軽減または改善するこ とができる。

発明の詳細 珪藻上板メルクＦ２５４を用いてＴＬＣクロマトグラフィーを行ない、その際、 次の溶出系（Ｖ＃）を用いた：系Ａ：塩化メチレン　メタノール（９８：２）、 系Ｂ、塩化メチレン　メタノール：酢酸　水（８０：　２０：　７　：３）、 系Ｃ：塩化メチレン：メタノール（９５：５）、系Ｄ　塩化メチレン：アセトン （４・１）、系Ｅ　塩化メチレン　メタノール：酢酸（８０：２０＋１）、系Ｆ 、塩化メチレン：アセトン（９：　１）、系Ｇ、塩化メチレン：アセトン（９５ ：５）、系Ｈ：塩化メチレン：メタノール（９０：　［０）。

本発明を添付図面によりさらに説明する：第１図は、本発明による抗トランスフ エリンリセブタ免疫結合体１３のヒト黒色腫細胞ライン（ラインＸ−−−Ｘ−− −Ｘ＞および親抗−ヒトトランスフニリンリセブタ抗体０ＫＴ９のヒト黒色腫細 胞ライン（ライン◇−−−◇−−−◇）に対する結合を評価すべ（以下の実施例 ３０に記載したＥＬｒＳＡの結果を示すグラフである。このグラフにおいては、 ４９ｓｆｉ■における吸光度（ｙ軸）を抗体濃１ｆ（ｎｇ／ｄ）に対してプロッ トした。

４７４２図は、本発明の抗−トランスフエリンリセブタ免疫結合１３　（ライン Ｘ−−−Ｘ−−−Ｘ）　、無関係な比較対照結合体ラインローーーローーーロ） および親遊離アントラサイクリン薬物（ライン◇−−−◇−−−◇）の選択的細 胞毒性に関する以下の実施例３Ｉに記載した評価の結果を示すグラフである。こ のグラフにおいて、比較対照の％としての（３Ｈ）チミジン組込み（７輪）をア ントラサイクリン濃度ｎＭ（ｘ紬）に対して合体１３の細胞毒性の阻止に関する 以下の実施例３２に記載した評価の結果を示すグラフである。ラインＸ−−−Ｘ −−−Ｘ＝免疫結合体１３＋０ＫＴ９抗体であり、ライン◇−−−◇−−−◇− 免疫結合体１３である。比較対照の％としての（３Ｈ）チミジン組込み（ｙ紬） をアントラサイクリン濃度ｎＭに対し結合抗体ＤＫＴ９による、抗トランスフエ リンリセブタ免疫結合１３の細胞毒性に関する投与量反応阻止状況を示す。この グラフにおいて、比較対照の％としての（３Ｈ）チミジン組込み（ｙＭ）を遊離 抗体過剰量（Ｘ紬）に対してプロットした。

１［５図は、ＦＧＦ結合体１７　（ラインＸ−−−Ｘ−−−）、無関係な免疫結 合体１４　（ラインロー−一ローーーロ）および遊離アントラサイクリン（ライ ン◇−−−◇−−−◇）の選択的結合毒性に関する以下の実施例３４に記載した 評価の結果を示す。このグラフにおいては、比較対照の％としての（３Ｈ）チミ ジン組込み（７輪）をアントラサイクリン濃度ｎＭ（ｘ紬）に対してプロットし た。

以下、実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ ２−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ビラン−２−イル）メチルオキシ酢酸エチル（ ８Ｂ）の製造 無水メタノール（１００ｍ）に溶解された２−メタノール−３゜４−ジヒドロ− ２Ｈ−ビラン（式Ｍ、４．２ｇ、３５ミリモル）に水酸化ナトリウム（１，６ｇ 、４０ミリモル）を添加して、緩やかに加温した。次いで溶剤を減圧除去し、残 留物をジメチルスルホキシド＋１ｏａｄ）で溶かした。この溶液に、ジメチルス ルホキシド（１００ｄ）ベースの酢酸２−クロル−ナトリウム（８ｇ、ｔ、ｓミ リモル）を激しく撹拌しながら２時間以内に添加した。３０分間静置させた後、 反応混合物を冷却し、トリエチルアミン（５ｍ）とエチルヨウ素とを添加して、 室温で１晩保った。次いで反応混合物を水で希釈し、エチルエーテルで抽出した 。標準的な後処理の後、標記化合物を石油エーテル／エーテルの混液（８０・Ｉ ＯＶ／Ｖ）で溶出させる珪酸でのクロマトグラフィーにより精製して、１．６ｇ 、の化合物５を油状物として回収した（収率２６％）。珪藻土板Ｆ　（メルク社 ）における溶出系として容量比１：１の石油エーテル：エーテルの混液を用いて ＴＬＣ：Ｒ，０，７゜ ’ＨＮ１１１（２Ｇ０１１）Ｉｒ、ＣＤＣｌ　）δ：　１．２１ｉｆｌ、Ｊ＝７ ．１１［ｆ、３［１，Ｃｌ１２Ｃ［Ｉ、　）　；１．６−２．２（ｍ、４Ｈ，ｃ Ｈ−３，Ｃｔｌ　−４１；３．６４（ｄ、Ｉ弓２［１！、　２Ｌ■２０）；４、 　Ｈｉｍ、　１Ｂ、　Ｈ−２）　；　４．　Ｎ（ｍ、　０１．０ＣＲ２Ｃ＝Ｏ１ ；　４．１９（ｑ、　１＝’１．１ｆｌｒ。

２Ｈ１す２ＣＨ３）　；　４．６５１ｍ、ｌ）１．　！！−３１；　６３５（ｄ ｄｄ、Ｉ＝６．２，２．０．２．０４′−エビ−４’　−０−（２−カルボキシ テトラヒドロビラン−６−イル）ダウノルビシンの製造：Ｘおよびｙ異性体（２ ’　Ｒ，６’　Ｒおよび２’　Ｓ、６’　Ｓ）４′　−エビ−Ｎ−トリフルオロ アセチルダウノルビシン（３ｃ　：　Ｒ−ＮＨＣＯＣＦ３）（３，１ｇ、５ミリ モル）を無水塩加メチレン（５００ｄ）に溶解させ、文献１：「１ｌｚｃ＋口１ ｕｌｅＣｏｌ＋＋Ｊｗｏｌ　１２．　Ｎｏ　１．　ｐ　５−９．　ｌ５ｎ−Ｆｅ ｂ　１９７９コに記載されたように合成した３、４−ジヒドロ−２Ｈ−ビラン− ２−エトキンカルボニル（８Ａ、３．４ｇ、２５ミリモル）およびｐ−トルエン スルホン酸（１００■）で室温にて窒素下に処理した。１時間の後、クロマトグ ラフ比較はそれぞれ系Ａにて０．５３および０．３６のＲ５値を育する２種の生 成物の形成を示した。

この反応混合物を５％炭酸水素ナトリウムの水溶液と水とで洗浄し、次いで有機 相を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、小容量まで減圧下に濃縮し、次いで 珪酸カラムでクロマトグラフにかけて標記化合物の４′　−エビ−４’　−０− （２−カルボエトキンテトラヒドロビラン−６−イル）Ｎ−トリフルオロアセル ダウノルビシン誘導体を得、これらはそれぞれ系へにてＱ−３３’Ｄ　ＲＬ値（ １，５ｇ　、収率４０％）およびｏ、３６のＲ２値（１，２８ｇ。

収率３２％）を有した。化合物Ｒ＋　−０−５３；　ＦＤ−ＭＳ　：　ｍ／ｅ　 ６ｏ３　（Ｍ＋）１１１ＹＭＲ（２［１０ＭＬ、　Ｃ［１Ｃ１３）　特ｔ：　６ 　川、　３１（ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３゜１＝７．ｌＨり、　Ｌ、３３（５’−ＣＨ ３，Ｉ＝６．４Ｈ＋ｌ　、２．４１（ＣＯＣ［Ｉ３）　、３．４０（４’４．Ｉ ＝９．７）ｌｒ）　、　４．０７（４−ＣＨ３０）、　４．５５　（６”−且） 　、　１９６（２”４１　、５．３０　（７４）　、　５．４８（１’一旦１． ７．９２（ＮＨＣＯＣＦ３）。

化合物Ｒ，＝０．３６ ＦＤ−ＭＳ　：　ｍ／ｅ６６３（ｌｌ＋）１＝７．１１１ｔ）、　１ｉ８（５’ −Ｃｆ１３．Ｊ＝６．４８ｘｌ　、　２．４２（ＣＯＣＨ，）　、　３．５４（ ４’−且、Ｉ＝８．７Ｈ２）　、４．０７（４−ＣＩ’＋３０＋、４．４２　（ ６”−ｕ）　、５．ＬＯ（２パ一旦１　、５．２９　（７−ｊｊ）　、　５．４ Ｈ１’４）　、　６．６２（Ｎ旦Ｃ０ＣＦ、　）。

化合物Ｒ，＝０．５３（１，４ｇ、１．７９Ｅ　！Ｊ　％ｋ）　ヲ０．２Ｎ水酸 化ナトリウム水溶液で窒素下に溶解させ、Ｏ’Ｃに８時間保った。次いで、この 水溶液をＩＮ塩１！溶液でｐＨ３に調整し、塩化メチレンで反復抽出した。有機 相を水洗し、分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いで減圧下に蒸発させて 標記化合物４’　ｃ（Ａ）の２種の異性体（Ｘおよびｙ）の一方、すなわちＸを 得たｔｏ、　９　、　、収率７９％）。

Ｒ，−０，６０（系Ｂ）　。ＦＤ−ＭＳ　：　ａｌｅ　６３９（ｍ÷）化合物Ｒ ，−０３６（１，Ｉｇ、１．４ミリモル）を上記と同様に加水分解して、標準的 な後処理の後に標記化合物４’　ｃ　（Ａ）の他方の異性体ｙを得た（０．７２ ｇ、収率８０％）。Ｒ１＝０４５（系Ｂ）。Ｆ［１−ＭＳ　：　工／Ｉ　６３９ 　（Ｍ＋ｌ　。

実施例３ ４′　−エビ−４’　−０−（２−カルボキシテトラヒドロビラン−６−イル） −３′　−デアミノ−３′　（４−モルホリノ）ダウノルビシンの製造：Ｘ異性 体（２種の２’　Ｒ，６’　Ｒ，および２’　Ｓ、６″Ｓの一方） 実施例２に記載したように合成した化合物４’　ｃ　（Ａ）　（Ｘ異性体）　ｆ ｌ、２ｇ、１．８ミリモル）を水（２００ｄ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム でｐＨ７，５に調整し、水（２０ｄ）に溶解された２−オキシエチルーンハルデ ヒド（ｌｌｊｇ）を添加した。１時間後、水（６メ）におけるンアノ硼水素ナト リウム「１０Ｇ■）の溶液を室温にて攪拌しながら添加した。３０分間の後、反 応混合物を５％酢酸の水溶液でｐＨ６に調整し、ｎ−ブチルアルコールで抽出し た。有機相を水洗し、溶剤を減圧下で除去した。

残留物を塩化メチレン：メタノール：酢酸（容積で９０＋８：２）の系を用いる 珪酸のカラムにおけるクロマトグラフィーにより精製して、標準的な後処理の後 に標記化合物４ｃ　（Ａ）（ＭＯ）を得た（Ｌ　６　ｇ　、収率４５％）。

Ｒ，＝Ｏ，？０（系Ｂ）　、　ＦＤ−！ＪＡ　：　ａｌｔ　？２４（Ｍ＋１゜’ ！（！ＩＭＩＩ　ｆ２…Ｈ＋、ＣＤＣｌ　）特にδ：　Ｌ、　２９（５’　−Ｃ Ｊ　、　ｌ・６．３Ｈ＋ｌ　。

２、４２　（Ｃｏ■３）　、　２．４−２．１１１：■２−１−Ｃ■２１　、２ ．９Ｈ３’一旦）。

！、６５ｆｃｌＩ　０−ＣＨ）　−３，４０（４’−Ｈ，Ｉｇ９．ＯＩＩ＋１． ４．０８（４−ＣＩ’１３０１゜４′−エピ−４−０−（２−カルボキシテトラ ヒドロピラン−６−イル）−３′　−デアミノ−３′　（４−モルホリノ）ダウ ノルビシンのＮ−オキシスクシニミジル誘導体の製造：Ｘ異性体（２種の２’　 Ｒ，６’　Ｒもしくは２’　Ｓ、６’　Ｓの一方）実施例３に記載したように合 成した化合物４　ｃ　（Ａ）　（ＭＯ’）（０，５５ｇ、０．７ミリモル）を無 水ジメチルホルムアミド（２５ｉｄ　）に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミド（９５■）とＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（０，１５ｇ）とで 処理した。

混合物を４℃にて２日間保ち、次いで溶剤を減圧下で除去した。

残留物を少量の酢酸エチルで処理し、濾過、溶剤を減圧下で除去した。この手順 を４回行なってジシクロヘキシル尿素を除去した。最後に、残留物をエーテルで 処理し、そこから０．４５ｇ（収率７２％）の純粋な標記誘導体５ｃ　（Ａ）（ ＭＯ）を結晶化させた。

Ｒ，＝０．７０（系Ｂ）　。ＦＤ−ＭＡ　：　ａｌｅ　８２１（１１＋１　。

’ＢＮＭＲ（２００１１（１，ＣＤＣｌ３　）　特ニ６　：　２．４２　（ＣＱ ＣＪ　）　、２．４−２．６（山−Ｎ−ＣＩ（２）、　２．８２（Ｃｏ−■２匹 ＩＩ　２−ＣＯｌ、　３．５−３．７（Ｃ１ｌ、、　−０−ＣＨ２）、４．０８ 　（４−ＣＨ３０）、５．１３（２”−１（）、　５．２８（７−８，６”−ｔ ｌ）　、　５，５２６、Ｉｆ、４’　−トリー〇−７セチルーＮ−トリフルオロ アセチリ−ドキソルビシン（９ｆ）の製造 Ｎ−トリフルオロアセチル−ドキソルビシン（３ｆ＋Ｒ３＝Ｎ　ＨＣＯＣ’Ｆ　 ３　）　（１ｇ１１０ミリモル）を無水塩化メチレンｆ７５０ｍｌ）に懸濁させ 、次いでトリエチルオルトホルメート（１５０ｍｌ）とｐ−トルエンスルホン酸 （３ｇ）とを室温にて攪拌下に添加した。３時間の後、クロマトグラフ比較は出 発物質の消失を示した。標準的な水での後処理の後、有機相を分離し、無水硫酸 ナトリウムで脱水し、次いで濾別した。溶剤を減圧除去して粗生成物を得、これ をピリジン（５０ｍｌ）と無水酢酸（５０＋ｏｌ）との混液に溶解させ、少量の ジメチルアミノピリジン（０，５ｇ）を添加した。２時間後、反応混合物を水お よび氷（２００ｈｌ）に注ぎ入れた。沈殿物を焼結ガラス上に集め、水洗し、テ トラヒドロフラン（４００ｍ１）で溶解させ、次いでｔｌ、ＩＮ塩化水素水溶液 （５０ｍｌ）で室温にて１晩処理した。次いで塩化メチレンを添加し、有機相を 水と５％炭酸水素ナトリウム水溶液と２回の水とで洗浄した。通常通り後処理し た後、残留物を塩化メチレン・アセトン（容量で９０　：　ｔｏ）の溶剤系を用 いる珪酸のカラムでのクロマトグラフィーにより精製して５ｇ（収率６５％）の 標記化合物９ｆを得た。

Ｒ，＝Ｏ，Ｈ（系Ｄ） Ｆ［１−ＭＳ　ｓ／！７６５　（Ｆｌ １９０−２．Ｇ（ｉ、２１１．２′−ＣＢ２）　、　２．１−２．４　（ｍ、２ Ｈ１辷■２）　、　２．１９゜２．４９．２．５３．　（＋、９！１．ＣＯＣ［ ｌ３Ｘ３１．２．９５（ｂ＋、Ｉ＝４．２．　ＬＨ，ＣＨ２プ１−１３．１３（ ｂａ＋、２１（，１ｏ−ＣＨ）　、　３．９９Ｆ！、３Ｈ，４−ＣＨａ　Ｏ）、 　４．２０（ｑ、Ｉ：６．６Ｈｒ。

１Ｈ，５’−Ｈ）、４３５（ｍ、ｌＨ，３’−！Ｉ）　、Ｃ４４（ｂ＋、ｌ［１ ，９−０ＨＩ、４．７Ｈｍ、２ｆｌ。

ＣＨ２−０Ｈ）５．１−５．３（ａ、　３ｈ、　７−［１，ｌ’　−）１．４’ 　−Ｈ）　、　６．４０（ｂｄ、　Ｉ＝６．４Ｈ＋、　ＩＨB １４−Ｏ−（２−カルボキシテトラヒドロピラン−６−イル）ドキソルビシンの 製造：χおよびｙ異性体（２’　Ｒ，６’　Ｒおよび２’　Ｓ、６’　Ｓ）。

実施例５に記載したように合成した６、１１．４’　−１リ−Ｏ−アセチル−Ｎ −トリフルオロアセチルドキソルビシン（１０ｆ）（５ｇ、６．５ミリモル）を 無水塩化メチレン（６００ｍ１）に溶解させ、２−エトキシカルボニル−３，４ −ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（８Ａ）（５ｇ、３６ミリモル）とｐ−ｈルエンスル ホン酸（５００■）とで室温にて窒素下に処理した。２時間の後、反応混合物を ５％炭酸水素ナトリウムの水溶液と水とで洗浄し、次いで有機相を分離し、無水 硫酸ナトリウムで脱水し、歩容量まで減圧下に濃縮し、次いで石油エーテルを添 加した。沈殿物をメタノール（５００ｍｌ）に溶解させ、モルホリン（８ｍｌ） を添加し、室温に２時間保った。その後、反応混合物に酢酸（１０ｍｌ）を添加 し、塩化メチレンで抽出した。有機相を小容量まで濃縮し、溶出系として塩化メ チレン：アセトンの混液（容量で９５５）を用いる珪酸カラムでのクロマトグラ フにかけてＮ−トリフルオロアセチル１４−Ｏ−（２−カルボニルテトラヒドロ ピラン−６−イル）ドキソルビシン（１０ｆ）（４，２ｇ、収率８２％）を得た 。

Ｒ，−０，４１（系Ｄ）　；　ＦＤ−ＭＳ　ｓ／ｓ　？９５　（Ｍｌｌｌ（口Ｒ ｆ２ＧＯ１１，ＣｌＩＣ＋　１特に１．３（５’−山、ＣＯＯ，Ｃ１１１２山） 。

３．６５（４’−［（、Ｉ：２．ＩＨ＋ｌ、４．０８（４−ＯＣＨｌ　、４．２ １（Ｃｏｏぜ２　ＣＩ（３。

一３ １＝７゜Ｏ，Ｈｔ）　、　４．４８（６”−Ｈ）　、　４．８８　（９−Ｃｏ■ ２−０１　、５．０４（２’″」）、５．２Ｎ？−旧　、５．５ｏ　（１’−旧 、６．６９（ＮＨＩ。

化合物１０ｆ＠０℃にて０．ＩＮＮ水化化ナトリウム　５Ｈｍｌ）により窒素下 で溶解させた。１時間の後、反応混合物を酢酸でｐＨ６となし、ｎ−ブタノール で抽出し、次いで水洗した。有機相を分離し、溶剤を減圧除去した。残量物を少 量の塩化メチレンで処理し、エーテルを添加して標題生成物４’　ｆ　（Ａ）（ χ、ｙ異性体）２．９ｇ（収率６６％）を得た。

Ｒ＋　−０，３（系Ｂ）　；　Ｆｉｌ−ＭＳ　ｌｌ１ｅ　６７１　（Ｍ＋）実施 例７ １４−０−（２−カルボキシテトラヒドロピラン−６−イル）−３′−デアミノ −３’　Ｃ２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリノ〕　ドキソルビシンの製造、χ およびｙ異性体（２’　Ｒ，６’Ｒと２’　Ｓ、６’　Ｓ） 実施例６に記載したように作成した１４−Ｏ−（２−カルボキシテトラヒドロピ ラン−６−イル）ドキソルビシン（４′ｆ（Ａ、）、１．３ｇ、２ミリモル）を 水（３００ｍ１）に溶解し、アセトニトリル（２０ｍｌ）と水（２０ｍ１　）と の混液に溶解された１−メトキシ−２，２′−オキシジアセトアルデヒド（１２ ）　（３，４ｇ　）を添加した。この混合物をトリエチルアミンでｐＨ７，ｓ〜 ８０となし、攪拌下で室温に１時間保った。次いで水（１０ｍｌ）に溶解された シアノ硼水素化ナトリウム（０，１２６ｇ　）を添加し、反応混合物を室温に１ ５分間保った。その後、アセトン（ｆｏｍｌ）を添加し、反応混合物に少量の酢 酸を添加し、次いでｎ−ブタノールで抽出した。有機相を水洗し、溶剤を減圧除 去した。残量物を、溶出溶剤として塩化メチレン：酢酸：メタノールの混液（容 量で１００：　１　：　７）を用いる珪酸カラムでのクロマトグラフにかけた。

通常の後処理の後、標記化合物４　ｆ　（Ａ）（ＭＭ）（ＯｊＯｇ、収率２６％ ）を回収した。

Ｆ、＝０．８（系Ｅ）　、　ＦＤ−ＭＳ　ｉ／ｅ　７７１　（ｌＩ＋１１Ｈ口Ｒ （２００１１）１ｘ、　ＣＤＣｌ３　）特に１．３４　（５’−山）　、　３． ３９　（Ｃ１１３−０“モルホリノ”）　、　４．０７＋４−０ぜ３）　、　４ ．４７（６”−［１１、４，５８ユとＯＣＩ＋、’モルホリノ”）　、　４．８ ５　（９−Ｃｏす２．−０−１　、５．Ｃ１４（２”１４−Ｏ−（２−カルボキ シテトラヒドロピラン−６−イル）−３′−デアミノ−３’［２（Ｓ）−メトキ シ−４−モルホリノコ　ドキソルビシンのＮ−オキシスクシニミジル誘導体の製 造・ｘおよびｙの異性体（２’　Ｒ，６’　Ｒおよび２′Ｓ。

６′Ｓ） 実施例７に記載したように合成した化合物４ｆ　（Ａ）（ＭＭ）（０，１５■） を無水ジメチルホルムアミド（２５ｏａｌ）に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミド（９５■）とＮ、Ｎ’　−ジシクロへキシルカポジイミド（０，１５ｇ ）とで実施例４に記載した手順にしたがい処理した。標記化合物５　ｆ　（Ａ） （ＭＭ）が８５％の収率（０，ｌＳｇ）で得られｈｏ Ｒ４冨０２０（系Ａ）　；　ＦＤ−ＭＳ　ｓ／１８Ｈ（Ｍ＋）実施例９ １４−０−（２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロピラン−６−イ ル）トルソルビシンの製造：異性体２′Ｒ１６’Ｒ，２’Ｓ、６’　Ｒ，２’　 Ｓ、６’　Ｒ，２’　Ｒ，６’　Ｓの混合物 実施９ＩＩ　５に記載したように合成した６、１！、４’　−１−ジ−０−アセ チル−Ｎ−１リフルオロアセチル−ドキソルビシン（９ｆ、　０．６５ｇ、　０ ．８５ミリモル）を無水塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、化合物８Ｂ　（０ ，７ｇ、３．５Ｅリモル）と無水ｐ−トリエンスルホン酸（０，０４５グラム） とで室温にて窒素下に処理した。１０分間の後、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶 液（２０ｍｌ）を添加した。有機層を分離し、次いで２回洗浄し、無水硫酸ナト リウムで脱水し、次いで溶剤を減圧下に除去した。油性残留物をメタノール（５ ０＠ｌ）に溶解させ、最初にモリホリン（１２ｍｌ）で２時間処理し、次いでナ トリウムメトキシド（０，１ｇ）により３０分間処理した。その後、反応混合物 をｏ、　ｔＮ塩化水素水溶液でｐｌ（７，５となし、塩化メチレンで抽出した。

標準的な後処理の後、残留物を、塩化メチレンを溶出剤として用いる珪酸でのク ロマトグラフにかけて、０４ｇ（収率５６％）の標記生成物の保護を受けたＮ− トリフルオロアセチルおよび（２−エチルオキシカルボニル）誘導体を得た。

Ｒ，＝０３１（系Ｄ）。

ＦＤ−４１ｓ　：　−／ｅ　８３９　（７６、１１＋）　；　６３９　（８４） 　；　ｌｏｔ　（１００）０．４ｇ　（０，４７ミリモル）の上１ＥＮ−トリフ ルオロアセチル２−エチルオキシカルボニ誘導体をＯＩＮ水酸化ナトリウム水溶 液（１００ｍ１）で０℃にて窒素下に９０分間処理した。その後、溶液を酢酸で ｐＥ（５となし、ｎ−ブタノールにて飽和した水により抽出し、水で飽和したｎ −ブタノールにより洗浄した。溶剤を減圧下で除去し、残留物を塩化メチレン− メタノールの混液で処理し、標記生成物４’　ｆ　（Ｂ）Ｏｊ２ｇ　（収率９４ ％）をエチル工−テルの添加により沈殿させ、次いで焼結ガラス漏斗に集めた。

Ｒ，−０ｉ１（系Ｂ）。

ＦＤ−ＩＪＳ　：　ｍ／ｅ　７１５　（２１Ｍｆｔｌ　：　３２１１００）実施 例１０ ［４−Ｏ−（２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロピラン−６−イ ル）−３′−デアミノ−３′　（４−モリホリン）ドキソルビシンの製造：異性 体２’　Ｒ，６’　Ｒ，２’　Ｓ。

６’　Ｓ　、２’　Ｓ、６′Ｒ；２’　Ｒ，６′Ｓの混合物生成物４’　ｆ　（ Ｂ）（０３ｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド（４０ｍｌ）に溶解させ、トリエチ ルアミン（０，３ｍ１）とビス（２した。２４時間の後、溶液を酢酸で酸性化さ せ、溶剤を減圧下に除去した。残留物を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で０℃ にて窒素下に処理した。２０分間の後、溶液を酢酸で酸性化させ、ｎ　−ブタノ ールで抽出し、次いで水洗した。溶剤を減圧除去し、次いで粗製物室を塩化メチ レン／メタノールの混液（容量で０：５）により溶出される珪酸カラムで精製し て、標記化合物４ｆ（Ｂ）（ＭＯ）（０，０５ｇ、収率２３％）を得た。

Ｒ，＝０．４８（系Ｂ） ＦＡＢ　＝１１Ｓ：　７５７　（Ｍ＋）実施例１１ １４−０−〔２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロピラン−６−イ ルコー３′　−デアミノ−３′　（４−モルホリノ）ドキソルビシンのＮ−オキ シスクシニミジル誘導体の製造。

異性体２’　Ｒ，６′Ｒ：２″Ｓ、６’　Ｓ；２’　Ｓ、６″Ｒ：２’　Ｒ，６ ’　Ｓの混合物 生成物４　ｆ　（Ｂ）　（ＭＯ）　（０，０３ｇ、　０．０３７　ミリモル）を 乾燥ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ド（０，０１ｇ）とジシクロへキンル力ルポジイミド（０，０２ｇ）とを添加し た。この混合物を室温に８時間保ち、次いで溶剤を減圧除去し、残留物を塩化メ チレン：メタノール（９５：５）を溶出剤として用いる珪酸カラムでのクロマト グラフにかけて標記化合物５　ｆ　（Ｂ）　（ＭＯ）　（０，０２）ｌ　ｇ、収 率８５％）を得た。

Ｒ，＝Ｉ１．Ｓ２（系Ｈ） ＦＡＲ−ＭＳ：　８５２　（Ｈ，ＩＩＨ＋　）　；　２００（１００１実施例１ ２ ＋４−Ｏ−（２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロビラン−６−イ ル）−３′　−デアミノ−３’　［２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリノ］　ド キソルビシンの製造−異性体２’　Ｒ，６’　Ｒ，２’　Ｓ、６’　３．２’　 Ｓ、６″Ｒ，２’Ｒ。

６’Ｓの混合物 実施例９に記載したように合成した１４−０（２−カルボキシメチルオキシメチ ル−テトラヒドロビラン−６−イル）−ドキソルビシン（４’　ｆ　（Ｂ）、０ ．３ｇ）を１−メトキン−２゜２′　−オキソジアセトアルデヒドでの処理およ びシアノ硼水素化ナトリウムでの還元により実施例７に記載したと同じ手順にし たがって標記化合物４ｆ　（Ｂ）（ＭＭ）まで変換させた。

ＲＩ＝　Ｏ，Ｅｌ　（系Ｂ） ＦＡＢ−ＭＳ　＋　７８７ 実施例１３ ＋４−０−［２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロビラン−６−イ ルコー３′　−ジアミノ−３’　［２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリノ〕　ド キソルビシンのＮ−オキシスクニミジル誘導体の製造：異性体２’　Ｒ，６’　 Ｒ，２’　Ｓ、６’　Ｓ　；２’　３．６’　Ｒ；２’　Ｒ，６’　Ｓの混合物 実施例１２で作成した生成物４　ｆ　（Ｂ）　（ＭＭ）　（０，０３グラム、０ ．０３７　ミリモル）をジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解させ、Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドを添加し、標記化合物５ｆ　（Ｂ）（ＭＭ）（実施例８） まで変換させた。

Ｒ、−０，５５（例Ｈ）。ＦＡｆｉ−ＭＳ　：　８８２実施例１４ ＋４−Ｏ−（６−ピペラジンカルボニルテトラヒドロビラン−２−イル）−３′ 　−デアミノ−３’　［２（Ｓ）−メトキン−４−モルホリニル］　ドキソルビ シンの製造：χおよびｙ異性体（２’　Ｒ，８’　Ｒおよび２’　Ｓ、６’　Ｓ ）実施例８に記載したように合成した１４−０−、（２−カルボキシテトラヒド ロビラン−６−イル）−３′−デアミノ−３′Ｅ２　（Ｓ）−メトキシ−４−モ ルホリニル］　ドキソルビシンのＮ−オキシスクンニミンル誘導体５　ｆ　（、 Ａ）　（ＭＭ）　（１００■）を無水テトラヒドロフラン（２０ａ＋１）に溶解 し、０℃まで冷却し、次いで無水テトラヒドロフラン（２ｍｌ）に溶けた１、４ −ピペラジン（５０■）の溶液を添加した。この反応混合物を０℃にて１５分間 攪拌し、次いで塩化メチレン（ｌｏｃａｌ）で希釈し、水（３ｘ５０ｍｌ）で洗 浄した。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いで溶剤を減圧下に 除去した。粗生成物を、塩化メチレン／メタノール混液（容量で８０／　２０） を溶出系として用いる珪酸カラムでのクロマトグラフにかけた。標記化合物７　 ｆ　（Ａ）（ＭＭ）（８０■）をエチルエーテルにより沈殿させた。溶出系塩化 メチレン／メタノール（容量で７０／　３０）を用いる珪藻上板（メルク社）上 におけるτＬＣ：　Ｒ，＝０．５５．　ＦＤ−ＭＳ　・［４−Ｏ−（６−ヒドラ シノカルポニルテトラヒドロビランー２−イル）−３′−デアミノ−３’［２（ Ｓ）−メトキシ−４−モルホリニル］　ドキソルビシンの製造：χおよびｙの異 性体（２’　Ｒ，６’　Ｒおよび２’　９．６’　Ｓ’１実施例８に記載したよ うに合成した１４−Ｏ−（２−カルボキシテトラヒドロビラン−６−イル）−３ ′−デアミノ−３′Ｃ２（Ｓ）−メトキン−４−モルホリニルコ　ドキソシルビ シンのＮ−オキシスクシニミジル誘導体４　ｒ　（Ａ）　（ＭＭ）　（１０［１ ■）を無水テトラヒドロフラン（ｉ！０ｗ１）に溶解させ、イソプロパツール（ ５ｍｌ）中ヒドラジン水和物の１Ｍ溶液を添加した。

この混合物を０℃に１時間保ち、次いで塩化メチレンを添加し、混合物を冷水で ３回洗浄した。有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、次いで 溶剤を減圧除去した。残留物を、塩化メチレン／メタノールに混液（容量で９９ ／　１　）を用いる珪酸カラムで精製した。ｌＫ記化合物６　ｆ　（Ａ）　（Ｍ Ｍ）　（９５■）をエチルエーテルで沈澱させた。溶出系として塩化メチレン／ メタノール（容量で９５／　５　）を用いる珪藻上板（メルク社）Ｆ２５４上に おけルＴＬＣ：　Ｒ，−０，２３ＦＤ−ＭＳ　：　ｍ／ｒ　７Ｎ’ＨＮＭＲ（２ ００１１＋！、　ＣＤＣｌ３　）　、δ：　ｌ、　３６　（ｄ、　Ｉ＝６．６Ｈ ＋、　３Ｈ，５’−山）　；Ｌ、２−２．２（ｍ、９Ｈ，３”　−周、４″−腿 、、５”　−■２．２’−ＣＩＨ２，８ＪＩ　−（１）　；　２．３−２．０ｍ 、ｏＨ，３’−［１、ｌｌ！−Ｋ　、ＮＣＩ（２ＣＨ２０゜１１ｃＩ（２−Ｃ１ ｌ　（ＯＣＩ（３１０）　；　２．９−３．４（■、　２１ｔ、　ｔｏ−■２　 ）　；　３．３８（ｂ　３１（、ＮＣＨ２ＣＭ（ＯＣＪ　）０１　；　３．５５ ，３．９０（ｔｗｏ　Ｌ　２＋１１．　ＮＯ３ＣＨ２０１；３．６８（ｍ、ｌｔ ｌ、４’　−Ｈｌ　；　３．９５（ａ、ｌＨ，ｓ’　−Ｈｌ　；　４．０８（＋ 、３Ｈ，４−ＯＣＩ（３）　；　４ｉ８（ｍ、ｌＨ，ｌｉ”ｌｊ）　；　４．４ ９（ｍ、ｔＬ　ＮＣｔ（２ＣＨ（ＯＣＨ３）０１　；　４．６−４．９（ｌＮ、 ２Ｈ，１４−Ｃ２１；　４．９７（ｍ、Ｉ［１，２”−肛；　５．２９　（ｍ、 　ＩＩＩ。

７−１１）　；　５．５４　（履、ＩＬ　ｌ’　−ｆｉｌ　；　７．３９　（ｄ 、　Ｉ＝１．６ＨＬ　ｌ［＋、　３−肛、７．５９（Ｎ。

１＝６．８Ｈｒ、　ＩＨ，Ｃ０Ｎ）　：　７．７ｆｔ、　］＝７．６Ｈ！、　Ｉ Ｈ，３−Ｈ）　；　８゜０３　（ｄ、　Ｉ＝７．６ｈ。

ＬＨ，１−ｔ（）　；　１３．２９（ｓ、　ｌ［１，ＩＩ−Ｈ）　：　１３．９ ８（＋、　ｌ［１，６−０［１１。

実施例１６ 抗−ヒト黒色腫結合体１′の製造 ジメチルホルムアミド（３８ｍｌ）中化合物５　ｆ　（Ａ）（ＭＭ）（実施例８ ）のｌｏ−２Ｍ溶液を精製されてマウスのモノク・ナー（ル抗−ヒト黒色腫抗体 Ｅ　ｐ　１　［Ｐ、Ｇｉ＆ｃｏｍｉｎｉ、　Ｏ，Ｓｅｇｘｌｔ＋＋、　Ｐ、Ｇに ５ｌｚｌｉ、　Ｉｆｉｔ、　１．　ＣＪＩＩｃｅｒ　３ム１９＆７．７２９］の ＰＢＳ　ｐＨ７，５緩衝液中２■／ｍｌ溶液１ｍｌに添加した。この反応混合物 を室温にて１晩攪拌し、遠心分離により清澄させた生成物を、ＰＢＳ（ｐＨ７， ５）で溶出させるセファデックスＧ−２５カラム（ＰＤ−１，０，ファルマシア 社）でのゲル濾過クロマトグラフィーで単離した。排出されたピークを集め（２ ｍｌ）、次いで４８Ｇａｍでの分光分析法によりアントラサイクリン含有量につ き分析した。蛋白含有量は比色蛋白分析（ＢＣＡ、ピアス社）で分析した。結合 物１１は８Ｔ：１のアントラサイクリン；蛋白の比にして０．９８■／ｍｌの抗 体を含有した。生成物の化学物理的性質を二重波長検出でのＨＰＬＣゲル濾過分 析（２８０および４８θａｍ）および５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。ＨＰＣ Ｌにより生成物の分子量は約１６０ＫＤであり％　４８Ｇａｍのアントラサイク リン吸収は同じ分子量に一致した。共有結合形成の証明は５ＤＳ−ＰＡＧＥによ って得られ、４８ｈａのアントラサイクリン吸収とクーマシー染料蛋白反応とは １６ｆｌＫＤの分子量であった。

実施例１７ 抗−結腸癌結合体１２の製造 ｐＨ６のＧ、１Ｍ燐酸塩緩衝液（１ｍｌ）中２．６■／ｍｌのＢ　７２．３抗体 （米国特許第４．５２２．９１１１号、　１９８５）の溶液をＮ　ａ　Ｉ　Ｏ４ の０．１Ｍ水溶液０．１ｍｌにより暗所中で４℃にて処理した。１時間の後、生 成物を０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ６）で溶出させるセファデックスＧ−２５カラ ム（ＰＤ−１ｏ、ファルマシア社）でのゲル濾過クロマトグラフィーにより精製 した。蛋白含有フラクシタン（１，７■、２ｍ１）をジメチルホルムアミド中化 合物６Ｆ（Ａ）（ＭＭ）（、実施例１５）のｔｏ−２Ｍ溶液３０モル等量で処理 した。暗所中で３７℃にて２４時間の後、反応混合物を遠心分離し、０．１Ｍ燐 酸塩緩Ｗｔｅ、（ｐ　Ｈ７，３）で溶出されるセファデックスＧ−２５カラム（ Ｐ　Ｄ　−１０，ファルマシア社）でのゲル濾過クロマトグラフィーにより精製 した。蛋白含有ピークを集め（２ｍｌ）、実施例１６と同様に特性を決定した。

この結合物１２は１、．３／ｌのアントラサイクリン／蛋白の比にて０．４５■ ／ｍｌの抗体を含有し、実施例１６で得られた結合物と同様な分析特性を抗−ト ランスフェリンリセプタ結合体１３の製造Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７ Ｍ）中化合物５ｆ（Ａ）（ＭＭ）（実施例８に記載）の１０　Ｅ　−２Ｍ　ｆｌ ｌ　ｊｌｌを、　Ｏ，１ＭのＮａＨ２ＰＯ２とＯ，ＬＭＮａＣ＋とのｐＨ８緩衝 液中の精製マウスモノクローナル抗−ヒトトランスフエリンリセブタ抗体０ＫＴ ９　［Ｓｗｊｈｓｒｌｚａｄ、Ｒ，、Ｄｅｔｉｘ、Ｄ、、５Ｃｈｎｔｉｄｓ＋、 Ｃ，。

Ｎｃｙｌｎ、　Ｒ，、Ｋｅｉ＋ｈｅｉｄ、　Ｊ、、　Ｇ＋＋＊ｙｅ＋、　Ｍ、、 　ＰｒｏＣ，Ｎ！＋、　Ａｃ１ｄｐＨ７，３（ギブコ社、＋ＯＸ、カタログ魔０ ４２−０４２００Ｍ　）で溶出させるセファデックスＧ−２５カラム（Ｐ　Ｄ　 −１０、ファルマシア社、カタログ＆　ＩＴ−０８５１−０１）でのゲル濾過ク ロマトグラフィーにより単離した。排出されたピークを集め、アントラサイクリ ン含有量につき分析し、（４８ｈｍでの分光光度法）、さらに蛋白含有量につき 分析した（ＢＣＡ蛋白試薬、ピアス社、カタログ！ＩＣＬ２３４２５）。この結 合体は９５：１のアントラサイクリン：蛋白のモル比にて１．９４■／　ｍｌの 抗体と８０．９７１　／　ｏ＋１のアントラサイクリンとを含有した。この生成 物の分析特性を実施例１６におけると同様に評価して同様な結果を得た。

実施例１９ 抗−結腸癌結合体１４の製造 ９．１のアントラサイクリン／蛋白の比にて０．７４■／ｍｌの蛋白と２７．５ 埒／　ｍｌのアントラサイクリンとを含有する式１４の結合体が、実施例１日と 同様に操作すると共に０ＫＴ９の代りにＢ　７２．３抗体の溶液（２，３■／ｍ ｌ）　Ｃ９ｃｈｌｏ国、ｊ１等ＵＳ　ＰＡＴ４５２２９１Ｂ　（＋９８５）コと ４３ｍ１の５　ｆ　（Ａ）（ＭＭ）の溶液を用６．９のアントラサイクリン／蛋 白の比にて０．４９■／ｍｌの蛋白と１４．３ＡＶ／ｍｌのアントラサイクリン とを含有する結合体１５が、実施例１８と同様に操作すると共に０ＫＴ９の代り に抗−表皮成長因子リセプタ抗体ｃｔ、ｔｓ■／ｍｌ）〔ビオマミール、カタロ グ！！１１６０８０．クローン２９．２コと１３Ｊ１１の化合物５　ｒ　（Ａ） （ＭＭ）の溶液を用いて得られた。

実施例２１ 抗−トランスフエリンリセプタ結合体１６の製造３９のアントラサイクリン／蛋 白の比にて０．３４■／ｍｌの蛋白と　５．３埒／　ｍｌのアントラサイクリン とを含有する標言己化合物１６が、実施例１８と同様に操作すると共に０ＫＴ９ の代り↓こ抗−トランスフエリンリセプタ抗体Ｂ３／２５＋０．５■／ｍｌ）［ ベ−’Ｊ　ンカ−・ｆｙ　９　ｏ　り１に１１１８０４Ｂ）ノ溶液と　９．４Ｉ １１の５ｆ（Ａ）（ＭＭ）の溶液とを用いて得られた。

実施例２２ ＦＧＦ結合体１７の製造 ３４のアントラサイクリン／蛋白の比にて０．７７■／ｍｌの蛋白と　ｌ　７’ ７　埒／　ａ＋Ｉめアントラサイクリンとを含有する化合物１７を、り実施例１ ８におけると同様に操作すると共に０ＫＴ９の代りにヒト組換ＦＧＦの溶液（１ ｊ５■／ａ＋Ｉ）　［Ｂｓｒｒ等、Ｉ、ＢｉｏｌＣｂｅ国　２６３．（１９８ｇ ＋、１６４７１コおよび４８１１１の５　ｆ　（Ａ）（ＭＭ）の溶液を用いて作 成した。

実施Ｎ２３ 抗−トランスフニリンリセブタ結合体１８の製造４．９０のアントラサイクリン ／蛋白の比にて０．４６■／ｍｌの蛋白と１３■／ｍｌのアントラサイクリンと を含有する結合体１８が、実施例１８におけると同様に操作すると共に３７ｗ１ の５ｆ（Ｂ）（ＭＯ）Ｃｌ施例１１）　のＩＤＥ−２Ｍ溶液を用１．）ＴＪらｔ した。

実施例２４ 抗−結腸癌結合体１９の製造 ４．５のアントラサイクリン／蛋白の比にて０．４６■／ｍｌの蛋白とｉ３ｇＪ ５１／ｍｌのアントラサイクリンとを含有する式１９の結合体が、実施例１８に おけると同様に操作すると共に０ＫＴ９の代りに抗−結腸癌抗体Ｂ１２ｊと４３ Ｊｉ１の５ｆ　（Ｂ）（ＭＯ）（実施例１１）のＩＯＥ　”ＭＭ液とを用いて得 られた。

実施例２５ 抗−トランスフェリンセブタ結合体１１Ｇの製造７．６のアントラサイクリン／ 蛋白の比にて０．６７■／ｍｌの蛋白と２０．３■／ｍｌのアントラサイクリン とを含有する化合物１１Ｏが、実施例１８におけると同様に操作すると共に３７ １．１１の５ｆ（Ｂ）（ＭＭ）（実施例１３）のＩＯＥ’Ｍ溶液を用いて得られ た。

実施例２６ 抗結腸癌結合体１１１の製造 実施例１８におけると同様に操作すると共に０ＫＴ９の代りに抗結腸癌抗体Ｂ７ ２ｊと４３４ノ化合物５　ｆ　（Ｂ）　（ＭＯ）　ノ１０Ｅ　’Ｍ溶液とを用い て、３．２のアントラサイクリン／蛋白の比で０５５■／ｍｌの蛋白と　７．４ Ｒ／ｍｌのアントラサイクリンとを含有する標記化合物１１Ｌから作成された。

実施例２７ ポリ（Ｇｌｕ、　Ｎ＋、　Ａｌ＋、　Ｔｒｔ）（１：　１　：　１）　１１２の 製造ポリ（Ｇｌｕ、Ｈａ、Ａｌｔ、　Ｔ７ｒ　）　（１：　１　：　１）　Ｍ２ Ｓ０ＧＯ−４０００（シグマ社、０．２ｇ）を水（５ｍｌ）中に室温で攪拌下に 溶解させた。

対応の遊離酸を０．４ＮのＨａによりｐＨ３の水溶液から沈澱させた。回収され かつ減圧下で乾燥されたポリ（Ｇｌｍ−０［１，＾ｈ。

Ｔｒｙ）　（０，１７ｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、 １４−０−　（６−ピペラジンカルボニルテトラヒドロビラン＝２−イル）−３ ′−デアミノ−３’　［２（Ｓ）−メトキシ−４モルホリニル］　ドキソルビシ ン［７ｆ（Ａ）（ＭＭ）、０．０３５　ｇコ（実施例１４に記載）とＮ−エトキ シカルボニル−２−ニドキン−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）　Ｃｆ１ ．０８ｇ）とを添加した。さらにＥ　Ｅ　Ｄ　Ｑ　（０，Ｈｇ）を３時間後に添 加した。この反応混合物を室温にて１晩攪拌し、次いでエチルエーテル（３００ ｍ１）に注ぎ入れた。沈澱物を水（１０ｍｌ）に懸濁させ、Ｏ，ＩＮのＮ　ａ　 ＯＨ（１４ｍｌ）で処理し、溶液をＯＩＮのＨａでｐＨａ、ｓとなし、セファデ ックスＧ［ｉｌのカラムに通した。

この水溶液を凍結乾燥してＯ，１６ｇの標記化合物１１２得た。

３′−デアミノ−３’Ｃ２（Ｓ）−メトキン−４−モルホリニル］　ドキソルビ シン塩酸塩として計算したアントラサイクリンの含有量（Ｗ／Ｗ％）：【０％。

実施例２８ ポリ−Ｌ−グルタミン酸の結合体％３の製造ポリ−Ｌ−グルタミン酸、Ｍ　ｗ　 ２０００−１５［ｌｏｏ　（シグマ社、０．１ｇ）と１４−Ｏ−（６−ピペラジ ンカルボニルテトラヒドロビラン−２−イル）−３′　−デアミノ−３”２　（ Ｓ）−メトキシ−４−モルホリニル〕　ドキソルビシン［７ｆ（Ａ）（ＭＭ）　 、０．０３ｇＦ　（実施例１４に記載）とを無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ ）に溶解させ、次いで３時間攪拌した。その後、Ｎ−エトキシ−カルボニル−２ −エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（０，０３ｇ）を添加した 。この混合物を攪拌下に１晩保ち、次いでエチルエーテルを石油エーテルとの混 液に注ぎ入れた。沈殿物を焼結ガラスフィルタ上に集め、エチルエーテルで洗浄 し、炭酸水素ナトリウムの２．５％水溶液（８ｍｌ）で溶解された。この溶液を 逆相力ラムＲＰ−８，４０〜６３（メルク社）　（３０Ｘ　１．８　Ｃｆ１）に 通過させ、水とアセトニトリルとの混液で溶出させた。結合体を含有する溶出液 を凍結乾燥し、次いで焼結ガラスフィルタ上に集め、メタノールとエチルエーテ ルとで洗浄して標記化合物１”（６５■）を得た。分光光度測定により、結合体 は１６％（Ｗ／Ｗ％）の３′−デアミノ−３’　［２（Ｓ）−メトキシ−４−モ ルホリニル］　ドキソルビシン塩酸塩を含有した。

実施例２９ ポリーＬ−ダルタミン酸の結合体１１４の製造実施例２８に記載したと同じ手順 にしたがい、ポリ−Ｌ−グルタミン酸Ｍ　ｗ　２１１（１０〜１５［１０［１（ シグマ社、　Ｏ，Ｌｇ）と１４−Ｏ−（６−ヒドラシノカルポニルテトラヒドロ ビランー２−イル）＝３′−ジアミノー３１：２　（Ｓ）−メトキシ−４−モル ホリニル］　ドキソルビシン［６ｆ　（Ａ、）　（ＭＭ）　、０．０５ｇ１　（ 実施例１５に記載）とをＥＥＤＱの存在下にジメチルホルムアミド中で反応させ た。後処理およびＲＰ−８，４０〜６３＊（メルク社）カラムでの精製の後、５ ０■の標記化合物１１４が回収された。

分光光度測定により、結合体は１２％（Ｗ／Ｗ％）の３′−デアミノ−３’　［ ２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリニル］　ドキソルビシン塩酸塩を含有した。

実施例３０ ヒト黒色腫細胞ラインにおける抗−トランスフェリンリセプタ結合体１３の細胞 結合活性の測定 文献：　ＭＮｓｏｉ、　Ｍ、等、１．　ＩｍｍｏｃｏｌｏＨ，１４１ｆ１９８８ １１４１０ａ■ｏｌ、丁、Ｆ等、ＡＣ１ｉｂＯｄ７−１１ｅｔｌ目＋１ｄ　Ｄｔ ｌｉｖ＋ｒｒ７　Ｓ７＋ｌ＋ｍ。

Ｒｏｄｖ＋ｌＩ、１．　０．　ＥＤ、、！１９８Ｈ５５Ｈｓｔｐ！ｔ、ｊ、Ｒ等 、ＡａｚｌＢｉｏｃｈｅｍ、、ＩＮ　［１９８０）　５１ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４ ８培地（Ｐ　Ｂ　Ｉ　１２／１６７　Ｂ）　、　１０％ＦＣ３（フロー・ラボラ ドリース　２９１０１−５４）　、１％グルタミン中におけるＭＩＯヒト黒色履 細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ８Ｇ２１）を９６穴ミクロタイター板（コスタ−３５９６ ）に塗抹した（細胞ＩＨＯＯ個／穴１個）。３７℃にて１６時間の後、細胞をＰ ＢＳ、３％ＦＣ３で洗浄し、種々異なる濃度の結合体１３　（実施例１８）また は０ＫＴ９抗体と共にＰＢＳ、３％Ｆ　ＣＳ　（１ｏｆｔｔｌｌ）　、５−１ｆ ｌＨ■／　ｍｌ中で３７℃にて１時間培養した。ＰＢＳ、３％ＦＣ８で３０洗浄 した後、西洋ワサビベルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（ビオドラ１７ ２〜１０１１）の１　：　１５００希釈物１００４を各穴に添加した。次いで、 プレートを３７℃で１時間培養し、ＰＢ３３％ＦＣ８で洗浄した。次いで０−フ ェニレンジアミンニ塩酸塩（シクマＰ６９１２）　（０，５ｗ／ａ＋１）および Ｈ２Ｏ２（ｆｌ、Ｇ１５％）の新たに合成した基賀水溶液１ｏｏＪ１１を各穴に 添加した。３７℃にて３Ｇ分間培養した後、２５１１！の４．５Ｎ　ＪＳＯ４を 各穴に添加して反応を停止させ、吸光度をビオラドＥＩＡリーダー・モデル２５ ５０により　４９５■で測定した。この結合体は、第１図に示したように親抗体 と比較して良好な細胞結合活性の保持を示した。

実施例３１ 抗−トランスフェリンリセブタ結合体１　の選択的細胞毒性の測定 文献：　Ｄｉｌ１ｍｉ３　Ｒ，Ｏ等、ＣＪＱＣｅＩ　Ｒｔ、、ｓ、、４８　（１ ９８８）　６０９７＾ｈ口ｘｄ、　Ａ　等、Ａｎｔｉｅｔ口ｃｅＴＲ＋＋、、ユ ０　（１９９０＋　８３７ＭＩＧヒト黒色腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０２１） を、［０％ＦＣ８（フロー・ラボラドリース２９１σ−５４）と１％グルタミン とを含有する　２００ｍのＲＰＭｒ１６４０（ＰＢＩ　１２／１６７　Ｂ）にて ９６穴プレート（コスタ−３５９６）に３７℃で塗抹した（細胞１ＯＮＯ個／穴 １個）。１８時間の後、培地を除去し、１００／ｎの新たな培地を添加した。Ｐ ＢＳ、３％ＦＣ３中における種々異なる濃度の結合体１３および比較物のそれぞ れ５Ｊ１１を３つずつ穴に添加した。これらプレートを３７℃にて２４時間培養 し、次いで０，８μキユ一リー／穴１個の（３Ｈ）チミジン（ＮＥＮ・デュポン ・ＮＥＴ３５５）を２０ｔｉ１の培地に添加し、３７℃にて培養を７時間続げた 。細胞をダイナチク・マルチマッシュ２００Ｇ細胞回収器で濾紙（ワットマン１ ８２７８４２　）上に回収し、フィルタを空気乾燥させ、シンチレーション流体 （コントコン・ア六°リチカル・スーパートロン５６９２０−０４ＮＯ）と共に 小壜に入れ、シンチレーションカウンタ（コントロン・インスツルーメント・ベ ーターマチック）で計数した。

結合体は全て親薬物よりも実質的に低い細胞毒性を有したが、特定の抗−トラン スフエリンリセブタ結合体は無関係な比較結合体よりも５倍優れた効果を示し、 これは２Ｎの化合物のＩＣ５ｏ間の比較が示す通りである。典型的な実験の結果 を東２末結合抗体による抗−トランスフェリンリセプタ免疫結合体１３の細胞毒 性の阻止 文献：　ＣｈｇＩＩｎｄｈｔ＋！、　’ｉ、　Ｋ、等、Ｎ＊ｌａ＋ｅ　３３９　 （１９８９）　３９４Ｂ！１１３．１．　Ｋ、等、　Ｍｏｌ　ｇｌｌｄ　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ、ＩＩ　（１９９１１２２００Ｓｉｓｇｌｌ、　Ｃ，８，等、Ｊ 、　Ｒｉａｌ、Ｃｈｅｗ、２５６　（１９９０１１６３１８ＭＩＯヒト黒色腫細 胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０２１　）を、ＩＯ％ＦＣ３（フロー・ラボラドリース 　２９１０１−５４　）と１％グルタミンとを含有する　２０Ｑｔｌｌ（ＤＲＰ ＭＩＩ６４０ＣＰＢＩ　１２／１６７Ｂ）にて９６穴プレート（コスタ−３５９ ６，）に３７℃で塗抹した（細胞ｌＨＯ’０個／穴１個）、１８時間の後、培地 を除去し、Ｓｏｄの新たな培地を添加した。次いで完全培地における０ＫＴ９抗 体の溶液５０成を３つずつ穴に添加した（　７０００〜５６４／ｌｌの穴におけ る最終濃度）。比較対照穴を５０４の完全培地で処理した。ブレー全 トを４℃にて１時間培養し、次いで完成培地における種々異なる濃度の結合体１ ３の５０ｕ１を添加した（　７０＝　０．５６ｕｇ／　ｍｌの穴中抗体最終濃度 、先の工程で添加された遊離抗体の１　＋　１００モル過剰に相当する）。３７ ℃にて２４時間の後、２０１１１培地中の０８μキユ一リー／穴１個の（３Ｈ） チミジン（ＮＥＮ・デュポン・ＮＥＴ３５５）を添加し、培養を３７℃にて７時 間続けた。細胞を回収し、放射能組込みを実施例３１におけると同様に測定した 。

！３図に示したように、遊離抗体の添加はアントラサイクリン含有量の投与量範 囲にわたり免疫結合体の細胞毒性を阻止し、ここに説明した化合物のリセブタ媒 介効果を確認した。典型的な実験の結果を第３図に示す。

実施例３３ 未結合抗体による、抗−トランスフェリンリセプタ免疫結合体１３細胞毒性の投 与量反応阻止 ＭＩＯ細胞を塗抹すると共に、実施例３２に記載したように、１８時間培養した 。その後、培地を除去し、５０１１１の新たな培地を添加した。次いで完全培地 中０ＫＴ９抗体の溶液５０ｄを３つずつ穴に添加した（　２１２０〜２１．２Ｎ 　／　ｍｌの各穴中最終濃度）。比較対照穴を５０ｕ１の完成培地で処理した。

これらにプレートを４℃にて１時間培養した。次いで、完成培地における５０１ １１の結合体１３を添加した（　２．１２ｑ　／　ｍｌの各穴中抗体最終濃度） 。細胞を培養し、回収し、次いで放射能組込みを実施例３１と同様に測定した。

第４図が示すように、結合体細胞毒性の投与量反応に関する阻止を種々異なる過 剰量の未結合抗体による細胞の予備処理で行ない、化合物のリセブタ媒介細胞毒 性を確認した。

実施例３４ ＦＧＦ結合体１７の選択的細胞毒性の測定実施例３１と同様に操作すると共に式 １７の結合体を用いて、ＦＧＦ結合体の選択的細胞毒性を示した（第５図）。

実施例３５ 実施例３１に記載した手順およびアントラサイクリンとリンカ−と標的キャリヤ との種々異なる組合わせを用いて種々異なる結合体を作成し、その細胞毒性を種 々異なる細胞ラインにつき試験し、その際非結合性結合体を比較として用いた。

′Ｍ１表が示すように、特定の結合体は富に比較の非結合性結合体と対比して腫 瘍細胞の成長を一層効率的に阻止する。ｒＣｉｏ間の比を、化合物の選択性の指 数とし採用することができる。たとえば特定結合体の７〜３８９６は、比較結合 体の　ＩＨ％投与量と同程度に細胞毒性である。観察された選択性は、種々異な るアントラサイクリンとリンカ−と標的細胞とを用いて種々の培養時間にわたり 行なった実験から確認された。

第１表 ＩＣ５ＱＸＩＯＥ７　１ｃ５０ 特定配合体　比較配合体　標的細胞　培養時間　特定／比較　比１’　１’　Ｍ ｌｏ　２４　５．０／２１．０　１１．２３〃〃〃４ｇ　１．２／６．８　０． １７／ｌ　〃　〃　ア２　＋、７　／　５．　６　０．　３０〃／Ｍ１４　４８ 　３．９／１６．０　Ｇ、２４１１〃〃７２　５．０／１７．０　Ｇ、２９〃〃 ０ＹＣＡ１３　７２　４．１／１１０　０．２３〃〃Ａ４３１　２４　９．１／ ４０．０　Ｇ、２３〃〃〃７２　０．４／２．３　０．１７〃〃Ｍ１４　２４　 １．２／１１．０　Ｇ、１０〃〃〃７２　１．６／１２．０　Ｇ、１３１”　１ ”　ＩＪＩＯ２４２，２／９．０　０．２４〃〃〃７２　３．０／８．０　０Ｊ ８ 〃”　ＭＩ４　２４　５．１／＞１０．Ｏｎ、ｄ。

”　”　”　７２　６．０／＞１０．Ｏｎ、ｄ註　標的細胞の記号： ＭＩＯ：ヒト黒色腫、ＡＴＣＣＣＲＬ　８０２１Ｍ１４　：黒色腫［Ｎｚ１ｚｌ ｉ、Ｐ、　Ｇ、等、）、１ｍｍａｎｏ１１Ｍｅｆｌ＋、　６２　（ＩＨ３）、　 ３３７］０ＶＣＡＲ−３：　ヒト卵巣癌、ＡＴＣＣ１（ＴＢ　１６１＾４３１： 　ヒト類寥υ支頂竪、ＡＴＣＣＣＲＬ　１５５５　。

実施例３６ 化合物１１４の評価 化合物１１４を、３′−デアミノ−３′　［２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリ ノ］　ドキソルビシン（ＤＭＭ）およびドキソルビシンと比較して、ドキソルビ シンに耐性のＰ３８８ネズミ白血病に対し「インビボ」で評価した。データを第 ２表に示す。この結合体は同様な抗腫瘍活性を示したが、遊離薬物の高い投与量 であった。

化　合　物　投与量”　Ｔ／Ｃ”　ＴＯＸ（■／ｋｇ）　％ １１４５、２　”’　２００　Ｇ／１Ｇドキソルビシン　１６．９　Ｉｏ００／ １ＧＤＭＭ″”　０．０９　１９２　０／３９註、（１）細胞１Ｇ’個／マウス 匹（Ｐ３８ｇ／Ｄｘ　、ジｖンソン）　、　ＣＤＦＩマウスに１マて移植。腫瘍 を接種してから１日後に処理。

（２）最適投与。

（３）未処理比較に対するメジアン生存時間％。

ｆ４１活性薬物、３′　−デアミノ−３’　［２（Ｓｌ−メトキン−４−モルホ リノ］　ドキソルビシンｆＤＭ＆Ｉ）の投与。

（５）３−デアミノ−３’　［２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリノ］ドキンル ビンン。

要　約　書 ［式中、部分Ａ−〇−は少なくとも１個の第一もしくは第二ヒドロキシル基を有 する式Ａ−０−Ｈのアントラサイクリンの残基であり：ａは１〜３０の整数であ り；Ｗは式２：の残基であり（ここでＢは必要に応じヘテロ中断されたＣ１〜Ｃ ６アルキレン基を示し、ｍはＯもしくは１であり）：２はスペーサ基であり、Ｔ はキャリヤ部分である］の結合体。

本発明の式１を有する結合体は、ヒドロニウムイオン触媒の加水分解または「イ ンビボ」酵素切断に際し親ドラグＡ−０−Ｈを放出するアセタール結合を宵して いるので有用な抗腫瘍剤となる。

国際調査報告 トＯｒｍＰＣＴ／ｌ５Ａｎ１０１９−一−噛１１ｖ賞１１１内−−１＋２１１− １’に＋２６０シ１１国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．式１ 〔Ａ−Ｏ−Ｗ−Ｚ］１−Ｔ　１ 〔式中、部分Ａ−Ｏ−は少なくとも１個の第一もしくは第二ヒドロキシル基を有 する式Ａ−Ｏ−Ｈの任意のアントラサイクリンの残基であり；ａは１〜３０の整 数であり；Ｗは式２：▲数式、化学式、表等があります▼　２の残基であり（こ こでＢは必要に応じヘテロ中断されたＣ１〜Ｃ６アルキレン基を示し；ｍは０も しくは１であり）；Ｚはスペーサ基であり、Ｔはキャリヤ部分である］の結合体 。
2. ２．（ｉ）Ｚが−ＮＨ−を示し、Ｔ−Ｚが少なくとも１個の遊離アミノ基を有す る式Ｔ−ＮＨ２のキャリヤの残基を示すか、または（ｉｉ）ＺがＮＨ−［Ｄ］ｄ −Ｎ＝ＣＨ−であり［ここでｄは０〜２の整数であり、［Ｄ］は−ＮＨ−ＣＯ（ ＣＨ２）ｎＣＯ−ＮＨ−（ｎは２もしくは４である）を示し］、Ｔ−Ｚが少なく とも１個のホルミル基を有する式Ｔ−ＣＨＯ、またはＴ［ＣＯＯＨ〕ａ（ここで ａは請求の範囲第１項に記載の意味を有する〕のキャリヤの残基からなるか、ま たは（ｉｉｉ）Ｚがピペラジニルカルボニル部分または式−ＮＨ−［Ｄ］ｄ−Ｎ Ｈ−ＣＯ−（ここで［Ｄ］およびｄは上記の意味を有する）の基であり、Ｔ−Ｚ が上記式Ｔ−［ＣＯＯＨ］ａのキャリヤの残基からなる請求の範囲第１項に記載 の結合体。
3. ３．少なくとも１個の第一もしくは第二ヒドロキシル基を有するアントラサイク リンが式３： ▲数式、化学式、表等があります▼　３［式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシも しくはメトキシ基であり； （ｉ）Ｒ２はヒドロキシ基であり、Ｒ４およびＲ５の一方は水素原子であり、か つＲ４およびＲ５の他方はヒドロキシ基であり、Ｒ４は沃素原子であり、Ｒ５は 水素原子であるか、またはＲ４とＲ５との両者は水素原子であるか、あるいは（ ｉｉ）Ｒ２は水素原子であり、Ｒ４およびＲ５の一方はヒドロキシ基を示しかつ Ｒ４およびＲ５の他方は水素原子であり；Ｒ３はアミノ基であるかまたはモルホ リノ環に含まれる窒素原子を示す］ を有する請求の範囲第１項に記載の結合体。
4. ４．部分Ａ−Ｏ−が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１およびＲ３は請求の範囲第３項に記載の意味を有し、Ｒ４およびＲ ５の一方は水素原子でありかつＲ４およびＲ５の他方はヒドロキシ基であるか、 またはＲ４は水素原子もしくは沃素原子であり、Ｒ５は水素原子であり］を示す 請求の範囲第３項に記載の結合体。
5. ５．部分Ａ−Ｏ−が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１およびＲ３は請求の範囲第２項に記載の意味を有する］ を示す請求の範囲第３項に記載の結合体。
6. ６．Ｂが−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−、− Ｃ３Ｈ６−もしくは−Ｃ６Ｈ１２−を示す請求の範囲第１〜５項のいずれかに記 載の結合体。
7. ７．キャリヤが腫瘍関連抗原に結合しうるポリクローナル抗体または抗原結合部 位を含むその断片；腫瘍細胞集団で優先的または選択的に発現される抗体に結合 しうるモノクローナル抗体または抗原結合部位を含むその断片；腫瘍細胞に優先 的もしくは選択的に結合しうるペプチドもしくは蛋白；および高分子キャリヤか ら選択される請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の結合体。
8. ８．キャリヤが抗−Ｔ細胞抗体、抗−ＣＤ５抗体、抗−トランスフェリンリセブ タ抗体および抗−黒色腫抗体、抗−癌マーカー抗体、抗−卵巣癌抗体、抗−乳癌 抗体および抗−膀胱癌抗体から選択される請求の範囲第７項記載の結合体。
9. ９．キャリヤが成長因子である請求の範囲第７項に記載の結合体。
10. １０．（ａ）式４： Ａ１−Ｏ−Ｗ−ＯＨ　４ ［式中、Ａ１−Ｏ−は少なくとも一個の第一もしくは第二ヒドロキシル基を有す ると共にモルホリノ基により保護もしくは置換された糖部分のアミノ基を有する アントラサイクリンの残基であり、Ｗは請求の範囲第１項に記載の意味を有する ］の誘導体を式５： Ａ１−Ｏ−Ｗ−Ｌ　５ ［式中、Ａ１−Ｏ−およびＷは上記の意味を有し、Ｌはアミド結合を形成する活 性化基を示す］ の活性化された誘導体まで変換させ； （ｂ）（ｉ）上記式５の得られた化合物を請求の範囲第２項に記載の式Ｔ−ＮＨ ２の化合物と縮合させるか、または（ｉｉ）式５の活性化された化合物を式ＮＨ ２−［Ｄ］ｄ−ＮＨ２（ここでＤおよびｄは請求の範囲第２項に記載の意味を有 する）の誘導体と反応させ、必要に応じ得られた式６：Ａ１−Ｏ−Ｗ−ＮＨ−［ Ｄ］ｄ−ＮＨ２　６［式中、Ａ１−Ｏ、Ｗ，ｄおよび［Ｄ］は請求の範囲第２項 に記載の意味を有する］ の誘導体を保護解除すると共に、これを請求の範囲第２項に記載の式Ｔ−ＣＨＯ もしくはＴ−［ＣＯＯＨ］ａの化合物と縮合させるか、または （ｉｉｉ）式５の化合物を１，４−ピペラジンと反応させ、得られた式７： ▲数式、化学式、表等があります▼　７［式中、Ａ１−Ｏ−およびＷは上記の意 味を有する］の化合物を、必要に応じ縮合剤の存在下に、上証式Ｔ［ＣＯＯＨ］ ａの化合物と縮合させて式１の結合体を生成させ、ここで必要に応じ存在する未 反応の活性化カルボニル基は医薬上許容しうるアミンによりクエンチングしうる ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の式１を有する結合体の製造方法。
11. １１．医薬上許容しうるキャリヤもしくは希釈剤と、活性成分としての、請求の 範囲第１〜９項のいずれかに記載の結合体または請求の範囲第１０項に記載の方 法により製造された結合体とからなる医薬組成物。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載の式４の誘導体。
13. １３．４′−エピ−４′−Ｏ−（２−カルボキシテラトヒドロピラン−６−イル ）−３′−デアミノ−３′−（４−モルホリノ）−ダウノルビシン； １４−Ｏ−（２−カルボキシテトラヒドロピラン−６−イル）−３′−デアミノ −３′−（２−メトキシ−４−モルホリノ）−ドキソルビシン；および １４−Ｏ−（２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロピラン−６−イ ル）−３′−デアミノ−３′−（４−モルホリノ）−ドキソルビシンから選択さ れる請求の範囲第１２項に記載の誘導体。
14. １４．（ａ）必要に応じ保護された請求の範囲第１項に記載の式Ａ−Ｏ−Ｈを有 するアントラサイクリン（ただしアントラサイクリンＡ−Ｏ−Ｈにおける糖部分 のアミノ基は遊離もしくは保護アミノ基の形態である）を式８： ▲数式、化学式、表等があります▼　８［式中、Ｂおよびｍは請求の範囲第１項 に記載の意味を有し、Ｒｘは保護基である］ のジヒドロピランカルボキシル誘導体と縮合させ；（ｂ）得られた中間体から各 保護基を除去することにより式４′： Ａ−Ｏ−Ｗ−ＯＨ　４′ ［式中、Ａ−Ｏ−およびＷは請求の範囲第１項に記載の意味を有し、ただしアン トラサイクリン残基Ａ−Ｏ−における糖部分のアミノ基は遊離アミノ基の形態で ある］の誘導体を生成させ； （ｃ）（ｉ）式４′のアントラサイクリンにおける糖部分の遊離アミノ基をモル ホリノ誘導体まで変換させるか；または（ｉｉ）式４′の前記アントラサイクリ ンの前記遊離アミノ基を保護する ことを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の式４を有する誘導体の製造方法。
15. １５．請求の範囲第１４項に記載の式４′を有する誘導体。
16. １６．４′−エピ−４′−Ｏ−（２−カルボキシテトラヒドロピラン−６−イル ）−ダウノルビシン； １４−Ｏ−（２−カルボキシテトラヒドロピラン−６−イル）−ドキソルビシン ：および １４−Ｏ−（２−カルボキシメチルオキシメチル−テトラヒドロピラン−６−イ ル）ドキソルビシン から選択される請求の範囲第１５項に記載の誘導体。
17. １７．（ａ）必要に応じ保護された請求の範囲第１項に記載の式Ａ−Ｏ−Ｈのア ントラサイクリン（ただしアントラサイクリンＡ−Ｏ−Ｈにおける糖部分のアミ ノ基は遊離もしくは保護アミノ基の形態である）を請求の範囲第１４項に記載の 式８のジヒドロピランカルボキシル誘導体と縮合させ；（ｂ）得られた中間体か ら各保護基を除去することを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の式４′を有 する誘導体の製造方法。
18. １８．請求の範囲第１０項に記載の式５を有する誘導体。
19. １９．４′−エピ−４′−Ｏ−（２−スクシンイミドカルボニルーチトラヒドロ ピラン−６−イル）−３′−デアミノ−３′−（４−モルホリノ）−ダウノルビ シン；１４−Ｏ−（２−スクシンイミドカルボニル−テトラヒドロピラン−６− イル）−３′−デアミノ−３′−（２−メトキシ−４−モルホリノ）−ドキソル ビシン；および １４−Ｏ−（２−スクシンイミドカルボニルメチルオキシメチルーテトラヒドロ ピラン−６−イル）−３′−デアミノ−３′−（４−モルホリノ）−ドキソルビ シン から選択される請求の範囲第１８項に記載の誘導体。
20. ２０．請求の範囲第１０項に記載の式４を有する誘導体を式５の対応の前記誘導 体まで変換させることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の式５を有する誘 導体の製造方法。
21. ２１．請求の範囲第１０項に記載の式６もしくは７を有する誘導体。
22. ２２．（ｉ）請求の範囲第１０項に記載の式５有する誘導体を１，４−ピペラジ ンもしくは式ＮＨ２−［Ｄ］ｄＮＨ２の誘導体と反応させ、必要に応じ得られた 式６もしくは７の誘導体を保護解除する ことを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の式６もしくは７を有する誘導体の 製造方法。
23. ２３．請求の範囲第１４項に記載の式８を有するジヒドロピランカルボキシル誘 導体。
24. ２４．２−エトキシカルボニル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン； ２−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルオキシ酢酸エチル； ２−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルオキシ酢酸メチル； ２−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルチオ酢酸エチル；お よび ２−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアミノ酢酸エチルか ら選択される請求の範囲第２３項に記載の誘導体。
25. ２５．抗腫瘍剤として使用する請求の範囲第１項に記載の式１を有する結合体。
26. ２６．処置を必要とする患者に医薬上有効量の請求の範囲第１項に記載の式１を 有する結合体を投与することを特徴とする腫瘍の処置方法。