JPH05504253A

JPH05504253A - ワクチニアウィルスのポリペプチドのシグナル配列をコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH05504253A
Application number: JP2510018A
Authority: JP
Inventors: ガフニィー，デイレナ・フランシス; パテル，アルヴィンド・ヒラブハイ; ストウ，ナイジェル・デニス; スバク―シャープ，ジョン・ハーバート
Original assignee: ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド
Priority date: 1989-07-11
Filing date: 1990-07-10
Publication date: 1993-07-08
Also published as: GB9015168D0; CA2063389A1; EP0482061A1; EP0408301A1; AU633334B2; GB2233655B; GB2233655A; AU5955590A; GB8915870D0; WO1991000911A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】９、請求項８において請求した動物細胞により生産される外来タンパク質。

明　細　書ワクチニアウィルスのポリペプチドのシグナル配列をコードするＤＮＡ発朋Ω宵量上−発皿Ω公野本発明は組み換えＤＮＡの分野におけるものであり、ワクチニアウィルスの系統によって発現されるポリペプチドの分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに関連する。

Ｉ−元行伏街Ω説朋最近ワクチニアウィルスは哺乳類の細胞中へ外来遺伝子を導入するためのベクターとして使われている。ウィルスは哺乳類の宿主中で完全ではないまでも少なくとも限定された複製が可能であるように、外来遺伝子がウィルスの不可欠な機能を妨げないようなウィルスのゲノム中の「非本質的な部分」の中へ導入される。

外来遺伝子の転写はワクチニアウィルスのプロモーターを要求し、そのプロモーターはゲノム中のどこか他の所から関連したＤＮＡを切り取ることによって得られ、非本質的な部分の中の外来遺伝子の上流へ一緒に挿入される。

最も広く使われるワクチニアウィルス（ＶＶ）のプロモーターはｒ７．５に、プロモーター（Ｐ７．５Ｋ）である、それは相対分子量約７．５キロダルトンのタンパク質をコードする遺伝子（７，５に遺伝子）の転写を促進する。その遺伝子とプロモーターの部分配列はペンカテサンら（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ　ｅ±　１ ±、）。

Ｃｅ１ｌ　２５．８０５−８１３　（１９８１）によって部分的に決定された。

ＶＶＩＩＩみ換え体の発現を改良することにかなりの興味がもたれている。

例えば狂犬病ウィルスのワクチンのためのベクターとしての利用をもたらしたｖ ■についての主要な研究は、はとんど専らウェスタン　リザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｒｅ５ｅｒｖｅ）（ＷＲ）系統を用いて行なわれた。

１０年以上前に、エバンス（Ｅｖａｎｓ）系統を用いた研究でＭ、　Ａ、マノククラエ（Ｍ、Ａ、ＭｃＣｒａｅ）およびＴ、Ｈ，ペニングトン（Ｔ、Ｈ，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２８．８２８− ８３４　（１９７８）には、感染後２から２．５日間後に細胞培養培地中に大量に分泌されてそして分泌が続けられる相対分子量約３５ＫＤの■■ポリペプチドが記述されている。しかし本発明者らの１人はエバンス（Ｅｖａｎｓ）系統は十分に増殖しないことを見い出した。そのポリペプチドはよく用いられるＷＲ糸系統は決して確認されていない、（ＷＲ糸系統用いた研究で、Ｇ、Ｊ、　コトワルおよびＢ、モス（Ｇ、Ｊ、Ｋｏｔｗａ　Ｉ　およびＢ、Ｍｏ５ｓ）、Ｎａｔｕｒｅ１１５．１７６−１７８　（１９８８）には３５ＫＤのポリペプチドの精製およびそれをコードする遺伝子のＤＮＡ配列が報告されているが、しかし彼らはマノククラエおよびペニングトン（ＭｃＣｒａｅ　ａｎｄ　Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）が報告したものとは実際に異なる３５ＫＤのポリペプチドを記述している〕。

発朋辺概要本発明者らの研究は、３５ＫＤポリペプチドがリスター（Ｌｉｓｔｅｒ）系統から分泌されて、この系統はよく増殖するという発見、およびＶＶのリスター（Ｌｉｓｔｅｒ）系統は３５ＫＤポリペプチドのための強力なプロモーターを含んでいるであろうという期待に基づいていた。■ｖ組み換え体の中で異種の遺伝子の発現を増強するために、すなわち７．５にプロモーターに改良を加えるために、そのようなプロモーターは異種の遺伝子へ連結するために有用であろう。

しかしｒ３５に、遺伝子のクローニングとンークエンンングに基づいて、そのプロモーターの配列はＷＲ糸系統７．５にプロモーターのそれとほぼ同一であることが見いだされた。

しかしリスター（ＬｉｓＬｅｒ）系統の３５に遺伝子はシグナル配列を含むことが見いだされた。シグナル配列はポリペプチドが感染された細胞の細胞膜を通過して培養培地へ入ることを可能にするものである０分泌の間にシグナル配列は切断されて、培養培地中での成！したタンパク質の生産という結果になる。この例では推定のシグナル配列は３５に遺伝子のンークエンシングおよびその配列を７．５に遺伝子のそれと比較することによって初めに発見された。

この遺伝子のオーブンリーディングフレームの最初の１２のコドンは２つのウィルスで同じであるが、しかしその後はそれらに相違がある。３５に遺伝子の推定のシグナル配列は３５に遺伝子のオープンリーディングフレームの最初の１７のコドンから成る。このオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の最初の２０のコドンを下に示した：ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＡＴＣＧＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＧＣＡＴＧＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＭｅｔＴＧＣＣＴＧ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＣＣＡＧＴＣｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　５ｅｒ（下線が省略されて番号がつけられていることだけが異なる配列ＩＤＮ０：１も見よ）、アンダーラインの付いた部分はＷＲ糸系統対応するＤＮＡには存在しない塩基を表わす。３５に遺伝子（３５ＫＤプロテインがそこから翻訳される遺伝子を示すためにここで用いられる用語）は、それがこれらの付加的な塩基を含むという点でのみならず、付加的な配列のすぐ下流でフレームシフトが起きているという点でも７．５に遺伝子と異なってコードしている。成熱したタンパク質の相対分子量が３５ＫＤであるとの本明細書中での言及は便宜的な表現であり、この分子量が必ずしも正確であることを示すこととして用いてはいない、正確な推定分子量は後に示すアミノ酸配列から計重できる。

本発明は、カセットの製造での使用に、究極的には庖癒ウィルスのゲノムの中への挿入に遺したＤＮＡ分子、すなわち次のアミノ酸配列（配列ＩＤ　ＮＯ：２）をコードするＤＮＡ分子を提供する：Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＡｌａＡｌａ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　。

この配列：よ４つの付加的なアミノ酸の１つ、２つ、３つ、すなわちＬｅｕ、おそら＜ｃ＋７、おそらくもう１つのＧ　ｌ　ｎおよびその後のＳｅｔをさらに含んでもよく（配列ＩＤ　ＮＯ：２のＣ末端から続いて含む）、本明細書中で「シグナル配列ＤＮＡＪと呼ばれる。最初の１７のコドンのみが３５ＫＤタンパク質の分泌に要求されるらしいが、それにもかかわらず、成熟した３５ＫＤタンパク譬のアミノ酸をもコードする少なくとも３つの他のコドンは組換えベクター中でソゲナル配列の使用に不可欠と考えられるので、「シグナル配列」という用語が用いられる。

アミノ酸の適当な置換によって、特にｌｉｅより前方の疎水性の範囲内で疎水的なアミノ酸への置換（Ｇｌ　ｙ、　Ａｌａ、Ｖａ　ｌ、Ｉ−ｅｕ、＋　１４．　Ｃｙｓ。

Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓおよび時にはＬｙｓ）によってシグナル配列ＤＮＡを変えることができる。そのようなｆ換の許容できる程度は実験によって決定することができる。

好ましくはカセットはプロモーター、例えば７．５にプロモーターまたは３５に遺伝子の前にあるプロモーターのような望ましくは強力なプロモーター、を含む。

外来遺伝子を容易に挿入できるように、カセットはシグナル配列の下流にマルチクローニング部位も含むことが好ましい。

哺乳類の細胞中へ導入される外来遺伝子は、原則として細胞へ感染させるときに用いる予定のポックスウィルスに関して外来の任意のものであってよい、したがって、カセットはシグナル配列ＤＮＡとフレームの合った外来遺伝子も含んでおり、便利である。

したがって好ましいカセットは転写が起こるように互いに連結した次の因子から成る：　−（（ＶＶ７．５にのようす）　７’Ｏモーター〕−Ｃ”シダーｊ−ル配列ＤＮＡ」ＩＩ−〔随意であるが例えば配列ＩＤ　ＮＯ：３のような３５に遺伝子からさらに下流の配列、しかし配列ＩＤ　ＮＯ：３の最初の４つのアミノ酸をコードするＤＮＡはシグナル配列ＤＮＡの一部であるかもしれず、次にここでは繰り返されないだろうということを心に留めておくべきである〕−〔外来遺伝子または外来遺伝子の挿入のためのマルチクローニング部位〕−〔ウィルスの転写終結シグナル〕。

カセットＤＮＡをその両端に隣接したポックスウィルスの配列（感染するポックスウィルス由来）と共にもつバクテリアのまたはイーストのプラスミドのようなベクターを本発明は含む０本明細書中ではこれは「組換えベクター」と呼ばれ、最終的には相同的組換えの過程に利用するためのベクターを意味する。相同的組換えにおいて、組換えベクター中の隣接したポックスウィルスの配列は、感染するポックスウィルスの「ＩＬＪ系統の中に対応する配列と置き換わり、それによってカセットＤＮＡはそのポックスウィルス中へ挿入されるようになる。

外来遺伝子の挿入のためのマルチクローニング部位をもち、３つの可能なオープンリーディングフレームのどれにでもシグナル配列とフレームを合わせてそれを挿入できるこの型の３つの別個のプラスミドが提供されることが理想である。

さらに本発明は、相同的組換えから得られ、そのためにカセットＤＮＡを含む組換えポックスウィルス、その＆１１換えポックスウィルスによって感染された動物細胞、試験管内での培養によって組換え体に感染された細胞から直接的にまたは間接的に得られる外来タンパク質、および出願国の特許法が許す範囲で組換えウィルスを実験動物へ投与することから成るワクチン接種方法を含む。

凹血凶璽単犀説朋図１はワクチニアウィルス（リスク−（Ｌｉｓｔｅｒ）系統）のゲノムの一部の制限マツプであり、３５に遺伝子の位置を示す；図２は本発明の岨換えベクターの調製に使用するための好ましいカセットの構築を模式的に示したプラスミドの説明図である；図３　（３ａ＋３ｂ）は、シグナル配列を含むカセノ）ＤＮＡを含む本発明の組換えベクターの構築を、比較の目的のために作られた他の組換えベクター（そしてこれらはワクチニアウィルスの３５Ｋまたは７．５に遺伝子中への相同的組換えに用いることができる）とともに示したプラスミドの誘導体形成を直線状態で説明する工程図である；および図４　（−４ａ＋４ｂ）は本発明の組換えベクターおよびワクチニアウィルスのＴＫ遺遺伝子への相同的Ｍｉ換えに用いることができる、比較のための組換えベクターの構築を示したプラスミドの誘導体形成を直線状態で説明する別の工程図である。

炸り旦粒慧欅■説朋本発明は一般的にポックスウィルスのベクターに関して興味がある。ポックスウィルス族はＶｖ７．５にプロモーターを鶏痘、ヤギ痘、牛痘、および鳩痘中で用いるのに十分なほどの層像性がある。以下において本発明を■Ｖに基づいて説明するが、プロモーターおよびシグナル配列の組合せは、７．５にプロモーターがそのゲノムのＤＮＡの転写に機能する他の任意のポックスウィルス中において、遺伝子の発現および産物の分泌を促進するために有用であると認識されるだろう。

本発明のシグナル配列は３５にプロモーターＤＮＡまたはその前に位！する７、５にの８物に関連して主に用いられる。コクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）ら、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ　昼Ａ、３０−３７　（１９８５）によａば、ＶｖのＤＮＡのＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の１３７ｂｐは、ＷＲ糸系統おける７、５にプロモーターの初期および後期促進機能の両方を含むことがわかる。これらの１３７ｂρの中で、最後の１８ｂｐ（後ろに数えて）はコクラン（Ｃｏｃｈ、ｒａｎ）らの論文に記述された構築物中には存在せず、そのためにおそらく不可欠ではない、リスター（Ｌ　ｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ）系統の３５にプロモーターはほぼ同一であり、ｍＲＮＡの推定の転写開始点の８６ｂｐＪ：流までの部分の中にわずか２つの塩基の置換があるのみである。１３７−１８＝１１５ｂｐの長さはもし望むならば短くすることができ、例えばデレージョン地図作成、オリゴヌクレオチドの合成、位置特異的突然変異などの該当分野でよく知られた実験によって決めることにより、プロモーター中で様々なデレージョンまたは変化を作ることができるであろう、そのような様々な配列のすべては、ここで用いられるｒ７．５にプロモーターＪ　（Ｐ７．５Ｋ）または「３５にプロモーターＪ　（Ｐ３５Ｋ）という用語の範囲内にある。

しかし、シグナル配列はポックスウィルス中で他のポックスウィルスのプロモーターとともに、または、例えば単純庖疹ウィルス中のような他のウィルス中でそれぞれのプロモーターとともに、用いることができる可能性がある。

シグナル配列はプロモーターの強さにかかわりなく分泌を確実にするであろうから、プロモーターは強力なものである必要はない。

上に示した、分泌後に切断される３５ＫＤタンパク質の前駆体であるポリペプチドの部分は、メチオニン（Ｍｅｔ）残基を末端に有し、その直後のプロリン（Ｐｒｏ）残基が成熟した３５ＫＤタンパク質のＮ末端のデミノ酸になる０本発明では前駆体ポリペプチドのシグナル配列をコードする任意の１７コドンのＤＮＡは、成熟した３５ＫＤタンパク質のＮ末端の少なくとも３つのアミノ酸、好ましくはＮ末端の少なくとも５つのアミノ酸と結合し、望まれる外来遺伝子（ポックスウィルスに関して外来であるもの）がその後に続く、これによって外来遺伝子が宿主細胞によって分泌されることが標準的に保証されるだろう、したがって、分泌されるタンパク質は、Ｎ末端で成熟した３５ＫＤタンパク質のＮ末端の部分のアミノ酸と融合した外来タンパク質であろう、成熟した３５ＫＤタンパク質のＮ末端のアミノ酸の望ましい数は、実験で決めなければならない問題であるが、しかし融合ポリペプチドの発現は、外来遺伝子の融合のためのオープンリーディングフレーム（シグナル配列も含めて）の２２番目または４２番目のコドンの位１を用いたときに得られた。

３５Ｋ（または７．５Ｋ）プロモーターは絶対的要件ではなく、任意のポックスウィルスのプロモーターの後にシグナル配列を挿入することができる。プロモーターが同じウィルスに由来するということさえ絶対的要件ではない０本発明は例えばプロモーターおよびシグナル配列ＤＮＡを含むカセットを作成することによる、またはシグナル配列ＤＮＡを別に導入することによる挿入の任意の方法を含む、實際に位置特異的突然変異を現存するＤＮＡを変えるために使うことができるだろう。

現在最良と考えられるのは、カセットＤＮＡが割り込んだまたはカセットを含むポックスウィルスのゲノムの非不可欠部分から成る構築物、即ちプロモーター、シグナル配列、随意であるが３５にシグナル配列のすぐ下流の成るＤＮＡ、外来遺伝子の配列を導入するためのマルチクローニング部位、および随意であるがウィルスの転写終結因子、をこの順で含む構築物を作成することであると考えられている０例を挙げるために図２を参照すると、プラスミド’ＰＩＪ（任意の名称）は非不可欠部分の左側の配列、プロモーター、シグナル配列、ｗ、　ｘ、　ｙおよびＺ（４つを示したが、「マルチ」の用語は２つ以上を意味する）の制限サイトをもつマルチクローニング部位および非不可欠部分の右側の配列を含む。（上で列挙した随意の付加的な成分は例を明快にするために省略した）。Ｘはプラスミド「ｐ２」からの配列Ｘ−Ｘをクローニングサイトに挿入することを可能にする制限サイトであり、その結果組換えプラスミド「Ｐ３」が得られる。

そのようなプラスミドの構築物を用いて、組換えはポックスウィルスのゲノムの非不可欠部分（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇｉｏｎ）（ＮＥＲ）中で起こるだろうと期待できる。したがってＮＥＲは外来遺伝子の発現に用いる予定のものと同しポックスウィルスのもの、そしてもし可能ならば同し系統のものであることが好ましい、さらにあるＮＥＲはいくつかのポックスウィルス中で実質的に相同性があるかもしれず、その場合にはＮＥＲは同一のウィルスのものである必要はない０組換えベクターのＮＥＲの感染させるポックスウィルス（すなわち組換えはその中で起きるウィルス）のＮＥＲとの正確な相同性は必ずしも必要ではない、適当なＮＥＲＯ例はワクチニアウィルスにとってはＴＫＫ伝子または３５に遺伝子（これは不可欠ではなく、そして末端の逆転した繰返し部分の中にある）であり、そして鶏痘ウィルス（ＦＰＶ）にとっては、ＮＲＤＣのイギリス特許出願公開第２２２０９４１Ａ　（または対応のＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／１２６８４）に記述されているように逆転した末端の繰返しくＩＴＲ）中の非不可欠部分であるが、しかしＮＥＲのゲノム中での位！は重要ではない。外来遺伝子がＩＴＲ中にある場合は、２コピーの外来遺伝子がポックスウィルスのゲノムに入る。

理論的には少なくとも相同的組換えにはＮＥＲは必要ではなく、プロモーター、シグナル配列および外来ＤＮＡが非不可欠部分の中へ挿入されるかぎり相同的組換えは不可欠な遺伝子の中で起こることができる。したがってＮＥＲそれ自身はその中に不可欠な遺伝子が存在する部分に隣接することができる。カセットはその両端に少なくとも１０００ｂｐの隣接した配列、すなわちＮＥＲ配列と随意のある：（１）相同的組換えが可能なポックスウィルスゲノムの第一の配列；（２）ポックスウィルスゲノムの非不可欠部分（ＮＥＲ）の最初の部分の中にある配列；（３）プロモーターＤＮＡ；（４）転写ができるようにプロモーターに結合させた、すなわち転写が起こるような方法で結合させた、本発明のシグナル配列ＤＮＡ；（５）シグナル配列ＤＮＡとフレームを合わせた外来ＤＮＡ；（好ましくは更に５Ａとして；ポックスウィルスと適合する転写終結シグナル）；（６）前記のＮＥＲの２番目の部分の中にある配列；および（７）相同的組換えが可能なポックスウィルスゲノムの第二の配列。

必要な組換えベクターを生産するために、そのような構築物をバクテリアのプラスミドベクターのような適当なベクターの中へクローニングする。

配列（１）および（２）は必ずしも別個のものではなく、（６）および（７）もまたそうである、終結シグナルは成％ｍＲＮＡの生産には重要かもしれない。

組換え体ＶＶまたは他のポックスウィルスを生産する組換えは、ｖＶ組換え技術において知られている任意の方法によって起こすことができ、ポックスウィルスの適当な系統を動物細胞中へ試験管内で導入すること、およびまた本発明の組換えベクターをこれらの細胞へ導入することを含む、ｖＶが感染できる任意の動物細胞例えばラット、ウサギ、トリまたはヒトでさえも使用可能であろう。

本発明が企図する主要な利用は、タンパク質として発現させるべき外来ＤＮＡの動物細胞への導入のためのベクターとして、ワクチニアウィルスまたは別のウィルスを用いて、試験管内でタンパク質を合成することにある。しかし、例えば鶏痘ウィルスで家禽にワクチン処理するように、組換えポックスウィルスでワクチン処理すべき動物生体内での外来産物の生産のためにシグナル配列を組み込むことも有益である可能性がある。

このようにして生産された外来タンパク質は、外来タンパク質の配列に融合した成熟した３５ＫＤ　ＶＶタンパク質のアミノ酸を瞼去するための、そして／またはｔｌ鎖を除去するための酵素による処理をおそらく必要とするであろう、任意の伝統的なそのような処理を用いることができる。本発明は、直接的であろうと間接的であろうと動物細胞から得られた外来タンパク質を含む。

次の寞施例により本発明を説明する。

実施廻１３５ＫＤポ！ペプチ′本コード　る　−　の　のための　法３５ＫＤポリペプチドをコードする遺伝子の地図を作成するために用いられる戦略は数段階を含んだ：（１）初めに３５ＫＤポリペプチドを精製して、感染細胞のｍ　ＲＮ　Ａから試験管内で合成したポリペプチドの中から３５に遺伝子の産物を認識できる抗血清を作成するために用いた。

（１１）ワクチニアウィルスのゲノムの全体に由来するいくつかの特定のＤＮＡ断片を、３５ＫＤタンパク質の試験管内での翻訳を阻害する能力についてテストした。

軸）翻訳を阻止した小さい（２，，２ｋｂ）ＤＮＡを同定し、そのＤＮＡ配列を決定した。これによって３５に遺伝子の位置を正確に決定することおよびコードしているポリペプチドの配列を推定することが可能になった。

坑血遣９生庄ワクチニアウィルスのりスター（Ｌｉｓｔｅｒ）系統は広く入手可能である。

ウサギ腎（ＲＫ）細胞にそのウィルスを感染させて、ウィルスを加えてから′２．５時間後に直情を含まないリン酸塩を緩衝側として含む塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄した０次の３−４時間の間にＰＢＳ中へ分泌されたタンパク質を集めて、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥ５２のカラムを用いたジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）イオン交換クロマトグラフィーに通した。他の混入したタンパク質を少量含むだけの３５ＫＤタンパク質の調製品が得られた。

ＤＥＡＥセルロースカラムで精製した調製品を用いてウサギを免疫し、それによって得られた抗血清は分泌された３５ＫＤタンパク質を沈殿させることができた。

感　のｍＲＮＡのハイブリノドアレスーフドトーンスレーションリスター（ｌｉｓｔｅｒ）系統のウィルスで感染させた細胞から得たｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球の溶解物を用いて試験管内で翻訳させて、ポリペプチドを抗血清を用いて沈殿させた。２つの試験管内の産物は効率良く免疫沈降した。Ｄ。

Ｗ、クリーブランド（Ｄ、Ｗ、Ｃ１ｅｖｅ　１ａｎｄ）ら、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ。

２５２．１１０２−１１０６　（１９７７）に記述されたクリーブランド（ＣＩ　ｅｙ６１ａｎｄ）の消化方法を用いて、これらの１つ（ＩＰａと名付けられた）を、成熟した分泌３５ＫＤタンパク質の試験管内での前駆体であると同定することができた。

ワクチニアウィルスのゲノムの様々な部分を代表するＤＮＡの断片にハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いて、次に試験管内の翻訳と免疫沈降反応を行なった。

Ｂ、Ｍ、バターソ７（８９Ｍ、Ｐａｔｅｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　Ｌ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　工４　４３７０−４３７４　（１９７７）の手順を用いた最初の実験では、末端の）（ｉｎｄｌ［Ｉ断片ＢおよびＧ（図１）が３５に前駆体の翻訳を阻害した。クローニングしたサブ断片をテストすることによって、効率図１にはワクチニアウィルスのゲノム上での３５に遺伝子の位置を示す、ボックス状に囲んだ部分は逆転した末端の繰り返し配列を示し、そして末端のＨｉｎｄｍ　（Ｈ）断片ＢおよびＧの位１を示されている。拡大した部分は３５に遺伝子（矢印をつけた）の翻訳を阻害した２コピーの２．２　ｋ　ｂのＢａｍＨＩ　（Ｂａ）およびΣｌ↓Ｉ　（Ｓ）断片を示す、「Ｓｓ」はＳｓ±■サイトを示す。

３５に゛　−のヌクレオチド配完全な２．２ｋｂのＢａｍＨＩおよびＳａ±１断片、およびＳａ土Ｉサイトの下流的３００ｂρのＤＮＡ配列をジデオキシチェインターミネーシヲン法を用いて決定し、下に示す、（配列ＩＤ　ＮＯ：４）。

ＣＡＣＡ丁ＡＴＣＣＡＣ［；ＴＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＧ丁ＣＡＣＡＣＴＡＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＣ１２O ＧＡＣＡＡＧＣＩＩ！丁　ＴＣＡＴＣ丁ＡＣＧＣＩＪＴＡＡＴＡＧＡＴ　ＣＡＴＧＧＡＧＣＡＡ　ＡＣＡＴＴＭＣＧＣＧＧＴＴＡＣＡＣＡＣP８０ＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡ　ＣＡＧＴＡＴＡＣＣＡ　ＡＡＣＡＴＡＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧ　ＴＡＴＧＣ丁ＣＴＴＴ　ＴＡＴＣＴＣＣＡＧf　２４０ＡＴＡＣＧＴＡＡＴＡ　ＡＴＣＴｒｃＡＴＴＧ　ＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡ　ＴＧＣＡＡＣｃＡＴＴ　ＧＴＧＣＡＡＣＡＧＧ　ＴＣＡＴＡＴＴＣsＣ３００ＡＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＣＡＡＴＴＧＧＣＡ　ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧ　ＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴ　ＴＴＡＴＣＴＡＴＴＣR６０ＡＴＡＡＡＡＣＡＴＡ　ＡＴＣＡＡＧＣＡＴＡ　ＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴ　ＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴ　ＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡ　ＴＡＧＧＴＴＣＧ`Ｃ４２０ＡＴＴＣＡＣＡＡＡＧ　ＡＣＣＡＡＴＡＣＴＡ　ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴ　ＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡ　ＴＧＴＴＧＣＣＴＣ`　４８０ＴＡＣＡＴＣＧＣＡＴ　ＡＣ（、ＡＣ訊ＴＣＭ　ＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴ　Ａ／い ωＣＧＧＴＡ汀Ｃ品Ｃ“口’ＧＧ　ＴＧＴＴＴυＡ蛎　５４O ＣＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＧＧ　ＣＧＣＡＴＧＴＴＧＴ　ＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡ　ＧＡＣＴＧＡＡＡＧ丁@６００ＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴ　ＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴ　ＣＧＴＴＧＴＴＣＴＡ　ＣＡＡＧＡＴＧＴＣ丁　ＣＴＣＣＣＴＡＣＣＡ　ＣＧＡＴＴＡＣＴ`Ｃ６６０ＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡ　ＴＡＣＴＡＧＣＣＴＡ　ＣＴＧＣＣＴＡＴＴＡ　ＡＧＧＣＡＣＣＡＧＴ　ＣＡＴＴＣＧＣＧＧＡ　ＡＣＴＡＣＡＴＡfＴ　７２０ＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴ　ＴＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＡＧＴ　ＧＴＡ汀ＴＡＴひＮ仏ＡＴＡＴＡＴＣＡＴＴＣ品Ｔ品Ｇ７８０＾ＴＡＧＡＴＴＣＣＡ　ＴＣＡＴＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＧＴＣＧＣＣＴＴＡＡＡＣＡＣＡＴ　ＴＣ［、ＡＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣｌｌ、ＡbＣ８４０ＴＧＴＡＴＡＣＧＧＴ　ＡＴＣＡＣＡＧＣＴＡ　ＴＣＴＴＡＭＧＣＣＡＴＡＣＡ丁工ＣＡＧ　ＡＣＡＣＡＣＡＱ’ｔＴ　ＴＴＣＡＴＴＴＣＣb９００ＭＴＣＴＧＴＡＴＣＣＣＧＴＣＡＡＣＧＡ　ＣＡＣＡＴＣＧＴＧＴ　ＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡ　ＣＣＡＣＴＡＣＣＧＧ　ＴＣ工ＣＡＧＣＣＡＡ@１０２０ＴＣＣＡＴＣＴＣＡＡ　ＣＧＴＣＧＣＡＡＣＴ　ＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴ　Ａ丁ＧＡＡＴＣＡＴＡ　ＭＧＡＣＴＧＴＡＡ　ＴＣＣＣＧＴＣＴｎ@１０８０ＣＧＴ（、ＡＴＧＣＡＴ　ＡＣＴＴＣＴＣＴＧＴ　ＣＣ丁ＴＡＡＴＭＧ　ＧＴＡＧＣＡＡＣＴＴ　ＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴ　ＴＡＣＡＧＣＡＧ`Ａ　＋＋４０＾ＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴＡＡＡＴ　ＧＣＡＡＴＡＡＣＡＡ　ＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＴ　P２００ＴＭＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴ　ＡＣＴＡＴＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＧＣＡ　ＧＡＣＡＧＴＡＡＣＴ　ＣＴＡ（、ＴＣＧＧＣＧ@１２６０ＡＣＡＴＣ丁ＡＴＡＴ　ＡＣ丁ＡＴＡＴＡＧＴ　ＡＡ丁ＡＣＣＡＡＴＡ　ＣＴＣＡＡＧＡＣＴＡ　ＣＧＡＡＡＣＴＣＡＴ　ＡＣＡＡＴＣ丁ＣsＴ　＋３２０ＡＴＣＡＴＧ丁ＧＧＧ　ＴＡＡＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡ　ＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴＡＴＡＣＡＴＡ　P３８０ＭＣＴＣＡＴＣＡＣ工ＡＡＴＴＣＣＡＡＡ　ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴ　ＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡ　ＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡ　P４４０比Ｊヱ。

注：系統ＷＲについて発表されている配列は残基１２６７−１６０５および２４０５−２５７０に対応する。上記引用文中のコクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）らによって、ＷＲ糸系統ＶＶ７，５にプロモーターを含むと同定された開始コドンの１３７ｂｐ上流の上の配列の中の対応物は１４０７から１５４３であろう（１５４４番目の開始コドンのすぐ前に位１する）。

もっとも長いオーブンリーディングフレームは２３５のアミノ酸であり、そのＣ末端のΣ土工１サイトを越えてのびている。推定されたポリペプチドのＮ末端はシグナル配列として機能する１７アミノ酸の疎水的な部分をコードする。これを越えるとすぐ、推定されたアミノ酸配列は（配列ＩＤ　ＮＯ：５）：Ｐｒ。

Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎである。

この配列は、アバディーン大学（Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｂｅｒｄｅｅｎ）のＪ、　Ｅ、フオザーギル（Ｊ、Ｅ、Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ）およびＢ、デュンバー（Ｂ、Ｄｕｎｂａｒ）が本発明者らのために非公式に取得したＤＥ５２カラムで精製した成熟した３５ＫＤタンパク質のＮ末端の限定されたアミノ酸配列（未知−Ａｌａ−未知−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ）に対応し、これによって配列を決定した遺伝子が分泌された３５ＫＤタンパク質をコードすると確信した。３５に遺伝子の残りの部分（Σｌ土■サイトの下流）は、重複するクローニングしたＤＮＡ断片をシーフェンシングすることによって決定し、それにより完全な遺伝子はさらに２３のアミノ酸をコードしていた。

２．２ｋｂ（７）旦ａｍＨＩおよびΣｌ土１断片の配列を、Σｌ１Ｉサイトの下流の約３００残基とともに示す、３５にのオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸を示す、系統ＷＲのＤＮＡに欠けている１９残基には下線を引いてあり（１５８０−１５９８を含む）、そして星印をつけたプロリンは成熟した分泌される３５ＫＤタンパク質（すなわちシグナル配列の切断後の）のＮ末端の位置（アミノ酸番号１）を示す、系統ＷＲの７．５Ｋ　ｍＲＮＡの５′および３ ′末端の配列決定された位置も示す（ペンカテサン（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ）らの論文から引用）、下線を引いた制限酵素の認識部位はｑ１且Ｉ、旦互二Ｈ１およびΣＪ±Ｉのためのものである（実施例２を見よ）。

実施例λ この実施例はプロモーターおよびシグナル配列のテストに関するものである。

３５Ｋ　云　の。ノに　るカセント　１・　えベクターの　と３５に−の　へ　るためＱ外米遺伝子図３は、プロモーター、シグナル配列（比較のための構築物の中では省略する）および外来遺伝子から成るカセン）ＤＮＡの構築に用いるプラスミドを直線状態で示した地図である０図３に言及すると、末端のＨｉｎｄ［［ｌ断片をさらに消化した旦ａｍＨＩ−３ａ↓Ｉサブ断片を、広く入手できるプラスミドｐＵｃｌＱ中でクローニングした。その結果得られるプラスミドは３５ＫＤタンパク質をコードする配列の大部分を含み、ｐＧ６２と名付けた。３５に遺伝子の残りの部分はプラスミドＰ４８−１５中の重複するＸｂａ　ｌ断片に位置する。ＰＧ６２０はこれらの２つのプラスミドから構築されて、完全な３５に遺伝子を含んだＢａｍＨＩからＸｂａｌまでの断片を含む。

３５ＫＤ前駆体ポリペプチドのＮ末端の最初の４２のアミノ酸を除くすべてのコード領域を含む旦よａ■断片から次のようにデレーシ３ンミエータントを作成した。ｐＧ６２をＨｉｎｄｌ［［で消化し、そして旦土互Ｉで部分消化した。ｐＵｃ１９およびＢａｍＨＩから始まり２番目のΩ±ａｌサイトまでのワクチニアのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をアガロースゲルからエレクトロエルーシ３ンによって単離し、プラスミドｐ４８−１５のΩ１ａ！およびＨｉｎｄｌ［断片ヘライゲーションして、ｐＤ３５を作成した。

ｐＤ３５の３５にプロモーターから下流のＱ±ａｌサイト中へＬＩＬＬＩＩリンカ−を導入してｐＤ３５−Ｌを作成した。ｐＤ３５−Ｌ中のワクチニアのＤＮＡ配列を旦且ｏＲＩからΣｌ↓■までの断片として同し制限酵素で切断したｐＡＴ１５３中へサブクローニングした。その結果得られたプラスミドｐＤ３５１は３５に遺伝子の左のＤＮＡ配列［３５Ｋ　（Ｌ））、３５にプロモーター（Ｐ　３５　Ｋ）およびＮ末端の４２のアミノ酸をコードする配列（１７アミノ酸から成るシグナル配列を含む４２アミノ酸から成る前駆体ポリペプチド）、その後に唯一のＬＬＬ■サイトおよび３５に遺伝子の右のＤＮＡ配列Ｃ３５Ｋ　（Ｒ））を含む。ＢａｍＨ！断片上のそれぞれ上ａｃＺ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を別々にＰＤ３５１のＢｇｌ■サイトへクローニングして、プラスミドＰＤ３５２およびｐＤ３５１／ＣＡＴをそれぞれ作成した。これらの構築物は、３５に前駆体ポリペプチドのＮ末端の４２アミノ酸をコードするＤＮＡとフレームを合わせて結合させた上のマーカー遺伝子を含み、そして３５にプロモーターを含む。

比較の目的のために、±ａｃＺおよびｃａｔ遺伝子を３５に遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンのすぐ下流へ導入するためのベクターを構築した。そのようなベクターはソゲナル配列を欠いているが、しかし外来遺伝子に結合したプロモーターを含む、ＰＤ３５１を旦立↓■で消化して、末端をうめて平滑末端として、そして Σｃａｌで部分消化した。ｌＬＬ■／うめて作成した平滑末端から始まる３５Ｋ　（Ｒ）配列、ｐＡＴ１５３およびＡＴＧ開始コドンから１８ｂｐ上流のΣ且互Ｌサイトで終わる３５Ｋ（Ｌ）配列を含むＤＮＡ断片をアガロースゲルからエレクトロエルーン５ンによって単離して、リンカ−（配列ＩＤ　ＮＯ：６）−ＡＣＴＣＡＡＴＣＡＡ　ＴＡＣ，ＣＡＡＴＴＡＴ　ＧＧＡＴＣＣヘライゲーンゴンしてｐＤ３５６を作成した。これによってＢａｍＨＩサイトをＡＴＧコドンのすぐ下流に作ることが可能となり、ＰＤ３５１中の３５に遺伝子のＮ末端をコードする配列を欠失させることも可能となった。ＡＴＧコドンの上流の配列は変化なしに残された。新しく作成したＢａｍＨＩサイトへ、±ａｃＺおよびｃａ↓遺伝子をコードするＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片を別々に挿入して、それぞれρＤ３５７およびｐＤ３５６／ＣＡＴを作成した。これらの構築物はマーカー遺伝子にフレームを合わせて結合させた３５に遺伝子の最初のＡＴＧコドンを含む。

２つのマーカー遺伝子の、３５に前駆体ポリペプチドの最初の２２のＮ末端のアミノ酸をコードする（推定のシグナルベブチドを含ｔ、’）ＤＮＡのみへのフレームの合った翻訳の融合が可能なベクターを構築するために、３５Ｋ（Ｒ）配列およびｐＡＴ　１５３を含むＰＤ３５６の旦且旦Ｒ１および旦見二Ｈ１断片を、３５Ｋ　（Ｌ）、３５にプロモーターおよび旦り上Ｉおよび旦ａｍＨ［の接着末端のあるオリゴヌクレオチドリンカーの存在下でＩ＋サイトの下流をコードする配列（アミノ＃−１０−５、ＢａｍＨＩサイトの前）を含む前駆体のポリペプチドをコードする配列（最初の７アミノ酸）の一部を含むｐＧ６２のＥｃｏＲＩおよびＩＩ断片ヘライゲーノヲンして、ρＤ３５８を作成した。±ａｃＺおよび旦ａｔ断片を別々にｐＤ３５Ｂ中の新しく作成したＢａｍＨｌサイトへ挿入し、それぞれプラスミドｐＤ３５９およびｐＤ３５８／ＣＡＴを作成した。

クチニアウィルスのＴＫ゛　−へのカセートＤＮＡの　のための　えべＬ又二塁構繁図４の直線状態で示したプラスミドの地図に言及すると、３５にプロモーターに結合させた、マーカー遺伝子の■■ゲノムのＴＫ（チミジン　キナーゼの非不可欠遺伝子）遺伝子座への挿入を可能にする岨換えベクターを構築した０次の配列のリンカ−を合成すること：ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡおよびこのリンカ−をプラスミドｐＶ３２中のＴＫ遺遺伝円内位置する旦Ｃ０Ｒ１サイトへ挿入することによって旦ａｍＨＩサイトを導入し、ｐＶ３２１を作成した（ｐＶ３２はりスター（Ｌｉｓｔｅｒ）系統のＤＮＡのＨｉｎｄｌｌＩのに断片を含むｐＡＴ１５３である；ＷＲ糸系統ゲノムの対応する断片はＴＫＫ伝子を含む）、３５にプロモーターおよび前駆体ポリペプチドのＮ末端の４２アミノ酸（４２ａａ）をコードする配列から成るｐＤ３５１の約２７０ｂｐの旦立±■ および旦ｌ土■断片を、旦ａｍＨ＋の旦立１断片とともに、ＰＶ３２１のＴＫＫ伝子座の中の新たに作成したＢａｍＨＩサイトへ挿入した。この新しい岨換えベクターｐＶ３２５は、ワクチニアのゲノムのＴＫＫ伝子座中への挿入のために、３５にプロモーターの制御下で３５に遺伝子から発現する、ｃａｔ遺伝子のＮ末端の４２アミ人酸への融合を可能にするフレームの合った結合を生した。ＴＫ（Ｌ）およびＴＫ　（Ｒ）はＴＫＫ伝子の左および右の部分を含むワクチニアのＤＮＡの断片のことである。

上のｐＤ３５１のＢｃ±Ｈ１および旦ａｍＨＩ断片は、ＩＩＫワクチェアプロモーター（Ｐ　１１　Ｋ）とｐｓｃ８　（ｐＳＣ８はワクチニアのＴＫ配列が両側に隣接する１１にの■■後期プロモーターの制御下の上互且Ｚを含む；Ｓ、チャクラパティ　（Ｓ、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ　ｉ）ら、Ｍｏ１．ａｎｄ　ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ。

旦、３４０３−３４０９　（１９８５））の上且工Ｚ遺伝子との間の旦且二Ｈｌサイトへも挿入し、ｐｓｃ８／３５１を構築した。このプラスミドは３５に＠駆体ポリペプチドのＮ末端の４２アミノ酸をコードするＤＮＡへ融合した↓ａｃＺ遺伝子を含み、３５にプロモーターの制御下°にある。

３５にプロモーター配列およびＡＴＧ開始コドンを含む比較用のカセットベクターｐＤ３５６の約１７０ｂｐの旦立」」および且互ｍＨ！断片を、ρ■３２１のＴＫＫ伝子座の中のＢａｍＨｌサイトへクローニングして、ＰＶ３２６を作成した。±ａｃＺおよびｃａ工遺伝子をコードするＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片をｐＶ３２６中のＡＴＣ，開始コドンのすぐ下流のＢａｍＨＩサイトへ別々に挿入し、それぞれｐＶ３２７およびｐＶ３２８を作成した。これらのプラスミドは３５にプロモーターを含むが、シグナル配列を欠いており、比較の目的のために作成した。

３５にプロモーターおよび前駆体ポリペプチドのＮ末端から最初の２２アミノ酸をコードする配列を含む比較のカセットベクターｐＤ３５８の約２３０ｂｐの３５にプロモーターおよび２２アミノ酸のシグナル配列をコードする配列の下流リン酸カルシウムで沈殿させたプラスミドｐＤ３５７およびｐＶ３２７　（３５にプロモーターに結合した上ａｃＺ遺伝子を含むがシグナル配列を含まず、それぞれ３５におよびＴＫＫ伝子座中に挿入されている）を、野性型ワクチニアウィルスの系統リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）を感染させたＣＶ−１細胞へトランスフエクンジンした０Ｍｉ換えウィルス（青いプラーク）を以前に報告された方法で単離した（マケント（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４９．８５７−８６４（１９８４）；チャクラパティ　（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）ら、Ｍｏ　１．　Ｃｅ　ｌ　ｌ。

Ｂｉｏｌ、旦、３４０３−３４０９　（１９８５））。

３５に遺伝子座またはＴＫ遺伝子中（それぞれ■３５７およびＶ３２７）に３５にプロモーターの制酊にある±ａｃＺを含む組換えウィルスは、β−ガラクトンダーゼ活性を効率良く発現した。！ＩＪ持されたように活性の大部分は細胞内に存在した。±ａｃＺ遺伝子は、■３５７ゲノムの両方の逆転した末端の繰返し中に挿入されていたことがサザンプロット解析から確認された。

■３５７に感染した細胞は、培地中にも細胞の抽出物中にも検出できるほどの３５ＫＤタンパク賀を発現していなかった。↓ａｃＺの発現が３５ＫＤタンパク質の合成を途中で限定した可能性を排除するために、ＴＫＫ伝子座中に挿入された同し３５にプロモーター−上ａｃＺ融合体を含み組換えウィルス■３２７は３５ＫＤタンパク質を発現して分泌する能力を保持していることを示した。これらの結果は■３５７が３５ＫＤタンパク質を発現できないのは３５に遺伝子の欠失のためだということを示している。これらの結果は３５ＫＤの分泌されたタンパク質が実施例１で同定されたオープンリーディングフレームにコードされていることを確認し、その存在が組織培養中のりスター（Ｌ　ｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ）系統のワクチニアウィルスの増殖には不可欠ではないことを示す。

ｃａｔｉ　云　１む　えウィＪレスの上に記述したように、プラスミドＰＶ３２８、ＰＶ３３１、ｐＶ３２５およびｐＤ３５１−ＣＡＴを用いて、ツレツレ組換えウィルスｖ３２８、Ｖ３Ｓｉ、■３２５およびＶ３Ｓｉ−ＣＡＴを構築した。ｃａｔ遺伝子をウィルスｖ３２８゜Ｖ３３１および■３２５のリスター（Ｌｉｓｔｅｒ）系統のＴＫＫ伝子座へ、そしてＶ３Ｓｉ−ＣＡＴ中の３５に遺伝子の両コピーへ挿入した。Ｖ３２Ｂ、Ｖ３Ｓｉ、■３２５およびＶ　３５１−ＣＡＴハ、９立１遺伝子の５′末端へフレームを合わせて結合させた前駆体ポリペプチドのそれぞれ０．２２．４２および４２アミノ酸をコードする配列を含む。

えウィルスによるＣＡＴの　°、上のｃａｔＭｉ換えウィルスで感染後６時間のＣＶＩ細胞を用いて分泌された（ＳＰ）および細胞内の（ＣＥ）ＣＡＴタンパク質およびＣＡＴ酵素活性をめた。

結果を表１に示す：表−土Ｖ３２Ｂ　０．１３８　６５．５０　１．３３５　２０５．１５０Ｖ３３１　２．０００　２−６０　８．８２５　１．４２０Ｖ３２５　２．９３０　ｔ、ｓ５　ｏ、９７５　０．３４３Ｖ３５１−ＣＡＴ　３．４００　１．００　４．０９５　１．３５０注：酵素免疫学的定量（ＥＬＩＳＡ）および酵素活性のデータは別個の実験から得られる。測定は、感染から６時間後に収穫し、細胞外の培地（ＳＰ）または細胞内の抽出物（ＣＥ）について行なった。

対照のウィルスである■３２８は他のウィルスよりもはるかに多くのＣＡＴタンパク質を生産したが、Ｖ３３ＬＶ３２５およびＶ３Ｓｉ−ＣＡＴが感染した細胞からはそれよりもかなり多く分泌されたことが表１かられかる（ＥＬＩＳＡの結果を見よ）、同様に別個の実験におけるＣＡＴの酵素活性の測定からは、検出できる活性の大部分は、Ｖ３Ｓｉ、■３２５およびＶ３Ｓｉ−ＣＡＴが感染した細胞では分泌されるが、■３２８が感染した細胞では細胞内に残ることがわかった。３５ＫＤ前駆体ポリペプチドのＮ末端から２２および４２のアミノ酸を含む断片は機能しうるシグナル配列を含み、Ｉ準的な多くの細胞内のＣＡＴタンパク質を効率良く分泌に向けることが可能であることをこれらの結果は示している。

ＣＡＴの　γへのチュニカマイノンのｔ上に記述した型の実験における再現性のある知見は、組換えウィルス■３３１、■３２５およびＶ３Ｓｉ−ＣＡＴの生産するＣＡＴタンパク質はＶ３２８の生産するものよりも低い比活性（すなわちＣＡＴタンパク質ｎｇ当たりの）を示すということだった。これはたぶん、糖鎖の付加が起こることが知られている分泌のための経路をＣＡＴタンパク質が通るようにさせるシグナル配列の結果として、前者のタンパク質には糖鎖の付加が起こるためであろうと考えられた。さらにはＣＡＴタンパク質は３４−３６の位置にＮに結合して糖鎖の付加が起こる可能性のある部位Ａｓ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｔｈ　ｒを含むことに注目した。この仮説をテストするために、タンパク質のＮに結合する＄１１１の付加を阻害するチェニヵマイシンを用いた。チュニカマイシンの存在下または比存在下でＣＡＴ組換えウィルスを感染させてから１８時間後のｃｖ−ｉ細胞の培地（ＳＰ）および細胞内の抽出物（ＣＥ）においてＣＡＴ活性を測定した。

結果を表２に示す：表１Ｖ３２８　１．１６　３．０１　２３２８．３０　２５７３．６０Ｖ３３１　１５５．３０　５１．７８　１７１．８０　１６．００Ｖ３２５　３３８．４０　１２．５０　１９９．２０　７．４０注：チュニカマイシンの存在下（＋Ｔ）または非存在下（−丁）で細胞に感染させて、培地（ＳＰ）および細胞内の抽出物（ＣＥ）についてＣＡＴ活性をめた。

表２の結果は、チェニカマイシンはＶ３Ｓｉおよびｖ３２５によって生産されるＣＡＴ活性の水準を上昇させるが、Ｖ３２８によるものについては上昇させないことを示す、チェニカマイシンは合成されるＣＡＴタンパク質の量を少し減少させることをタンパク質ゲルが示した。したがってＶ３Ｓｉおよび■３２５によって生産される融合タンパク質の比活性はチュニヵマイシンの存在下で実質的に増加する。これは、少なくとも部分的にはｗ鎖の付加の阻害のために、これらのウィルスによって生産されるＣＡＴタンパク質の活性が低下することと一致する。

Ｖ３ＳｉおよびＶａｌ５が感染した細胞中でチュニヵマイシンの存在下で検出される細胞内の活性が増加することは、細胞内の酵素活性は分泌の経路中で一過性であることを示す。

ｃａｔ　−の　オリゴヌクレオチド（峰　る″然・アミノ酸の位置３４−３６のＮに結合するｗＭ鎖付加の可能な一つの位置Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒを除去するために、ｃａ工遺伝子に特異的に突然変異を起こさせた。アミノ酸Ａｓｎ−３４およびＴｈｒ−３６を以下のようにそれぞれＧｌｎおよびＶａｔで買換した。ｃａ工遺伝子を含むＢａｍＨ＋断片をベクターｐＴＺ１９Ｕ（ファルマシア（Ｐｈａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ））中へサブクローニングして、このプラスミドρＴＺ１９Ｕ−ＣＡＴの作る一本！！ＤＮＡの鋳型を大腸菌系統ＴＧｌ中で、ヘルパーファージとしてファージＭ１３ＫＯ７を用いて増やした〔ミード（Ｍｅａｄ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　土、６フー７６（１９８６））、ミスマツチする塩基（下線を引いた）を含むオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ　ＮＯニア）：３’　ＣＧＴＩ：、ＴＴＡＣＡＴ　ＧＧＡＴＡＧＴ工ＧＴ　ＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＡＡ　５’を合成した。セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）およびエクンユタイン（Ｅｃｋｓ　ｔ　ｅ　ｉ　ｎ）のホスホロチオエートを用いる方法にしたがって立見よりＮＡの突然変異誘発を行なった（１９８９、タンパク質の機能において：実用的な方法（Ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ｐ２７９−２９５＊クライトン（Ｃｒｅｉｇｔｏｎ）による編集、Ｔ、Ｅ、ＩＲＬ出版、オックスフォード）、Ａｓｎ−３４をＧｌｎおよびＴｈｒ−３６をＶａｌに変換した買換による突然変異を含むプラスミド（ＰＴＺ１９Ｕ−ＣＡＴＩ　４）をＤＮＡシークエンソングによって確認した。

次に、ｐＴＺ１９Ｕ−ＣＡＴＩ４の乱ｌ工Ｈ１断片上の突然変異させた且１１遺伝子を、正しい方向で組換えベクターＰＶ３２６およびｐＶ３２９中にクローニングして、それぞれプラスミドｐＶ３２８−１およびＰＶ３３１−１０を作成した。３５にプロモーターおよびＮ末端の４２アミノ酸をコードする配列を含むｐＤ３５１の約２７０ｂＰの旦旦土Ｉおよび旦」」工■断片を、ｐＴＺ１９Ｕ−皇 Δ工１４からの旦ｌ凹Ｈ１の突然変異させたＣａ工断片とともにｐＶ３２１のＴＫ遺伝子座へ挿入してプラスミドｐＶ３２５−１１を作成した。Ｎに結合した［ＩＩの付加の可能性のある部位をこわした２つのアミノ酸の買換を除いては、プラスミドｐＶ３２８−１．ｐＶ３３１−１０およびｐＶ３２５−１１はそれぞれｐＶ３２８、ｐＶ３３１およびｐＶ３２５と同しである。突然変異させた立土工構築物を系統リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）のゲノムのＴＫ遺伝子座へ相同的Ｍｌ換えによって導入し、そして上に記述したように組換えウィルスＶ３２Ｂ−Ｌ　Ｖ３Ｓｉ−１０およびＶａｌ５−１１を単離した。

力紙゛　せたｃａｔ’−”゛ウィルスによ　て　れるＣＡＴ　の′折チュニカマイシンの存在下又は非存在下で、突然変異させたおよび野性型のｃａ工遺伝子の樽築物を含む組換えウィルスをＢＨＫ細胞に感染させて、分泌されたおよび細胞内のＣＡＴ活性を１８時間の保温後に分析した。結果を表３に示す：Ｖ３２Ｂ　７８．３００　１０２１４．２０　４５．０２０　４３２３．７００Ｖ３２８−１　０．１４５　１６０．００　０．０３７　５５．８４０１１３３１　５７．７００　５７．３０　２３０．４９０　７１３．９００Ｖ３３１−１０　０．０３８　０．５６　０．０１７　０．３５８Ｖ３２５　３５．１３０　４０．１０　６５０．６３０　８３８．４４０Ｖ３２５−１１　０．０５８　２ −１３　０．０１９　１．０３８注：チュニ力マイシンの存在下または非存在下で細胞に感染させて、細胞外の培地（ＳＰ）および細胞外の抽出物（ＣＥ）においてＣＡＴ活性をめた。

Ｖ３２８−１、Ｖ３Ｓｉ−１０およびＶａｌ５−１１によって生産されるＣＡＴ活性の水準はチェニカマイシンによって上昇しないことを表３は示している。

逆にチュニカマインンの存在下ではおそらくこの薬剤の細胞への有毒な効果のためにこれらのウィルスがコードするＣＡＴ活性はやや減少したように見えた。この薬剤の非存在下で、ウィルスＶ３３１−１０およびＶａｌ５−１１によって発現される突然変異させたＣＡＴタンパク質は、（Ｖ３Ｓｉおよび■３２５によって生産される）突然変異させていない対応物よりも、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において速く移動した。これは糖鎖の付加が起きる部位を除去する特異的な突然変異と矛盾しない、これらのアミノ酸の置換はＶ３２８−１、Ｖ３３１− １ＯおよびＶ３２５−１１がコードするＣＡＴの全体的活性の大巾減少も引き起こしたことが注目される（表３）、ウィルスＶ３２８−１、Ｖ３３１−１０およびＶ３２５−１１が発現する突然変異させたＣＡＴタンパク質の量は突然変異させていない対応物が発現するものと類憤していることを他の結果は示している。

したがって、これらの突然変異は残念なことにＣＡＴタンパク質の酵素活性を減少させてしまうように見える（おそらく活性中心への効果のため）ものの、特異的な突然変異によって、分泌されるＣＡＴの糖鎖の付加を阻止できることを上の結果は強く示唆している。

要約すると、前駆体ポリペプチドのＮ末端の２２および４２アミノ酸はシグナル配列として機能することおよびそれらのアミノ酸が付着するタンパク質の分泌を効果的に指令することの両方が可能である。しかし上記Ｎ末端のアミノ酸は／’ １イブリッドタンパク質を分泌のための経路を経由させるので、１つの問題は本来または分泌すべきタンパク質をコードする遺伝子の部位特異的な突然変異の誘発により、糖鎖の付加の部位を除去することによってこの問題を回遇する可能性があることをこの結果は示している。この配列表は特定の締約国（ＥＰＣ諸国、米国、日本）の要求もしくは希望を満たすために本ＰＣＴ出順に加えられた。一般的情報の部分は米国のみに通用される。

配列ニス上立上と一二瓜的逍葺（１）出願人　：ガフニイ、ダレイナ　フランセス；パテル、アーウインドヒラブハイ；ストウ、ニゲル　デニス；スハクーノヤレブ、ジョンバーバート輸）発明の名称：ワクチニアウィルスのポリペプチドのシグナル配列をコードするＤＮＡ（１１１）配列の数　＝７（１ｖ）連絡先　：ニクソン＆バンダーバイ、１４階、２２００　クラレンドン通り、アーリントン、バージニア、米国２２２０１（Ｂ）コンピュータ：ｒＢＭ　ＰＣ／ＡＴ互換（Ｃ）オペレーティングンステム：ＭＳ−ＤＯ３３，２（Ｄ）ソフトウェア；ワードパーフェクト　ＡＳＣＩ　Ｉ　ファイルフォーマット（ｖｉ）本出願のデータ　：（Ａ）出願番号　：（Ｂ）出願日　：（Ｃ）分類　・（ｖｉ）　先の出願のデータ：（Ａ）出願番号　：ＰＣＴ／ＧＢ　９０／（Ｂ）出願日　：（Ａ）出願番号　：ＧＢ　８９１５８０７．３（Ｂ）出願日　：１９Ｂ９年７月１１日（ｖｊ）代理人の情報　：レオナルド　Ｃ，ミチャード　登録番号２９００９参照書類Ｎｏ。

（ｉｘ）電信の情報　：（Ａ）を話　：　（７０３）８７５−０４００（Ｂ）ファックス　：　（７０３）５２５−３４６８２　１Ｄ　Ｎｏ、　１の（１）配列の特性：（Ａ）長さ　：２０アミノ酸に対応する６０塩基対（Ｂ）タイプ　：ヌクレオチドと対応アミノ酸（Ｃ）ストランド　：二本鎖（Ｄ）トポロジー　：線状（１１）起源　：ワクチニアウィルス、リスター系統（ｉｉ）実験源　：ワクチニアウィルス、リスクー系統（１ｖ）特性　・ポリペプチドの細胞膜の通過を可能にするシグナル配列をコードするＤＮＡおよび分泌されるポリペプチドのＮ− 末端配列（ｖ）配列　ＩＤ　Ｎｏ、ｌ：ＡＴＧ　ＡＡＡ　Ｃ，ＩＡ　ＴＡＴ　ＡＴＣＧＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＧＣＡＴＧ　３０Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｔ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＭｅｔＴＧＣＣＴＧ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＣＣＡＧＴ　６０Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ３　＋ＤＮ０．２の（１）配列の特性：（Ａ）長さ　：２０アミノ酸（ＢＪタイプ　二アミノ酸配列（Ｄ）トポロジー　＝ｗＡ状（１１）起＃　：ワクチニアウィルス、リスター系統（ｌｉｉ）実験′ａ　：ワクチェアウィルス、リスター系統（１■）特性　：ポリペプチドの細胞膜の通過を可能ならしめるシグナル配列および分泌されるポリペプチドのＮ−末端アミノ酸（ｖ）配列ＩＤＮ０．２：Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＭｅｔＣｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｈａ　Ａｌａ　Ａｈａ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｈａ　Ｓｅｒ５ｌ −ＧＬｌ配ダ■−見一）」と−１ｑ憧報（１）配列の特性：（Ａ）配列の長さ　：１４アミノ酸（Ｂ）配列のタイプ：アミノ酸配列（Ｄ）トポロジー　：線状（１１）起ｆｌ：ワクチェアウイルスの３５に遺伝子、リスター系統＜ｉｉ）実験源　：ワクチニアウィルスの３５に遺伝子、リスター系統（ｉｖ）フラグメント　：ワクチニアウイルス、リスター系統の３５ＫＤ蛋白質のＮ末端のアミノ酸残基４−１７（ｖ）配列ＩＤＮ０．３：Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＳｅｒＣｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ５　１Ｄ　Ｎｏ　４（７４報（１）配列の特性（Ａ）配列の長さ　：２５７７塩基対（Ｂ）配列のタイプ：塩基配列および対応する蛋白配列（Ｃ）ストランド　：二本鎖（Ｄ）トポロジー　二線状（Ｅ）分子タイプ　ニゲツムＤＮＡ（１１）起源　：ワクチニアウィルス、リスター系統（ｉＩｉ）実験源　：ワクチニアウィルス、リスター系統（ｉｖ）特性　：ワクチニアウィルスＤＮＡ、リスター系統の逆位末端繰り返しのフラグメント、３５に遺伝子を含む（ゲノム当り２コピー）（ｖ）性質　：１５４４から２３１７番が３５にポリペプチドをコードする（ｖｊ）配列ＩＤ　Ｎｏ　：４ＧＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＧＡＴ　ＧＡＡＣＴＣＡＣＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＡＴＴＡ　ＣＴＡＣＴＧＴＡＡＡ@６０ＴＡＣＡＴＣＧＧＡＴ　ＡＣＣＡＣＡＴＣＡＡ　ＣＣＴＴＣＣＣＡＣＴ　ＡＡＡＣＡＣＧＧＴＡ　ＴＴＣＣＡＣＴＴＧＧ　ＴＧＴＴＴＧＡＡ`Ａ　−’５４０ＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＧＧ　ＣＧＧＡＴＧＴＴＧＴ　ＧＡＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡ　ＧＡＣＴＣＡＡＡＧＴ@６００ＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴ　ＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴ　ＣＧＴＴＧＴＴＣＴＡ　ＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴ　ＣＴＣＣＣＴＡＣＣＡ　ＣＧＡＴＴＡＣＴ`Ｃ６６０ＴＧＴＡＴＡＣＧＧ丁　ＡＴＣＡＣＡＧＣＴＡ　ＴＣ工ＴＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＡＧ　ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴ　ＴＴＣＡＴＴＴＣＣb９００＾ＴＧＴＡＣｆｌ；ＡＣＧ　ＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＣＧＴＡＣＣＣＡＧＡ　ＡＡＴＡＣＣ丁ＴＴＡ　ＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡ　ＴＧＴＧＣＡＡ`ＴＴ　９６０ＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＣＣにＴＣＡＡＣＧＡ　ＣＡＣＡＴＣＧＴＧＴ　ＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡ　ＣＣＡＣ丁ＡＣＣＧＧ　ＴＣＴＣＡＧＣＣＡ`　１０２０ＴＣＣＡＴＣＴＣＡＡ　ＣＧＴＣＧ（、ＡＡＣＴ　ＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴ　ＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡ　ＡＡＧＡＣＴＧＴＡＡ　ＴＣＣＣＧＴＣsＴＴ　１０８０ＣＧＴＧＡＴＧＧＡＴ　ＡＣＴＴＣＴＣＴＧＴ　ＣＣＴＴＡＡＴＭＧ　ＧＴＡＧＣＡＡＣＴＴ　ＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴ　ＴＡＣＡＧＧＡＧＡ`　１＋４０ＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴＭＡＴ　ＧＣＡＡＴＭＣＡＡ　ＡＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＴ　１２O０ＴＭＣＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣＡＴ、ＡＣ丁ＡＴＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＧＣＡ　ＧＡＣＡＧＴＡＡＣＴ　ＣＴＡＧＴＧＧＧＣＧ　P２６０ＡＣＡＴＣＴＡＴＡＴ　ＡＣＴＡＴＡＴＡＧＴ　ＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡ　ＣＴＣＡＡＧＡＣＴＡ　ＣＧＡＡＡＣＴＧＡＴ　ＡＣＡＡＴＣＴＣsＴ　１３２０ＡＴＣＡＴＧＴＧＧＧ　ＴＭＴＧＴＴＣＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＴＡ　ＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＧＴＡＧＴＴＧＣＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡ　１R８０ＡＡＣＴＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣＣＡＡＡ　ＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴ　ＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡ　ＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡ@１４４０ＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴ　ＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡＧＴ　ＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡ　ＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡ　ＴＴＧＣＡＣＧＧＴ`　＋５００（６）配列ＩＤ　Ｎｏ、、’ｌの＋ｆ１１報ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＣＴＣＡＴＣＧＡＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＣＴＣＡＡＡ　ＧＣＧ　ＴＧＴ　ＧＴＣＴＧＡ　２３２０（ｉ）配列の特性　：（Ａ）配列の長さ　：６アミノ酸（Ｂ）配列のタイプ：アミノ酸配列（Ｄ）トポロジー　二線状（ＩＩ）特　性　：オリゴヌクレオチド（ｉｉ）配列ＩＤＮ０．７：ＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴ　ＧＴＴＧＡＴＡＧＧＴ　ＡＣＡＴＴＧＴＧＣ３９臣西Ｉマル分７０−二〕７（任／位 □７°ラスミド”ＤＮＡ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．以下のアミノ酸配列（配列ＩＤ　ＮＯ：２）：【配列があります】または前記のアミノ酸配列の保存的に修飾された変異体をコードするシグナル配列ＤＮＡ。２．アミノ酸配列が（配列ＩＤ　ＮＯ：２のＣ末端に続いて）さらにＬｅｕ、Ｇｌｎ、場合によってはもう一つのＧｌｎおよびさらに場合によりＳｅｒを含む請求項１記載のＤＮＡ。３．ポックスウィルスのゲノムの中への挿入に適したＤＮＡカセットであり、（５′から３′への順に）転写が可能なようにプロモーター配列に結合させた請求項１または２に定義されたシグナル配列およびそれに続く外来遺伝子のフレームを合わせた挿入のためのマルチクローニング部位、から成る前記のカセット。４．シグナル配列とフレームの合った、マルチクローニング部位の下流の外来遺伝子をさらに含む請求項３記載のＤＮＡカセット。５．ポックスウィルスのゲノムヘの相同的組換えのために、下記カセットＤＮＡの再端に隣接するポックスウィルスの非不可欠な部分の配列を含む請求項４記載のカセットＤＮＡを含む組換えベクター。６．（１）相同的組換えを可能にするポックスウィルスのゲノムの第一の配列；（２）ポックスウィルスのゲノムの非不可欠部分（ＮＥＲ）の第一部分中の配列；（３）プロモーターＤＮＡ；（４）請求項１または２において定義された、転写を可能にするようにプロモーターへ結合させたシグナル配列ＤＮＡ；（５）シグナル配列ＤＮＡとフレームを合わせた外来ＤＮＡ；（６）前記のＮＥＲの第二部分中の配列；および（７）相同的組換えを可能にするポックスウィルスのゲノムの第二の配列；からなる請求項５記載の組換えベクター。７．ポックスウィルスと適合性の転写終結シグナルを外来ＤＮＡ（５）および２番目のＮＥＲ部分（６）の間に含む請求項６記載の組換えベクター。８．ポックスウィルスおよび請求項５、６または７記載の組換えベクターで感染させた動物細胞。９．請求項８において請求した動物細胞により生産される外来タンパク質。