JPH0795954B2 - 外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法 - Google Patents

外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法

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JPH0795954B2
JPH0795954B2 JP59500057A JP50005784A JPH0795954B2 JP H0795954 B2 JPH0795954 B2 JP H0795954B2 JP 59500057 A JP59500057 A JP 59500057A JP 50005784 A JP50005784 A JP 50005784A JP H0795954 B2 JPH0795954 B2 JP H0795954B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 DNA組換え技術により、１つの生物の遺伝子を他の生物
内で発現させることが可能になった。従来技術では、パ
ポヴァウイルス、パピローマウイルス、アデノウイル
ス、及びレトロウイルスを包含するいくつかのウイルス
群が真核生物用クローニング及び発現ベクターとして用
いられている。これらのウイルスのゲノムは比較的小さ
いので、組換え体DNA分子の生体内外での構築が容易で
あった。しかしながら、それらは一般的に宿主範囲が狭
く、挿入可能なDNAの量が著しく限定されており、か
つ、外来性DNAを挿入することによって感染性が失われ
るという不利益を有していた。ポックスウイルスのよう
なより大きなウイルスの遺伝子操作はより困難であるけ
れども、そのようなベクターは、感染性の保持及び宿主
範囲の広さに関し、より大きな能力と可能性を有すると
いう利点を有している。ワクチニアウイルスのようなポ
ックスウイルスに関し、このような組換え体は、生きた
ウイルスワクチンの開発を可能にするかもしれない。
ワクチニアウイルスはポックスウイルスの中で最もよく
研究されているので、ここではワクチニアウイルスにつ
いて記載する。ワクチニアウイルスは生体外及び生体内
において極めて広範囲の宿主域を有し、痘瘡を引き起こ
すポックスウイルスであるワリオラに対する有効なワク
チンとして世界中で用いられている。ワクチニアウイル
スは大きなウイルスであって、分子量122万、すなわち1
80,000塩基対の直線状の２本鎖DNAを含む。このウイル
スは、感染細胞の細胞質中で、転写及び複製のための自
身の酸素を用いる。ヌクレオチド配列のデータより、ワ
クチニアウイルスゲノム中にコードされた転写調節信号
は、真該細胞によって用いられるものとは異なっている
ことが示されている。ここに記載するこの発明では、ポ
ックスウイルスゲノムの大きなこと、及びその固有の転
写調節信号について考慮する。
この発明に関する文献は、ヴェンカテサン、バロウディ
及びモス、Cell 125:805−813（1981）；ヴェンカテサ
ン、ジャーショビッツ及びモス J.Virol.44:637−646
（1982）；バジュザー、ウィテック、ウェイアー及びモ
ス、J.Virol.,45:62−72（1983）；ウェイアー及びモ
ス、J.Virol.46:530（1983）；モス、ウインターズ及び
クーパー、J.Virol.40:387−395（1981）；パニカリ及
びパオレッチ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:4927−4931
（1982）；マケット、スミス及びモス、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,79:7415（1982）；コーエン及びボイアー、
米国特許4,237,224;ヴェルエンズエラら、Nature298:35
0（1982）；モリアリティら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA7
8:2606−2610（1981）；リウら、DNA1:213−221（198
2）；ウェイアー、バジュザー及びモス、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA79:1210（1982）である。
発明の概要 この発明は、外来性遺伝子を発現する感染性のポックス
ウイルス組換え体及びその一般的な製造方法を提供す
る。この発明によると、外来性遺伝子が、病原体からの
適当なものである場合には、組換え体ポックスウイルス
は、生きたワクチンとして働く。このような外来性遺伝
子の例は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、非
Ａ、非Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘ
ルペスウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイル
ス、パルヴォウイルス、口蹄疫ウイルス、ポリオウイル
ス、はしかウイルス、狂犬病ウイルス、コロナウイル
ス、コクサッキーウイルス、病原性細菌、リケッチア、
病原動物及び後生動物からのDNA遺伝子及びRNA遺伝子の
DNAコピーを包含する。この発明によると、ポックスウ
イルス組換え体で感染された細胞もまた、外来性遺伝子
生産物を製造するのに用いることができる。
ワクチニアウイルスや他のポックスウイルスを感染性発
現ベクターとして開発するにあたり、これらのものの次
のような生物学的性質を考慮した。ワクチニアウイルス
が自身の転写調節配列を進化させたという証拠；その大
きなゲノムサイズ；及び単離されたウイルス性DNAの感
染性の欠如。
この発明によると、ワクチニアウイルスの転写調節配列
と外来性遺伝子の切断されていないタンパク質コーディ
ング配列とから成るキメラ遺伝子を形成することによっ
て、外来性DNAの効率的な発現が得られる。ワクチニア
ウイルスの転写調節配列は、RNA合成が開始される部位
の上流あるいはこの部位を含むDNA断片から成る。以下
の記載では、遺伝子の転写をポジティブに調節する配列
を「プロモータ」と言う。外来性遺伝子のタンパク質コ
ーディング配列は、翻訳の開始に対応する部位を含んで
おり、以下これを「外来性遺伝子」と言う。外来性遺伝
子の翻訳開始部位を利用することにより、融合タンパク
質の生物活性に関連したコドンフェイジング（codon ph
asing）及びポテンシャル問題が回避される。上記キメ
ラ遺伝子は、ワクチニアウイルスゲノムの既知の非必須
的部分からDNAが側面についているので、究極的には相
同性（homologous）の組換えが起きる。この発明はこの
ように、複数の制限エンドヌクレアーゼ部位をワクチニ
アウイルスプロモータの隣に有し、側面に位置する（fl
anking）ワクチニアウイルスDNA並びにプラスミド複製
開始点及び抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを構築
し得る、一般的な外来性遺伝子の発現方法を提供する。
このプラスミドは次に適当な制限エンドヌクレアーゼで
切断されて連結可能な末端を形成し、相補的な末端を有
する外来性遺伝子が、ワクチニアウイルスプロモータの
隣に連結される。キメラ遺伝子とフランキング（flanki
ng）ワクチニアウイルスDNAを含むプラスミドは細菌を
形質転換するのに用いられ、その形質転換された細菌か
ら精製される。
ワクチニアウイルスDNAが側面についたキメラ遺伝子を
含むプラスミドは次に、この発明に従って、ワクチニア
ウイルス又は他の適合性のあるポックスウイルスによっ
て予め感染された細胞に、トランスフェクション条件下
においてトランスフェクトされる。相同性の組換え及び
複製が起き、それによってキメラ遺伝子が、フランキン
グDNAによって特定される位置でワクチニアウイルスゲ
ノム内に挿入される。感染性を破壊しないために、フラ
ンキングDNAは非必須的領域からのものであることが重
要である。
この発明によって得られる組換えワクチニアウイルス
は、種々の方法によって元のウイスから分離できる。例
えば、ワクチニアウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝
子をフランキングDNAとして用いることにより、キメラ
遺伝子をワクチニアウイルス内のチミジンキナーゼ遺伝
子内に挿入することができ、それによってその機能を阻
害することができる。このように、フランキングDNAが
ワクチニアウイルスのTK遺伝子からのものである場合に
は、TK活性を欠くウイルス組換え体を選択することがで
きる。あるいは、ウイルスは、DNA−DNAハイブリダイゼ
ーション、外来性遺伝子生産物の検出又は他の選択操作
のいずれによっても分離できる。
好ましい具体例の詳細な説明 この発明の以下の記載は、以下のセクションに分割す
る。
I.ワクチニアウイルスプロモータ、外来性遺伝子の挿入
部位及びワクチニアウイルスDNAフランキング配列を含
むプラスミドベクターの製造 II.外来性遺伝子の製造及びプラスミドベクター内にそ
れを挿入してキメラ遺伝子を形成すること。
III.ウイルス感染細胞の、キメラ遺伝子含有プラスミド
を含むプラスミドによるトランスフェクション IV.組換えワクチニアウイルスの単離及び外来性遺伝子
生産物の検出 V.ワクチニアウイルス組換え体による感受性細胞又は動
物への感染 以下の記載を通じて、例えばワクチニアウイルスゲノム
内のチミジンキナーゼ遺伝子の位置付けのような、ワク
チニアウイルスDNAの操作は、ポックスウイルス一般に
直ちに適用できる例示として詳細に記載されている。従
って、以下に記載する実施例は、例示のためのみに記載
されたものであって、この発明の範囲内での種々の変更
及び修飾が当業者によって明らかであることが理解され
なければならない。
I.ワクチニアウイルスプロモータ、外来性遺伝子の挿入
部位及びワクチニアウイルスDNAフランキング配列を含
むプラスミドベクターの製造 挿入ベクターを組み立てるのに用いられるビークルは、
適当ないずれのプラスミド、コスミド、又はファージで
あってよい。この発明に用いることができるファージの
例として、ラムダファージとM13ファージを挙げること
ができる。用いることができるコスミドの例としてpHC7
9を挙げることができ、これはホーンとコリンス、Gene1
1:291（1980）に記載されている。用いることができる
プラスミドの例としてpBR322,pBR325,pB8327,pBR328,pU
C7,pUC8,及びpUC9を挙げることができる。この実施例に
おいて外来性遺伝子の転写を促進するために用いられる
ワクチニアウイルスDNA断片は、RNAの開始部位の上流及
び該開始部位を含むヌクレオチド配列を含んでいた。こ
の領域のヌクレオチド配列及び詳細な転写地図は、この
方法を適用するのに必要である。適当な制限エンドヌク
レーゼ部位がRNA開始部位及びRNA開始部位よりも後であ
るが、最初のATGすなわち翻訳開始コドンよりも先にあ
る場合には、プロモータ部分は制限エンドヌクレアーゼ
によって切り取られ、アガロースゲル電気泳動のような
標準的な方法によって単離される。適当な制限エンドヌ
クレアーゼ部位がない場合には、所望の位置の向こう側
を開裂し、余剰のヌクレオチドBal31のようなエキソヌ
クレアーゼによって除去するような、他の方法を用いる
ことが必要になる。マニアチスら、MOLECULAR CLONING:
A LABORATORYMANUALL（Cold Spring Harbor Laboratory
1982）を、このような方法及びここで適用される他の
技術の記載のために参照のこと。
プロモータ断片を直接又はその末端を修飾した後、予め
制限エンドヌクレアーゼで開裂され適当な連結可能な末
端を生じているプラスミドと連結した。接着末端又は平
滑末端の連結は常法に準じた。プロモータを、予め複数
の挿入部位を有するpUC9のようなプラスミドに挿入する
ことによって、さらに制限エンドヌクレアーゼ部位をプ
ロモータの隣に設けた。もっとも、合成ポリヌクレオチ
ドを連結することも可能である。プロモータを含むプラ
スミドを細菌を形質転換するのに用い、次に精製した。
制限エンドヌクレアーゼを隣接する制限エンドヌクレア
ーゼ部位で切り取るのに用い、取られたDNA断片を常法
により精製した。
プロモータの隣に付けられ、追加的な制限エンドヌクレ
アーゼ部位を与えたDNAは、ワクチニアウイルスゲノム
の非必須的領域から誘導した。このような非必須的領域
の例として、チミヂンキナーゼ遺伝子（ウェイアー、バ
ジュザー及びモス、前掲；ウェイアーとモス、前掲）及
び左逆転末端繰り返しの基端にある少なくとも9,000塩
基対（bp）の領域（モス、ウィンターズ及びクーパー、
前掲）を挙げることができる。非必須的領域を含むDNA
は、制限エンドヌクレアーゼ開裂によって切り取られ、
アガロースゲル電気泳動又は他の常法によって精製され
た。この断片は、予め制限エンドヌクレアーゼによって
開裂されて相補的な連結可能な末端を生じているプラス
ミドDNAと連結された。ワクチニアウイルスDNAを含むプ
ラスミドは、細菌を形質転換するのに用いられ、次に精
製された。先に単離したプロモータ断片と連結するため
に、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミド
中のワクチニアウイルスDNAの非必須的断片を開裂し
た。この操作（又は、連結と開裂工程の順序が変えられ
たその自明な変形例）によって、隣接する制限エンドヌ
クレアーゼ部位にワクチニアウイルスDNAの非必須的断
片が結合されたワクチニアウイルスプロモータを有する
プラスミドが得られた。このプラスミドはプラスミド複
製開始点及び抗生物質耐性遺伝子を有しているので、細
菌を形質転換するのに用いられ、複製された。
II.外来性遺伝子の製造及びプラスミドベクター内にそ
れを挿入してキメラ遺伝子を形成すること。
外来性遺伝子又は外来性遺伝子のcDNAコピーを含むDNA
断片を得た。このDNA断片を、翻訳開始コドンよりも前
の部位及びタンパク質コーディング配列の末端よりも後
の部位で制限エンドヌクレアーゼで開裂した。適当な制
限エンドヌクレアーゼ部位がない場合には、所望の位置
の向こう側を開裂し、余剰のヌクレオチドをBal31のよ
うなエキソヌクレアーゼによって除去するような、他の
方法を用いることが必要であった。最適の発現のため
に、断片中の最初のATGを、所望の遺伝子の翻訳を開始
するために用いた。ワクチニアウイルスRNAのスプライ
シングの証拠がないので、連続的なタンパク質コーディ
ング配列を用いた。
パートＩで構築したプラスミドを、プロモータに隣接す
る制限エンドヌクレアーゼ部位で開裂した。外来性遺伝
子のタンパク質コーディング部分は、それが相補的末端
を有している場合には直接プロモータに連結し、そうで
ない場合には適当に末端を修飾した後プロモータに連結
した。このプラスミドは、細菌を形質転換するのに用い
られ、次に精製された。外来性遺伝子が２以上の方向に
挿入可能なときには、制限エンドヌクレアーゼ消化とゲ
ル電気泳動によって、あるいはヌクレオチド配列決定に
よって、適切なものが得られたかどうかチェックするこ
とが必要であった。所望のプラスミドは、外来性遺伝子
の開始部位に隣接してプロモータを有していた。
III.ウイルス感染細胞の、キメラ遺伝子含有プラスミド
を含むプラスミドによるトランスフェクション ワクチニアウイルスの非必須的領域からのDNAがその側
面に結合されたキメラ遺伝子を含むプラスミドを、予め
ワクチニアウイルスに感染させた細胞をトランスフェク
トするために用いた。キメラ遺伝子は、ワクチニアウイ
ルスゲノムの中に、相同組変えによって挿入された。典
型的には、25cm2のCV−1,BSC−1,TK143又は他の細胞の
集密的単層細胞を、１細胞あたり0.01〜0.05プラーク形
成単位（pfc）のワクチニアウイルスで感染した。１μ
ｇのワクチニアウイルスDNAを有する、又は有さない、
約１μｇのプラスミドと20μｇのウシ申状腺DNA又は他
の担体DNAとを、1mlの0.1％デキストロース、0.14M NaC
l,5mM KCl,1mM Na2HPO4,20mMへペス（Hepes）（pH7.5）
中で混合し、終濃度125mMのCaCl2を加えることによって
沈殿させた。この混合物をゆっくりとかきまぜ、室温で
約45分間放置した。感染２時間後、0.8mlの微粒懸濁液
を、培養液を除去した感染単層に加えた。30分後、８％
のウシ胎児血清を含む8mlのイーグル又は他の組織培養
液をそれぞれのびんに加え、37℃でさらに3.5時間イン
キュベートした。感染６時間後、８％のウシ胎児血清を
含む新鮮な培地を加え、48時間インキュベートした。こ
の時、感染された細胞をびんからかき取り、遠心し、組
織培養液に再懸濁し、ホモジナイズして細胞を破壊し、
ウイルスを遊離させた。
IV.組換えワクチニアウイルスの単離及び外来性遺伝子
生産物の検出 トランスフェクトされた細胞からのウイルスは、そのう
ちのわずかなもののみが組変え体であった。これらの組
換え体を単離するのに、種々の選択的又は非選択的方法
を用いた。
選択的方法は、元のウイルスを阻害する環境下において
組変え体が複製する能力に基づいたものであった。１つ
の選択的方法は、ワクチニアウイルスTK遺伝子の不活化
を包含する。これは、ワクチニアウイルスTK遺伝子から
のDNAを、キメラ遺伝子の側面に結合するのに用いるこ
とによって達成された。相同組変えが起きると、キメラ
遺伝子はウイルスDNAのTK遺伝子中に挿入され、組変え
体はTKネガティブ（TK-）発現型を表す。TK-ワクチニア
ウイルスを単離するための選択的条件は、１％低融点寒
天がその上に積層された、TK-143細胞のようなTKネガテ
ィブ細胞の単層を、25μg/mlの５−ブロモデオキシウリ
ジン（BUdR）とともにウイルスでプラークイングするこ
とによって達成された。５％二酸化炭素を含む湿った空
気中で、37℃の温度下で48〜72時間放置した後、0.005
％のニュートラルレッドで染色することによってプラー
クを検出した。典型的には、30％を越えるTK-プラーク
が組変え体から成り、残りは、自発的にTK-突然変異体
になったワクチニアウイルスから成っていた。
TK-細胞をワクチニアウイルスのTK-突然変異体で感染
し、次にキメラヘルペスウイルスのTK遺伝子を含むプラ
スミドでトランスフェクトした時に第２の選択方法を用
いた。（TK-突然変異体は、TK-143細胞を、25g/mlのBUd
Rの存在下でワクチニアウイルスで感染することによっ
て得た。TK陰性突然変異体は次に、BUdRの存在下でTK-1
43中で少なくとも２回連続的にプラークした。）ヘルペ
スウイルスTKを発現している組換え体を、イーグル培
地、８％ウシ胎児血清、100μＭチミジン、50μＭグア
ノシン、10μＭグリシン、１μＭメトトレキセートを含
む１％低融点寒天がその上に積層されたTK-143上でのプ
ラークアセイにより選択した。５％CO2を含む湿った37
℃の空気中で48ないし72時間放置した後、ニュートラル
レッドで染色することによりプラークを検出した。
外来性遺伝子を含むウイルスプラークの同定に依存した
非選択的方法も用いた。さらに、この方法は、選択的方
法によって分離した後にも組換え体の同一性を確認する
ために用いた。
DNA−DNAハイブリダイゼーションを、組換え体ウイルス
によって形成されたプラークを同定するのに用いた。１
つの方法はドットブロットハイブリダイゼーションと呼
ばれる。この操作においては、感染細胞をキメラプラス
ミドでトランスフェクションとして得られたウイルス
を、１％寒天がその上に積層された単層細胞上にプラー
クした。48ないし72時間後、ニュートラルレッドで染色
してプラークを検出した。個々のプラーク中のウイルス
を減菌パスツールピペットを用いて取り、マイクロタイ
ター皿の直径16mmの単層細胞を感染するのに用いた。37
℃で48時間インキュベートした後、細胞をかき取り、連
結−解凍サイクルを３回繰り返して破壊し、マイクロサ
ンプルマニホールドを用いたろ過によって（Schleicher
とSchuell,NH）ニトロセルロースシート上に集めた。ろ
紙を100mM NaCl,50mMトリス−HCl（pH7.5）で洗い、
（１）0.5 NaOH,（２）1M トリス−HCl（pH7.5），
（３）2X SSC（SSCは0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリ
ウム）をしみ込ませた連続的なワットマン3MM紙にしみ
こませ、80℃で２時間焼き、5Xデンハードの溶液（デン
ハード、Biochem.Biophys.Res.Commun.,23:641−646（1
966））と共に２時間インキュベートし、4X SSC中にあ
る0.1mg/mlの変性サケ精子DNAを65℃で４時間加えた。
ニック翻訳により32Pでラベルした外来性DNAと終濃度0.
1％のドデシル硫酸ナトリウムとを加え、ハイブリダイ
ゼーションを12時間を継続した。ろ紙を2X SSC/0.1％SD
Sで65℃で15分間２回洗い、次に0.2X SSC/0.1％SDSで洗
った。ろ紙をＸ線フィルタの隣に置いてオートラジオグ
ラフを取ると、現像フィルムの暗いスポットが組換え体
ウイルスに一致する。用いたもう１つのDNA−DNAハイブ
リダイゼーション法は、ヴィラリアルとバーグ（Scienc
e 196:183−185（1977））によって記載されている。こ
の方法では、ニトロセルロースろ紙で単層細胞上に直接
置くことによってウイルスプラークのレプリカを形成す
る。DNA−DNAハイブリダイゼーションを上述のようにし
て行ない、組換え体ウイルスを含むプラークの位置を決
定した後、残余のウイルスを、もともとプラーク上に積
層された寒天から溶出した。
外来性遺伝子の発現に基づく他の方法もまた、プラーク
を同定するのに用いた。組換え体ウイルスを含むプラー
クを次にオートラジオグラフによって同定した。ヘルペ
スウイルスチミジンキナーゼが発現された場合には、組
換え体プラークは、感染14〜48時間後に20μg/mlのテト
ラヒドロウリジンの存在下で［125I］デオキシチジン
（１μCi/ml）を組み入れることによって検出した。
V.ワクチニアウイルス組換え体による感受性細胞又は動
物の感染 ワクチニアウイルス組換え体を同定した後、２以上の連
続的なプラーク精製を行なって純粋な組換え体ウイルス
を得た。BSC−1,ヒーラ細胞、MRC−５やその他の感受性
細胞を感染して大量の組換え体ウイルスのストックを得
た。このストックのタイターを逓減稀釈とプラークアセ
イにより測定した。
外来性遺伝子を発現するために、細胞を１ないし30pfu/
細胞の粗製又は精製ウイルスで感染し、37℃で48時間以
下インキュベートした。外来性遺伝子生産物はその性質
に応じて細胞培養物中又は細胞中で見出された。細胞内
に存在する場合には、超音波崩壊、凍結−解凍、ホモジ
ネーション、及び洗剤処理を包含する多くの方法のうち
の１つによって、その生産物を遊離させた。外来性タン
パク質は免疫的、酸素的、及び電気泳動的方法によって
検出した。
動物を感染させるために、組換え体ウイルスは、経皮的
に投与した。もっとも、他の投与経路も満足できるもの
である。外来性遺伝子の生成物に対する抗体が形成され
たおとにより、外来性タンパク質が形成され、それが免
疫原性であることが示された。
実施例 この発明を例示するために、我々はワクチニアウイルス
プロモータを有し、外来性タンパク質コード配列を挿入
してキメラ遺伝子を形成するのに用いることができるい
くつかのベクターをつくった。他のDNAウイルス、RNAウ
イルス及び原核生物からのタンパク質コード配列を、プ
ラスミドに挿入した。キメラ遺伝子を含むベクターを次
にワクチニアウイルスで感染した細胞をトランスフェク
トするのに用い、組換え体ウイルスを選択的方法によっ
て単離した。それぞれの場合において、外来性遺伝子の
発現を示した。用いた多くのルーチン操作はMANIATIS
ら、前掲に詳述されている。
実施例１ ワクチニアウイルスの7.5Kポリペプチド遺伝子（7.5K遺
伝子）からのプロモータと、外来性タンパク質コード配
列を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位と、フ
ランキングDNAとして切断されたワクチニアウイルスチ
ミジンキナーゼ遺伝子を含むプラスミドpGS20とpGS21の
製造 （ａ）7.5KプロモータDNAの単離 7.5Kと呼ばれるタンパク質をコードする初期ワクチニア
ウイルス遺伝子のRNA開始部位の上流及びこの部位を含
む約275pbのDNA断片を、プラスミドpAG4（ヴェンカテサ
ンら、Cell,125:805−813（1981））から得た。70μｇ
のpAG4を、50mM NaCl,10mMトリス−HCl（pH7.4）,10mM
MgSO4,及び1mMジチオトレイトール（DTT）から成る溶液
（以下媒体塩制限バッファーという）中にある100ユニ
ットの制限エンドヌクレアーゼHind IIとRSa I（ニュー
イングランドバイオラボ）で、37℃で２時間処理して完
全に消化した。得られたDNA断片は、40mMトリス酢酸（T
ris−Ac）（pH8.0）、20mM酢酸ナトリウム（NaAc）、2m
M EDTA、18mM NaClを含む1.5％アガロースゲルを介して
200ボルトで１時間電気泳動した。このゲルを、１μg/m
lのエチジウムブロミド（EtBr）を含むアガロースゲル
バッファーに10分間浸した。DNA断片中のゲルを長波長
紫外線の下で見、275bpのDNA断片を含むゲル薄片をレー
ザー刃を使って切り取った。このゲル薄片中のDNAを、4
0mM Tris−Ac（pH7.2）,20mMNaAc,1mM EDTAから成る溶
液中にあるジメチルアミノエチル（DEAE）セルロースの
シート上に2.5mAで45分間エレクトロブロット（electro
blot）し、1.2M NaCl,40mM Tris−Ac（pH7.2）,20mM Na
Ac,1mM EDTAから成る溶液中で25℃で30分間浸透するこ
とによってEDAE−セルロースから溶出した。12,000gで
２時間遠心することによってDEAE−セルロースを除去
し、２体積のエタノールを加えることによってDNAを上
清から取り、12,000gで５分間遠心した回収した。
（ｂ）7.5K遺伝子プロモータのプラスミドpUC9への挿入 ２μｇのpUC9 DNAを、媒体塩制限バッファー中にある５
ユニットの制限エンドヌクレアーゼHind IIで、37℃で
２時間消化した。この混合物を70℃まで５分間加熱し、
DNAを等量のフェノール／クロロホルム（1:1）で抽出
し、エタノール沈殿により回収した。次の工程で自己連
結することを防止するために、0.1ユニットのウシ小腸
アルカリフォスファターゼ（ボエリンガー・ニュンヘ
ン）を含む、50mM Tris−HCl（pH9.0）,1mM MgCl2,0.1m
M ZnCl2,1mMスパーミジンから成る溶液50μｌ中で37℃
で30分間インキュベートすることによって５′末端を脱
リン酸化した。この混合物を等量のフェノール：クロロ
ホルムで２回抽出し、DNAをエタノール沈殿により回収
した。0.5μｇの直線化され脱リン酸化されたpUC9 DNA
を、１ユニットのT4DNAリガーゼを含む、66mM Tris−HC
l（pH7.5）,6.6mM MgCl2,10mM DTT,0.5mM ATPから成る
溶液50μｌ中で、12℃で15時間かけて予め単離したワク
チニアウイルスプロモータと連結した。25μｌの連結DN
A混合物を、コンピーテントな大腸菌JM103株を形質転換
するのに用い、100μｌの形質転換された細胞サスベン
ジョンを50μｌの２％Ｘ−gal及び10μｌの0.1M IPTGと
混合し、これを、1.5％バクトアガー（Difco）と50μg/
mlアンピシリンを含むＬ肉汁プレートに撒いた。このプ
レートを37℃で15時間インキュベートした。白い細菌コ
ロニーを取り、50μg/mlのアンピシリンを含む10mlのＬ
肉汁中で生育させた。プラスミドDNAを以下の操作（以
下プラスミドDNAのミニプレパレーションという）によ
って1.5mlの細菌培養物から精製した。細菌細胞を遠心
（12,000g,1min.）してペレット化し、25mM Tris−HCl
（pH8.0）,10mM EDTA,50mMグルコース、2mg/mlリゾチー
ムから成る溶液（溶解液）0.1mlに再懸濁し、４℃で30
分間インキュベートした。0.2M NaOH,1％ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）から成る溶液0.2mlを加え、この混合
物を氷上でさらに５分間インキュベートした。0.15mlの
3M NaAc（pH4.8）を加え、混合物を氷上で１時間インキ
ュベートし、12,000gで５分間遠心した。上清に存在す
るプラスミドDNAを、1mlのエタノールを加えることによ
って沈殿させ、遠心して回収し、10mMのTris−HCl（pH
7.5）,1mM EDTA（TEバッファー）から成る溶液0.1mlに
再懸濁した。それぞれのプラスミドプレパレーションの
10％を、制限エンドヌクレアーゼHind III及びEcoR Iで
消化することによって（媒体塩制限バッファー中にそれ
ぞれの酸素が５ユニットずつ含まれたもので37℃で１時
間）、ワクチニアウイルスプロモータの存否を調べた。
DNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、上述のよ
うにして視覚化した。ワクチニアウイルスプロモータを
含むプラスミドプレパレーションは、さらに、ワクチニ
アウイルスプロモータのプラスミド配列に対する方向に
決定するために分析した。これは、制限エンドヌクレア
ーゼHind IIIとHind II、又はHind IIとEcoR Iで消化し
（媒体塩制限バッファー中にそれぞれの酸素が５ユニッ
トずつ含まれたもので37℃で１時間）、アガロースゲル
電気泳動にかけることによって行なった。プラスミドに
固有のBamH I制限部位に向かって読むワクチニアウイル
スプロモータを有するプラスミドをpSG15と呼んだ。こ
のプラスミドは以下の操作（以下、プラスミドDNAの製
造と呼ぶ）によって大量に精製された。必要とするプラ
スミドを含む細菌を、50μg/mlアンピシリン、150μg/m
lプロリン、150μg/mlロイシン、0.8μg/mlビタミンB1
を含むＭ−９培地から成る溶液400mlにまき、590nmの吸
光度が0.8になるまで生育させた。クロラムフェニコー
ルを終濃度が200μg/mlになるように加え、この培養物
を37℃で12時間インキュベートした。細菌を遠心（5,00
0g,10min.）してペレット化し、10mM Tris−HCl（pH7.
5）,0.15M NaClで洗い、10mlの溶解液に再懸濁して氷上
で30分間インキュベートした。0.2M NaOH,0.1％ SDSか
ら成る溶液20mlを加え、氷上でのインキュベーションを
５分間続け、15mlの3M NaAc（pH4.8）を加え、氷上でさ
らに１時間インキュベートした。この混合物を遠心した
（10,000gで10分）。２体積のエタノールを加えてプラ
スミドDNAを沈殿させ、10,000g,10分間の遠心によって
回収した。このDNAペレットを10mlのTEバッファーに再
懸濁し、等体積のフェノール：クロロホルムで２回抽出
し、エタノール沈澱と遠心によってDNAを回収し、5mlの
TEバッファーに再懸濁した。0.1mg/mlのリボヌクレアー
ゼ（予め10分間煮沸処理してデオキシリボヌクレアーゼ
を不活化してある）を加え、37℃で30分間インキュベー
トした。次にDNAを、NaAc（pH7）を0.1Mに、かつ1.5体
積のエタノールを加えて沈殿させ、遠心によって回収し
た。ペレットを0.3M NaCl,10mM Tris−HCl（pH7.5）,10
mM EDTAから成る溶液に溶かし、これを同じバッファー
で平衡化させたセファクリル−S300でろ過してDNAから
残留するRNAを除去した。最初のA260nmピークに溶出し
たDNAをエタノール沈殿と遠心によって回収した。DNAを
最後にTEバッファーに溶かし４℃で貯蔵した。
（ｃ）pGS15のHind III部位のEcoR I部位への変更 pGS15中にクローン化されたワクチニアウイルス7.5K遺
伝子プロモータを、固有のEcoR I部位でワクチニアウイ
ルスチミジンキナーゼ遺伝子内に挿入することができる
ようにするために、pGS15のHind III部位をEcoR I部位
に変えることが必要であった。このため、ワクチニアウ
イルスプロモータ及び隣接する制限部位の側面にEcoR I
部位をつける（フランクする）ことになった。20μｇの
pGS15 DNAを、媒体塩制限バッファー中に含まれる50ユ
ニットのHind III制限エンドヌクレアーゼで37℃で２時
間開裂させた。フェノール：クロロホルムで抽出した
後、エタノール沈殿と遠心によってDNAを回収した。0.2
mM dATP,0.2mM cCTP,0.2mM dGTP,0.2mM dTTP,0.5mM DT
T,5mM MgCl2,50mM Tris−HCl（pH7.8）から成る溶液中
に２ユニットのDNAポリメラーゼＩ大断片（ボエリンガ
ー・マンハイム）を含む溶液中で37℃で45分間DNAをイ
ンキュベートすることによってDNAの末端を埋めて平滑
末端を形成した。フェノール：クロロホルムで抽出した
後、エタノール沈殿と遠心によってDNAを回収した。50m
M ATP,66mM Tris−HCl（pH7.6）,10mM MgCl2,10mM2−メ
ルカプト−エタノール中にある１ユニットのポリヌクレ
オチドキナーゼとともに37℃で30分間インキュベートす
ることによって、合成EcoR Iリンカーを５′未満で加リ
ン酸化した。１ユニットのT4DNAリガーゼを含む、0.5mM
ATP,66mM Tris−HCl（pH7.6）,6.6mM MgCl2,10mM DTT
中で４℃で15時間インキュベートすることによって、上
記加リン酸化されたEcoR Iリンカーを次に、直線化され
た平滑末端pGS15 DNAに連結した。DNAを次に、100ユニ
ットのEcoR Iを含む高塩制限バッファー（100mM NaCl,5
0mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgSO4）中で４時間消化
し、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。DEAE−
セルロース上にエレクトロブロットすることによって29
0 bpの断片を精製し、予めEcoR Iで開裂され、フォスフ
ァターゼで処理されたpUC9に連結した。形質転換コンピ
ーテントな大腸菌をこの連結プラスミドで上述したよう
に形質転換し、形質転換株を選択し、生育させ、プラス
ミドを増幅させ精製した。このプラスミドをpGS19と名
づけた。
（ｄ）7.5K遺伝子プロモータのワクチニアウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子への挿入 プラスミドpGS8（ワクチニアウイルスTK遺伝子を含むワ
クチニアウイルスHind III J断片を、プラスミド配列中
の、BamH IとEcoR I部位を欠失した固有のプラスミドHi
nd III部位に挿入することによってpBR328から誘導され
た）を生育させ精製した。５μｇのpGS8をEcoR Iで消化
し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈
殿させた後回収した。５′末端リン酸をアルカリフォス
ファターゼ処理によって除去し、DNAを再びフェノー
ル：クロロホルム抽出後エタノール沈殿によって回収し
た。0.5μｇのpGS8DNAを次に、EcoR I部位が側面につけ
られたワクチニアウイルスプロモータ配列を含む0.1gの
290bpのDNA断片に連結した。この断片はpGS19から切り
出され、アガロースゲル電気泳動とエレクトロブロッテ
ィングによって精製されたものである。連結されたDNA
をコンピーテントな大腸菌HB101株細胞を形質転換する
のに用い、細菌クローンについて、ワクチニアウイルス
プロモータ配列を含むプラスミド有しているかどうか調
べた。このようなプラスミド２つを増幅させ、精製し
た。これらはそれぞれワクチニアウイルスプロモータ配
列を有していたが、その方向はプラスミド配列に対して
反対であった。これらのクローンをpGS20及びpGS21と名
づけた。これらのベクターは両方とも、移送されたワク
チニアウイルス7.5K遺伝子プロモータの下流に外来生遺
伝子を挿入するためのBaH I及びSma I制限部位を有して
おり、かつチミジンキナーゼ遺伝子の部分をコードする
DNA配列がその側面についている。
実施例２ ワクチニアウイルスチミジンキナーゼのプロモータ、外
来性タンパク質コード配列を挿入するための制限エンド
ヌクレアーゼ部位、及びチミジンキナーゼ遺伝子の部分
を含むフランキングDNAを含むプラスミドpMM3とpMM4の
構築 （ａ）pMM1の構築 ワクチニアウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子のマ
ッピング及び配列決定技術（ウェイア、バジュザー及び
モス、前掲；ウェイアーとモス，前掲）により、転写開
始部位を有するが翻訳開始部位を有さないTKプロモータ
を単離する戦略を開発することが可能になった。配列を
調べたところ、転写開始部位と翻訳開始部位との間にGT
Cが存在することがわかった。この配列をGACに連結する
と、種々の制限酵素によって認識されるGTCGAC配列が形
成される。これは次のようにして行なった。ワクチニア
ウイルスHind III J断片を挿入することによってpUC9か
ら誘導した25μｇのプラスミドを、10mM Tris−HCl（pH
8）,10mM NaCl中にある50ユニットのCla I（ボエリンガ
ー・マンハイム）で、37℃で２時間開裂させ、直線状DN
A分子を得た。バッファー組成物を20mM Tris HCl（pH8.
1）,100mM NaCl,12mM CaCl2,1mMNa2EDTAに変え、溶液を
30℃で10分間プレイキュベートした。２ユニットのエキ
ソヌクレアーゼBal31を加え、６μｇの試料を、ヌクレ
アーゼを添加後1,2,5及び10分間後に取った。それぞれ
の試料の１μｇを媒体塩制限バッファー中にある２ユニ
ットのHind III（ベツサダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ）で、37℃で２時間消化し、得られた断片を１％アガ
ロースゲル上で電気泳動によって分離した。500bpの最
も小さな断片の平均サイズを与えるBal31エキソヌクレ
アーゼの消化時間を、その後の操作のために選んだ。ヌ
クレアーゼによって10分間消化した試料の５μｇをフェ
ノールで抽出し、エタノール沈殿させた。このDNAを媒
体塩制限バッファー中にある10ユニットのHincIIで37℃
で２時間開裂した。バッファー組成物を40mMのdATP,dCT
P,dGTP,dTTP,200mM NaCl,75mM Tris−HCl（pH8.8）,10m
M MgCl2に変え、１ユニットの大腸菌DNAポリメラーゼＩ
（大断片）を加え、室温で１時間インキュベートした。
DNAをフェノール抽出しエタノール沈殿した。プラスミ
ドの複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA分
子の混合物は、一方の端にHinc II開裂によって発生し
たGACを含み、他方の末端には種々の配列を有する。し
かしながら、いくつかの分子は、反対の末端のTK遺伝子
転写開始部位と翻訳開始部位との間にGTCを有すること
が予想された。連結すると、これらの分子は新たに発生
するSal I部位（GTCGAC）を有する。分子混合物を、20m
M Tris−HCll（pH7.6）,10mM DTT,10mM MgCl2,0.5mM AT
P中にある２ユニットのT4 DNAリガーゼ（ボエリンガー
・マンハイム）で室温で１夜かけて連結した。１μｇの
連結した混合物を用いて、50μg/mlのアンピシリンを含
むＬ−肉汁プレートにまいて37℃で１夜培養したコンピ
ーテントな大腸菌JM103株100μｌを形質転換した。144
の単一コロニーを、アンピシリンを含むマスター寒天倍
地に移した。144コロニーを12グループに分け、それぞ
れのグループをアンピシリンを含むＬ−肉汁に接種し
た。１夜培養した後、プラスミドのミニプレパレーショ
ンをつくり、２μｇの精製DNAを、10mM Tris−HCl（pH
7.5）,10mM MgCl2,100mM NaCl中にある２ユニットのHin
d IIIと２ユニットのSal Iで37℃で２時間開裂した。１
つのDNMプレパレーションが約500bpの断片を有してい
た。これは、Sal I部位がTK転写開始部位の後に発生し
ていたならば、Hind IIIとSal Iとによって形成れる断
片の大きさである。このDNAプレパレーションをつくる
のに用いた12コロニーを単独でＬ−肉汁中で培養し、プ
ラスミドDNAを精製しHind IIIとSal Iで開裂した。プラ
スミドの１つから、アガロースゲル電気泳動によって約
500bpの断片を検出した。この断片をファージM13mp8及
びM13mp9中で再クローン化し、Hind IIIとSal I部位の
両方から100ヌクレオチドの部分の配列を、サンガーの
ジデオキシ鎖末端法によって決定したところ、所望の配
列を持っていることがわかった。Hind III−Sal I断片
を有するプラスミドをpMM1と命名し、１リットルの形質
転換された大腸菌培養物から精製した。
（ｂ）pMM2の構築 ワクチニアウイルスDNA Hind III J断片を含む5gのpUC9
誘導体を、10mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,150mM
NaCl（高塩制限バッファー）中にある５ユニットのXho
Iで37℃で２時間開裂した。バッファー組成物を40mMの
dATP,CTP,dGTP,dTTP,250mM NACl,75mM Tris−HCl（pH8.
8）に調節した。１ユニットの大腸菌DNAポリメラーゼＩ
（大断片）を加え、平滑末端を与えるためにこれを室温
で１時間インキュベートした。合成EcoR Iリンカーを、
上述したようにしてポリヌクレオチドキナーゼとインキ
ュベートすることによって５′末端を加リン酸化した。
リン酸化されたリンカーを上述のように平滑末端DNAと
室温にて連結した。1mgの連結された混合物を用いて大
腸菌JM103株を形質転換し、１つのアンピシリン耐性コ
ロニーを取り、プラスミドが以前Xbo I部位であったと
ころにEcoR I部位を有しているか否かを調べた。新たな
EcoR I部位を有しているプラスミドをpMM2と命名した。
（ｃ）pMM3の構築 pMM2からのTK遺伝子の１部を有する、新たにつくられた
EcoR I断片を、pMM1のEcoR I部位に挿入することによっ
て、外来性遺伝子コード配列を挿入するための多数の制
限部位を有する新たなプラスミドが得られた。50mgのpM
M2を高塩制限バッファー中にある75ユニットのEcoR Iで
37℃で２時間開裂し、1kbのEcoR I断片をアガロースゲ
ル電気泳動及びDEAE紙へのエレクトロブロッティングに
よって精製した。5gのpMM1を５ユニットのEcoR Iで上述
したように37℃で２時間開裂した。1.5ユニットの細菌
性アルカリフォスファターゼをこの制限消化物に加え、
さらに30分間インキュベートした。反応混合物を次にフ
ェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈殿させた。EcoR Iで開裂されアルカリフォスファタ
ーゼ処理されたpMM1の0.25mgを、pMM2からの単離された
EcoR I断片0.5mgに加え、DNAを１夜かけて連結した。連
結された混合物を用いて大腸菌JM103株を形質転換し、
プラスミドが、pMM1中に挿入された1kbのEcoR I断片
を、ワクチニアウイルスゲノムに存在するのと同じ方向
に有しているかどうか調べた。pMM3と命名された得られ
たプラスミドは、チミジンキナーゼプロモータの隣に外
来性遺伝子を挿入するための固有のHinc II,Acc I,Sal
I,BamH I及びSma I部位を有している。
（ｄ）pMM4の構築 TKプロモータの制御下に外来性遺伝子を挿入するための
EcoR I部位を持つために、TKプロモータの末梢部にある
第２のEcoR I部位をまず除去することが必要であった。
これは次のようにして行なった。100mgのpMM2を高塩制
限バッファー中にある20ユニットのEcoR Iで37℃で15分
かけて部分的に開裂し、単一のEcoR I部位で開裂される
ことによって形成された直線DNA分子を、アガロースゲ
ル電気泳動とDEAE紙上へのエレクトロブロッティングに
よって単離した。250mgの直線乗DNAを、40mM dATP,dCT
P,dGTP,dTTP,50mM NaCl,75mM Tris−HCl（pH8.8）中に
ある0.5ユニットの大腸菌DNAポリメラーゼＩ（大断片）
とともに15℃で１時間インキュベートした。反応混合物
を次にフェノール抽出、クロロホルム抽出、及びエタノ
ールを沈殿した。連結後、このプラスミドを用いて大腸
菌JM103を形質転換した。得られた形質転換された大腸
菌中に、欠失したプロモータから最も遠いEcoR I部位を
有するプラスミドが存在するかどうか調べた。pMM4と命
名されたプラスミドは、外来性遺伝子を挿入するための
固有のHinc II,Acc I,Sal I,BamH I,Sma I及びEcoR I部
位を有していた。
実施例３ 原核生物性クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（CAT）遺伝子を発現するワクチニアウイルス組
変え体の形成 （ａ）pGS21へのCAT遺伝子の挿入 pBR328DNAを制限エンドヌクレアーゼTag Iで開裂し、ア
ガロースゲル電気泳動、DEAE−セルロース上へのエレク
トロブロッティングと溶出、エタノール沈殿と遠心によ
る回収によって、CAT遺伝子を含む770bpのDNA断片をpBR
328から単離した。この770bpのDNA断片を次のようにし
てプラスミドpUC7に挿入した。pUC7 DNAを制限エンドヌ
クレアーゼAcc Iで開裂し、５′末端リン酸をウシ小腸
アルカリフォスファターゼで除去し、DNAをフェノー
ル：クロロホルム抽出した後エタノール沈殿により回収
した。0.5μｇの直線化され脱リン酸化されたプラスミ
ドDNAを、上述した標準条件下で0.2μｇの770bp断片と
連結した。連結したDNAを用いて次に大腸菌JM103を形質
転換し、Ｌ−肉汁,50μg/mlアンピシリン、Ｓ−gal及び
IPTGを含む1.5％バクトアガープレート上に生育した白
い細菌性コロニーを取り、Ｌ−肉汁中で培養した。プラ
スミドDNAのミニプレパレーションが、CAT遺伝子を有す
る770bp DNA断片を有するかどうかを、BamH Iによる消
化及びアガロースゲル電気泳動によって調べた。このよ
うなプラスミドを上述したようにして常法により生育
し、増幅し、精製してこれをpGS29と命名した。
プラスミドpUC7は、Acc I部位の近くに２つのBamH I部
位を有する。従って、CAT遺伝子をAcc I部位に挿入する
と、この遺伝子はBamH Iによって780bpの断片として切
り出すことが可能となった。pGS29をBamH Iで消化した
後、780bp断片をアガロースゲル電気泳動、DEAE−セル
ロース上へのエレクトロブロッティングと溶出、エタノ
ール沈殿による回収によって単離した。
次の工程は、このBamH I DNA断片をプラスミドベクター
pGS21内に挿入することであった。pSG21 DNAをBamH Iで
開裂して直線化し、５′末端リン酸をウシ小腸アルカリ
フォスファターゼで消化することによって除去し、DNA
をフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈
殿させることによって回収した。0.5μｇの直線化さ
れ、脱リン酸化されたpGS21 DNAを標準条件下で0.1μｇ
の780bp DNA断片と連結し、連結されたDNを、コンピー
テントな大腸菌HB101株を形質転換するのに用いた。形
質転換された細胞を、1.5％バクトアガーと50g/mlアン
ピシリンと含むＬ−肉汁プレート上にまいた。37℃で15
時間インキュベートした後、細菌性コロニーを取り、50
μg/mlアンピシリンを含むＬ−肉汁中で培養し、プラス
ミドDNAをマイクロプレパレーション操作によって精製
した。BamH I又はEcoR Iで消化し、アガロースゲル電気
泳動にかけることによって、プラスミドDNAに、ワクチ
ニアウイルスプロモータに対して正しい方向に入った78
0bp CAT遺伝子BamH I断片が存在するかどうかを調べ
た。このクローンをpGS24と命名し、上述したように培
養し、増幅し、精製した。
（ｂ）キメラCAT遺伝子のワクチニアウイルスへの挿入 25cm2のTK-143単層細胞を野生型ワクチニアウイルスで
0.01pfu/細胞で感染した。１μg pGS24,1μｇワクチニ
アウイルスDNA,20μｇウシ甲状腺DNA混合物を、125mM C
aCl2で沈殿させた。微懸濁液を、感染２時間後に細胞を
トランスフェクトするのに用いた。25℃で30分経過した
後、８％のウシ胎児血清を含むイーグル倍地7.2mlを加
え、その単層を37℃で3.5時間インキュベートした。倍
地を除去して、８％ウシ胎児血清を含む新鮮なイーグル
倍地と交換し、37℃で２日間インキュベートし続けた。
細胞をびんからかき取り、遠心（2,000g,5分）してペレ
ット化し、2.5％ウシ胎児血清を含む0.5mlのイーグル倍
地に再懸濁した。
（ｃ）キメラCAT遺伝子を含む組換え体ワクチニアウイ
ルスの選択 25μg/mlのBUdRを含む１％低融点アガロースがその上に
積層されたTK-143細胞中でのプラークアセイにより、チ
ミジンキナーゼ陰性ワクチニアウイルス組換え体を選択
した。37℃で３日後、細胞単層を0.005％ニュートラル
レッドで染色し、滅菌パスツールピペットを用いてプラ
ークを取り、2.5％ウシ胎児血清を含むイーグル倍地0.5
mlに入れた。凍結と解凍を３回繰り返し、超音波崩壊を
行なった後、それぞれのプラークの0.25mlを、直径16mm
のTK-143細胞の単層を感染するのに用いた。感染２時間
後、倍地を除去し、単層上に、2.5％ウシ胎児血清と25g
/ml BUdRとを含む1mlのイーグル倍地を積層した。37℃
で２日間インキュベーションした後、細胞単層をウェル
からかき取り、遠心してペレット化し、0.5mlの0.15M N
aCl,10mM Tris−HCl（pH7.5）に再懸濁し、凍結と解凍
を３回繰り返し、0.1mlを、ミクロろ過マニホールド
（シュレイシャー・アンド・シュエル）を用いてニトロ
セルロースに移した。変性、中和、及びニトロセルロー
スへの固定操作の後、そのろ紙を32PでラベルしたCAT遺
伝子DNAとハイブリダイズした。ろ紙を洗った後、オー
トラジオグラフを得た。32P−ラベルDNAに対して陽性の
ハイブリダイゼーションを示したウイルス組換え体を、
BUdR選択を伴なうTK-143細胞中でさらにプラーク精製
し、CAT DNAに対するスクリーニング操作を繰り返し
た。この段階でCAT DNAに対して陽性のクローンをBUdR
選択とともにTK-細胞で１回増幅し、選択なしにCV−１
細胞中で１回増幅し、CV−１細胞中でのプラークアセイ
によってウイルスタイターを決定した。このウイルスを
vCAT24と命名した。
（ｄ）キメラCAT遺伝子の発現分析 CV−１細胞をvCAT24で10pfu/細胞で感染した。37℃で24
時間後、細胞をかき取り、ペレット化し、0.2mlの0.25M
Tris−HCl（pH7.8）に再懸濁し、超音波崩壊した。細
胞破片を遠心（12,000g,5分）で除き、上清についてそ
のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活
性を本質的にゴーマンら、Mol,Cell Biol.2:1044−1051
（1982）に記載された方法によって測定した。vCAT24で
感染した細胞からの抽出物は、薄層クロマトグラフィー
によって示されるように、クロラムフェニコールをアセ
チル化する酵素活性を含んでいた。非感染及び野生型ワ
クチニアウイルス感染細胞からの抽出物は両方とも検出
できるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ活性を有していなかった。
実施例４ キメラヘルペスチミジンキナーゼ（HTK）遺伝子を発現
するワクチニアウイルスの構築 HTK遺伝子を含むBamH I断片を有する50μｇのプラスミ
ド（エンクイストら、Gene 7:335−342（1979））を、
媒体塩制限バッファー中で50ユニットのHinc IIと50ユ
ニットのPvu IIで37℃で２時間開裂した。HTKを転写開
始部位は含まないが、そのコード配列の全てを含む1.8k
bのHinc II−Pvu II断片が、アガロースゲル電気泳動と
DEAE紙上へのエレクトロブロッティングによって得られ
た。５μｇのpUC7を、媒体塩制限バッファー中で、５ユ
ニットのHinc IIで37℃で２時間開裂した。1.5ユニット
のウシ小腸アルカリフォスファターゼを加え、反応混合
物をさらに30分間インキュベートし、その後、フェノー
ル抽出、クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿した。
250ngのこのDNAを500ngの単離されたHinc II−Pvu II H
TK断片と連結し、この連結した混合物で大腸菌JM103細
胞を形質転換した。プラスミドを形質転換細菌から単離
し、pUC7中へ挿入されたHinc II−Pvu II断片を有する
かどうかをスクリーニングした。このプラスミドをpVH4
と命名した。50μｇのpVH4をEcoR Iで開裂し、HTK遺伝
子を含むEcoR I断片をアガロースゲル電気泳動及びDEAE
紙上へのエレクトロブロットによって単離した。５μｇ
のpMM4をEcoR Iで開裂し、1.5ユニットのウシ小腸アル
カリフォスファターゼを加え、これをさらに30分間イン
キュベートした。反応混合物を次にフェノール抽出、ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿した。250ngのこの開
裂されたプラスミドを、HTKコード配列を含むEcoR I断
片500ngに連結し、この連結された混合物を大腸菌JM103
を形質転換するのに用いた。アンピシリン耐性コロニー
を１つずつ、pMM4のEcoR I部位にHTKコード配列を含む
プラスミドを含むかどうかスクリーニングした。この組
換えプラスミドをpMM20と命名し、これはワクチニアウ
イルスTK転写調節配列及びワクチニアウイルスTK遺伝子
の末梢半分を結合していた。野生型ウイルスのワクチニ
アウイルスTK遺伝子の部位で相同組換えが置きるよう
に、このキメラ遺伝子の側面にワクチニア配列を結合し
た。
ヒトTK-143細胞を0.01pfu/細胞のワクチニアウイルスTK
-突然変異株（TK-13;バジュザーら、J.Virol.,前掲）で
感染した。TK傷害はワクチニアTK転写開始部位とワクチ
ニアTK遺伝子中のEcoR I部位との間に位置し、従って、
傷害はpMM20との組換えによっては野生型ワクチニアTK
には保持され得ない。リン酸カルシウム沈殿した1gのpM
M20 DNAをTK-13ワクチニアウイルスで感染されたTK-143
中にトランスフェクトすることによって導入された。TK
+ウイルスを選択するのに用いた先に述べた選択操作を
行なった。単離された単一のTK+プラークのそれぞれを
再びプラーク精製し、ヘルペスウイルスTKを合成してい
るかどうか調べた。［I125］dCはヘルペスウイルスTKに
とって特異的な基質であるがワクチニアウイルスや細胞
性TKにとっては特異的基質ではないので、［I125］dC
は、ヘルペスウイルスTKが発現された場合にのみウイル
スDNAに取り込まれる。推定組換え体ウイルスで感染さ
れた細胞単層のオートラジオグラフィーをとるとウイル
スプラークに対応するフィルム上に暗いスポットが現わ
れ、TK+ウイルスがヘルペスウイルスTKを発現していた
ことを示した。ヘルペスTKがウイルスゲノムと一体化し
たことは、Ｐ−ラベルHTK DNAのDNA−DNAハイブリダイ
ゼーションによって精製組換えウイルスDNAの分離され
た制限消化物への結合がみられたことにより示された。
ヘルペスウイルスTKが発現したというさらなる確証は、
40μg/mlのブロモデオキシシチジン（BCdR）の存在下及
び不存在下において組換えウイルスストックをプラーク
することによって得られた。倍地に40μg/mlのBCdRを加
えると、野生型ワクチニアウイルスプラークはその大き
さがわずかに小さくなったが、多数のプラークが変化せ
ずにとどまった。しかしながら、もしへルペスウイルス
TKの合成が起きているならば予想されたように、組換え
ウイルスのタイターは40μg/mlのBCdRの存在下で10倍か
ら100倍減少した。
実施例５ 水疱性口内炎ウイルス（VSV）Ｎ遺伝子を発現するワク
チニアウイルス組換え体の構築 50μｇのpJS223（VSV N遺伝子のcDNAコピーを含むプラ
スミド、スプラーグら、J.Virol.45:773（1983））を高
塩制限バッファー中で50ユニットのXho Iで37℃で２時
間開裂した。Ｎ遺伝子DNAを含む小さな断片をアガロー
スゲル電気泳動とDEAE紙上へのエレクトロブロッティン
グによって単離した。5gのpMM3を５ユニットのSal Iで3
7℃で２時間開裂した。1.5ユニットのウシ小腸アルカリ
フォスファターゼを加えてさらに30分間インキュベート
した。反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽
出、エタノール沈殿した。250ngのこのDNAを500ngの単
離されたXho I断片と連結し、この連結された混合物で
大腸菌JM103を形質転換した。単一のアンピシリン耐性
コロニーのそれぞれについてpMM3中にクローン化された
VSV cDNAが存在するかどうかスクリーニングした。VSV
cDNAと隣接してワクチニアプロモータを含むキメラプラ
スミドをpMM17と命名した。細胞を野生型ワクチニアウ
イルスで感染し、このプラスミドでトランスフェクトし
た。48時間後、細胞を破壊し、TK-ウイルスを、寒天が
積層される、BUdRを用いたプラーク形成によって選択し
た。キメラVSV N遺伝子の発現は、標準的な免疫沈殿法
によって示された。組換えウイルスを、20pfu/細胞で細
胞を感染するのに用い、［35S］メチオニンを培養物に
加えた。感染６時間後、細胞質性抽出物を感染細胞から
つくった。ウサジ抗VSV抗血清とスタフ（staph）Ａタン
パク質をVSVタンパク質を沈殿させるために用いた。ス
タフＡタンパク複合物を解離した後、このタンパク質
を、真正なVSV Nタンパク質と平行して10％ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析した。蛍光グラフィーの後、組換
えウイルスで感染された細胞から免疫沈殿されたタンパ
ク質が、真性VSV Nタンパク質と共に移動したことが示
されされた。この結果は、ワクチニアウイルス組換え体
がキメラVSV N遺伝子を発現したことを示している。
実施例６ キメラＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）遺伝子を発
現するワクチニアウイルスの構築 （ａ）pGS20,pGS21,及びpMM3へのHBsAg遺伝子への挿入 HBsAg遺伝子を含む1,350bpのDNA断片をプラスミド（モ
リアリティら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2606−2670
（1981））から得た。ヌクレオチド配列データによる
と、BDamH I制限エンドヌクレアーゼ部位のうちの１つ
の後にある最初のATGコドンがHBsAgの最初のメチオニン
残基を表わすことが示唆される。HBsAgを含む断片を、5
0mM NaCl,10mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgSO4,10mMジ
チオスレイトール（DTT）（以下、媒体制限バッファー
と呼ぶ）中にある100ユニットのBamH Iで37℃で２時間
消化することによって50gのこのプラスミドから単離し
た。DNA断片を、40mM Tris−酢酸（Ac）（pH8.0）,20mM
NaAc,2mM EDTA,18mM NaClを含む１％アガロースゲルを
介して200ボルトで１時間電気泳動することによって分
離した。このゲルを１μg/mlエチジウムブロミド（EtB
r）に浸し、DNA断片を長波長紫外線で照らすことによっ
て見た。1.35キロ塩基対（kb）のDNA断片を含むゲル薄
片をアガロースゲルから切り取り、この薄片内のDNA
を、40mM Tris−Ac（pH7.2）,20mM NaAc,1mM EDTA中で
ジメチルアミノエチル（DEAE）−セルロースに、2.5mA
で１時間エレクトロブロットすることによってジメチル
アミノエチル（DEAE）−セルロースに移した。1.2M NaC
l,40mM Tris−Ac（pH7.2）,20mM NaAc,1mM EDTA中で25
℃で30分間浸透することによってDNAをDEAE−セルロー
スから溶離し、２体積のエタノールを加えて12,000gで
５分間遠心することによって上清から回収した。
プラスミドpGS20,pGS21及びpMM3を、媒体塩制限バッフ
ァー中で２ユニットのBamH I/μgDNAで37℃で２時間消
化することによって直線化した。直線化したプラスミド
を次に、50mM Tris−HCl（pH9.0）,1mM MgCl2,0.1mM Zn
Cl2,1mMスパーミジン中で0.1ユニットのウシ小腸アルカ
リフォスファターゼで37℃で30分間インキュベートする
ことによって、その５′未端を脱リン酸化した。等体積
のフェノール：クロロホルム（1:1）で２回抽出した
後、DNAをエタノール沈殿と遠心によって回収した。0.5
μｇのそれぞれ直線化され、脱リン酸化されたプラスミ
ドを、66mM Tris−HCl（pH7.5）,6.6mM MgCl2,10mM DT
T,0.5mM ATP中で12℃で15時間、HBsAg遺伝子を含む0.2g
の1.35kbのBamH I断片と連結した。連結したDNAをコン
ピーテントな大腸菌HB101株細胞を形質転換するのに用
い、形質転換された細胞を、1.5％バクトアガーと50μg
/mlアンピシリンとを含むＬ−肉汁プレート上で37℃で1
5時間培養した。細菌コロニーを取り、50μg/mlのアン
ピシリンを含む10mlのＬ−肉汁中で37℃で15時間培養し
た。プラスミドDNAを、次のプラスミドDNAのミニプレパ
レーションによって1.5mlの細胞培養物からつくった。
細菌細胞を遠心（12,000g,1分）によってペレット化
し、0.1mlの溶解液（25mM Tris−HCl（pH8.0）,10mM ED
TA,50mMグルコース、２μg/mlリゾチーム）中に再懸濁
し、氷上で30分間インキュベートした。0.2mlの0.2M Na
OH,1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加え、混合物
を氷上で５分間インキュベートした。0.15mlの3M NaAc
（pH4.8）を加え、さらに１時間氷上でインキュベート
した後、混合物を12,000gで５分間遠心した。1mlのエタ
ノールを加えてプラスミドDNAを上清から沈殿させ、遠
心（12,000g,5分）によって回収し、最後に0.1mlの10mM
Tris−HCl（pH8.0）,1mM EDTA（TEバッファー）に再溶
解した。
それぞれのDNA試料の10％を媒体塩制限バッファー中で
５ユニットの制限エンドヌクレアーゼBamH Iで37℃で１
時間消化し、次にアガロースゲル電気泳動とEtBr染色を
行なうことによって、プラスミドDNAが1.35kbBamH Iを
有しているかどうかスクリーニングした。
1.35kbBamH I B型肝炎ウイルスDNA断片は、それぞれの
プラスミド内で２つの方向のいずれにでも挿入され得る
ので、さらなるスクリーニングが必要であった。pGS20
及びpGS21から誘導されたプラスミドを、100mM NaCl,50
mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCO（高塩制限バッファ
ー）中でXba I制限エンドヌクレアーゼで37℃で１時間
消化し、アガロースゲル電気泳動で分析した。約830bp
又は1,730bpのXba I断片は、HBaAg遺伝子をそれぞれ誤
った及び正しい方向に含むpGS20の誘導体に対応してい
る。約2,150bp又は1,150bpのXba I断片は、HBsAg遺伝子
をそれぞれ誤った及び正しい方向に含むpGS21の誘導体
に対応している。pMM3から誘導したプラスミドを、媒体
塩制限バッファー中でHinc IIによって消化し、アラロ
ースゲル電気泳動を行なうことによってスクリーニング
した。HBsAg遺伝子が正しい方向に入っていることは、
約5,400bpと200bpの断片の生成によって示され、一方、
HBsAgが誤った方向に入っていると4,400bpと1,200bpの
断片が生成する。プラスミドを次のようにして生育、増
幅、精製した。形質転換された細菌を、150μg/mlロイ
シン、150μg/mlプロリン、0.8μg/mlビタミンB1,50μg
/mlアンピシリンを含む400mlのＭ−９倍地を植え、590n
mでの吸光度が0.8になるまで培養した。次にクロラムフ
ェニコールを200μg/mlになるように加え、培養物を37
℃で12時間インキュベートした。細菌を遠心（5,000g,1
0分）,0.15M NaCl,10mM Tris−HCl（pH7.5）中で１回洗
い、次に10mlの溶解液（上述）に再懸濁した。氷上で30
分間インキュベートした後、20mlの0.2M NaOH,1％SDSを
加え、インキュベーションを５分間継続した。次に15ml
の3M NaAc（pH4.8）を加え、さらに１時間氷上でインキ
ュベーションした後、混合物を10,000gで10分間遠心し
た。上清を10,000gで10分間再遠心し、２体積のエタノ
ールを加えて最後の上清からプラスミドDNAを沈殿させ
た。10,000gで５分間遠心した後、ペレットを10mlのTE
バッファー中に再溶解し、溶液を等体積のフェノール：
クロロホルムで２回抽出した。DNAをエタノール沈殿と
遠心によって回収し、5mlのTEバッファーに再懸濁し
た。0.1mg/mlのリボヌクレアーゼ（100℃で加熱して混
入するデオキシリボヌクレアーゼを不活化したもの）を
加え、混合物を37℃で30分間インキュベートした。終濃
度0.1MのNaAc（pH7.5）と1.5体積のエタノールを加える
ことによってDNAを沈殿させ、5,000g,5分の遠心で回収
した。ペレットを0.3M NaCl,10mM Tris−HCl（pH7.5）,
10mM EDTA中に溶解し、このバッファーで平衡化された
セファクリル−S300カラムを通過させることによって残
存するRNAをDNAから除去した。最初のピークで溶出する
DNAをエタノール沈殿と遠心とによって回収し、1.0mlの
TEバッファーに溶かし、４℃で貯蔵した。HBsAg遺伝子
を、転移されたプロモータに対して誤った方向及び正し
い方向に有する、pGS21からのプラスミドをそれぞれpHB
s1及びbHBs2と命名した。HBsAg遺伝子を、転移されたプ
ロモータに対して誤った方向及び正しい方向に有する、
pGS20からのプラスミドをそれぞれpHBs3及びpHBs4と命
名した。HBsAg遺伝子をTKプロモータに対して正しい方
向に有する、pMM3から誘導されたプラスミドをpHBs5と
命名した。
（ｂ）キメラHBsAg遺伝子を含むワクチニアウイルス組
換え体の形成 ワクチニアウイルスTK遺伝子の部分が側面に結合された
キメラHBsAg遺伝子を含むプラスミドを、野生型チミジ
ンキアーゼ陽性（TK+）ワクチニアウイルスで感染され
た細胞を形質転換するのに用いた。一面にひろがった単
層のCV−１又はMRC−５細胞（25cm2）をワクチニアウイ
ルスで0.01プラーク形成ユニット（pfu）で感染した。
１μｇのプラスミド、１μｇのワクチニアウイルスDNA
及び20μｇのウシ甲状腺DNAを、1mlの0.1％デキストロ
ース、0.14M NaCl,5mM KCl,1mM Na2HPO4,20mMヘペス中
で混合し、終濃度0.125MのCaCl2で沈殿させた。この混
合物を25℃で45分間ゆっくりとかきまぜ、微懸濁液を、
倍地が除去された単層に、感染２時間後に加えた。25℃
で30分後、８％ウシ胎児血清（FBS）を含む7.2mlのイー
グル倍地を加え、さらに37℃で3.5時間インキュベート
し続けた。感染６時間後、倍地を８％FBSを含む新鮮な
倍地と取り換え、インキュベーションを２日間続けた。
細胞を次にびんからかき取り、ペレット化し、0.5mlの
細胞培養液に再懸濁し、ホモジナイズして細胞を破壊
し、ウイルスを遊離させた。
形質転換された細胞によって生産されたウイルスのうち
のわずかなパーセントのもののみが組換え体であった。
これらの組換え体は選択的及び非選択的方法により単離
された。HBsAgコード配列がTK遺伝子中に挿入され、そ
の機能を中断しているので選択は可能であった。ミジン
キナーゼ陰性（TK-）表現型の故に、組換え体ウイルス
は５−ブロモデオキシウリヂン（BUdR）の存在下でプラ
ークを形成することが可能であったが、もとのTK+ウイ
ルスはできなかった。非選択的操作は、ヴィラリアルと
バーグ［サイエンス、196:183−185（1977）］に記載さ
れた方法によって行なった。
単層のTK-143細胞に、形質転換された細胞からのウイル
スを接種し、２時間後、１％低融点寒天,25μg/ml BUd
R,及び2.5％FBSを含む倍地をその上に積層した。５％CO
2を含む湿った空気中で37℃で３日間インキュベートし
た後、細胞を0.005％のニュートラルレッドで染色し
た。この条件下で視覚化されたプラークの50％を越える
ものが、ドットブロットハイブリダイゼーションによっ
てＢ型肝炎ウイルスDNAを含むことが示された。後者の
操作のために、個々のウイルスプラークを滅菌パスツー
ルピペットを用いて取り、直径16mmのマルチウェルディ
ッシュ中のTK-143細胞の単層を感染するのに用いた。BU
dRを含む倍地中で37℃で48時間インキュベートした後、
細胞をかき取り、凍結−解凍サイクルを３回繰り返して
破壊し、マイクロサンプルマニホールド（シュレイシャ
ー・アンドーシュエル、NH）を介したろ過によってニト
ロセルロースシート上に集めた。ろ紙を100mM NaCl,50m
M Tris−HCl（pH7.5）で洗い、（１）0.5M NaOH,（２）
1M Tris−HCl（pH7.5），（３）2x SSC（SSCは0.15M Na
Cl,0.015Mクエン酸ナトリウム）で飽和された連続的な
ワットマン3MMろ紙上に３回ブロットし、80℃で２時間
焼き、4x SSC中に変性、剪断サケ精子DNAを0.1mg/ml含
む液が加えられた5xデンハードの溶液［デンハード、Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.23:641−646（1966）］とと
もに65℃で４時間インキュベートした。ニック翻訳によ
って32PでラベルしたＢ型肝炎ウイルスDNA（リグビー
ら、J.Mol.Biol.113,237（1975）］と終濃度0.1％のド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）を加え、ハイブリダイゼ
ーションを65℃で15分間続けた。ろ紙をＸ線フィルムの
隣に置くことによってオートラジオグラフィーを行な
い、暗いスポットの存在によってHBsAg遺伝子を含む組
換え体ウイルスが同定された。組換え体ウイルスを、25
μg/mlのBUdRを含む寒天が積層されたTK-143細胞中で再
びプラーク精製し、組換え体ウイルスストックを次につ
くった。組換え体ウイルスストックは、それが誘導され
たプラスミドに与えられた名前に対応してvHBs1,vHBs2,
vHBs3,vHBs4及びvHBs5と命名された。
（ｃ）ワクチニアウイルス組換え体で感染された細胞中
でのHBsAgの発現 ワクチニアウイルス組換え体で感染された細胞中でのHB
sAgの発現の証拠は、標準的な放射免疫分析操作（アス
リア、アボットラボラトリーズ）によって得られた。CV
−１細胞の単層を、第１表に示すように、細胞あたり１
プラーク形成ユニット（pfu）のワクチニアウイルス組
換え体若しくは野生型ワクチニアウイルスで感染し、又
は感染しなかった。感染２時間後、ウイルス接種物を除
去し、2.5％FBSを含むイーグル倍地を積層した。24時間
インキュベートした後、細胞を培養フラスコからかき取
り、遠心（2,000g,5分）によって倍地から分離した。細
胞ペレットを0.5mlのTBS［0.15M NaCl,10mM Tris−HCl
（pH7.5）］に再懸濁し、凍結解凍を３回繰り返し、超
音波崩壊し、遠心（12,000g,1分）して破片を除去し
た。上清及び組織培養液についてHBsAgが存在するかど
うか放射免疫分析によって分析した。抗HBsAg抗体でコ
ートされたビーズを0.2mlの試料とともに45℃で２時間
インキュベートし、1mlの水で８回ざっと洗い、HBsAgに
対する125I−ラベル抗体と共に45℃で１時間再インキュ
ベートした。存在したHBsAgの量は、アボットラボラト
リーズによって供給され、平行してインキュベートした
ポジティブ及びネガティブ対照を参照することによって
計算した。
第１表に示すように、HBsAgはvHBs2及びvHBs4で感染さ
れた細胞によって最も多量に生産された。より少量のHB
sAgがvHBs5で感染された細胞によって生産された。対照
的に、転移されたワクチニアウイルスプロモータに対し
て正しい方向にHBsAg遺伝子を有していない組換え体で
あるvHBsl及びvHBs3は、かろうじて検出できるレベルの
HBsAgを生産した。有意義なことに、多量のHBsAgが倍地
中に排出されていた。90％の感染性ウイルスが細胞内に
残っていたので、HbsAgの放出は細胞溶解によるもので
はない。第１表はまた、野生型（WT）で感染した場合で
も組換え体ウイルスで感染した場合でも同様なウイルス
収量が得られることを示している。
ワクチニアウイルス組換え体で感染された細胞によって
合成されたHBsAgの性質を免疫沈殿によて分析した。精
製ワクチニアウイルス組換え体によって30pfu/細胞で感
染された単層のCV−１細胞を0.01mMメチオニンを含むイ
ーグル倍地中で、感染後４時間インキュベートした。細
胞を次に、［32S］メチオニン（120μCi/5x106細胞）が
添加された、メチオニンを含まない新鮮なイーグル倍地
とともに37℃で20分間インキュベートした。過剰の
［Ｓ］メチニオンを、氷冷されたリン酸塩バッファーで
３回洗うことによって除去し、次に0.5mlの0.1％アプロ
チニン、0.1M Tris−HCl（pH8.0）,0.1M NaCl,0.5％NP4
0と共に氷上で10分間インキュベートし次いで遠心する
ことによってつくった。80％の上清を25μｌのモルモッ
ト非免疫血清とともに４℃で15時間インキュベートし、
次に50μｌのホルマリン処理スタフィロコッカルＡ懸濁
液を加え、４℃で30分間インキュベートし、次いで遠心
することによって免疫複合物を除去した。20μｌのモル
モットHBsAg抗血清を加え、４℃で15時間インキュベー
トし、次に、上述のスタフィロコッカルＡ懸濁液を加え
て遠心することによって免疫複合物を除去した。ぺレッ
トを0.05M Tris−HCl（pH7.5）,0.15M NaCl,0.1％SDS,1
％トリトンＸ−100,1％デオキシコール酸ナトリウムで
２回洗い、0.4M LiCl,2M尿素,10mM Tris−HCl（pH8.0）
で２回洗った。50μｌの0.06M Tris−HCl（pH6.8）,3％
SDS,5％β−メルカプトエタノール、10％グリセロー
ル、0.002％ブロモフェノールブルー中で25℃で15分間
インキュベートすることによって、免疫複合物をスタフ
ィロコッカルＡペレットから溶出させた。遠心後、上清
を煮沸し、15％ポリアクリロアミドゲルを通して電気泳
動にかけら。ゲルを固定し、エンハンス（ニューイング
ランドニュークレアーコーポレーション）で処理し、蛍
光写真を得た。蛍光写真を調べることによって、２つの
ポリペプチドが特異的に免疫沈殿されたことが示され
た。これらの分子量は23,000と25,400であり、ヘパトー
マ株細胞PLC/PRF/5からのHBsAg抗血清によって免疫沈殿
されるポリペプチドと共にポリアクリルアミドゲル上を
移動した。ワクチニアウイルス組換え体から排出された
HBaAgの性質をさらに調べた。30pfu/細胞のワクチニア
ウイルス組換え体vHBs4で感染されたCV−１細胞の組織
培養倍地を感染24時間後に回収し、2,000g,5分遠心する
ことによって透明化し、次いで75,000g,24時間４℃で遠
心した。ペレット4.5mlの10mM Tris−HCl（pH7.5）,150
mM NaCl,1mM EDTA中に再懸濁し、1.38gのCsClを終密度
が1.2g/cm3になるように加えた。試料を４℃で220,000g
で64時間遠心し、勾配画分を回収した。稀釈した試料を
放射免疫分析によってHBsAgについて試験した。HBsAgの
ピークは1.2g/cm3の密度の部分に検出され、これは、ヘ
パトーマ株細胞PLC/PRF/5からの倍地を平行して処理し
たときに得られたHBsAgのピークと一致していた。HBsAg
のピーク分画をリン酸塩バッファー（PBS）に対して透
析し、PBS中の５〜30％（w/w）ショ糖勾配中で、４℃で
150,000g,4.5時間遠心した。勾配分画を集め、試料を稀
釈し、放射免疫分析によってHBsAgを分析した。ヘパト
ーマ株細胞PLC/PRF/5からのHBsAgと同じ速度で沈殿する
HBsAgのピークが検出された。これらのピークからの試
料を電子顕微鏡によって分析すると、HBsAgの粒子が検
出された。
調べた全ての点（抗原性、ポリペプチド組成、浮遊密
度、沈降速度）において、ワクチニアウイルス組換え体
vHBs4によって感染された細胞か排出されたHBsAgは、ヘ
パトーマ株細胞PLC/PRF/5から放出されたHBsAg粒子と区
別することができなかった。
（ｄ）ワクチニアウイルス組換え体によるウサギのワク
チン接種 Ｂ型肝炎ウイルスを保持するヒトの血液からのHBsAg粒
子は、非常に免疫原性であり、Ｂ型肝炎ウイルスの感染
性を中和することができることが以前の研究で示されて
いる。従って、HBsAgを発現するワクチニアウイルス組
換え体で動物を感染することによって抗HBsAg抗体形成
が誘導されるかどうかを調べた。
予め血液を採取したウサギを、野生型ワクチニアウイル
ス又はワクチニアウイルス組換え体vHBs4で、それぞれ
のウサギの背中に４カ所ずつ、108pfuのウイルスを皮下
注射することによって感染させた。接種後毎日ウサギか
ら採血し、血清を取って−70℃で凍結した。５日目に、
接種した部位に傷害が発生したが、10日目までにこれら
の傷害は目に見えて治癒された。ウサギからの血清を、
放射免疫分析によってHBsAgとHBsAgに対する抗原を調
べ、プラーク分析によってワクチニアウイルスについて
調べた。血清中にはHBsAgもワクチニアウイルスも検出
されなかった。しかしながら、接種後５日目までに、HB
sAgに対する抗体が検出された（第２表）。
CV−１単層細胞を、精製した野生型（WT）若しくはワク
チニアウイルス組換え体（vHBs1−５）で、30プラーク
形成ユニット（pfu）で感染し、又は感染しなかった。
２時間後、ウイルス接種物を2.5％ウシ胎児血清を含む
イーグル倍地と取り換えた。細胞を24時間後に回収し、
2,000gで５分間遠心することによって倍地から分離し
た。細胞ペレットを2.5mlのリン酸塩バッファーに懸濁
し、凍結と解凍を３回繰り返し、超音波崩壊した。同じ
部分の細胞抽出物と培養物とを、放射免疫分析によって
HBsAgについて調べ、CV−１細胞中でのプラーク分析に
よってワクチニアウイルスについて調べた。細胞が容器
の底一面を覆うようになってから３日後のヘパトーマ株
細胞PLC/PRF/5から上述のようにしてつくった倍地と細
胞抽出物を、平行してHBsAgについて調べた。
示した日にウサギから得られた稀釈していない血清につ
いて、放射免疫操作（AUSAB、アボットラボラトリー
ズ）によってHBsAgに対する抗原を調べた。アボットラ
ボラトリーズから供給されたHBsAg陽性対照ヒト血漿は5
12RIAのタイターを有していた。
材料の寄託 pGS20で形質転換された大腸菌HB101株の試料を、1982年
11月30日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ATCC）、12301パークローンドライブ、ロックフ
ィル、メアリーランド20852に寄託し、ATCC No.39249の
寄託番号が与えられた。pHBs4又はvHBs4で形質転換され
た大腸菌HB101株の試料をそれぞれ寄託してATCC No.392
50、ATCC No.VR2055の寄託番号をそれぞれ与えられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マツケツト，ミカエル アメリカ合衆国 メリーランド州 20814. ベセスダ バツテリー・レーン 4930 ア パートメント・ナンバー １

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポックスウイルスを遺伝的に修飾する方法
    であって、 （ａ）ポックスウイルスDNAを含んだプラスミド、コス
    ミド又はファージからなり、前記DNAが、 （ｉ）少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位の
    隣にある少なくとも一つの転写調節配列と、 （ii）前記転写調節配列および前記制限エンドヌクレア
    ーゼ部位に隣接する、ポックスウイルスゲノムの非必須
    領域からのDNAと を具備するベクターを調製する工程と、 （ｂ）外来性遺伝子由来の少なくとも一つのタンパク質
    コード配列を、前記転写調節配列の隣の前記制限エンド
    ヌクレアーゼ部位に挿入する工程と、 （ｃ）ポックスウイルス属で感染された少なくとも一つ
    の細胞を提供する工程と、 （ｄ）前記細胞を前記ベクターでトランスフェクトする
    ことにより、前記ポックスウイルスのDNAと、前記ベク
    ターに含まれる前記ポックスウイルスDNAの少なくとも
    一部との間で相同組換えを起こさせる工程と、 （ｅ）前記細胞から、前記タンパク質コード配列を発現
    することができる組換えポックスウイルスを単離する工
    程とを具備した方法。
  2. 【請求項２】動物またはヒトにおいて免疫応答を誘起す
    るための生ワクチンの製造方法であって、 （ａ）少なくとも一つのポックスウイルス転写調節配列
    および少なくとも一つの外来遺伝子由来の蛋白質コード
    配列を有するキメラ遺伝子をその中に含む感染性ポック
    スウイルスであって、前記キメラ遺伝子が前記ポックス
    ウイルスゲノムの非必須領域からのDNAに隣接してお
    り、細胞に感染したときに前記タンパク質コード配列を
    発現することができる感染性ポックスウイルスを調製す
    ること工程と、 （ｂ）前記動物またはヒトに接種されたときに、免疫応
    答を誘起するために充分な濃度の前記感染性ポックスウ
    イルスを含んだ接種物を調製する工程とを具備したこと
    を特徴とする方法。
  3. 【請求項３】特許請求の範囲第２項に記載の製造方法で
    あって、前記免疫応答には、前記タンパク質コード配列
    によってコードされるタンパク質の少なくとも抗原性部
    分に対する抗体の産生が含まれる方法。
  4. 【請求項４】少なくとも一つのポックスウイルス転写調
    節配列および少なくとも一つの外来遺伝子由来の蛋白質
    コード配列を有するキメラ遺伝子をその中に含む感染性
    ポックスウイルスであって、 前記キメラ遺伝子が前記ポックスウイルスゲノムの非必
    須領域からのDNAに隣接しており、細胞に感染したとき
    に前記タンパク質コード配列を発現することができる感
    染性ポックスウイルス。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第４項に記載の感染生ポッ
    クスウイルスであって、前記キメラ遺伝子が更に、RNA
    合成が開始される部位およびその上流のポックスウイル
    スDNAを具備する感染生ポックスウイルス。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第５項に記載の感染生ポッ
    クスウイルスであって、前記ポックスウイルスDNAは、R
    NA合成が開始される前記部位の上流の、約275以下の塩
    基対を含んだDNA断片を具備する感染生ポックスウイル
    ス。
  7. 【請求項７】特許請求の範囲第５項に記載の感染生ポッ
    クスウイルスであって、前記タンパク質コード配列が免
    疫原性タンパク質をコードする感染生ポックスウイル
    ス。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第７項に記載の感染生ポッ
    クスウイルスであって、前記タンパク質コード配列が前
    記免疫原性タンパク質の少なくとも抗原性部分をコード
    する感染性ポックスウイルス。
  9. 【請求項９】特許請求の範囲第８項に記載の感染生ポッ
    クスウイルスであって、前記免疫原性タンパク質がＢ型
    肝炎ウイルスの表面抗原である感染性ポックスウイル
    ス。
  10. 【請求項１０】特許請求の範囲第８項に記載の感染生ポ
    ックスウイルスであって、vHBs2、vHBs4およびvHBs5か
    らなる群から選ばれる感染性ポックスウイルス。
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