JPH09504706A

JPH09504706A - 角膜表面移植片

Info

Publication number: JPH09504706A
Application number: JP7506621A
Authority: JP
Inventors: ジェラードスティール，ジョン; エーホールデン，ブライアン; スウィーニー，デビー; オレアリー，ダン; シントヘルム，クラウス; ヴァンナス，アーンティ; ジョンソン，グラハム
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 1997-05-13
Also published as: KR100355168B1; ZA949170B; EP0729323A1; HU222185B1; PL177096B1; IL111578A; IL111578A0; NO961980D0; FI962094A0; EP0729323B1; DE69412125D1; WO1995013764A1; TW257671B; NZ275119A; KR960705513A; HU9601345D0; NO306805B1; DK0729323T3; CZ286070B6; US5713957A

Abstract

(57)【要約】哺乳動物の角膜の内部又は上への外科的移植での用途のための角膜表面移植片が記載されている。本発明の角膜表面移植片は、それを通して視力を与える光学特性を持つ光軸領域を有し、生物非分解性で、非ヒドロゲルの、眼科的に生物適合性の材料よりなり、かつこの表面移植片は、移植した表面移植片の前部細胞とその背部細胞との間の組織液に流動を与えるために、表面移植片を通して１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する組織液成分の通過を可能にするに十分な多孔度を有することを特徴とする。光軸領域の多孔度は、目の組織の内部への成長を排除するが、組織液成分の流動を可能にするような多孔度である。この表面移植片は、上皮の再移植に適していることによってさらに特徴付けられる。上記のように、角膜表面移植片を角膜内部又は上に外科的に移植することよりなる、目の光学特性を矯正又は目の外観を変更する方法もまた記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】角膜表面移植片本発明は、眼科学の分野に関し、より詳しくは角膜移植体に関する。角膜は、上皮細胞の外層、この上皮層の背部にあるボーマン膜、このボーマン膜の背部にある支質、この支質の背部にあるデスメ膜及びデスメ膜の直ぐ背部にある内皮よりなる複雑な層構造体である。多くの外科手術の方法は、一つ以上のこれらの角膜成分の内部又は上にレンズ構造物を移植することである。眼科外科手術の一つの形態においては、上皮細胞層を切除し、細胞が切除された位置に、矯正レンズ構造物を配置して確保するものである。眼科外科手術の別の形態においては、上皮細胞層の一部を切除し、ボーマン膜及び下層の支質からくさび状の環状部分を切除する。次いで、環状帯内で外に向かって放射状に広がる生成した溝の背部末端から切開し、弁を画定する。次に、レンズ構造の翼を角膜弁の下に挿入し、適所で縫合することによって矯正レンズ構造物を付着させる。矯正レンズ構造物は、支質内に完全に配置することができる。この外科手術の方法は、角膜内を切開し支質への接近手段を得ることであり、また、支質内にレンズ構造物を配置することによって支質を破壊することでもある。上記の角膜矯正外科手術は、過度又は不十分な角膜曲率、角膜への外傷性損傷、コンタクトレンズに不耐性の患者などに関連した障害のような重篤な視覚障害の治療に用いられる。これらの方法は、一般に角膜移植術として知られている。移植される角膜人工器官は、角膜組織に効果的に固定され、気体、代謝物及び栄養素（特にグルコース）に対する透過性を具備しなければならないことが、従来から認識されている。移植片を適所に固定するために、縫合などによる外科的な方法及び機械的な固定法とは別に、移植片を覆う付着因子が提案され、使用されてきた（例えば、米国特許第４，７１５，８５８；５，１７１，３８１；及び５，１９２，３１６号各明細書参照）。透過性の問題に関して、従来の提案は、グルコースに対する透過性及び気体交換特性に基づいて、高含水量のポリマーを形成するヒドロゲルを使用するものであった。本発明者は、ヒドロゲルは、グルコース、栄養素及び代謝物には浸透性であるが、蛋白質に対しては浸透性でないことを見いだした。ヒドロゲル及び類似の「浸透性」ポリマーは、蛋白質及びその他の高分子量組織液成分の自由な移動を遮断し、その結果、角膜移植片の下の組織から移植片前部の組織を区分する。以下で説明するように、これは有意な有害結果をもたらす。ヒドロゲルは、また、目の移植片に必要な必須の機械的性質を欠いている。例えば、オーストラリア特許第６２３，１３７号明細書に記載されている目のヒドロゲル移植片は、生理食塩水中に放置すると約２２％収縮（初期体積からの収縮）する（オーストラリア特許第６２３，１３７号明細書１６頁、１９ないし２４行参照）。このような材料は、目への移植に明らかに適当でない。さらに、ヒドロゲルポリマーへの細胞の付着は非常に悪いので、ヒドロゲル移植片の上皮の移植が妨げられるに違いない。角膜の低位層から移植片を経由して、角膜の上位層に栄養素及び各種体液を輸送する細孔を有する角膜移植片を提供することは、従来から提案されてきている。これらの提案には、具備された細孔が蛋白質を通過させるには狭ますぎるか、又は、移植片を通過する光の直接的な歪み又は組織の内部への成長の何れかによって、視力が視覚を妨げるように影響されるような直径であるような不都合がある。本発明者は、驚くべきことであるが、角膜移植片を通して、すなわち、上皮細胞から支質細胞へ、さらに内皮層へ及びそれを越える、蛋白質及び糖蛋白質（例えば、成長因子、ペプチド及び蛋白ホルモン、及び必須金属の輸送に関連した蛋白質）などのような高分子量組織液成分の流れは、角膜移植片の前部及び背部の組織の長期の維持と生存能力に必須であることを見いだした。上皮細胞領域が切除され、移植片が、残りの上皮内又は基底膜上の何れかに挿入される、角膜上皮内の移植片に関連して、付着した上皮細胞と共に、移植片のすべての重要な適用範囲に必要な組織液成分の流動は重要である。これは、上皮細胞と共に前部表面の最初の適用範囲の処置の間、移植片の下部にある支質組織から前部表面上の組織（特に上皮組織）に向かう組織液の流れ、及びこれらの上皮細胞から支質組織とそれを越えた蛋白質成分の流れを含む。本発明者は、驚くべきことであるが、従来の技術の角膜移植片は、（１０，０００ダルトンまで又はそれ以上〜２００，０００ダルトンまで及びそれ以上の分子量を有する蛋白質及び糖蛋白質のような）高分子量の蛋白質及び糖蛋白質の通過を妨げ、角膜の上皮層内に挿入されたレンズ移植片の前部表面上の上皮層の形成に悪影響を及ぼすことを見いだした。さらにその上、角膜移植片の背部の組織は、高分子量蛋白成分が上皮組織から支質組織に移行することができないことから結果すると考えられている支質の変性から影響を受ける。本発明は、特に、角膜上皮組織の下部、内部若しくは角膜上皮組織を経由して、又は角膜支質若しくは角膜のその他の組織層内部に配置する移植片を指向している。便宜上、このような移植片の全てを、以下で角膜表面移植片(corneal onl ay)という。この発明の第一の特徴は、哺乳動物の角膜の内部又は上への外科的移植での用途のための角膜表面移植片を提供することであり、該表面移植片は、それによって視力を与える光学特性を持つ光軸領域を有し、該表面移植片は、生物非分解性で、非ヒドロゲルの、眼科的に生物適合性の材料よりなり、そして該表面移植片は、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する組織液成分を通過させるのに十分な多孔度を有し、それによって移植された表面移植片前部にある細胞と表面移植片背部にある細胞との間で組織液に流動を与えることを特徴とし、光軸領域の多孔度は、目の組織の内部への成長を排除するが、組織液成分の流動を可能にするものであり、該表面移植片は上皮の再移植に適している。この発明の別の特徴は、目の視覚特性を矯正又は目の外観を変化する方法を提供することであり、哺乳動物の角膜内部又は上への外科的な移植での用途のための角膜表面移植片の、角膜内部又は上への外科的移植を含み、該表面移植片は、それを通して視力を与える光学特性を有する光軸領域を有し、該表面移植片は、生物非分解性で、非ヒドロゲルの、眼科的に生物適合性の材料よりなり、そして該表面移植片は、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する組織液成分を通過させるのに十分な多孔度を有し、それによって移植された表面移植片の前部の細胞とその背部の細胞との間で組織液に流動を与えることを特徴とし、光軸領域の多孔度は、目の組織の内部への成長を排除しながら組織液成分の流動を可能にするものであり、該表面移植片は上皮の再移植に適している。角膜表面移植片は、その容積を横切って、通常のコンタクトレンズと同様な視力を有する。しかしながら、視力は、瞳孔を被覆する表面移植片の部分［以下、光軸領域(optical axis region)と呼ぶ］だけに要求されるので、それを通して１０，０００ダルトンまで又はそれより大きな分子量を有する組織液成分の通過を可能にするが、目の組織の内部への成長を排除するに十分な多孔度を有する光軸領域を持つ角膜表面移植片を提供することが好ましい。このような状況で、光軸領域を取り巻く表面移植片の周囲は、角膜への表面移植片の固定を容易にするために、目の組織の内部への成長を可能にするに十分な多孔度を有する外辺を画定するすることができる。目の光軸領域上の角膜表面移植片の多孔度は、この表面移植片を通して、高分子量蛋白質を含む組織液成分、並びにグルコースのような低分子量の栄養素、及び呼吸気体の流出又は流動を可能にする。表面移植片の多孔度は、数千ダルトン〜数十万ダルトン又はそれ以上の分子量を有する蛋白質種を、上記したように角膜層を通して自由に通過することを可能にする。これは、例えば成長因子、ホルモン、シグナル蛋白質、分子の伝達物質、及び輸送蛋白質、例えば必須の金属イオンを輸送するトランスフェリンのような高分子量の蛋白質成分の通過であり、これは、移植された角膜表面移植片の背部及び前部の組織の維持、完全性及び健全性を提供する。本発明者の実験は、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有する蛋白質及びその他の成分の通過は、組織の完全性及び維持に必須であることを示した。前記のごとく、１０，０００ダルトンより少ない分子量を有する蛋白及びその他の成分の通過も重要であることは明らかであり、したがって、本発明は、栄養素、代謝気体、並びに特に３００，０００ダルトンまで又はそれ以上、例えば５００，０００ダルトン又は１，０００，０００ダルトンまでの蛋白質、炭水化物及び脂質の角膜表面移植片通過を包含する。ここに記載する角膜表面移植片は、（目の視覚障害を矯正するような）角膜の光学特性の変化又は瞳孔着色のような目の外観を変化させるために、生きている角膜と外科的に結合及び好適には付着させることができる。角膜表面移植片の多孔度は、表面移植片が形成される材料により、すなわち材料の固有の多孔度によって提供される。又は、細孔は、移植片がＷＯ９０／０７５７５、ＷＯ９１／０７６８７、米国特許第５，２４４，７９９、５，２３８，６１３、４，７９９，９３１及び５，２１３，７２１号の各明細書に記載されているようなこの技術分野で公知の各種方法で形成される材料に、導入することができる。細孔は、表面移植片形状の（ポリマー注型によってのような）製造後、又は表面移植片形状形成に先立って、バルク材料中で形成される。このような方法としては：ｉ）表面移植片又は表面移植片材料を通して細孔を焼き抜くために火花又はレーザーの使用。細孔は、例えばＷＯ９１／０７６８７明細書に記載されているように、マイクロプロセッサー制御下のパルス型レーザーのようなエキシマーレーザーを用いて好都合に製造することができる； ii）米国特許第５，２１３，７２１号明細書に記載のようなポリマー性材料の反復絞り成形； iii）多相成形法、次いで米国特許第５，２３８，６１３号明細書に記載のような連鎖重合；が挙げられる。又は、多孔度は、不溶解性物質の存在下での重合によってのようにして製造された表面移植片材料全体にわたって、細孔の相互貫通網状組織によって供給することができる。その後の不溶解性物質の除去が、形成されたポリマー材料全体にわたって隙間を与える。本発明の表面移植片に欠くことのできない多孔度の形成法とは無関係に、表面移植片は、角膜表面移植片の光軸領域に、１０，０００〜１，０００，０００ダルトンのような１０，０００ダルトンまで及びそれより大きな分子量を有する蛋白質を通過させるに十分であるが、細胞、及びしたがって、組織の侵入を許すには十分でない多孔度を有していなければならない。表面移植片の多孔度が細孔によって与えられる場合、光軸領域は多数の細孔を含み、細孔の数は、この発明で決して限定するものではないが、移植された表面移植片の前部から背部領域に組織成分の流動を与えるのに十分なものである。実施例としてに過ぎないが、表面移植片に与えられる細孔の数は、１平方ミリメートル当り２００細孔〜１平方ミリメートル当り３００，０００細孔又はそれ以上の範囲である。好適には、光軸領域内に形成される細孔は、直径が５ナノメートル〜１５×１０³ナノメートルの範囲である。光軸領域内でのこの大きさの細孔は、視覚矯正に関して何らかの問題を起こす程度までの可視光線の屈折を起こさない。より好適には、光軸領域における細孔は、１５〜３００ナノメートルの直径を有し、そしてさらにより好適には、直径が２０〜１５０ナノメートルである。細孔という用語は、細孔の性質に何らかの幾何学的な限定を行なうものではなく、規則的又は不規則な形態であり得るものと理解されるべきものである。この文脈で、用語「平均幅」は、用語「直径」よりも好ましい。上記の好適な直径の範囲で、全ての細孔は同じ直径である必要はなく、上記の範囲内で異なり得ることが認められるべきである。光軸領域の外側で、表面移植片は光軸領域と同じ多孔度を有する、すなわち、表面移植片を経由して低分子量の栄養素、呼吸気体、及び１０，０００ダルトンまで及びそれより大きな分子量（例えば、１，０００，０００ダルトンまで又はそれ以上）を有する組織液の蛋白及びその他の成分を通過させるが、特異的に組織の内部への成長を排除する多孔度を有する。又は、光軸領域の周辺を取り巻く表面移植片のこの領域（外辺と呼ぶことができる）は、角膜細胞の内部への成長を可能にし、それによって目への表面移植片の固定を助ける。この実施態様において、この外辺は、２０ミクロン又はそれ以上、好適には５０〜１，０００ミクロン、より好適には５０〜５００ミクロン、そしてさらにより好適には５０〜３００ミクロンの直径の多数の細孔を含んでいる。表面移植片の光軸領域における細孔の製造について上に記載したのと同一の方法で、細孔を外辺に形成させることができる。外辺における多孔度は、外辺が形成される材料の固有の特徴である。この点で、外辺が光軸領域と同一の材料から形成され、それと一体であることが理解される。この状況で、直径が異なる細孔は光軸領域及び外辺に形成される。又は、光軸領域と同一の材料から形成されるが、外辺は遥かに大きな多孔度を有し、それによって組織の内部への成長が可能なように、光軸領域の方法とは異なる別の方法で、外辺を形成することができる（例えば、重合したマトリックスから溶解し、高度に多孔度の相互に貫通した網状構造を与えるグルコースのような不溶性試剤の存在下の重合により）。又は、外辺は光軸領域とは異なる材料から形成されてもよく、その材料は組織の内部への成長が可能であるように光軸領域よりも高度に多孔度である。外辺は、ポリオレフィン材料から作られた繊維のような、細孔が相互に貫通した網状構造を有する溶融引抜き繊維の凝集性原料を製造するような、光軸領域にも適用される、高度に多孔度を生じる方法で加工することができる。外辺は、光軸領域に対して例えば溶媒接着、熱溶融又は接着剤の使用によってのような、溶融されている高度に多孔度のセラミック材料から形成することができる。組織の内部への成長を容易にする高度に多孔度のセラミックは公知である（例えば、J．Biomed．Mater．Res．Symp，No 4，pp 1-23，1973参照）。角膜表面移植片は、アクリル類、ポリオレフィン類、フルオロポリマー類、シリコーン類、スチレン類、ビニル類、ポリエステル類、ポリウレタン類、ポリカーボネート類、セルロース類又はコラーゲンを基剤とする材料のような蛋白質として一般に知られているクラスのポリマー及びコポリマーのような必須の機械的性質を備えた公知の天然又は合成ポリマー材料の何れかから製造することができる。ヒドロゲルポリマー組成物は、収縮する性質、高分子量種に対する多孔度の欠如、及び乏しい細胞付着性の理由から明確に排除される。重合性材料の混合物が角膜表面移植片の製造に使用される場合、これらの材料は、この技術分野で公知の方法によって共重合され、ポリマー性の網状構造を与えることができる。前記のように、外辺は、組織の内部への成長を可能ならしめるような光軸領域とは異なったポリマー又はその他の材料から形成することができ、これがより大きな多孔度の機能を果たしている。外辺領域は、組織の内部への成長を可能にするような約２０ミクロンよりも大きな直径の細孔を有し、上記のポリマー、セラミックス又はその他の生物適合性で生物非分解性の材料の一つ以上から生成することができる。本発明の角膜表面移植片は、この技術分野で公知の角膜表面移植片の製造のための標準的方法によって製造することができる。明らかに、ポリマー、コポリマー、これらの混合物の重合、セラミックスの製造、及び必要に応じて光軸領域を外辺に結合するために用いられるその方法は、使用する材料の性質によって異なり、常法による適当な方法がそれぞれの材料に対して採用される。角膜表面移植片は、角膜人工器具の製造分野で公知の標準的なフライス削り、ポリシング、及び／又は成形法によって、製造工程の途中又は終わりに形成することができる。例として、重合によって製造される角膜表面移植片は、重合の間の成形又は予め形成されたボタンの木ずりの何れかにより成形して生成される。又は、光軸領域は、例えば予め形成されたボタンの成形又は木ずりの何れかにより成形して製造し、その後に、外辺は、その近くで重合によって光軸領域の周辺に付着される。又は、光軸領域は、例えば外辺をアセトン中に浸し、両者を一緒に圧縮して多孔性の外側の外辺に付着することができる。又は、光学的に許容しうる接着剤が、パルスレーザーによって発生されるような熱の適用によって一緒に溶融された材料について用いることができる。環状の開口部を有する外辺が最初に形成され、開口部に中で、重合又は予め形成されたボタンの固定の何れかによって光軸を形成することができる。表面移植片又はその一部は、この技術分野で公知の一つ以上の色素又は染料で着色することができる。着色された表面移植片、特に瞳孔域の周辺の着色は、移植に際して目の色を変化させることになる。本発明の角膜表面移植片は、上皮の再移植に適している。これは、表面移植片を形成するポリマー基材が細胞付着又は運動性を阻害しないことを意味している。その上、表面移植片の個々の表面は、以下で説明するように細胞付着を容易にするために改質することができる。角膜表面移植片の外部の背表面及び前表面は、反応性官能基に変換し、その後に表面移植片表面に共有結合的にカップリングし得るペンダント基を有するポリマーを適用することによって改質することができる。例えば、表面を改質する成分は、例えばペンダント基の約１０モルパーセントがナイトレン官能基に変換され得るポリリシンのようなポリアミノ酸を含むことができる。改質された表面は、それ自体が、上皮細胞のような移植された表面移植片に隣接する細胞又は支質細胞の付着を刺激する。又は、改質された表面は、移植された表面移植片に隣接する組織の成長を促進する一つ以上の成分で被覆されていてもよい。このような材料としては、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロイタン硫酸塩、コラーゲン、細胞付着蛋白、抗ゼラチン因子、低温−不溶解グロブリン、コンドロネクチン、表皮成長因子、むらさきいがい（mussel）付着蛋白、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、及び各種のプロテオグリカン類、並びに／又は上記の誘導体及びこれらの混合物が挙げられる。フィブロネクチン、フィブロネクチン誘導体、表皮成長因子、表皮成長因子誘導体及びそれらの混合物は、特に有用である。又は、表面を改質していない角膜表面移植片それ自体は、移植された表面移植片の隣接した組織の成長及び／又は表面移植片への細胞付着を促進する一つ以上の成分で直接に被覆されてもよい。これらの成分は、細胞付着を与える及び／又は成長因子並びに付着因子のような細胞成長を促進するいかなる成分又は成分類であってもよい。好ましい材料は、表面が改質された角膜表面移植片への適用と関連して説明した材料である。好適には、移植された表面移植片に隣接する組織の成長を促進する成分の被覆は、その光学的性質に影響を及ぼすことなく、表面移植片と共有結合的に結合される。表面改質の結果として、又は表面移植片の固有の性質によって、本発明の表面移植片は上皮の再移植に採用される。ここに記載した本発明の角膜表面移植片は、移植片の下部組織から前部表面への高分子量の組織液成分の効果的な流動を与え、移植片は、隣接する組織及び層状構造からの移動の過程を通して、角膜上皮細胞と共に移植片の前部表面の適用範囲を支え、かつ刺激し、そして移植片を被覆する上皮組織の維持、又は実際に、移植片を被覆する何れかの他の組織を支える点で、独自なものであり、従来の技術の提案よりも優れている。角膜を通してのシグナル伝達は、例えば移植後の初期期間の間、例えば上皮での移植片の被覆の間に与えられ、さらに移植片の前表面に施される治療化合物に対する移植片の多孔度を与える。本発明の角膜移植片は、この技術分野で公知の確立した角膜切除術によって目に挿入される。この発明は、以下の図及び実施例を参照して説明されるが、限定するものではない。図：第１図：膜の特定の細孔径に対して角膜潰瘍を有する動物の割合（％）を示すヒストグラムである。カラムＡは、膜材料がクプロファン／ガンブラン（Cupropha n/Gambrane）である。第２図：膜の特定の細孔径に対して上皮及び前部の支質を減少した動物の割合（％）を示すヒストグラムである。カラムＡは、膜材料がクプロファン／ガンブランである。第３図：２４時間後に分画した血清中の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）へのウシ角膜上皮細胞付着を示すヒストグラムである。Ｘ−軸は培地である。Ｙ−軸は対照の百分率細胞数で、６日目における対照＝ＤＤ／Ｆｎを１００％とする。ＤＤは血清を含まない培地プラス２０％（v/v）フィブネクチン−及びビトロネクチン−除去血清；「１００ｋ」は、血清を含まない培地で、画分１の２０％(v /v)を添加し、寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子を有する；「３０ｋ」は、血清を含まない培地で、寸法が１，０００〜３０，０００ダルトンの血清因子２０％(v/v)を添加した；「１０ｋ」は、血清を含まない培地で、寸法が１，０００〜１０，０００ダルトンの血清因子２０％(v/v)を添加した；「１００＋３０＋１０ｋ」は、血清を含まない培地で、寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子２０％(v/v)を添加した；「ＤＤ」は、血清を含まない培地プラス２０％(v/v)フィブネクチン−及びビトロネクチン−除去血清（寸法に関しては分画していない）；ＳＦＭは、血清を含まない培地；そしてＦｎは、組織培養ポリスチレン表面がフィブロネクチンで予め被覆されていることを表す。第４図：６日間培養後の分画した血清中の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上の角膜上皮細胞外部成長を示すヒストグラムである。Ｘ−軸は培地である。Ｙ− 軸は百分率細胞数２４時間／５（６日目の対照）；細胞外部成長６日／２４時間（図中、カラムの平行線部分は外部成長を示し、黒の四角は細胞数を示す）である。「ＤＤ」は、血清を含まない培地プラス２０％(v/v)フィブロネクチン−とビトロネクチン−除去血清（寸法に関しては分画していない）；「１００ｋ」は、血清を含まない培地で、画分１の２０％(v/v)を添加し、寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子を有する；「３０ｋ」は、血清を含まない培地で、寸法が１，０００〜３０，０００ダルトンの血清因子２０％(v/v)を添加した；「１０ｋ」は、血清を含まない培地で、寸法が１，０００〜１０，０００ダルトンの血清因子２０％(v/v)を添加した；「１００＋３０＋１０ｋ」は、血清を含まない培地で、寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子２０％(v/v)を添加した；ＳＦＭは、血清を含まない培地；そしてＦｎは、組織培養ポリスチレン表面がフィブロネクチンで予め被覆されていることを表す。実施例１：角膜を経由する高分子の通過は、正常な角膜構造の維持／完全性に必須である異なる細孔径を有する膜をネコの目に移植し、角膜移植片の背部及び内部の両方で、角膜を経由する高分子量の組織液成分の流動を促進する効果又は遮断する効果を測定した。最初の実験において、細孔径が１．４ナノメートルの透析膜をネコの角膜に移植した。この膜は、グルコース、アミノ酸、水そして呼吸気体の通過が可能であるが、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する成分の通過を遮断した。試験動物の角膜上皮及び支質の両者共、４週間の試験期間で完全性を喪失した。この実験は、１０，０００より大きな分子量を有する組織成分、すなわち蛋白質及び糖蛋白質は、角膜の完全性のために必須であることを示している。次いで、より詳細な試験に成熟ネコ４頭を使用した。Ａ．ベースライン測定細隙灯評価により、角膜の完全性についてベースラインを測定した。角膜透明度、血管充血及び焦点深度、表面特性、混濁度などの詳細を評価した。Ｂ．実験計画二種類の型の膜、ヌクレポアフィルター（Nuclepore Filter）（ポリカーボネート）及び透析膜（ポリカーボネート／ＰＥＧ）を、この試験に使用した（表１）。移植に先立ち、直径１２mmの冠状に膜を成形した。ネコ２に用いた膜は、膜の周辺にレーザーを用いて形成した２０〜３０マイクロメートルの細孔を有していた。ヌクレポアフィルターは、ミラフロー（Miraflow）コンタクトレンズクリーナーで摩擦して磨き、次いで滅菌した等張生理食塩水中で濯ぎ加圧滅菌した。透析膜は、レーザーで穿孔した後、滅菌した等張生理食塩水中で濯ぎ加圧滅菌した。Ｃ．手術の方法１．ネコを、ステージ３−水準２の深さまで麻酔した。２．上部角膜縁の直ぐ内側に６mmの切開の調製のためにダイアモンドナイフを用いた。３．直径１４〜１５mmの薄層のくぼみを付けるために鋭利な刃の角膜解剖器具を用いた。４．このくぼみに、先端がプラスチック製の鉗子を用い、直径１２mmの膜を挿入した。５．ネコ１及びネコ２は、９〜０のモノナイロン糸で切開を閉じ、ネコ３及びネコ４は、８〜０の絹糸で切開を閉じた。Ｄ．追跡評価臨床徴候が終末を保障するまで、目を毎日評価した（表２）。ペントバルビトンナトリウムの過剰量（１４０mg／体重kg）を静脈注射してネコを安楽死させた。Ｅ．組織学安楽死後、動物の目を直ちに切除した。摘出の間、前面の角膜表面が湿潤状態を保持するのに十分な速度で、両眼に固定液を滴下した（０．１Mカコジル酸ナトリウム三水加物溶液中の２．５％グルタルアルデヒド、２mM塩化カルシウム、１M ＨＣｌでｐＨを７．２に調整、２５℃）。死亡直後に、各々の目の前室に固定液０．３mlを注射し、背部の角膜表面の固定を助けた。角膜を残りの目から分離し、４℃で６０時間、固定液中に浸した。各々の角膜から１mm幅の二片；すなわち、上下の軸に沿って、周辺から中心に向かって一片；鼻から側頭への軸に沿って、周辺から中心に向かって一片を切開した。結果：表３と４は、試験計画及び所見の要約である。Ｉ．臨床観察・膜の臨床状態、すなわち、膜の位置及び大きさは、観察期間中変化がなかった。・沈着、浮腫及び血管新生は、膜を移植していない「擬似」対照眼に比較して、移植試験した目においてより激烈であった。これらの反応は、膜／くぼみの前面に位置しているように思われた。・移植した目において、この「沈着」は、手術の２〜３日後、膜の前面、特にくぼみの内部領域で観察された。・「擬似」眼に関して、「沈着」は、主としてくぼみの中心領域に位置しており、移植した目に見られるものよりも厚くなかった。この「沈着」は移植した目のそれと同様に現われたが、同程度には進行しなかった。・全てのネコにおいて、角膜の血管新生は切開部位で始まり、膜の上部にある支質に浸透し続けた。しかしながら、試験期間中、一つの目（ネコ４）では角膜の血管新生は退行した。観察された血管新生は、栄養素の欠如による血管成長よりはむしろ手術方法による併発症であった。・上部支質の「沈着」及び浮腫は、観察期間を通じて、ネコ１、ネコ３及びネコ４で観察された。・上部の支質の沈着、浮腫及び血管新生は、ポリカーボネート／ＰＥＧ膜の非穿孔領域の上にある移植部位で見られた。しかしながら、浮腫及び血管新生は、穿孔領域の上にある部位には見られなかった。・膜背部の支質又は内皮に臨床的に検出される変化は、移植された目の何れにも見られなかった。 II．組織学的観察・移植した膜の上皮は、対照の角膜（手術していないもの及び手術したもの）に見られるそれと比較して、ネコ１及びネコ３のそれぞれには細胞層の厚さと数の両者を減少させた。・移植した目の全ての上皮細胞は、細胞外染色量の増加、多い顆粒核及びより少ない明瞭な細胞質によって立証されるように、ある程度、形態的に変化した。・ネコ２及びネコ３における膜前部及び背部の角膜に炎症反応が明らかであった。これは、膨張した角膜細胞、円形で黒ずんだ染色細胞、恐らく好中球、及び背部支質の血管新生として現われた。・ネコ２において、細胞変化と移植した膜との間には密接な関連があり、これは、以下の点から明らかである： −角膜細胞の密度は、膜に接近するにつれて劇的に増加した； −膜の上部にある上皮内部並びに膜の前部及び背部の支質において、小型の円形で、黒ずんで染色される細胞（恐らく好中球）の数が増加した； −膜の非穿孔領域上の部位において、ボーマン層は破壊したと思われた； −顆粒物質が支質／膜の界面に隣接して観察され；前部の支質／膜の界面の顆粒物質の層は、ネコ２において背部に見られるそれよりも厚く集積した； −上皮の細胞成分における形態学的変化は、膜の非穿孔領域上の部位において、穿孔領域よりも明らかであった。・全ての移植した目において、上皮は完全であり、連続しているように思われた。・ネコ３における移植した目において、多量の角膜細胞に似た細胞は、デスメ膜と内皮細胞との間を貫入した。幾つかの赤血球も、また、内皮の背面に付着しているのが見られた。これらの特徴は、「擬似」眼には見られなかった。上記のように、高分子量の蛋白質組織成分の流動を阻害する移植は、支質の変性及びボーマン層の破損、並びに角膜上皮の完全性の喪失を起こす。実施例２：上皮及び支質の健全性を維持するのに要する表面移植片の多孔度この実施例において、成熟ネコの目（ｎ＝５０）に外科的に各種の多孔度の表面移植片を挿入した。全てのネコには視覚又は全身性の疾患はなかった。この試験に使用した膜の詳細と特性を表５に示す。移植に先立ち、１２mm、１０mm又は８mmの直径に穿孔した。外科手術の方法及び追跡評価は、実施例１と同様に行なった。特定の膜を移植した動物数を、表６に示す。集めた大量の臨床観察及び組織学的データのうちで、表面移植片膜挿入による上皮と支質の健全性を評価するための最も適切なデータは、角膜潰瘍形成、並びに上皮及び前部支質の薄層化である。図１は、各移植群における角膜潰瘍を有する動物の百分率を示すヒストグラムである。２５nmの細孔膜を移植した動物の４３％は、角膜潰瘍化を示した。１５ nmの細孔径を有する膜を移植した動物の８０％は、角膜潰瘍化を示した。約１．５nm未満の細孔径を有するクプロファン及びガンブラン膜についても、実際上、同一の結果が見られた。５０nm及び１００nmの細孔径を有する膜を移植した動物には潰瘍化は見られなかった。図２は、各種の細孔径の膜を目に移植することによる上皮及び前部支質の薄層化を起こした動物の百分率を示すヒストグラムである。図２は、明らかに、移植した膜の細孔径が減少するにつれて、上皮及び前部支質が薄層化した動物数は増加している。１５nm未満の細孔径を有する膜を移植した動物の全ては、上皮及び前部支質の薄層化を示した。２５nmの細孔径を有する膜は、動物の７５％に上皮及び前部支質に薄層化をもたらした。５０nm及び１００nmの細孔径を有する膜に関しては、それぞれ３１％と２７％に低下することを図示している。図１と図２は、明らかに、動物の目に挿入する角膜表面移植片の細孔径は、大体１５nmより大きくあるべきことを示している。実施例３：角膜上皮組織は、細胞付着、移動及び上皮の外部成長のためには分子量が１０，０００ダルトンより大きな栄養因子を必要とする血清によって例示するように、この実験において、角膜上皮細胞の最適の増殖及び移動応答を可能にする組織液因子への接近手段の必要条件を決定した。グルコース、栄養素、代謝物及び生理的低分子に対する細胞の要求を満たす培地（血清無添加）で、角膜上皮細胞を維持した。この実験の目的は、角膜上皮を含む角膜移植組織の定着を可能にする確実な細胞機能を認め、その上皮組織を維持するために、組織の栄養因子に対するこれらの細胞の必要条件を決定することであった。このような組織液の例として、これは、角膜上皮細胞の移動及び外部成長に及ぼす血清培地への添加の影響を検討することによって示された。実験の目的は、栄養効果の諸因子に対する角膜上皮細胞の必要条件を決定することであったので、血清因子の刺激効果が、血清因子をポリマー表面に吸着させることによる細胞付着の直接刺激によってのみ起こる可能性を排除する方法で、この実験を計画した。二種類の組織及び血清因子、フィブロネクチン又はビトロネクチンは、可溶な形で分離され、表面に吸着され、そしてこの不溶な形で、細胞付着を促進するのに利用することができる。栄養素又は栄養支援物質を血清因子と区別するため、血清フィブロネクチン及び／又はビトロネクチンの培地表面への吸着の結果としての培地表面への細胞付着の刺激とは異なるように、これらの実験で使用した血清は、細胞検定で使用するのに先立って、付着している蛋白質、フィブロネクチン及びビトロネクチンを徹底的に除去した。組織の栄養因子の効果を決定するために使用した細胞培養検定系は、この従来の技術の角膜表面移植片材料であるものが選ばれ、初期の細胞付着過程での支援材料であった。角膜上皮細胞は、組織培養ポリスチレンと呼ばれ、細胞付着の支援体として最適化された酸化ポリスチレン表面である合成ポリマー表面で培養された。角膜上皮細胞の付着を支える表面化学の観点から、このポリマー表面は、細胞付着に関する限り、従来の技術に記載されている角膜表面移植片の例のそれに似ている。フィブロネクチン、ラミニン又はコラーゲンのような細胞外マトリックス成分が、角膜上皮細胞の細胞性付着活性を刺激できることは、以前から提唱されてきている。予備実験において、角膜上皮細胞の移動活性を刺激するための最適表面を決定するために、諸因子が培養表面に吸着された場合の角膜上皮細胞の初期付着及び外部成長を支える能力について、各種の細胞外マトリックス成分を比較した。これらの予備実験において、培地の血清成分から吸着されたビトロネクチン又はフィブロネクチンからのいかなる寄与も受けることなく、各種の細胞外マトリックス成分の効果を決定するために、使用した培地は、フィブロネクチン及びビトロネクチンの両者を除去した２０％(v/v)子ウシ血清を含む血清無添加培地であった。各種細胞外マトリックス成分に対するウシ角膜上皮細胞の移動応答を調べるために、細胞群から細胞の外部成長速度を決定することは適切であった。これは、直径が既知の培養表面（組織培養ポリスチレン）の特定の中心領域に、培養期間の開始時に上皮細胞の融合性単層を形成するのに十分な予め決定した細胞濃度で、細胞を接種することによって達成された。この制限領域は、基部にｖ字型シリコーン製Ｏ−リングを有し、細胞が載せられる密閉領域を効果的に備えたステンレススチール（ｓ／ｓ）リングを用いて設置された。細胞が付着するのに十分な時間の間、接種し培養した後（４時間培養）に、リングを取り除き、新鮮な培地を供給した。次いで、上皮細胞群における細胞は、ポリマー表面に予め吸着されていた細胞外マトリックス成分によって部分的に決定される速度で、表面上で自由に成長させた。この検定において、二つの異なる構成が可能であった。細胞は、細胞の円形細胞群が効果的に作り出されるような中心部領域内、又はこの領域の外側の何れかに接種され、後者の場合には、表面の中心領域には細胞がないままになっている。これらの検定の構成を用いて、上皮細胞の外部成長に及ぼす影響について、細胞外マトリックス成分を比較した。実験細胞外マトリックス成分を有する表面の調製以下に記載する蛋白質を組織培養ポリスチレンに予め吸着させ、次いで残りの蛋白質結合部位を、ウシ血清アルブミンの１％(w/v)溶液で遮断することにより、角膜上皮細胞の付着を支える能力について、５種類の特性の異なるマトリックスを試験した：１．ウシ血清ビトロネクチン５μg/ml（上記と同様にして単離）；２．ウシ血清フィブロネクチン１０μg/ml（Sigmaの製品）；３．マウスラミニン５０μg/ml（ＥＨＳ肉腫から精製、Collaborative Biomedic alの製品）；４．マウスコラーゲンIV型４０μg/ml（ＥＨＳ肉腫から精製、Collaborative Bi omedicalの製品）；５．ウシコラーゲンＩ型１．５mg/ml（子ウシ皮膚から精製、ＩＣＮから「Cella gen」として市販）。これらの予め被覆した濃度を、細胞付着の最高の刺激を提供するレベルとして選んだ。予め設定した濃度でマトリックス溶液８０μｌを、組織培養ポリスチレン培養器（９６細孔培養トレイ）に加え、３７℃で１時間培養した。次いで、マトリックス溶液を除き、表面は、ウシ血清アルブミン１％(w/v)の血清を含まない培地溶液で「遮断し」、３７℃で１時間培養した。この「遮断する」工程は、細胞結合部位が供給されたあらゆる非マトリックスが、接種に先立って効果的に中和されていることを確実にした。遮断された組織培養ポリスチレン表面は、また、各検定に含められ、アルブミンでの処理の結果として、有効な負の対照として役立った。細胞付着検定：１％(w/v)ウシ血清アルブミンを含み血清無添加培地中の、培養細胞０．７− １．０×１０⁵細胞/ml又は一次細胞３．０−５．０×１０⁵細胞/mlの１００μｌのアリコートを各穴に添加し、３７℃で９０分間培養した。細胞付着を、メチレンブルー染色で測定し、プレートリーダー上で６５０ nmでの吸光度を読み取った。各細胞の原形型の対照基質としてコラーゲンＩ型を用い、細胞付着を１００％とし、したがって報告のためには、同じ実験においてはその他の全てのマトリックスへの細胞付着を、コラーゲンＩ型へのそれの百分率として表した。細胞の外部成長検定：周縁起源の培養したウシ角膜上皮細胞（通し番号５〜７）のアリコート１００ μｌを、ステンレススチール可動フェンスの中心に５×１０⁵細胞/mlの割合で、又は細胞懸濁液のアリコート０．４５mlを、フェンスの外側の周囲に接種した。これらの濃度は、培養４時間後、付着細胞の均一な単層を生じるのに十分であった。フェンスを取り除く前に３７℃で１時間培養した。使用した培地は、Dulbec co最少必須培地４０％(v/v)、Ham's F12 培地４０％(v/v)中、フィブロネクチン及びビトロネクチンを除去した子ウシ血清２０％(v/v)であった。各々の処理は、以下の表面被覆を用いて３回行なった：ａ）フィブロネクチン−フィブロネクチン、１０μg/mlで予め被覆；ｂ）Ｌｎ−ラミニン、２５μg/mlで予め被覆；ｃ）ＣＩ−コラーゲンＩ型、１８７．５μg/mlで予め被覆。予め被覆した細胞を、使用に先立って３７℃で１時間培養した。培養期間中、３日毎に培地を交換した。外部成長指数は、次式を用いて算出した：結果：１．培養細胞の反応−初期細胞付着短期間培養した細胞について（通し番号２−３）、細胞外マトリックス分子フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンIV、及びラミニンのそれぞれは、初期細胞付着を刺激した。組織、一次細胞懸濁液、から新たに調製した細胞での結果は類似していたが、ビトロネクチンに対するこれら細胞の応答性は比較的乏しかった。３回の実験で、精製した細胞外マトリックス成分を、培養の初期９０分間、角膜から摘出直後に用いたウシの角膜上皮細胞の付着について比較した。コラーゲンＩ、ラミニン及びコラーゲンIVの各々は、角膜上皮細胞の付着を刺激した。一連の８回の実験を通じて、フィブロネクチンも、また、各領域からの細胞の付着を刺激したが、しかしながら、各々の細胞起源により、フィブロネクチンに対する一次の分離細胞群の応答は、実験毎に異なっていた（２．３〜２．８倍の範囲で異なる平均の応答）。ビトロネクチンは、刺激性を有するけれども、これら摘出一次細胞の各々の細胞付着促進において、ラミニン、コラーゲン類又はフィブロネクチンよりも、一様に効果が非常に劣っていた。ビトロネクチンに関する限り、これは驚くべき知見であった。２．培養角膜細胞の移動に及ぼす細胞外マトリックス成分の影響ｉ）中心に接種された領域からの細胞の外部成長表７は、５〜７日の培養期間を通じての、上皮細胞群からの細胞の外部成長に対する各種の細胞外マトリックス処理の比較を示す。ビトロネクチンに対する角膜上皮の一次細胞の付着刺激に関して、ビトロネクチンの能力は乏しかったので、この因子を比較に含めなかった。異なる細胞外マトリックス処理の間に、興味深い相違があることは明らかである。フィブロネクチン及びビトロネクチンの両者を除去した血清の存在下に、細胞で被覆された領域に関して、フィブロネクチン又はコラーゲンＩ型の何れかで被覆された表面は中心の細胞群から移動を十分に起こした。しかしながら、ラミニン被覆表面は、その他の表面と比較して移動は乏しかった。 ii）周辺に接種したリングからの細胞の内部への成長何らかの処理の１回の実験が、細孔の中心部位を完全に被覆してしまうまで、フェンスの外側の周囲に接種した角膜上皮細胞を監視した。処理毎の効果を算出し、実験期間の終末に被覆された中心領域の百分率として表した。表８は、７日の培養期間を通じて上皮細胞群からの細胞の外部成長に対しての各種の細胞外マトリックス処理の比較を示す。この全体としての構成は、中心接種法で得られたものと同様な結果をもたらした。ラミニンは、移動活性の促進に効果の乏しい表面であったが、フィブロネクチン及びコラーゲンＩは、細胞移動を刺激するのに有効であった。これらの予備実験は、フィブロネクチン及びコラーゲンＩの両者は、ポリマー表面への角膜上皮の初期細胞付着並びに細胞群からの細胞の外部成長及び移動の両者の刺激となることを示した。血清の栄養因子の効果を決定する実験では、フィブロネクチン−被覆ポリマー表面は、生物学的付着因子を含む表面の代表的なものであった。角膜上皮細胞の移動及び外部成長を支える血清栄養因子の分子量測定実験血清の分画本発明者が以前に記述した方法により、子ウシ血清から細胞−付着分子のビトロネクチン(Vitronectin)及びフィブロネクチン(Fibronectin)を除去した。特定範囲の分子量を有する成分を含む画分に血清成分を分離するために、一連の限外濾過膜に、このフィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去血清を通過させた。３種類の異なる非イオン性アミコン（Amicon）限外濾過膜を使用した：１．アミコンＰＭ１０膜、１０，０００ダルトンの分子量で分離。２．アミコンＰＭ３０膜、３０，０００ダルトンの分子量で分離。３．アミコンＸＭ１００膜、１００，０００ダルトンの分子量で分離。製造業者の勧告通りに、使用前に膜を洗浄した。次の濾過工程で、膜表面への蛋白質の非特異的結合と二次的な血清成分の損失を減らすために、それぞれの膜を、１％(v/v)子ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液で前処理し、次いで滅菌ＰＢＳで洗浄した。各種の膜を限外濾過装置（Amicon）に保持し、フィブロネクチン −及びビトロネクチン−除去血清又はその画分を磁気撹拌器を用いて撹拌し、４００kPaの空気圧で濾過した。血清の分画は、以下の方法で行なった：フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去血清を、滅菌したリン酸−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の２倍容量で希釈し、一連の継続濾過を行なった。フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去し、かつ希釈した血清の全部を、最初に、直径４３mmのＸＭ１００膜を通過させ、濾液を集めた。この膜からの保留物は廃棄した。ＸＭ１００膜からの濾液の二つのアリコートを採取し、ＰＭ１０又はＰＭ３０の何れかの２５mm直径の膜を通過させた。これら二つの膜からの濾液を、別々に集め、これらの膜の保留物は廃棄した。濾液画分から低分子量成分を除き、１，０００ダルトンで分離排除する４３mm直径のアミコンＵＭ２膜で処理することにより、画分中の残りの成分を濃縮して、希釈されなかった場合の容量に等しいと計算される容量に戻した。かくして、スキーム１に示したように、以下の画分を得た：画分１：ＸＭ１００膜の濾液で、次にＵＭ２膜で保留された−この調製物は１，０００〜１００，０００ダルトン範囲の成分を含む。画分２：ＸＭ１００膜からの濾液で、ＰＭ３０膜の濾液でもあるが、次にＵＭ２膜で保留された−この調製物は１，０００〜３０，０００ダルトン範囲の成分を含む。画分３：ＸＭ１００膜からの濾液で、ＰＭ１０膜の濾液でもあるが、次にＵＭ２膜で保留された−この調製物は１，０００〜１０，０００ダルトン範囲の成分を含む。これらの各画分は、Gelman「Acrodisc」（商標）０．２２μmフィルターを通して調製後に滅菌した。血清画分は、濾過法の効果を確実にするため、非還元性条件下に、１２．５％ポリアクリルアミドミニゲル(BioRad Protean II)を通し、常法により、各画分の蛋白質濃度を測定した。角膜上皮細胞の成長及び移動に及ぼす、血清及び血清画分の効果の検定ウシの角膜上皮細胞の付着及び成長に及ぼす、各種画分の効果を試験するために、上記のように製した、フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去血清及び除去血清画分を、２０％(v/v)の濃度で培地（Dulbecco改良必須培養地／Ham's F12の血清無添加培地１：１）に添加し、６日間の培養期間を通じて検定を行なった。培養容器は、容器内に含まれて中心に配置された滅菌したステンレススチール製「フェンス」で組立てた。（ウシの角膜組織から製した）角膜上皮細胞の細胞懸濁液のアリコート（１００μl）を、５×１０⁵細胞/mlの濃度でステンレススチール製「フェンス」囲い領域に各々接種した。この細胞接種量は、そのままの血清を含む培地で、フェンスの内側空間で画定された培養領域に細胞接種した２４時間後に融合性の単層を生成するのに十分なものであった。これらの実験で、２４時間培養後、培養容器からフェンスを取り除き、次いで培地容量を調整して培養を続けた。フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去血清画分の各試験検体は、３個の培養器で検定し、１個の容器は、２４時間培養期間後に細胞を含む培養液の面積を計量化するのに使用し、２個の容器は、７日間の培養後に面積を測定するのに使用した。適切な時点で、細胞をホルマリン−生理食塩水で固定し、使用時まで４℃で滅菌ＰＢＳ中に保存した。細胞濃度は、オリバー（Oliver）らの方法によりメチレンブルーで染色して測定し、結合した染料量を、プレートリーダー上、６５５nmで比色定量的に測定した。細胞の外部成長面積の測定（ブルー染料の摂取による色の増加によって細胞を検出する、Quantimet 570画像分析器を用いた画像分析による）及び細胞増殖の程度の測定（免疫検定用のプレートリーダー上、６５５nmで比色定量的に測定した）の両方にメチレンブルー染色を使用した。培地の組合せは：ｉ）血清無添加培地、それに寸法が１，０００〜１０，０００ダルトンの血清因子を有する画分３の２０％(v/v)を添加； ii）血清無添加培地、それに寸法が１，０００〜３０，０００ダルトンの血清因子を有する画分２の２０％(v/v)を添加； iii）血清無添加培地、それに寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子を有する画分１の２０％(v/v)を添加； iv）血清無添加培地、それに寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子を有する画分１、２及び３の組合せの２０％(v/v)を添加；ｖ）血清無添加培地プラス２０％(v/v)フィブロネクチン−及びビトロネクチン −除去血清（寸法に関して分画していない）； vi）血清無添加培地単独；である。上記のように、二種類の培養表面を使用した：第一は、組織培養ポリスチレン、そして第二は、ウシ血清フィブロネクチンを１０μg/mlで予め被覆し、細胞接種前に３７℃で１時間培養した組織培養ポリスチレン。結果フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去血清を、既知の分子量範囲を含む画分に分離することによって、角膜上皮細胞の付着、移動及び外部成長に及ぼす、特定の分子量範囲にある血清成分の影響を評価することができた。図３は、培養の初期２４時間に角膜上皮細胞の付着に及ぼす、フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去血清から調製した異なる画分の影響を示す。この実験を行なった方法では、表面に存在する細胞数は、異なる処理を受けて２４時間培養後、各処理に関して同数に近かった。したがって、異なる処理は、最初の２４時間培養後に細胞の外部成長速度及び細胞数の増加で比較され、２４時間の時点での検定では細胞数は同数であった。図４は、６日の培養期間中、細胞で覆われた培地表面の面積に及ぼす各種の画分の影響を示し、（上記と同様に算出した）細胞の外部成長の指標として表した。図４は、また、６日の培養期間経過時に、（２４時間におけるそれとの比として表した）細胞培養面積における増加を（２４時間における）細胞付着データーに関係付ける方法で、これらの結果を比較した。細胞群の細胞移動及び外部成長は、あらゆる培地／表面の組合せ全部で明らかであるが、その程度は顕著に異なっている。概して、フィブロネクチン−及びビトロネクチン−除去の子ウシ血清を含む処理（陽性の対照）又は寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子を有する血清画分１の２０％(v/v)を含む処理において、細胞は、画分２又は３を含む処理で培養された細胞によって覆われる面積よりも約１０倍大きい面積を覆って移動した。その上、画分１、２及び３の再結合を含む処理において培養された角膜上皮細胞は、組織培養ポリスチレン及びフィブロネクチン被覆の組織培養ポリスチレンの両方で、陽性対照結合の面積の約３３％を覆って移動した。図４は、異なる血清画分の間の興味ある比較をしている。２４時間培養後、細胞付着の同様なレベルは、血清無添加培地単独、あるいは（寸法が１，０００〜１０，０００ダルトンの血清因子を有する）画分３の２０％(v/v)又は（寸法が１，０００〜３０，０００ダルトンの血清因子を有する）画分２の２０％(v/v) 又は（寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子を有する）画分１の２０％(v/v)、又は画分１若しくは画分１、２及び３の再結合を含む血清無添加培地の何れかの処理で見られた。初期の細胞付着は、これらの異なる処理で同等であるにも拘らず、細胞領域での増加には顕著な相違があった。画分１（寸法が１，０００〜１００，０００ダルトンの血清因子）の２０％(v/v)を含む処理及び画分１、２及び３の再結合を含む処理だけが、６日間の培養で、組織培養ポリスチレン上の細胞領域を増加させた。同じ結果は、フィブロネクチン−被覆の組織培養ポリスチレン表面での処理にも見られた。これら２例の培養基質の使用及び低分子量物質の細胞の要求に備える培地の使用によって、これらの実験に用いた実験の構成は、上記の角膜表面移植片の典型であり、栄養素及びその他の低分子量物質に対する両方の細胞の接近手段を提供し、角膜上皮細胞の付着を支える表面化学を提供している。まとめると、これらの結果は、血清中の因子によって例証されるように、組織培養ポリスチレン表面のような合成ポリマー表面の最適な上皮細胞適用範囲に要求される組織栄養因子が存在することを示している。これらの因子は、寸法が１，０００ダルトンより大きく、かつ１０，０００ダルトンより大きい分子を排除するフィルター上に保持される。これらの結果は、活性又はその一部は、（アミコンＰＭ１０膜フィルターによって排除され、アミコンＸＭ１００膜フィルターにより含まれることから決定した）１０，０００〜７５，０００ダルトンの分子量範囲にはいるものとして同定することができる。これらの血清因子は、付着因子フィブロネクチン又はビトロネクチンではない。これらの結果は、細胞の外部成長と表面上での移動の活動のためには、組織からの栄養因子に対して角膜上皮細胞の要求があることを示している。血清のような組織因子は、上皮細胞群からの上皮細胞の外部成長を刺激し、この効果は血清の付着性蛋白質フィブロネクチン及びビトロネクチンに依存するものではない。血清の分子量分画によって、この活性は、寸法が１０，０００ダルトンより大きい場合に存在することが示された。したがって、本発明の角膜表面移植片は、１０，０００ダルトンより大きい分子量を有する組織液成分の通過を可能にするに十分な多孔度を有している。実施例４：角膜表面移植片の製造角膜表面移植片は、次式： −（−ＣＲ¹＝ＣＲ²−Ａ−）− （式中、Ａは、それぞれ、３〜１０の炭素原子を有するアルキレン又はアルケニレンであり、そのそれぞれは、一つ以上のＲ³基で置換されてもよく、Ｒ¹ 及びＲ²のそれぞれは、互いに独立して、水素又は低級アルキルであり、そしてＲ³は、低級アルキル、フッ素化低級アルキル又はシロキサン基である）の単位から組立てられる架橋した大環状化合物を含むポリマーから製造される。このようなポリマーは、そのまま参照として、この明細書に引用されている欧州特許第Ａ−５０１，９１７号明細書に記載されている。最初の実験においては、５％tert−ブチルペル−２−エチルヘキサノアートを、ポリ（１−オクテン−１，８−ジイル）（商品名：Vestenamer）に加え、架橋剤を３５°の温度で減圧下に通常の市販のニーダー中で混和した。生成した混合物から、適切な染料を用い、１６０℃、５〜２０barの圧で５分間、角膜表面移植片を圧縮成形した。かくして得られた角膜表面移植片は、１０６の酸素透過度（Ｄｋ）及び２．７MPaの引裂き強さを有している。マイクロプロセッサー制御のパルスレーザーを用い、表面移植片に細孔を形成させた。それぞれの表面移植片の光軸領域には、約２００nmの直径を有する多数の細孔を形成させた。それぞれの表面移植片の光軸領域の外側には、約２００ミクロンの直径を有する多数の細孔を形成させた。第２の実験においては、欧州特許第Ａ−５３８，１８８号明細書に記載の式（Ｉ）のコポリマーから表面移植片を製造し、ここにそのまま参照として引用する。特に、トリシクロ［１．１．１．０^1,3］ペンタン１００mmol及びエチルアクリラート１５０mmolを、酸素を排除しながら、ジエチルエーテル中、室温で２日間、共重合させた。１００℃のガラス転移温度を有するシートを得た。このシートを圧縮成形して角膜表面移植片を調製した。上記と同様に、この表面移植片に細孔を形成させた。この明細書で参照した特許及びその他の技術資料は、この明細書で参考文献として引用されている。ここに記載した本発明は、熟練した技術者によって判断されるように、この発明の精神と範囲を逸脱することなく変更することができ。このような変更の全ては、この発明に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スティール，ジョンジェラードオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2151 ノースロックスザキャリッジウェイ７ (72)発明者ホールデン，ブライアンエーオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2032 キングスフォードレオナルドアベニュー 19 (72)発明者スウィーニー，デビーオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2069 ロスビルマルガストリート 23 (72)発明者オレアリー，ダンオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2220 ハーストビルドナルドストリート 45 (72)発明者シントヘルム，クラウスオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2120 チェリーブルックフランシスグリーンウェイドライブ 72 (72)発明者ヴァンナス，アーンティフィンランド国ヘルシンキ 17 ピーランタ 10 エー７ (72)発明者ジョンソン，グラハムオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2210 ピークハーストムーンバラアベニュー 10

Claims

【特許請求の範囲】１．それを通して視力を与える光学特性を持つ光軸領域を有し、かつ、生物非分解性で、非ヒドロゲルの、眼科的に生物適合性の材料よりなる、哺乳動物の角膜の内部又は上への外科手術移植に用いる角膜表面移植片であって、該表面移植片が、それを通して１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する組織液成分を通過させるに十分な多孔度を有し、それによって、移植された表面移植片前部の細胞とその背部の細胞との間で組織液に流動を与え、ここで、光軸領域の多孔度が、目の組織の内部への成長を排除するが、組織液成分を流動させるような多孔度であり、かつ該表面移植片が、上皮の再移植に適していることを特徴とする角膜表面移植片。２．光軸領域を取り囲む表面移植片の周囲が、角膜への表面移植片の固定が容易であるように、目の組織の内部への成長を可能にするのに十分な多孔度を有する外辺を画定する、請求項１記載の角膜表面移植片。３．表面移植片の表面が、移植された表面移植片に隣接する細胞の付着を刺激するように改質されている、請求項１又は２記載の角膜表面移植片。４．表面移植片が、移植された表面移植片に隣接する組織の成長、及び／又は表面移植片への細胞付着を促進する一つ以上の成分で被覆されている、請求項１〜３の何れか１項記載の角膜表面移植片。５．表面移植片の多孔度が、表面移植片を通して、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する蛋白質性の組織液成分を通過させるのに十分であるが、組織の内部への成長を排除する寸法を有する多数の細孔により与えられる、請求項１記載の角膜表面移植片。６．視覚光軸の多孔度が、表面移植片を通して、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する蛋白質性の組織液成分を通過させるのに十分であるが、組織の内部への成長を排除する寸法を有する多数の細孔により与えられる、請求項２記載の角膜表面移植片。７．多数の該細孔が、１５ナノメートル〜０．５マイクロメートルの直径を有する、請求項５又は６記載の角膜表面移植片。８．多数の該細孔が、１５ナノメートル〜３００ナノメートルの直径を有する、請求項７記載の角膜表面移植片。９．多数の該細孔が、２０〜１５０ナノメーターの直径を有する、請求項８記載の角膜表面移植片。１０．外辺の該多孔度が、組織の内部への成長及び表面移植片の固定を可能にするように、少なくとも２０ミクロンの直径を有する多数の細孔により画定されている、請求項２記載の角膜表面移植片。１１．外辺が、光軸領域を除いて、生物適合性で、生物非分解性の材料から形成され、該外辺が、光軸領域と一体になっているか、又はその周辺に確保されるかの何れかである、請求項１０記載の角膜表面移植片。１２．それを通して視力を与える光学特性を持つ光軸領域を有し、かつ、生物非分解性で、非ヒドロゲルの、眼科的に生物適合性の材料からなる、哺乳動物の角膜の内部又は上へ外科的に移植する用途のための角膜表面移植片を、角膜の内部又は上へ外科的に移植することからなる、目の視覚特性を矯正又は目の外観を変更する方法であって、該表面移植片が、それを通して１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する組織液成分を通過させるのに十分な多孔度を有し、それによって移植した表面移植片の前部細胞とその背部細胞との間で組織液に流動を与え、ここで、光軸領域の多孔度が、目の組織の内部への成長を排除するが、組織液成分を流動させるような多孔度であり、かつ該表面移植片が、上皮再移植に適していることを特徴とする方法。１３．光軸領域を取り巻く表面移植片の周辺が、角膜への表面移植片の固定が容易であるように、目の組織の内部への成長を可能にするに十分な多孔度を有する外辺を画定する、請求項１２記載の方法。１４．表面移植片の表面が、移植された表面移植片に隣接する細胞の付着を刺激するように改質されている、請求項１２記載の方法。１５．表面移植片が、移植された表面移植片に隣接する組織の成長、及び／又は表面移植片への細胞付着を促進する一つ以上の成分で被覆されている、請求項１２記載の方法。１６．表面移植片の多孔度が、表面移植片を通して１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する蛋白質性の組織液成分を通過させるのに十分であるが、組織の内部への成長を排除する寸法を有する多数の細孔により与えられる、請求項１２記載の方法。１７．視覚光軸の多孔度が、表面移植片を通して１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する蛋白質性の組織液成分を通過させるのに十分であるが、組織の内部への成長を排除する寸法を有する多数の細孔により与えられる、請求項１３記載の方法。１８．多数の該細孔が、１５ナノメートル〜０．５マイクロメートルの直径を有する、請求項１６又は１７記載の方法。１９．多数の該細孔が、１５ナノメートル〜３００ナノメートルの直径を有する、請求項１８記載の方法。２０．多数の該細孔が、２０〜１５０ナノメートルの直径を有する、請求項１８記載の方法。２１．外辺の該多孔度が、表面移植片の、組織の内部への成長及び固定を可能にするように、少なくとも２０ミクロンの直径を有する多数の細孔により画定されている、請求項１３記載の方法。２２．外辺が、光軸領域を除いて、生物適合性で、生物非分解性の材料から形成され、該外辺が、光軸領域と一体になっているか、又はその周辺に確保されるかの何れかである、請求項１３記載の方法。２３．該表面移植片が、角膜上皮に移植される、請求項１２記載の方法。２４．表面移植片が、角膜の基底膜に隣接して配置されている、請求項２３記載の方法。２５．光軸領域が、着色されている、請求項１３記載の方法。２６．請求項１２記載の方法での用途のための、請求項１記載の角膜表面移植片。