JPH05505302A - 単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１の変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１の変具体艮ｉ塁亘！ 本発明は生体内の神経細胞でウィルスの複製が無く、潜伏性感染状層を効果的に 定着させ、かつ、組込まれた治療遺伝子が発現することができる単純ヘルペス・ ウィルスのタイプ１　（Ｈ３Ｖ−１）の変異体に関する。これは、特に、遺伝子 欠陥による。又は、遺伝子欠陥に関連する神経の病気の治療に有効である。

！見 ヘルペス・ウィルス感染の際立った特徴は、複製可能でない状態、又は、潜伏性 の状態で宿主内に長期間滞在できる能力である。単純ヘルペス・ウィルスのタイ プ１　（Ｈ３Ｖ−４）は、ヒトの末梢神経系の感覚神経節内に潜伏性感染状層で 定着する。そして、活性化して、神経が分布している皮節内で皮膚と粘膜の反復 性の病巣部を生じろる（バイヒワルとサグデン、１９８８　；　ヒル、１９８５ ；ロイズマンとシアーズ、１９８７　（Ｂａｉｃｈｗａｌ　ａｎｄ　Ｓｕｇｄｅ ｎ。

１９８８：Ｈｉｌｌ、１９８５；Ｒｏｉｔｚｍａｎ　ａｎｄ　５ｅａｒｓ、１９ ８７）参照）、操作上、ヘルペス・ウィルス感染による病理作用には、いくつか の明確な段階があり、実験動物を用いた模擬実験で個別に研究できる。即ち、急 性のウィルス複製、潜伏状態の定着、持続、活性化の各段階である（ヒル、１９ ８５；　ロイズマンとシアーズ、１９８７　（Ｈｉｌｌ＋　１９８５；Ｒｏｉｚ ｍａｎ　ａｎｄ　５ｅａｒｓ＋　１９８７）−接種後、Ｈ８Ｖ−１は接種部位で 複製して、感覚神経節に輸送される。末梢神経系での、又は、感覚神経節での複 製は。

組織の均質懸濁液のウィルス滴定によって泗定されるが、その複製で潜伏性感染 状態で定着しているウィルス量を増加しつる。Ｈ５Ｖ−１のＤＮＡを感染された 組織内で検出うるが、ＪＩＫ染性のウィルスは検出されない（デッシュメーンと フレイザー、１９８９　；　エフスタシャスら、１９８６；　フレイザーら、１ ９８６；　ロックとフレイザー、１９８３　（Ｄｅｓｈｍａｎａ　ａｎｄ　Ｆｒ ａｓｅｒｌ　１９８９：Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ　ｅｔａｌ、、１９８６；Ｆｒａ ｓｅｒ　ｅｔａｌ。

１９８６：Ｒｏｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓｅｒｌ　１９８３）＠この潜伏状層は、 しばしば長期間、宿主が生きている間持続する。（発熱性の病気、及び、Ｘ線照 射のような）種々の刺激が、１伏状態を中衛させ、感染ウィルスの再出現、ない し、再活性化を生じる。

急性のウィルス複製と遺伝子発現についての情報の多くは組織培養系で得られて いる。Ｈ３Ｖ−１の細胞溶解性の複製サイクルは、少なくとも３種類のウィルス 遺伝子：α、β、γの一時的調節を含む統合的プロセスとして記述されている（ ロイズマンとシアーズ、１９８７　（Ｒｏｉｚｍａｎ　ａｎｄ　５ｅａｒｓ、１ ９８７）参照）、感染された細胞でウィルスが蛋白合成をする前に最初に発現す る。ごく初期の５種類の遺伝子（ＩＥ、α）が特定されている。これらの遺伝子 のうちの２種Ｉｔ　（ＩＣＰ４とＩＣＰ２７）は細胞培養系内でウィルスの複製 が行われるのに必須である（ディクソンとシャツファー、１９８０；　ブレスト ン、１９７９　；サックスら、１９８５　（Ｄｉｘｏｎ　ａｎｄ　５ｃｈａｆｆ ｅｒ。

１９８０ｉＰｒａｓｔｏｎ、１９７９；５ａｃｋｓ　ｅｔａｌ、、１９８５）ｓ 　β遺伝子はβ遺伝子を活性化する。β遺伝子の多くはヌクレオチド代謝に関係 する酵素であって、γ遺伝子を活性化する。γ遺伝子の多くは成熟ウィルス粒子 の構成要素である。角膜接種後に、遺伝子のα、β、γの各クラスに及ぶ広範囲 のＨ３Ｖ−１遺伝子が、マウスの三叉神経節でのウィルス複製の急性の段階中に 、原位置でのハイブリッド化とノーザン・プロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏ ｔ）分析によって検出できる（ディアリ−ら、１９８７；　スピヴアックと７レ イザー、１９８８ａ　（Ｄｅａｒｌｙ　ｅｔａｌ、、１９８７；５ｐｉｖａｋ　 ａｎｄ　Ｆｒａｓｅｒ、１９８８ａ）。

潜伏性感染期間のＨ３Ｖ−１の遺伝子の発現を性格付けることで、最近、進歩が あった。マウスの感染から最初の５−６日後の、三叉神経節でのＨ５Ｖ−１の遺 伝子の発現は限定的である（スピヴアックとフレイザー、１９８８ａ　（Ｓｐｉ ｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓｅｒ、１９８８ａ）、これは、三叉神経節に感染し たウィルスが少ないことと相関性がある（フッソら、１９７４：ステイナーら、 １９８７　（Ｋｎｏｔｔｓ　ｅｔａｌ、、１９７４；５ｔｅｉｎｅｒ　ｅｔａｌ 、、１９８７）、感染後４日で、Ｈ８Ｖ−１の潜伏に関連した転写（ＬＡＴ：　 １ａｔａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔａｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）（スビヴア ツクとフレイザー；　ステバンスら、１９８７（Ｓｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒ ａｓｅｒ：Ｓｔ、ａｖａｎｓｅｔａｌ、、１９８７）は三叉神経節に蓄積し始め る（スビヴアツクとフレイザー、１９８８ａ　（Ｓｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒ ａｓａｒ、１９８８ａ）。

この潜伏に関連した転写（ＬＡＴ）は二ニーロン細胞核に広く存在する（ディー トリら、１９８７；　１９８８；　ステイナーら、１９８８：　スティーブンズ ら、１９８７；　ストループスら、１９８４　（Ｄａａ　ｔ　ｌ　ｙ　ａｔ　ａ Ｌ、１９８７；　１９８８；５ｔａｉｎｅｒａｅａ１．、　１９８８：５ｔａｖ ａｎｓ　ａｔａｌ、、１９８７；５ｔｒａｏｐ　５ｅａ１．．１９８４）ａそし て、あまりポリアデニラート化（ｐｏｌｙａｄａｎｙｌａｔａｄ）されていない （スビヴアツクとフレイザー、１９８７　（Ｓｐｉｖａｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｇａ ｒ、１９８７）＃　これらの２゜０．１．５、及び、１．４５ｋｂの転写はウィ ルスのゲノムの反復領域内で二倍体遺伝子によって＝−ディングされている（ス ピヴアツクとフレイザー、１９８７　（Ｓｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓａｒ 、１９８７）、これらの遺伝子とその調節要素の詳細な構造は、依然として、完 全に解明されていない、この２゜Ｏｋｂの潜伏に＠遮した転写（ＬＡＴ）は感染 された組織培養の躇胞内で低レベルで検出できる（スピヴアックとフレイザー、 １９８７　（Ｓｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓａｒ、１９８７）６そして、前 に定義した種類のＨ８Ｖ−１遺伝子のどれとも異なる調節を受けるように見える （スピヴアツクとフレイザー、１潜伏に関連した転写（ＬＡＴ）の機能は、最近 になって研究されるようになった。遺伝子の分析では潜伏に関連した転写（ＬＡ Ｔ）が潜伏性ｌ１ｌｌＪｌ状態の定着のために必要でないこと（ヤヴイエールら 、１９８８　；　ステイナーら、１９８９（Ｊ　ａｖｉａｒ　ｅｔａｌ、、　１ ９８８；５ｔａｉｎｅｒ　５ｔａ１．、１９８９）　、　Ｌ／かし、潜伏に５Ｉ 連した転写（ＬＡＴ）は活性化のプロセスで役割を演じるだろうということ（ス テイナーら、１９８９　；　（Ｓｔａｉｎａｒ　ｇｔａｌ、、１９８９）が示さ れている。Ｈ８Ｖ−１の変異体ウィルスはＬＡＴを発現せずに、マウスの三叉神 経節で潜伏性感染状態を定着させているけれども、外部にＳ植された神経節内で は野生型ウィルスよりもずっとゆっくりと活性化する（ステイナーら、１９８９ 　（Ｓｔ．ａｉｎａｒ　ａｔａｌ．，１９８９）．活性化の過程の際に、ウィル スのＲＮＡ．ＤＮＡ、又は、感染ウィルスの合成を検出できる前に時間的遅れが ある（スビヴアックと７レイザー、１９８８ａ　（Ｓｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆ ｒａｇａｒ，１９８８ａ）．活性化が抑制剤によって阻止されている時でも、Ｌ ＡＴのレベルはこの期間に約２倍減少する（スビヴアックと７レイザー、１９８ ８ａ　（Ｓｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓｓｒ，１９８８ａ）．現在、感染の 初期の段階での、＊ａ溶解性の、又は、潜伏性のＨＳＶ−１の遺伝子の発現への 聾行、ないし、発現通程中の潜伏性の、又は、胤胞溶解性の転写プログラムから の移行についての情報はほとんど無い．ウィルスと細抱の転写因子の両方が重要 な要素になっているようである． ＨＳＶ−１のＩＥ遺伝子の転写は潜伏期間中に検出できない（ディートリーら、 １９８７；　スビヴアックとフレイザー、１９８７；　スティナーら、１９８８ ；　スティーブンズら．１９８７　（Ｄａａｔｌｙ　ｅｔａｌ．，１９８７；Ｓ ｐｉｖａｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓａｒ，１９８７：Ｓｔｅｉｎｓｒ　ａｔａｌ． ｙ　１９８８：Ｓｔｓｖａｎｓ　ａｔａｌ．ｅ　１９８７）＊　Ｌ／かしながら 、組織培養系内でのＩＥ遺伝子の発現がウィルス複製の前提山件である（ヂイク ソンとシャッファ一、１９８０；　プレストン、１９７９：　ロイズマンとシア ーズ．１９８７；　サックスら、１９８５　（Ｄｉ：ｃａｎ　ａｎｄ　Ｓｃｈａ ｆｆｅｒ，’１９８０；Ｐｒａｓｔｏｎ＋　１９７９；Ｒｏｉｚｍａｎ　ａｎｄ 　Ｓｅａｒｓ，１９８７；Ｓａｃｋｓ　ａｔ　ａｌ．，１９８５）．ＩＥ遺伝子 の転写は成熟ウィルス粒子の蛋白であるＶｍｗ８５　（　トランスインジューシ ング（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｃｉｎｇ）因子、又は、ｃｔＴＩＦ）によってトラン スインジュース（ｔｒａｎｇｉｎｄｕｃａ）される．Ｖｍｗ６５はＨＳＶ−１成 熟ウィルス粒子の要素である（バッダーリンとロイズマン，１９８３；　キャン ベルら、１９８４：　オーヘイアとへイワード、１９８７　：　ポストら、１９ １３１　：　ブレストンら、１９８４　（Ｂａｔｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｉ ｚｍａｎ，１９８３：Ｃａｍｐｂａｌｌ　ｅｔａｌ．＋　１９８４　；　○’　 Ｈａｒｅ　ａｎｄ　Ｈａｙｗａｒｄ，　１９８７；Ｐｏｓｔ　ａｌ：ａｌ．，１ ９８１　：Ｐｒｅｓｔｏｎ　ｓｅａｌ．；１９８４）．Ｖｍｗ６５はＨＳＶ−１ のＤＮＡに直接緒合していないが、ＩＥの調節要素のＴＡＡＴＧＡＲＡＴと相互 作用する複合体を形成するように、細胞逼白と閏係することによってトランスイ ンジューシング（ｔ　ｒ　ａ　ｎ　ｓ　ｉ　ｎ　ｄ　ｕ　ｃ　ｉ　ｒｉ　ｇ）を 媒介する（ゲルスターとロエダー、１９８８　；　建ツクナイトら、１９８７： 　オーヘイアとゴーヂイング、１９８８；　ブレストンら、１９８８　（Ｇｅｒ ｓｔａｒ　ａｎｄ　Ｒｏｓｄａｒ，１９８８：ＭｃＫｎｉｇｈｔ　＠ｔａｌ．＋ 　１９８７：Ｏ’　Ｈａｒｅ　ａｎｄ　Ｇｏｄｉｎｇ，１９８８；Ｐｒｅｓ　ｔ ｏｎ　ｅｔａｌ−ｅ　１９８８）＊　ＩＥ遺伝子の発現は，組織培養避胞内のＨ ＳＶ−４感条の結果の中での重要な因子であるので、機能性のＶｍｖ６５の有無 は生体内で増殖性感東状態になるか、潜伏性感染状態になるかの重要な決定要因 なのかも知れない（エースら、１９８９：　ロイズマンとシアーズ、１９８７　 （Ａｃｅａｔａｌ．，１９８９：Ｒａｉｚｍａｎ　ａｎｄ　Ｓａａｒｓ，１９８ ７）． ＨＳＶ−１の変異体のｉｎｌ８１４　（エースら，１９８９　（Ａｃｓａｔａｌ ．ｐ１９８９）は、Ｖｍｗ６５のコーディング領域に１２ｂｐの組込み部分を含 み、ＩＥ遺伝子の発現壺トランスインジェース（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｃａ）でき ない．しかし変異されたＶｍｗ６５は成熟ウィルス粒子に組込まれている．感染 中のｉｎ１８１４の複製は、一粂の複合度（Ｍ○Ｉ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ 　ｏｆｉｎｆｓｃｔｉｏｎ）に左右される．Ｖｍｗ６５の欠陥は感染の複合度（ ＭＯ工）が高《なると部分的に克服される．感染の複合度（Ｍｏ工）が高い（１ ０Ｅ２−１０Ｅ３１１ノ粒子／ｍ胞）テハ、ＩＣＰＯ、及び．ＩＣＰ２７Ｊ３発 現は宥意に減少し、ＩＣＰ２２は僅かに減少する．そして、ＩＣＰ４の発現は影 響壱受けない（エースら、１９８９　（Ａｃ＠＠ｔａｌ．，１９８９）．ｉｎｌ ８１４のＭＯＩが低い（１−１０個の粒子／ａｌｌ）と，β遺伝子の指標である 、ＨＳＶ−１のチミジン・キナーゼの発現が非常に減少し、ＩＥ遺伝子の発現が ウィルスの複諷サイクルを活性化するのには不十分であることを示唆している． （エースら、１９８９　（Ａｃｅ　＠ｔａｌ．，１９８９）．及五二１敗 本発明は、生体内の神ＭＩＩ胞内でのウイルス複製が無く、潜伏性感染状態を定 着できて，かつ、組込まれた治療遺伝子を発現できて、（ｉ）本買的にトランス インジューシング（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｃｉｎｇ）特性を除去しながら、その一 方で、この構造的役割を保持し、それによって、生体内での複製を防止するよう に、Ｖｍｗ６５Ｎ白についてコーディングしている遺伝子内のＤＮＡシーケンス の変化、！白のアミノ１２２８９から４１２の闇の位置で、１から７２の塩基対 のトランジシ冒ン（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）又はトランスバーション（ｔｒａｎ ｓｖａｒｓｉｏｎ）の変異、３から７２の塩基対のオリゴヌクレオチドの組込み 、又は、３から７２の塩基対の欠落によって実現されるＤＮＡシーケンスの変化 、及び （ｉｉ）ウィルスの培養にとって必須でないＨＳＶ−１のゲノムの領域に組込ま れた治療遺伝子、及び、そのために、生体内のニニーロン細胞内で治療遺伝子を 発現できるプロモーター、から成る単純ヘルペス・ウィルスのタイブ１　（ＨＳ Ｖ−１）の変異体を提供する． ＤＮＡシーケンスの変化の位置と大きさは重要である．なぜなら、それは、Ｖｍ ｗ６５！白のトランスインジューシング（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｓｉｎｇ）特性を 本質的に除去するために（そして、それによって生体内でのウイルスの複製を防 止し，その結果としての患者の病気を防止するために）必要で、その一方で、同 時にウイルスが培養されるときに完全に成熟したウイルス粒子をうまく姐立てる のに必要な蛋白の構造特性を保持するのに必要である．変異体のウィルスは、利 用するのに十分な量にその変異体のウィルスを生産できるような、ただし、同時 にそのウイルスが生体内で複製できないような培養状態の下で複製できなければ ならない．Ｖｍｗ６５！白のトランスインジューシング（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｃ 　ｉ　ｎ　ｇ）特性を無《すことで、ウィルスを潜伏段階に保ち、生体内でのウ イルスの複製と発現が活発になる段階に進行するのを防ぐ．変異体のウィルスは ，Ｓ合よく、ｉｎｌ８１４の表現型に基づいている．驚くべき発見として，前記 の大きさと位置でのオリゴヌクレオチドの組込みで、生体内での複製が防止され るが、それ麻外には、ウイルスの必要機能を抑制しないことが見出された．そし て、変異体のウイルスは「野生型」のウイルスと同様に効率的にターゲットとな る神経胤胞に転移されること，そのウイルスはその細胞内に留まり，消滅しない こと、潜伏に＠遷した転写（ＬＡＴ）の発現は影響されないこと，及び、ウイル スが侵入し、その潜伏ＲＮに留まる能力も、又、影響を受けないことが発見され た．これらの特性により、神経細胞を本質的に抹殺することなしに、特に治療遺 伝子を神ａ扁胞に導入し、持続させるためのベクターとして、この変異体のウィ ルスをうまく利泪できる．これは、神経の遺伝子欠陥治療のためのルートを提供 する． 治療遺伝子は、一般に、褌緬の遺伝子欠陥の病気に５Ｉ巡した遺伝子である．Ｕ ち、それが、遺伝的、又は、後天的な遺伝子欠陥を補償する．そのような治療遺 伝子に含まれる例としては、 （ａ）ヒト、ラット、又は、マウスのチロシン・ヒドロキシラーゼの遺伝子１、 ２、又は、３、これはパーキンソン病の症状朝減と＠連がある．（ｂ）ヒト、ラ ット、マウスの神経成長因子のβサブユニット、アルツハイマー病とバーキンソ ン病の治療用 （Ｃ）ヒト、ラット、マウスのヒボキサンチン・グアニン・フオスフｔリボジル 転移酵素の遺伝子、レッシュ・ナイアン病の治療用，（ｄ）ヒトのβヘキソサミ ニダーゼのαチェーン遺伝子、ティーサックス病とサンドホフ病の治療用 （ｅ）ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｎ’ｅｆ遺伝子、ＨＩＶに陽性のヒ トの神経性の症状抑制泪、 特に、本発明のＨＳＶ−１変異体による原位置でのチロシン・ヒドロキシラーゼ の発現は、パーキンソン病の症状畷減に役立つだろう．チロシン・ヒドロキシラ ーゼはドーパミンの合成に重要な酵素である。ドーパミンの欠陥はパーキンソン 病の症状の主要１１Ｋｖ１である。Ｌドーパの投与を含む現在の治療では短期間 の効果しかない。

治療遺伝子は、ウィルスの培養、即ち１体外での、特に、＄１組織でのウィルス の複製に必須でないウィルスのゲノムの任意の領域に組込める。

治療遺伝子の組込みは、単純ヘルペス・ウィルス（ＨＳＶ）の以下の遺伝子のコ ーディング・シーケンス、又は、フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）のＩ！１Ｉ Ｉｊ領域で行える。１！ｇち、 １、チミジン・キナーゼ遺伝子、これは、チくジン・キナーゼはＨＳＶの病原性 にとって重要で、その遺伝子を不活性化することは変異体ベクターの潜在的病原 性な弱めるので、好ましい選択である。

２、デオキシウリジン・トリフォスフェターゼ（ｄＵＴＰａｇｅ）遺伝子３、ウ ラシル−ＤＮＡのグリコシダーゼ遺伝子４．０Ｓ１遺伝子（別名、ＩＥ６Ｂ遺伝 子）５、ＵＳ２遺伝子 ６、ＵＳ３　（別名、プロティン・キナーゼ）遺伝子７、ＵＳ４　（別名、グリ ープロチインＧ）遺伝子８、ＵＳ５遺伝子 ９、ＵＳ７（別名、グリープロテイン工）遺伝子１０、ＵＳ、８　（別名、グリ ープロチインＥ）遺伝子１１、ＵＳ９遺伝子 １２、ＵＳ１０遺伝子 １３、ＵＳ１１遺伝子 １４、ＵＳ１２　（別名、Ｉ　Ｅ　１２）遺伝子１５、ＵＬ５．６遺伝子 １６、ＵＬ５６遺伝子 １７、潜伏に＠連する転写（ＬＡＴ）をコーディングする遺伝子１８、ＩＥＩＩ Ｏ遺伝子 ＵＳ命名システムは系統的命名法である。遺伝子の多くは、又、菅通名を持つ。

一般に、プロモーターは、ＨＳＶ−１の潜伏段階の間に、神経細胞中で操作でき るものにすべきである０例えば、ＨＳＶ−１の潜伏に関連する転写（ＬＡＴ）を １ＩＩＩ御するプロモーター、又は、＃経繊維の遺伝子を制御するプロモーター である。

本発明の他の側面は、病気の治療、特に、遺伝子欠陥による、又は、遺伝子欠陥 と＠連する病気の治療でのＨＳＶ−１の変異体の利用に関係している。

本発明の別のｌｌ１１Ｍは、薬剤として受入れられるキャリヤー内にこの変異体 ウィルスから成るウィルスを調合するための薬剤ｍ戊に関する。

衷爽亘 ＨＳＶ−１ウイルス・ベクター１ｎ１８１４のＩＫ！！、及び、それが、生体内 での複製と病気の発現を生じないでマウスの神ｍ細胞に感染する能力（そして、 潜伏段階で留まる能力）の評価について、ここでは、例示の形でのみ示す。

ここで、又、例示の形でのみ、ウィルス・ベクターエエ１８５ｏをｍ遣するため に、ウィルス・ベクター１ｎ１８１４に遺伝子（βガラクトシダーゼについての コーディングをするための遺伝子）を組込むこと、及び、その発現を示している 。この技術（容易に検出可能な遺伝子の存在）を実証するために、βガラクトシ ダーゼ遺伝子を挿入する。治療に芯層するためには、類似の方法で治療遺伝子を 組込むか、又は、βガラクトシダーゼの遺伝子１ｎ１８５０を治療遺伝子で直接 交換できる。

■　ウィルス・ベクター１ｎ１８Ｌ４の製　と評価実験手順 ＩＮ胞の培養、ウィルスの滴定、及び、ウィルスの親株の作成、マウスの感染用 ウィルスの親株を製造するために、変異体の１ｎ１８１４　（エースら、１９８ ９　（Ａｃｅａｔａｌ、、１９８９）、又は、復帰突然変異体の１８１４Ｒ（エ ースら、１９．８９　（Ａｃｅ　ｅｔ、ａｌ、、１９８９）を組込んだＨＳＶ− １の親株１７＋（ブラウンら、１９７３　（Ｂ、ｒｏｗｎ　ａｔａｌ、、１９７ ３）を、幼児ハムスターの腎ＩＩ　（ＢＨＫ）２１のクローン１３の頑胞の準集 合性の単層に感染させた。ウィルスの滴定はＢＨＫ、４１胞上で行い、ウィルス の粒子濃度は電子顕微鏡により、ラテン、クス・ビードの標準を用いて決定した 。使泪したウィルスの親株は、ＰＦＵ／ｍｌ単位（ＰＦＵ：ブラク形成単位：ｐ ｌａｑｕａ　ｆｏｒｍｉ　ｎ　ｇ　ｕ　ｎ　ｉ　ｔ　ｓ）　（括弧内の数字は粒 子／ｍｌ単位）で、１７＋が５．Ｘ　１０Ｅ＆（３，ｌＸ１０Ｅ９）：　１８１ ４Ｒが５Ｘ１０Ｅ８（５，ｌＸ１０Ｅ９）；　１ｎ１８１４がＬ　３Ｘ１０Ｅ７ （１，２Ｘ１０Ｅ１１）。

Ｖｍｗ６５を発現している廠胞上でのウィルスの滴定結果の比較Ｈ８Ｖ−１の親 株、１７＋、１ｎ１８１４．１８Ｌ４ＲをＭＴｘ５ｉ＋Ｉ！Ｉ胞上で滴定した。

ＭＴＸ５２１胞は、Ｌ　ＴＫ−の細胞から尋られ、Ｖｍｗ６５を発現させている （メンツら、１９８８　（Ｋｍａｔｚ　ａｔａｌ、、１９８８）、滴定結果をＣ Ｖ−１、Ｌ　ＴＫ−、ＭＴ、、Ｘ５の各細胞について、との細胞系列が急性感染 の際の１ｎＬ８１４のプラク分析にとって、又、三叉神経節からの体外移植時の 活性化にとって最も感度が良いかを決定するために比較を行った。ＬＴＫ−の細 胞と比較して、ＭＴＸ５１１胞はＶｍｗ６５を輸送でき（ｐｒｏｖｉｄｅｄ　Ｖ ｍｗ６５　ｉｎ　ｔｒａｎｓ）、１ｎ１８１４と相補性（ｃ　ｏｍｐ　１　ｅｍ ａ　ｎ、ｔ）を示したけれども、ＭＴＸ５Ｎ１胞上の１ｎ１８１４の滴定値は、 ＣＶ−１上より太き（はなかった（データは省略）、さらに、ＭＴＸ５上の１旦 １８工４は明確なプラクを形成しなかった。それで、ＣＶ−１上の場合と比較し てウィルスの滴定の精度が低く、滴定が困難であった。それで、大部分の実験で の指標細胞としてＣＶ−１ｉ１胞を用いた。この分析の感度を高めるために、（ 紫外線照射前の滴定に基づいて）紫外線照射を行ったｔｓＫウィルスを○、ＬＰ ＦＵ／細胞の割合でＣＶ−ＩＩＩ胞に吸収させた。そして、主たる親株からの１ ｎ１８１４と三叉神経節の均質懸濁液からの１ｎＬ８Ｌ４をこれらの細胞上で滴 定した。この方法により、１ユ１８１４のプラク形成能力が３　Ｌｏｇだけ高（ なった（エースら、１９８９　（Ａｃｅ　ｓｔ、ａｌ、、１９８９）、それで１ 粒子／Ｐ　ＦＵの比率が野生型ウィルスと同じになった。

急性感染の際のマウスの感染とウィルスの滴定角膜の乱切後に、生後４−６週間 のメスのマウスＢＡＬＢ／ｃＢＹＪ　（ジャクジン　ラボラトリーズ、Ｊａｃｋ ｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、又は、ＢＡＬＢ／Ｑ　（バーラン　スプ レーグ　ドーレイ、Ｈａｒｌａｎ　ＳｐｒａｇｕａＤａｗｌａｙ）に約１０ＥＳ ＰＦＵ／眼の１７＋、１８１４Ｒ１又は、１ｎ１８工４をａｌ染させた（表１） 、感染後第−日から、マウスの＠部を除くことによって殺していった。無菌状態 で角膜を綿棒の先端で拭き取り、その拭き取った綿棒の先端をＣＶ−１！Ｉ胞と ともに培養した。

三叉神経節と眼を無菌状態で除去し、血清を含まない１ｍｌの培養液中で均質懸 濁状態にした。そして、前記のようにＣＶ−１ｉＪＩ胞上の、又は、ＭＴＸ５１ １胞上の感染性のＨＳＶ−１について滴定した。

体外移植での活性化 Ａ、感染後少なくとも４週間から、潜伏性感染状態のマウスを殺して、三叉神経 節を除去して、ＣＶ、−１ｍ胞の単層とともに培養した。マウスは１７＋、１８ １４Ｒ１又は、±旦１８１４を１０　Ｅ５Ｐ’Ｆ　Ｕ／＠で、又は、同じものを 粒子数表示すると約１０Ｅ［１粒子／＠で感染させたグループからのものである （Ｊ２）、別に。

１０Ｍ４粒子／眼のえ旦１８１４で感染させた。ＩＮＮ痔病理学的効果徴候があ るかどうかについて、単層を毎日検査した。４−６日ごとに神経節を新しい単層 の細胞に移した。そして、活性化を生じるまで、又は、最大３５８間観察された 。活性化後に、ウィルスを含んでいる培養基が取出され、ＲＮＡ抽出のために保 存された。Ｆｌ伏状態の対照泪標準としては、感染後５透口と７週目のマウスか らの神ａｍを、体外移植時に滴定したが、感染性ウィルスについて否定された。

Ｂ、１ｎ１８１４の潜伏状態が定着した時点を決定するために、体外移植での活 性化のために、そして、神ａｍの均質懸濁液内の感染性ウィルスを滴定するため に、１ｎ１８１４で感染させたマウスから、感染後の指定時点で三叉神経節を取 出した。対照ｆｌＩｍｍとして、１７＋を感染させたマウスから三叉神経節を体 外移植し、細胞病理学的効果について、その単層の鳩胞を毎日観察した。

三叉挿ａＳからの潜伏性ウィルスのＤＮＡの抽出と定量化前記のように、ＤＮＡ を三叉神経節から抽出した（ロックと７レイザー　Ｒｏｅｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓ ａｒ、１９８３）、３ｔｔの三叉神経節の各サンプルから５μｇ！ニトロセルロ ーズ・フィルターに移し、６倍にＳＳＣで濡らし、８０”Ｃで２時開加熱し、１ 個所のニック（ｎ　ｉ　ｃ　ｋ）を１訳され、３２ｐの標識を付けられたＨＳＶ −１（Ｆ）成熟ウィルス粒子のＤＭＡプローブでハイブリッド化した。

洗浄後、ＸＡＲ−５（ｊダック）フィルムを用いて、フィルターの放射能写真を 撮って、−７０℃でスクリーンを増感した。

活性化したウィルスからのＤＮＡの抽出活性化したウィルスの個々のプラクを用 いてＣＶ−１１１胞に感染させた。そして、ウィルスの親株を育てた。ピグナラ ティら、Ｐｉｇｎａｔｔｉ　ｅｔａｌ、（１９７９）の示す方法で、ＨＳＶ−１ のＤＮＡに開運したヌクレオプロティンを、感染されている細胞の繍胞質部分か ら得た。ｍｓに説明すると、感染されているＨａを０．２５％）！Ｊ）ン　Ｘ’ −１００，１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ７Ｆ））リス−ＨＣＬ、ｐＨ７，９に よって溶解した（最終濃度１．５Ｘ１０Ｅ７１１胞／ｍｌ）。

そして、室温で１０分間ゆるやかに混合しながら培養した。そこで、ＮａＣ１を 加え、最終濃度０．２Ｍにして、４０℃で１０分間、１００Ｇ？遠心分−を行っ た。上ずみをｌｏｏｕｇ／ｍｌのプロティナーゼ　Ｋと０．２％ＳＤＳを月いて ３７℃で２時間、保温した。ＤＮＡをフェノール、フェノール・クロロフォルム 、りＩ：ＩｅＩフｔルムを用いて抽出し、その後にエタノールで沈澱させた。Ｄ ＮＡの量奄Ａ２６０によって測定した。

ＤＮＡ分析 ＤＮＡをｖ４＠酵素ＢａｍＨＩを用いて切断し、０．８％のアガロース・ゲルの 電気泳動によって分離した。サウザーンｅプロット（ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏ ｔ）をニトロセルローズに移した。ＨＳＶ−１（Ｆ）の制限断片のＢａｍＨＩ　 Ｆでハイブリッド化して、標準の手順で洗浄した（Ｒｏｃｋ　ａｎｄ　Ｆｒａｓ ａｒ。

１９８３）、ＸＡＲ−５（：！ダック）フィルムを用いて、フィルターの放射能 写真を撮って、−７０℃でスクリーン（ＤＵ　Ｐａｎｔ）を増感した。

３２ｐ−の標識の付いたプローブの作成ＨＳＶ−１の全てのＤＮＡ！成熟ウィル ス粒子から分離し、ＣｓＣ１のグラージェント（ｇｒａｄＬａｎｔ）ｍ心分離に よって精製した。）（ＳＶ−１（親株Ｆ）の１１＠断片ＢａｍＨＩ　Ｆをクロー ニングしたＰＢＲ３２２はＢ、　Ｒｏ　ｉ　ｚｍａ　ｎからの好意で送られたも のである（ポストら、Ｐｏ５ｔ　＠セミ１．，１９８０）。

制限酵素はＢａａｈｒｉｎｔａｒ　Ｍａｎｎｈａｉｍ　Ｂｉｏａｈａｍｉａａｌ ＄から購入し、メーカーの勧告通りに泪いた。ＤＮＡプローブは標１手順によっ てニックの■訳奄行った（マニアチスら、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔａｌ、、１９ ８２）、プローブは、５ａｐｈａｄｓｘ　Ｇ−５０を二・スピン・カラム（Ｂａ ａｈｒｉｎｇｅｒ）を通過させることによって組込まれていないヌクレオチドを 分離している。プローブの特定活性は、少なくとも、８Ｘ１０Ｅ７ｃｐｍ／μｇ のＤＮＡであった。

結果 マウスの眼と三叉神経節でのウィルスの急性ｍｓｉと死亡串Ａ、負膜と眼 親株のウィルス１フ＋、又は、復帰突然変異体１８１４Ｒを角膜に接種した後、 感−後５日間で、感染性のウィルスが角膜から集めた一本中で検出された（表１ ）、一方、１ｎ１８１４は、感自ｔ＆ＩＥ！目に角膜からの標本８１中８点で検 出されたが、２Ｅ１１１には、８点中３点で検出されただけであった。１７＋と １８１４Ｈの両方の滴定値が約１０　Ｅ４Ｐ　Ｆ　Ｕ／％に遺した（Ｉｌｌ）、 ｉｌ建値のピークは、それぞれ、感染８１３日と４日で生じた。ａの均質懸濁液 内の１ｎ１８１４の滴定値は　ｍ嚢後１日目に約１０２ＺＰＦＵで、３日までに 検出限界未満に低下した。＠の均貿Ｓ肩液中に存在する感染性の１ｎ１８１４ウ イルスは、ウィルスの複■によるよりはむしろウィルスの接種断片の残りである という可能性を検証するために、マウスに感染させるのに用いたウィルスの親株 な３７℃で培養し、毎日滴定した。３日間のそれぞれの日における、３７℃で培 養した１ｎ１８１４のｉｉＩ定値たＨＳＶ−１の親株ｔｓＫを用いて、Ｖｍｗ６ ５を指標耀胞内に侵入させた（エースら、Ａｃｅ　ａｔ　ａｌ、、１９８９）＊ それによって、１ｎ１８１４の粒子数／ＰＦＵの比が野生型ウィルスの比まで回 復した。マウスに感染させるのに用いた親株の１ｎ１８１４の滴定値はｔｇＫに よって１０００倍に上昇したけれども、感ｖｊｉ後３−５日間の銀の均質ｓｍｍ 中には感染性の１ｎ１８１４は検出されなかった。

Ｂ、三叉神経節 １７＋と１８１４Ｒの三叉神経節でのウィルス複製は、感染後５Ｂ目にピークに なった。その後、ウィルスの滴定値は１１日まで低下した（３！２）、ＣＶ−１ で滴定したところ、この期間を通じて三叉神ａＷｉで感染性の１旦１８１４は検 出できなかった（＠２）、分析の感度を高めるために、１ｎ１８１４を感染させ たマウスからの三叉神経節全体の均質懸濁液に免疫グロブリンを添加しないで、 ６枚の受け皿内でｃｖ−１，４胞と共に培養した。この手順で感染性の１ｎ１８ １４ウイルスが検出されなかった。他の一連の実験で、Ｖｍｗ６５を指１ＩＩＩ ＩＩ胞内に、ｉ）ＭＴｘ５ｉｌｌ！胞（Ｖ　ｍ　ｗ　６’５を本質的に発現して いる、メッツら、Ｋｍａｔｚｅｔａｌ、、　１’９８’８）を使用することによ り、又は、ｉｉ）紫外線で不活性化されたｔ＋＋にウィルスで事前に感染させる ことにより、侵入させた。これらの方法による感集後３−５日の三叉神経節の均 質懸濁液で、感染性の１旦１８１４は検出されなかった。

Ｃ０死亡串 １７＋と１８１４Ｈに感染したマウスの死亡串は同じフ、独立し合った実験で３ ５−６０％の範囲であるけれども、Ｌ旦１８１４に感染した１２７匹のマウスで 死亡したものはなかった。

潜伏性の１７＋、１８１４Ｒ，ｉユニ８１４の体外移植での活性化Ａ、同じＰＦ Ｕで感染したマウス 潜伏性のＨＳＶ−１の活性化について、影響を受けやすい細胞（ＣＶ−１）の単 層に体外移植された神経節を培養し、それらの細胞病理学的効果について毎日検 査することによって、感染から２８−３７日間に分析した。親株１７＋に感染し た全てのマウス（７匹のマウス、１４個の神経節中の１４個）で活性化したこと が、体外移植後５−６Ｂで検出できた（表２）、同様に、１８１４Ｒに感染した マウスの三叉神ａＳでは、体外移Ｍ後５−９日の間に検査した全てのマウスで（ ２４ａの神経節中の２４個で）活性化を生じていた０体外移植後５−１０日の間 に、潜伏性感染状態の全てのマウスで（２０個の三叉神経節のうちの１９個で） 経節の均質Ｓ、＊液のウィルス滴定によって測定した場合、体外移植された潜伏 性感染状態の神経節中に感染性ウィルスは検出されなかった。

Ｂ、同じ粒子数で感染したマウス １７＋（又は１８１４Ｒ）と１旦１８１４の聞では、粒子数／ＰＦ、Ｕの比に３ １ａｇの差があったので、同じＰＦＵのｉｎ１８１４１Ｍ断片は、１７＋又は１ ８１４Ｒと比較して、約１０Ｅ３個多い粒子を含んでいることになる。それゆえ 、我々は、同数の粒子を接種した場合に圭旦工８１４が潜伏的感染状態を形成す る能力ヲ検証しｔ：、１．４５ｘｌＯＥ８ｍの粒子（１，６Ｘ１０Ｅ２ＰＦＵ） 　に感染したマウスでは、１４個中に４個の三叉神経節で体外移植後６−８Ｂで 潜伏性ｇ東び１８Ｌ４Ｒの場合と同等の粒子数で潜伏性ｇ＊状態を形成できる。

しかしながら、Ｌ　４５）ｌＱＥ４個の粒子数（Ｌ、６ＰＦＵ）のＬユ１８１４ に１東した７匹のマウスの三叉神ｍ節からは活性化は認められなかった。

活性化したウィルスのＤＮＡの分析 潜伏性感染状態中に、１ｎＬ８１４のＶｍｗ６５遺伝子の組込み部分が変化しな い＊京になっていることを確認するために、活性化された１７＋、１Ｂ１４１゜ １ｎ１８１４から分離して、ＢａｍＨＩを消化した（ｄｉｒａｓｔａｄ）ＤＮＡ を用いて、サウザーン・プロット（Ｓｏｕｔｈａｒｎ　ｂｌｏｔｓ）を実行した 。

そして、Ｖｍｗ６５壷コーディングしていて、ニック（ｎｉｃｋ）を■訳された Ｈ５Ｖ−１（親株Ｆ）のＢ　ａ　ｍＨｒ制限断片Ｆでハイブリッド化した。

データから１ｎ１８１４のＶｍｗ６５に導入された１２ｂＰの組込み部分が潜伏 ＪＩＩＩ中も、Ｗ！性化期間中も保存されていることが示されている。１ｎ１８ Ｌ４内の颯込み部分ｉ！ＢａｍＨＩの刺隔鄭位を富んでいるので（エースら、Ａ ｃａａｅａｌ、、１９８９）、ｉ旦１８１４内で、また、三叉神鰻節に感染した 上１１８１４からの活性化した分ｍ＊片内で、２−のＢａｍＨｒ刺隅断片（５及 び３ｋｂ）がＢａｒｎＨＩ　Ｆとへイブリッド化された。単一の８ｋｂのバンド が１７＋及び１８１４ＨのＤＮＡとともに存在している。活性化した１７＋、１ ８１４Ｒ，ｉマウスの三叉′Ｉ＃！繰節内の潜伏性ウィルスのＤＮＡの定量化ｉ ！Ｌ１８　Ｌ　４の急性感染中に、三叉神練節でＨ５Ｖ−１の複調が検出されな かったので、これが潜伏性感染状態の闇の神緬節でＬ旦１８１４のＤＮＡの量を 減少させたかどうか決定することが重要になった。ＩＩ１分子想外なことである が、潜伏性ａｉｎＬ’８Ｌ４の［）ＮＡの１は１・７＋スはＬ８１４Ｒのいずれ かの潜伏性ｇ＊中に存在した量と同等で１．１ＯＥ−４から１０トＳ（ｗ／ｗ） 、の範１に減少していた。

これは履胞当たり４から０，４のＨ５Ｖ−１のゲノム当社に相当する。

潜伏状態定着の時点 感染性のｉｎｌ［３１４がマウスの三叉神ａ節で検出されなかったが、潜伏性の 感染状態は定着していたので、１ｎ１８１４は、いつ潜伏状態がはじまるかをＡ 室するユニークな楯金を撮供した。操作厘では、潜伏性の感染状態になった履織 は、１）ＩＩ負性ウィルスが無いことよって、そして、ｉｉ）感染性ウィルスを 活性化する能力によって宅義される（ヒル、Ｈｉｌｌ、１９８５＊Ｆり、１ｎ１ ８Ｌ４でｍ条されたマウスからの三叉神緬節は、感染後１２時間で体外移植壱關 鍮した。

活性化したウィルスは一１１！後２４時間で１４個の神ｍ節中の７傭で検出でき 、−１１１１１３６時１１１１？１０１１中９−で、感染後４８時間ｔ’１４１ １中１３−テ、感嚢後３日目には体外移植された全ての神ｍ節で検出できた。活 性化したウィルス壷検出するまでの輪適時間は、全ての体外ｓＷ１時点について 同じで１体外移植ａ５−１０日の［１１であった。そして、感−Ｉｌｌケ月で外 部魯植した三叉神縁節から活性化したウィルスを検出するのに必要な時間と同じ であった。この期間中の、どの１ｎ１８１４の三叉神ａｍの均質１１１１１Ｉ液 でも、感染性ウィルスは検出で台なか７た（１１２番ＩＩＩ）、これとは対照的 に、１７＋を急性ｇ条されたマウスから体外移植した三叉神縁節には６感桑性ウ イルスが含まれていた（１１２）、そして１体外移植後２−３日以内に細胞病理 学的勅果を生じた。これは６１ｇ１１後１ケ月で潜伏性になっている１７＋のマ ウスから体外移植した神ｍｓからの潜伏性ウィルスの活性化＜５−６Ｂ、前記参 ｆｆ１）より拳かプた。

ａｌ、角膜感染後のウィルλに陽性だった角膜の標本＄ウィルス　Ｌ７＋　１８ １４Ｒｉ口１８１４第−日　８／８　８／８　８／８ 第二〇　８／８　８／８　３／８ Ｓ三日　８／＠　７／８　０７８ 雲四日　７／８　６／８　０／８ 第五臼　４／８　４／８　０／８ 第七日　０／８　０／８　０／８ −注本　ウィルスに陽性の角Ｉｌｌ／全角ＩＩｖ！ＩＮｊ１２．同じＦ’ＦＵ、 又は、同じ粒子数で感染されたマウスからの潜伏性の１ｎ１８１４．１８１４Ｒ ，１７＋の活性化 ウィルス＊ｍ 断片／マウス１７＋　１８１４Ｒ１ｎｌｌｌ１４　１ｎ１８１４　１ｎ１８１４ ＰＦＵ　１．３Ｘ１０Ｅ５　１．３ｒｌＯＥ５　１．３Ｘ１０ＥＳ　、１．θＸ １０Ｅ２　１．８Ｘ１０ＥＯ粒子　７．８Ｘ１０ＥＳ　１．５ｒｌＯＥｆｌ　１ ．２ＸＩＯＥ９　１．５Ｘ１０２８　１．５Ｘ１０Ｅ４活性化廖　１４／＋４　 ２４／２４　１９／２０　４／１４　０／１４脚注本　活性化に陽性反応の五叉 神輪節／共培養のために体外移植された三叉神緬節の総数 ＩＩ　−ａｌ　伝　含む　１ｎ１８１４の実−手１値 １、　ブーＸｔド　ＴＫＬＡＴＥＸ（Ｆ）プラスミドｐＧｘ１６６は、Ｖ、Ｇ、 Ｐｒａｓｔｏｎ博士から得た。それは、チミジン・キナーゼ（ＴＫ）コーディン グ・シーケンス内の独自の５ｓｔＩ部位に組込んだＸｈｏＩリンカ−を持つ、前 記のプラスミドｐＴＫ１　（Ｗｉ　ｌ　ｋｉａら、１９７９）から成りている− 　ＰＧｘＬ８６のベクター（ＰＡＴ１５３）シーケンス内のＨｉｎｄ　ｒ　Ｉ　 ｒｔＩ１１位がＨｉｎｄＩＩＩで分′Ｗ４された・ことにより。

また、、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによるエンド・フィリング（ａｎｄ　ｆｉｌ ｌ　ｉ　ｎ　ｇ）と自己連結により除かれ、ｐＧＸ１ｆｌ１６ΔＨ３を生成して いる。プラスミドｐＦ、ｒ３はＲｉｘａｎｌ１士から得た。それは、ＳＶ４０エ ンヘンサ−／ブロモ−ター領域の上端のＰｖｕ　Ｉ　！！Ｉ１１位にＸｂａｌリ ンカ−を題込むことによつてｐｃＨＩＬｏ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ｔｌら得ら れた。Ｓ、Ｖ４０エンヘンサー／ブロモータニの抑制下でβガラ、クトシダーゼ 遺伝子を４０７３、ｂｐ、のに、ｂａＩ／Ｂａ、ｍＨＩ断片、とり、、ｒｐＦＪ ３からｉｎｌ出し、ｐＵｃ１８　（Ｘｈｏ）＝のＸｂａ、ＩとＢａｍＨＩの鮮位 聞でりｃＩ−、ユングが行われた。プラスミドｐＵｃ１８　（′ｘ：ｈａ）は、 ｘｈｏＩリンカ−をＰＯＣｌ２のＳｍａ　Ｉ部位に組込むことによつてＩＩＩ成 した。１％られたプラスミドはＰＵＣＬ８βｇａＬと名付けられた。

プ９ＸＲドｐＴＫＥＸは、、ｐＧＸｌ　ｆ３６ＡＨ３とｐｕｃｔａβｇ、ａｌか ら、βガラクトシダーゼの遺伝子壷富むｐＵｃ１８βｇａｌのＸｈｏＩ／５ａｌ Ｉ断片をｐＧＸＬ６６ΔＨ３のＸｈ　ｏ　ｌｌｌｌｌ位にりａ−ユングすること によって構成された（図４）、、ＬＡＴプロモーター亀含むことが臂られている ６０５ｂｐのＰｖｕ工断片（バチエラーとオーヘイア、１９９０　（Ｂａｔｃｈ ａｌｏｒ　ａｎｄＯ’　Ｈａ　ｒｅ、１９？Ｏ）を、最初に７４　ＤＮＡポリメ ラーゼで嶋瑠して、端部を鈍感にしてｐＵＣＬＡＴにしたあとで、ｐｃＵ１８の ＨｉｎａＩＩにクローニングした０紙込んだ断片の方向は、ｐＵｃ１８のＨｉｎ ｄｌＩＩ部位からＬＡＴの１写が発生するようになりていた。プラスミドのＰＴ ＫＥＸは、ＸｂａＩとＨｉｎｄｌｒＩで分割された。そして、大きな断片を分離 した。そして、ｐＵＣＬＡＴをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで分割して、小さい断 片を分離した。これら２断片のＤＮＡ（Ｆ）断片瘉お互イニ遮緒り、ｒｐＴＫｒ 、ＡＴＥＸＩ得り（Ｉ１１４）　。

単　ヘルペス・ウィルスの　体１ｎ１８５０のプラスミドのｐＴＫＬＡＴＥＸｔ 、ｌ１ｌｌｆｆ術を用−’テｉ　ｎ　１８　Ｌ　４ノＤＮＡトＢＨＫＩＩ胞に＝ トランスフエクシ菖ン（ｃｏｔｒａｎｓｆａｃｔ、１ｏｎ）された（ブレストン 、Ｐｒａ＊ｔｏｎ＋　１９８１）、子孫のウィルスについては、前記の方法壱用 いて、各鐙階でｐＴＫＬＡＴＥＸ１１込み部分を含むウィルス壱通別するのに５ ｏｕｔｈｅｒｎのハイブリッド化を用いることによっでプラクの多数回のｗｓｉ が行われた（エースら、Ａｃｓ　＠ｔａＬ、ｔ　１９８９）、分離されたプラク から＃ＩＩＬ、た子孫からの細胞とウィルスのＤＮＡをＥｃｏＲＩで分割し、ナ イロン謳のｒＧｓｎａｇｃｒａａｎ　ｐｌｕ＊Ｊの膜に移した。そして、プロー ブとして、ｐＧＸ１６６ΔＨ３の放射能で標識を付けた２５００ｂｐのＥｃｏＲ Ｉ断片を用いた（図４）。組込み部分がないウィルスのＤＮＡは２５００ｂｐの バンドになる。一方、組込み部分を含むウィルスは約５６５０ｂＰと１２５０ｂ ｐの２部分のバンドになる（図４）。ｐＴＫＬＡＴＥＸの組込み部分を含むが、 １ｎ３７℃で培養した。感染後、３時間と６時間に、顧胞を口取し、細胞質の抽 出を行い、前記のようにβガラクトシダーゼの活性を測定した。（マツキー、Ｍ 　ｃ　Ｋａｅ、１９９０）− 結果 プラスミドの　ＴＫＥＸ 遺伝子がＨ５Ｖ−４のゲノムに移動しやすくするために、プラスミドのｐＴＫＥ Ｘを構成した。このプラスミドには、ＳＶ４０のエンヘンサー／プロモーター領 域によってａｍされ、Ｈ８Ｖ−１チミジン・キナーゼ（ＴＫ）遺伝子の＝−ディ ング・シーケンスに組込まれて、それを破壊する原核生物のβガラクトシダーゼ 遺伝子からなる複合遺伝子が含まれている。プラスミドのｐ４ＫＥＸは、制限酵 素のエンドヌクレアーゼによるユニークな分割部位を有しているので、プロモー ター・シーケンス、又は、コーディング・シーケンスのクローニングに特に有用 である。それで、プロモーター・シーケンスをユニークなＸｂａＩとＨｉｎｄＩ ＩＩの部位の間に導入できる。そして、＝−ディング領域をユニークなＨｉｎｄ ＩＩＩとＸｈｏＩの部位の間にクローニングできる。この種の操作が行われると 、得られたプラスミドは、Ｈ３Ｖ−１のＤＮＡ、又は、Ｈ５Ｖ−１の変異体に由 来するゲノムのＤＮＡで、容易に、ＭＷえられる。もし、βガラクトシダーゼの 遺伝子が保持されていれば、Ｘ−ｇａｌを重ねた後で青いプラクを形成できるこ とで組替えの確認ができる。組替えのための選別は、又、Ｈ５Ｖ−１のＴＫによ り抑制生成物に代謝される５−ブコモヂオキシウリジン又はａｃｙｃｌｏｖｉｒ のような化合物の存在する中での移動（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）によって実現 しつる。ｐＴＫＥＸから由来する組込み部分を含む組替えウィルスを特定する別 の方法は、ＤＮＡの制限と、その後の’　５ｏｕｔｈｅｒｎ’　ｂｌ、ｏｔのハ イブリッド化による。

ス之スユびｊし」＝（ｋと二旦入 上記の方法を用いて、バチエラーとオーヘイア、Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ　ａｎｄＯ ’　Ｈａｒｅ（１９９０）が示したＬＡＴプロモーターがｐＴＫＥＸのＸｂａＩ とＨｉｎｄＩＩＩの部位の間に、ＳＶ４０のニンヘンサー／プロモーターの代替 としてクローニングされた。ｐＴＫＬＡＴＥＸ内で、ＬＡＴプロモーターはβガ ラクトシダーゼの発現を制淘する。

１ｎ１８５０のＤＮＡをＥｃｏＲＩで分割し、プローブとして、ｐＧＸ１６６Δ Ｈ３から由来し、放射能で標識を付けた２５００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を付けた 。

５６５０ｂｐと１２５０ｂｐの断片へのハイブリッド化は認められたが、４辷」 工１８１４のＤＮＡに存在する２５００ｂｐのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ工断片へのハイブ リッド化はによる汚染は検出出来なかった。

１ｎ１８５０によるβガラクトシダーゼの発現ＢＨＫの皿層を１ｎ１８５０で感 染させた場合、βガラクトシダーゼの活性の増加が観察された（表３）。これに より、ＬＡＴプロモーターが１ｎ１８５０の中で反応性を有することが示された 。それで、対象となる任意の遺伝子、例えば、治療遺伝子に対するコーディング ・シーケンスを１ｎ１８１４のゲノムに、ＬＡＴプロモーターの制嘗の下で、導 入しうる。これは、ｐＴＫＬＡＴＥＸのＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩの部位の間で 治療遺伝子のコーディング・シーケンスをクローニングし、次に、１ｎ１８５０ のＤＮＡを甫いて新しいプラスミドのＤＮＡを、徂譬えることによって行える。

ｆｆｉ替え要素の予備的選別はＸ−ｇａｌが存在している中で膏いプラクを形成 できないかどうかの選別によって行える。ｆｆｉ替え要素の構造の最終的検証は 、５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌ、ｏｔのハイブリッド化で行える。

表旦・ 胤胞からの抽出物　βガラクトシダーゼの活性（２ｘ１０Ｅ５個の箱胞当たりの 任意に設定した単位）偽の感染　０．３５０ 感染後３時間 １ユ１８５０に感染　２．７９０ 感染後６時間 図面の説明 図１．　急性感染中のマウスの眼の中のＨ３Ｖ−１の滴定値各点は２回の実験に おいて＠条後の指定時間（日）に別個に８回漬定した眼の滴定値の幾何平均を示 す。滴定値は、プラク形成単位／眼（ＰＦＵ／ｅｙｅ）とし図２．　急性感染中 のマウスの三叉碑経節内のＨ８Ｖ−１の滴定値各点は２回の実験において感染後 の指定時間（日）に別個に８回滴定した神経節の滴定値の幾何平均を示す。滴定 値は、プラク形成単位／三叉神経ｆｉ（ＰＦＵ／ＴＧ）として、灯数目盛り上に プロットしである。白抜きの菱形は１７＋株、黒の菱形は復帰突然変異体の１８ １４Ｒ１急性感染中には感染性の１ｎ１８１４（黒の四角形）は検出されなかっ た。

図３．マウスの三叉神＠節内に感染したＨ５Ｖ−１の潜伏性１旦１８１４の定着 時点 ＣＶ−１の単層で庸胞病理学的効果が検出された時点で神経節が活性化に対して 陽性を示した。数字は３件の実験からの累積データである。ｎち、データは各時 点での活性化した神経節のパーセントを示している。１０−１４ｍの神経節／点 。

図４．　ＴＫＬＡＴＥＸのｌ’ｌｉ１ 制限酵素のエンドヌクレアーゼによる分割部位の略号：Ｂｔ　ＢａｍＨＩ　：Ｈ ，ＨｉｎｄＩＩＩ　：Ｒ＋　ＥｃｏＲＩ　；ｓ、５ａｌＩ　；Ｘｂ＋Ｘｂａ工； Ｘｈ、ＸｈｏＩ。

５ｏｕｔｈｅｒｎのハイブリッド化層プローブとして用いたｐ　Ｇ　Ｘ　１６６ ΔＨ３からの２５００ｂｐのＥｃｏＲＩ、及び、ｐＴＫＬＡＴＥＸからの！５６ ５０ｂｐと１２５０ｂｐの断片を示している。

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とフレイザー、エヌ、ダブリュ＋、（Ｄｅａｔｌｙ、Ａ、Ｍ、、５ｐｉｖａｃｋ 。

Ｊ、Ｇ、、Ｌａｖｉ、Ｅ、ａｎｄ　Ｆｒａｓｅｒ、Ｎ、Ｗ、）（１９８７）、Ｈ ３Ｖ−１のゲノムのごく初期の領域からのＲＮＡが潜伏性の感染状態のマウスの 三叉碑経節に存在している。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、８４．３２０４−３２０８゜ ディートリー、エイ、エム０、スピヴアック、ジェイ、ジー０、　ラヴイ、イー ０、オーボイル、ディー、アール、とフレイザー、エヌ、ダブリュー、　（Ｄｅ ａｔｌｙ＋Ａ、Ｍ、、５ｐｉｖａｃｋ＋Ｊ、Ｇ、、ＬａｖｉｙＥ、＋Ｏ’　Ｂｏ ｙｌｅ、Ｄ、Ｒ，ａｎｄ　Ｆｒａｓａｒ、Ｎ、Ｗ、）（１９８８）、マウスの末 梢及び中枢神経系のＭＷａ内の潜伏性単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１の転写 のウィルス・ゲノムの同じ領域に対するマツピング、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２，７ ４９−７５６゜ デッシュメーン、ニス、エル、とフレイザー、ニヌ、ダブリュー、（Ｄｅｓｈｍ ａｎａ、Ｓ、Ｌ、ａｎｄ　Ｆｒａｓａｒ、Ｎ、Ｗ、）（１９８９）、潜伏期間中 の単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１のＤＮＡは、クロマチン槽遣内のヌクレオ ソームと関係がある。Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６３，９４３−９４７゜ディクソン、ア ール、エイ、エフ、とシャツファー、ビー、エイ、（Ｄｉｘｏｎ。

Ｒ，Ａ、Ｆ、ａｎｄ　５ｃｈａｆｆｅｒ、Ｐ、Ａ、）（１９８０）、単純ヘルペ ス・ウィルスのタイプ１のごく初期の蛋白ＶＰＬ７５のコーディングをする遺伝 子のうちで温度に感受性を持つ変異体の漱小欄造のマツピングと機能分析。Ｊ。

ＶｉｒｏＬ、３６，１８９−２０３゜ エフェスタシュー　ニス０、ミンジン、シー０、フィールド、エイチ、ジェイ０ 、アンダージン、ジェイ、アール、とワイルトリー、ビー、（Ｅｆａｓｔａｔｈ ｉｏｕ　Ｓ、、Ｍｉｎｓｏｎ、Ｃ，Ｆｉｅｌｄ、Ｈ，Ｊ、、Ａｎｄａｒｓｏｎ。

Ｊ、Ｒ，ａｎｄ　Ｗｉｌｄｌｙ、Ｐ、）（１９８６）、潜伏性感染状態のマウス とヒトからの単純ヘルペス・ウィルスＩｉ１！有のＤＮＡの検出。Ｊ、Ｖｉ　ｒ ｏ　１゜５７．４４６−４５５゜ フレイザー、エヌ、ダブりニー９、ディートリー、アイ、エム１、メラリック。

ディー、エム０、　マジェリッジ、エム、アイ、と　スビヴアック、ジェイ、ジ ー、（Ｆｒａｓｅｒ、Ｎ、Ｗ、、Ｄｅａｔｌｙ、Ａ、Ｍ、、Ｍｓｌｌｅｒｉｃｋ 。

Ｄ、Ｍ、＋Ｍｕｇｇａｒｉｄｇｅ、Ｍ、１．　ａｎｄ　５ｐｉｖａｃｋ、Ｊ、Ｇ 。

）（１９８６）、潜伏性の）ＩＳＶ−１の分子生物学、ヒトにおけるヘルペス・ ウィルスの感染、シー、ロベスとビー、ロイズマン（Ｃ，Ｌｏｐａｚ　ａｎｄ　 Ｂ。

Ｒｏｉｚｍａｎ）編、レーヴエン　プレス、　ニューヨーク（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒ ａｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）＋　ｐｐ３９−５４゜ゲルスチール、ティー、と　 ロエダー、アール、ジー、（Ｇａｒｓｔｅｒ、Ｔ。

ａｎｄ　Ｒｏａｄｅｒ＋　Ｒ，Ｇ、）−ｊ１９８８）、　ヘルペス・ウィルスの トランスアクティベーティング（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）Ｗ、白は、 転写因子０ＴＦ−１その他の細胞蛋白と相互作用をする。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５．６３４７−６３５１゜ヒル、ティー、ジ ェイ、（Ｈｉｌｌ、Ｔ、Ｊ、）（１９８５）、ｊ！純ヘルペス・ウィルスの潜伏 性、ヘルペス・ウィルスの一項目、ＶＯＬ、３１　ビー、コイズマン（Ｂ、Ｒｏ 　ｉｚｍａｎ）編。プレナム　パブリッシング　コーポレーシゴン、。

ニューヨーク　（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃａｒｐ、、ＮｅｗＹ ｏ　ｒｋ）、ｐｐ　１７５−２４０゜ヤヴイエール、アール、ティー０、　ステ ィーブンズ、ジエイ、ジー０、　ディセット、ブイ。ビー、と　ワグナ−フィー 、ケイ、（Ｊａｖｉｅｒ、Ｒ，Ｔ、ｒＳｔｅｖｅｎｓ、Ｊ＋Ｇ＋、ＤｉｓＳｅｔ ｔｅ、Ｖ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ、Ｅ、に、）（１９８８）、潜伏性感染 状態のニューロン内で単純ヘルペス・ウィルスの転写が多いことは、潜伏状態の 定着にとって重要でない、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１６６．２５４ −２５７゜メッツ、エム１、　オストランゾール、エム０、　シュワルツ、ジエ イ、と　ヅレイパー、ケー、ジー、（Ｋｍｅ　ｔ　Ｚｔ　Ｍ、ｒｏ５ｔｒａｎｄ ｅｒ、Ｍ、Ｔ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｊ、ａｎｄ　ＤｒａｐａｒｐＫ、Ｇ、）（１ ９８８）、ＭＴＸ５：生物学的に活性なＨ３Ｖ−１のＶｍｗ６５蛋白を発現する 顧胞系列、Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６，４７３５゜ノッツ、エフ、ビ ー０、　クック、エム。ニル、と　スティーブンズ、ジエイ。

ジー、（Ｋｎｏｔｔｓ、Ｆ、Ｂ、、Ｃｏｏｋ、Ｍ、Ｌ＋　ａｎｄ　５ｔｅｖａｎ ｓ、Ｊ、Ｇ、）（１９７４）、マウスの眼への接種後の痕疹性ｉ炎の病因、Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１３０＋　１６−２７゜マニアティス、ワイ０、フリッ ツヒ、イー、エフ、と　サンブロック、ジエイ。

（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｙ、Ｔ　Ｆｒ１ｓｔｓｃｈｔＥ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓａｍｂｒ ｏａｋ、Ｊ、）（１９８２）、分子のクローニング：研究所マニュアル、コール ド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−、コールド　スプリング　ハーバ−。

ニューヨーク　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

マツキー、ティー、エイ１．　ヂイズニー、ジー、エイチ１、　工ヴアレット。

アール、ディー、と　ブレストン、シー、エム、（ＭｃＫａｅ、Ｔ、Ａ、、Ｄｉ ｓｎａｙ、Ｇ、Ｈ＋ｔＥｖｅｒｅｔｔ、Ｒ，Ｄ、ａｎｄ　Ｐｒｅｓｔｏｎ、Ｃ＋ Ｍ、）（１９９０）、水痘−帯状庖疹のウィルスのごく初期の主要な遺伝子の発 現の刺鼻、ジャーナル　オブ　ジェネラル　パイロロジー（Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ Ｇｅｎａｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　７Ｌ　８９７−９０６゜マツクナイト、 ジェイ、エル、シー０、　クリステイー、ティー、エム、と　口′イズマン、ビ ー、（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｊ、Ｌ、Ｃ，ｔ　Ｋｒ１ｓｔｉａ、Ｔ、Ｍ。

ａｎｄ　Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｂ、）（１９８７）、単純ヘルペス・ウィルスに感染 した側胞内のα遺伝子の誘導を媒介する成熟ウィルス粒子の！白の、その同じ側 の部位（ｉｔｓ　ｃｉｓ　５ｉｔｅ）で必要とするＮｍＲ白への結合ｅ　Ｐ　ｒ 　。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８４．７０６１−７０６５゜オ ーヘイアケビ−、とゴーディング、ど−、アール、（○’　Ｈａｒｅ、ｐ、ａｎ ｄ　Ｇｏｄｉｎｇ、Ｃ，Ｒ，）（１９８８）、ＩＬ純ヘルペス・ウィルスのＩｌ 岐エレメントと免疫グロブリンのオクタマー（ｏｃｔａｍａｒ）領域が共通因子 で結合していて、両方が成熟ウィルス粒子のトランスアクティベーシゴン（ｔｒ ａｎｇａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）のためのターゲットになっている。セル（Ｃａｌ ｌ）５２．４３５−４４５゜ オーヘイアケビ−、と　ヘイワード、ジー、ニス、（○’　Ｈａｒａ、Ｐ、ａｎ ｄ　Ｈａｙｗａｒｄ、Ｇ、Ｓ、）（１９８７）、３種類のウィルスのコーディン グされたトランスアクティング（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ）因子による、単純ヘ ルペス・ウィルスのごく初期の遺伝子の正と負の調節のための上流側のシーケン ａｎｃｉｎａｒ＋　Ｎ、ａｎｄ　Ｍｉｌａｎｅｓｉ、Ｇ、）（１９７９）、新し い手順により、感染している遡胞から分離した単純ヘルペス・ウィルスのＤＮＡ 。

パイロロジーＶ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　９３．．２６０−２６４゜ポスト、エル 、イー０、＝ンレイ、エイ、ジェイ３、モカースキー、イー、ニス。

と　ロイズマン、ビー、（Ｐｏｓｔ、Ｌ、Ｅ、ｒ　Ｃｏｎ１ａｙ＋　Ａ、Ｊ、ｔ 　Ｍ。

ｃａｒｓｋｉ、Ｅ、Ｓ、ａｎｄ　Ｒａｉｚｍａｎ、Ｂ、）（１９８０）、Ｂａｍ ＨＩ断片のような、単純ヘルペス・ウィルス１の反復性及び非反復性のシーケン スのクローニング、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７７ ．４２０１−４２０５゜ ポスト、エル、イー０、マッケム、ニス、と　ロイズマン、ビー、（Ｐｏｓｔ。

Ｌ、Ｅ、、Ｍａｅｋｅｍ、Ｓ、ａｎｄ　Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｂ、）（１９８１）。

単純ヘルペス・ウィルスのα遺伝子の調ｎ：チミジン・キナーゼとα遺伝子のプ ロモーターの融合によって生じたキメラ遺伝子の発現、セル（Ｃ，ａ、ｌｌ）　 ２４゜５５５−５６５゜ ブレストン、シー、エム、（Ｐｒｓｓｔｏｎ、Ｃ，Ｍ、）（１９７９）、野生型 ウィルス、又は、温度に感受性のある変異体ｔｇＫに感染した趨胞内での単純ヘ ルペス・ウィルスのタイプ１のｍＲＮＡ合成の制御、Ｊ、Ｖｉｒｏ１．２９，２ ７５−２８４゜ ブレストン、シー、エム１、＝−ディングレイ、エム、ジー、とストウ、エヌ。

ディー、（Ｐｒａｓｔｏｎ、Ｃ，Ｍ、、Ｃｏｒｄｉｎｇｌａｙ＋　Ｍ、Ｇ、　ａ ｎｄ　Ｓｔｏｗ、、Ｎ、Ｄ、）（１９８４）−単純ヘルペス・ウィルスのごく初 期の遺伝子の転写を調節するＤＮＡシーケンスの解析、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　ｌ　５ ０ｙ　７０８−７１６゜ ブレストン、シー−エム１、フレーム、エム、シーとキャンベル、エム、イー。

エム、（Ｐｒａｓ　ｊｏｎ、Ｃ＋Ｍ、＋　Ｆｒａｍｅ、Ｍ、Ｃ，ａｎｄ　Ｃａｍ ｐｂａｌｌ、Ｍ、Ｅ、Ｍ、）（１９８８）１１胞の要素と単純ヘルペス・ウィル スのＩｌｌ！！性ポリペプチドの間で形成された複合体はウィルスのと（初期の 遺伝子調節用のＤＮＡシーケンスと結合、セル（Ｃａｔ　ｌ）　５２．４２５− ４３４゜変異体の微小構造のマツピング、ジャーナル　オブ　バイロロジー（Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　３９．１５０＝１６１゜ロック、デ ィー、エル、とフレイザー、エヌ、ダブリｓ＋、（Ｒｏｃｋ、Ｄ、Ｌ。

ａｎｄ　Ｆｒａｓａｒ＋　Ｎ、Ｗ、）（１９８３）、潜伏性感染状態のマウスの 中枢神経系でのＨ３Ｖ−１ゲノムの検出、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）Ｃ！ンド ン（Ｌｏｎｄｏｎ）　３０２，５２３−５２５゜ロイズマン、ビー、とシアーズ 、エイ、イー、（Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｂ、’ａｎｄＳａａ　ｒｓ、Ａ、Ｅ、）（１ ９８７）、単純ヘルペス・ウィルスの潜伏性のメカニズムに対する疑問ｅ　Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃ　ｒｏｂ　ｉｏ　１．４１，５４３−５７１゜ サックス、ダブり二一、アール０、グレーン、シー、ディー１、アッシュマン。

ディー、ピー、と　シ”Ｗッファー、ピー、エイ、（Ｓａｃｋｓ、Ｗ、Ｒ，＊　 Ｇｒｅｓｎａ＋Ｃ，Ｄ、＋ＡｓｃｈｍａｎｒＤ、Ｐ、ａｎｄ　５ｃｈａｆｆａｒ ＋Ｐ、Ａ、）（１９８５）、単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１のＩＣＰ２７は 、必原の調節！白である。Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５５，７９６−８０５゜スビヴアッ ク、ジェイ、ジー、とフレイザー、エヌ、ダブり二一、（Ｓｐｉｖａｃｋ、Ｊ、 Ｇ、ａｎｄ　ＦｒａｓｅｒｅＮ、Ｗ、）（１９８７）、マウスの潜伏性感染中の 朧純ヘルペス・ウィルスのタイプ１の転写の検出、　Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１゜６１ ．３８４１−３８４７゜ スビヴアック、ジェイ、ジーとフレイザー、エヌ、ダブリュー、（５ｐｉｖａｃ ｋ、Ｊ、Ｇ、ａｎｄ　Ｆｒａｓｅｒ、Ｎ、Ｗ、）（１９’８８ａ）、マウスの三 叉神経節内での急性感染中の単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１の潜伏に関連し た転写（ＬＡＴ）の廃現、及び、・潜伏性感染状態の活性化、Ｊ、Ｖｉｒｏ　１ ．６２、ｔ４７９−１４ｓ＋、　− スピヴアック、ジェイ、ジー、とフレイザー、エヌ、ダブり二一、（Ｓｐｉｖａ ｃｋ、Ｊ、Ｇ、ａｎｄ　Ｆｒａｓｅｒ、Ｎ、Ｗ、）（１９８８ｂ）、ＭＬ純ヘル ペス・ウィルスのタイプ１　（Ｈ８Ｖ−１）の潜伏に関連した転写（ＬＡＴ）の 発現、及び、無毒性の変異体ＨＦＥＭでの消滅によって影響をうけた動写：新分 類のＨ８Ｖ−１の遺伝子についての証拠、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２，３２８１−３ ２８７゜ ステイナー、アイ０、スビヴアック、ジエイ、ジー、リレツテ、アール、ピー、 ％ブラウン、ニス、エム９、マクリーン、アイ、アール、サバクーシャープ、ジ エイ、とフレイザー、エヌ、ダブリａ＋、（Ｓｔａｉｎｓｒ、１．．５ｐｉｖａ ｃｋ、Ｊ、Ｇ＋、Ｌｉｒｒｅｔｓｐ　Ｒ，Ｐ＋、Ｂｒｏｗｎ、Ｓ＋Ｍ、、Ｍａｃ Ｌｅａｎｙ　Ａ、Ｒ，ｒ　５ｕｂａｋ−８ｈａｒｐｅ、Ｊ、ａｎｄ　ＦｔａｔＩ ａｔｅ　Ｎ。

Ｗ、）　（１９８９）、単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１　（Ｈ３Ｖ−１）の 潜伏に関連した転写（ＬＡＴ）は、明らかに、潜伏性ｇ条にとって必原ではない 、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、８，５０５−５１１゜ステイナー、アイ０、スビヴアッ ク、ジエイ、ジー０．オーボイル、ディー、アール１、ラビ、イー、とフレイザ ー、エヌ、ダブリａ　−、（Ｓｔ、ａｉｎｓ、ｒｙ　ＬｔＳｐｉｖａｃｋ、Ｊ、 Ｇ、ｖ○’　ＢｏｙＬａｒ　Ｄ、Ｒ，、Ｌａｖｉ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｆｒａｓｓｒ 、Ｎ、Ｗ、）（１９８８）、ヒトの三叉神経節での潜伏性の亀純ヘルペス・ウィ ルスのタイプ１の転写、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．６２．３４９３−３４９６゜ スティーブンズ、ジェイ、ジー０、ワグナ−、イー、ケイ１、ヂヴイーラオ、ジ ー、ビー０、クック、エム、エル、とフェルトマン、エル、ティー、（Ｓｔａｖ ａｎｓ＋Ｊ、Ｇ、＋Ｗａｇｎａｒ、Ｅ＋に、、Ｄａｖｉ−Ｒａｏ＋Ｇ、Ｂ、＋Ｃ 。

ｏｋ、Ｍ、Ｌ、ａｎｄ　Ｆａｌｄｍａｎ、Ｌ、Ｔ、）（１９８９）、ヘルペス・ ウィルスのα遺伝子のｍＲＮＡに対するＲＮＡの相補性は、潜伏性の感染状態の ニューロンで巨立っている。サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３５ｅ　１０５ ６−１０５９゜ スツループ、ダブり二一、ジー８、ロック、ディー、エル、とフレイザー、エヌ 。

ダブリｓ＋、（ＳｔＦｏｏｐ＋Ｗ、Ｇ、ｐＲｏａｋｔＤ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｆｒａ ｓａｒ、Ｎ、Ｗ、）（１９８４）、急性及び潜伏性の感染中のマウスの中枢神経 系の三叉神経系と嗅神経系内の単純ヘルペス・ウィルスの原位置でのハイブリッ ド化による位置特廼、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、５１．２７−３８゜ウィルキー、 エヌ、エム０．クレメンツ、ジェイ、ビー０．ポル、ダブり１−３、マンティ、 ダブり二一、ロンズデール、ディー、とウェイスマン、シー、（Ｗｉ１ｋｉ＠、 Ｎ、Ｍ、ｖ　Ｃｌｓｍａｎｔｓ、Ｊ、Ｂ、ｖ　Ｂｏｌ　ｌｅ　Ｗ、、Ｍａｎｔａ ｉｙＷ、ＬｏｎｓｄａｌｅｐＤ、ａｎｄ　ＷａｉｓｓｍａｎｎｅＣ，）（１９７ ９）、単純ヘルペス・ウィルス１の活性チミジン・キナーゼ遺伝子を含むハイブ リッド・プラスミド、ヌクレイク　アシド　リサーチ（Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａａｉ ｄｓ　Ｒａｓ＠ａｒｃｈ）　Ｌ　８５９−８７７゜図　１ ウィルスの滴定値／眼 図２ ６、補正裏の提出年月日 補正型の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４４２Ｐ″５日廖

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．生体内の神経細胞内でのウィルス複製が無く、潜伏性感染状態を定着できて 、かつ、組込まれた治療遺伝子を発現できて、（ｉ）本質的にトランスインジュ ーシング（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｃｉｎｇ）特性を除去しながら、その一方で、こ の構造的役割を保持し、それによって、生体内での複製を防止するように、Ｖｍ ｗ６５蛋白についてコーディングしている遺伝子内のＤＮＡシーケンスの変化、 蛋白のアミノ酸２８９から４１２の間の位置で、１から７２の塩基対のトランジ ション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）又はトランスバーション（ｔｒａｎｓｖｅｒｓ ｉｏｎ）の変異、３から７２の塩基対のオリゴヌクレオチドの組込み、又は、３ から７２の塩基対の欠落によって実現されるＤＮＡシーケンスの変化、及び （ｉｉ）ウィルスの培養にとって必須でない単純ヘルペス・ウィルスのタイプ１ （ＨＳＶ−１）のゲノムの領域に組込まれた治療遺伝子、及び、そのために、生 体内のニューロン細胞内で治療遺伝子を発現できるブロモ−ター、から成る単純 ヘルペス・ウィルスのタイプ１（ＨＳＶ−１）の変異体。
2. ２．ＤＮＡのシーケンス変更をオリゴヌクレオチドのシーケンスを組込むことに よって達成する請求項１記載のウィルス。
3. ３．治療遺伝子をｉｎ１８１４のウィルス・ベクターに組込んだ請求項１記載の ウィルス。
4. ４．治療遺伝子がチロシン・ヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｈｙｄｒｏ ｘｙｌａｓｅ）の遺伝子である請求項１記載のウィルス。
5. ５．治療遺伝子が、神経成長因子βサブユニット遺伝子、ヒポキサンチン・グア ニン・ホスホリボジル転移酵素（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅｐ ｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎ３ｆｅｒａｓｅ）、β−ヘキソスアミニ ダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）αチェーン遺伝子、及びヒトの免疫不 全ウィルス（ＨＩＶ）のｒｅｆ遺伝子から選択された請求項１記載のウィルス。
6. ６．治療遺伝子が、チミジン・キナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｚｅ） 遺伝子のコーディング・シーケンス内に、又は、フランキング（ｆｌａｎｋｉｎ ｇ）制御領域内に組込まれている請求項１記載のウィルス。
7. ７．治療遺伝子が、 デオキシウリジン・トリフオスフェダーゼ（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐ ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）遺伝子、ウラシル−ＤＮＡ・グリコシダーゼ（ｕｒａｃ ｉｌ−ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子、ＵＳ１遺伝子、ＵＳ２遺伝子 、ＵＳ３遺伝子、ＵＳ４遺伝子、ＵＳ５遺伝子、ＵＳ７遺伝子、ＵＳ８遺伝子、 ＵＳ９遺伝子、ＵＳ１０遺伝子、ＵＳ１１遺伝子、ＵＳ１２遺伝子、ＵＬ５５遺 伝子、ＵＬ５６遺伝子、潜伏に関連した転写（ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａ ｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）をコーディングする遺伝子、ＩＥ１１０遺伝 子から選択した単純ヘルペス・ウィルス（ＨＳＶ）のコーディング・シーケンス 内に、又は、ブランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）制御領域内に組込まれている請 求項１記載のウィルス。
8. ８．治療遺伝子のためのブロモ−ターが潜在に関連した転写（Ｉａｔｅｎｃｙ− ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）の生成を制御するブロモ−タ ーである請求項１記載のウィルス。
9. ９．治療遺伝子のためのブロモ−ターが単純ヘルペス・ウィルス（ＨＳＶ）の神 経繊維（ｎｏｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）遺伝子を制御するブロモ−ターである請 求項１記載のウィルス。
10. １０．ｉｎ１８５０である請求項１記載のウィルス。
11. １１．薬理的に許容できるキャリア内に請求項１のウィルスから成る変異ウィル スを調合するための配合。
12. １２．ブラスミドｐＴＫＬＡＴＥＸ、又は、ブラスミドｐＴＫＥＸ。