JPH05505602A - 血小板因子４によるヘパリン中和 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板因子４によるヘパリン中和 発明の分野 本発明は血小板因子−４（ＰＥ４）によるヘパリンの中和に関する。

発明の背景 心肺バイパスのような先進医療技術の適用は様々な合併症を伴う。短期使用であ っても、血液酸素供給器は血液凝固を阻止するためヘパリンの使用を要するほど 十分な凝固経路の活性化を生じる。

このような外科処置で不変の合併症は、長期放血時間により発現される出血状態 であり、その原因としてはヘパリンを十分に中和する上での失敗と、血小板数の 減少、トロンボキサン合成の刺激及び血小板顆粒成分の放出で発現されるような 血小板の連続的刺激がある（　Ｃｏｌｍａｎ、Ｊ、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇ ｙ、ｖｏＩ　、８Ｇ　（５）　８Ｍａｙ、１９８７　、ｐ、５９５参照）。ヘパ リンの逆転は正常凝固状態を回復して術後血液喪失を抑制するために要求される 。

プロタミンはヘパリンの抗凝固効果を中和するために心血管外科処置の最後に通 常用いられるアルギニンに富むポリペプチド（サケからの３２アミノ酸）である 。しかしながら、プロタミンの使用はいくっがの外科後の合併症と関係しており 、その一部は、術後全身性低血圧、アレルギー反応、激変性肺血管収縮、急性肝 性高血圧、補体活性化、非心臓性肺浮腫、心拍出量減少（後の現象）及び血小板 減少／白血球減少である。

これらの身体的合併症に関して存在する生化学的基礎はほとんど理解されていな いが、但しプロタミンに対するアレルギー反応は詳細に報告されている。通常魚 がら単離されるプロタミンはヒト免疫系により外来タンパク質として認識されつ るため、既にプロタミン接触した患者は後の接触の際に特に危険である （Ｊｕｓｔ　Ｖｉｅｒａ、Ｊ、Ｏ，Ａｍｅｒ、Ｓｕｒｇｅｏｎ、５０．（１９ｇ ４）、１５１（６３）。

加えて、研究では補体活性化を介する非免疫経路が、ヘパリン抗凝固のプロタミ ン逆転に際して観察される急性反応の多くに関係することを示唆している。

プロタミンの使用を回避するため、いくつかのアプローチが提案された。凝固カ スケードを活性化しない物質によるバイパス回路の組立てが非ヘパリン抗凝固製 剤の使用と共に示唆された。プロタミン以外のヘパリン用中和剤も現在探求され ている。Ｈｏｒｒｏｗ、　”ＥｆｆｅｃｔｉｖｅＨｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　 Ｃａｒｄｉａｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ−（心臓外科で有効な止血）、ｃｈａｐ、２． ＥＩＩｉｓｏｎ　及びＪｏｂｅｓ　、　Ｅｄｓ　、印刷中、　１９８８゜現在様 々な研究段階にあるこれらすべての代用品は広範な受諾を得たプロタミンに適切 に代わりうることをまだ示していない。

ＰＦ４はヒト血漿中に５〜２０　ｎｇ／ｍｌの濃度でみられる詳しく特徴付けら れたヘパリン結合タンパク質である。

インビトロ研究において、血漿中におけるＰＦ４は血餅形成に関してヘパリンの 効果を逆転させることが証明された。Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｈａ ｅｍａｔｏｌ　、３８，５６１−５７１（１９７ｇ）。

インビトロ実験ではＰＦ４がラット及びウサギの双方において循環から急速に清 浄化されることを示している。

この急速な清浄化は内皮細胞とのＰＦ４結合のためである。内皮細胞表面で結合 されたＰＦ４は後にヘパリン投与で血流中に放出させることができる。ヒトにお いて、循環ＰＦ４濃度の同様な上昇はヘパリン投与後に観察される。

血小板濃縮物はバイパス手術後ヒトに投与された場合にヘパリン中和活性を有す ることが示されたが、その効果はＰＦ４に基づいていた。Ｗａｌｋｅｒ、Ｂｒ、 Ｈｅａｒｔ　Ｊ、、５２：１２−１４（１９８４）　。

発明の要旨 本発明は、ヘパリン中和量の精製されたＰＦ４又はそのヘパリン結合断片を投与 することによる、外科又は治療処置のような医療処置に関連したヘパリン投与に 起因して望ましくない高レベルの循環ヘパリンを有する哺乳動物におけるヘパリ ンの中和方法を特徴とする。

ヘパリン結合断片とはヘパリン結合領域のアミノ酸６１−６６を含む断片である 。

ユニで用いられる“精製された”という用語は、９５重量％以上のＰＦ４又はｒ ＰＦ４である、即ちそれが天然で会合する他のタンパク質、脂質及び炭水化物を 実質上含有しないＰＦ４又は組換えＰＦ４　（ｒＰＦ４）に関する。

精製されたタンパク質製剤はＰＦ４又はｒ　ＰＦ４の各サブユニットに関してポ リアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを通常生じる。本発明の組成物で用 いられる精製されたＰＦ４又はｒＰＦ４は、アミノ末端アミノ酸配列分析による 判断から純粋であることが最も好ましい。

我々は、常用されるヘパリン中和剤プロタミンによく伴う血小板もしくは白血球 の実質的枯渇又は他の有害効果なしに、ヘパリンで処置された哺乳動物における 正常凝固状態が精製されたＰＦ４の投与後に回復されることを発見した。

本発明の様々な面において：ＰＦ４又は断片はｒＰＦ４又はその断片である。Ｐ Ｆ４又は断片は合成ＰＦ４又はその断片である。ＰＦ４のヘパリン結合断片はア ミノ酸６１−６６を含む。その断片はＣ−４１である。ヘパリン中和量は５０単 位／ｋｇ体重以上で投与されたヘパリンを中和する上で十分な量である。その量 は約０゜１〜２０　ｍｇ／　ｋｇ体重である。該量は約６−ｇ／　ｋｇ体重であ る。

本発明は、ヘパリンとＰＦ４又は断片との複合体を形成させるために精製された ＰＦ４又はそのヘパリン結合断片を患者に投与することにより、血小板又は白血 球の実質的枯渇なしに、ヘパリン投与後にヒト患者で正常凝固状態を回復させる 方法も特徴とする。

本発明は、凝固を阻止するために治療有効量のヘパリンを患者に投与し、しかる 後ヘパリンを中和するため治療有効量の精製されたＰＦ４又はそのヘパリン結合 断片を患者に投与することにより医療処置に際してヒト患者を治療する方法も特 徴とする。

本発明の様々な面において：医療処置は心臓外科を伴う。医療処置は心肺バイパ スを要する。医療処置は臓器移植である。医療処置は腎臓透析である。医療処置 はカテーテル法である。カテーテル法は心臓カテーテル法である。カテーテル法 は血管形成用である。医療処置は血餅形成の予防用である。

好ましい態様の説明 我々は最初に図面の簡単な説明する。

４厘 図１は、硫酸プロタミン注射後における時間の関数として、ヘパリンで処置され たラットにおける血小板数、白血球数及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ ＡＰＴＴ）について示した図である。

図２はｒＰＦ４注射後における時間の関数として、ヘパリンで処置されたラット における血小板数、白血球数及びＡＰＴＴについて示した図である。

図３〜５は、コントロール溶液（図３）、硫酸プロタミン（図４）及びｒＰＦ４ 　（図５）投与後において、ヘパリンで処置されたラットの白血球数、血小板数 及びＡＰＴＴに関する変動について示した棒グラフである。

Ｆ４ １９８９年１月１０日付で出願された同一出願人に係る米国特許出願第２９５， ５５５号及び１９８９年１２月２７日付で出願された第４５１，０２１号明細書 で記載されているように、両出願の全内容は参考のためここに組み込まれるが、 ヒトＰＦ４は大腸菌で組換え法により産生できる。合成遺伝子は公知ＰＦ４アミ ノ酸配列配列づき組み立てられ、組換え融合タンパク質が発現されたが、これは その組換え融合タンパク質から非ＰＦ４アミノ酸の化学的開裂後にヘパリンーア ガロースアフイニティクロマトグラフイーで精製することができた。

そのタンパク質は開裂及び抽出され、抽出物はヘパリン−アガロースクロマトグ ラフィーを用い、汚染タンパク質を０．６Ｍ　ＮａＣ１で除去し、１．２ＭＮａ Ｃ１で希釈することにより精製される。溶出されたＰＦ４はｐＨ４，０の２０Ｉ ＩＭ酢酸緩衝液に透析され、しかる後見に逆相ＥｆＰＬＣで精製される。

上記出願で記載されたように、ヘパリン結合は残基６１−６６を含むペプチドの 領域に基づくことができる。

インビトロ実験 インビトロ実験はＰＦ４が適切な代用品であるか否かの予備評価に関してプロタ ミン及び、Ｐ　Ｆ　４の効果を比較するために実施した。加えて、ヒト血小板由 来ＰＦ４及びｒ　ＰＦ４を比較した。

試験されたすべての性質において、ヒトＰＦ４及びｒＰＦ４は本質的に同一の特 徴を示した。血小板及び組換え大腸菌細胞から単離されたＰＦ４はインビトロで （トロンビンの産生に必須の）因子Ｘａのヘパリン阻害を妨げるそれらの能力に 関して比較した。２種のタンパク質製剤はヘパリンの中和に関して同一の能力を 示し、タンパク質１　ｎｍｏｌはこのアッセイにおいて約０．２５ｎ■０１（０ ，１単位）のヘパリンを中和した。

凝固酵素因子Ｘａのヘパリン阻害を妨げるプロタミン及びｒＰＦ４の能力を比較 した。そのアッセイの詳細はＤｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、１９８３．Ｂｌｏｃｈ ｅｍ、Ｊ、、２０９：４５５で記載されている。

因子Ｘａアッセイにおいて、０．５単位のヘパリンは酵素活性をほぼ９０％阻害 した。低濃度のときｒＰＦ４及びプロタミンの双方は因子Ｘａ活性を一部回復さ せたが、但し１ｎＭ以上の濃度のときｒＰＦ４は因子Ｘａ阻害を妨げる上で明ら かにより有効であった。

因子Ｘａ実験に類似した条件下で行われた実験において、トロンビンは０．２５ 単位のヘパリンにより９９％阻害された。ｒＰＦ４及びプロタミンの双方は１ｎ Ｍでヘパリン阻害を完全に妨げ、それらのモル用量応答に関して有意の差異を示 さなかった。

ヒト血漿中におけるヘパリンの中和も試験した。正常ヒト血漿の活性化部分トロ ンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）は１単位／１のヘパリン添加で約３０秒間のそ の基本レベルから１９５秒間まで増加した。活性化トロンボプラスチンの添加に 先立ちインキュベート中に加えられた場合、ｒＰＦ４及びプロタミンはＡＰＴＴ をその無ヘパリンレベルまで回復させる上で同等に有効であった。

同様の研究及び結果はヘパリン結合領域の残基６１−６６を含むＰＦ４又はｒＰ Ｆ４のある断片を用いて得られる。例えば、前に組み込まれた米国特許出願箱２ ９５゜５５５号明細書で記載されたＰＦ４の４１アミノ酸Ｃ末端ペプチドＣ−４ １は因子Ｘａアッセイを用いてインビトロでヘパリンを中和する能力について証 明した。

インビボ実験 インビボ実験はプロタミン及びＰＦ４のヘパリン中和活性を比較しかつ血小板及 び白血球数に関するＰＦ４の効果を調べるためラットで実施した。

スプラグ・ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｖｌｅｙ）ラット　（２２５ｇ）をベ ンドパルビタールで麻酔し、気管に挿管し、右大腿血管及び頚動脈にカニユーレ 挿入した。ヘパリンを静脈内注入し、しかる後プロタミン又はｒＰＦ４のいずれ がを注入した。動脈血管サンプルはヘパリン注入前、ヘパリン注入直後及び中和 剤注入後いくつかの時点で採取した。コントロールはヘパリン及び実験剤の代わ りにリンゲル液で行った。サンプルは下記測定のために用いた：凝固時間、血小 板数及び白血球数。

図１及び２に関して、データはヘパリンしかる後硫酸プロタミンで注射された場 合（図１）及びヘパリンしかる後ｒＰＦ４で注射された場合（図２）にラットに おける血小板数、白血球数及びＡＰＴＴを比較する典型的実験から示されている 。これらの図において、ヘパリンは１−０で注射し、硫酸プロタミン又はｒＰＦ ４のいずれかはその２分間後（ｔ　＝　２ｍ１ｎ）に注射した。用いられた投与 量はヘパリン１単位／ｇ動物ｖｔ；硫酸プロタミン１μｇ／ｇ動物ｖｔ；及びＰ Ｆ４　７．’Ｂｇ／ｇ動物ｖｔであった。

図１において、プロタミンの効果は約１０分間後にほぼ正常レベルまでＡＰＴＴ の減少をおこすことで示されている。硫酸プロタミンの注射後に白血球数及び血 小板数の有意の減少も観察された。ヘパリン注射の１０分間後及び硫酸プロタミ ン注射の８分間後に、血小板数は８００×１０３／μＬ　（ｔ−０で測定）以上 から５００ＸＩＯ３／μＬ　（ｔ＝１ｃ）＋ｉｎで測定）以下まで低下した。同 様に、白血球数は５Ｘ１０３／μＬ　（ｔ−０）　以上から約３Ｘ１０３／μＬ 　（ｔ−１０ｍｉｎ）以下まで低下した。これらのラットは呼吸問題も有してい た。

ｒＰＦ４の投与もｔ−１０ｍ１ｎ　（ヘパリン注射の１０分間後及びｒＰＦ４注 射の８分間後；図２）で正常ＡＰＴＴレベルの回復により示されるようにヘパリ ンを有効に中和した。ｒ　ＰＦ４によるヘパリンの中和は硫酸プロタミンでおき るような血小板及び白血球の相当な枯渇を生じなかった。血小板数は７００ｘ１ ０３／μＬ（ｔ−０）の初期値から約５００×１０３／μＬ　（ｔ　−１０＋ｇ ｉｎ）まで比較的安定な低下のままであった。白血球数は試験中に約４×１０３ ／μして比較的安定であった。

実験は図１及び２に関して記載されたような条件下でヘマトクリットレベルを調 べるためにも行った。ヘマトクリットレベルの変化はＰＦ４又はプロタミンのい ずれかがヘパリン中和に用いられた場合に観察されなかった。

加えて、ヘパリン処置ラットが低用量のｒ　’Ｐ　Ｆ　４（１５０μｇ７１００ ｇ）で注射される３回の実験を実施した。

これらのラットにおいて、ヘパリンの抗凝固効果は一部中和され、血小板及び白 血球に対する影響は観察されなかった。

図３〜５に関して、コントロール溶液、リンゲル液で注射された（図３）、ヘパ リンしかる後硫酸プロタミンで注射された（図４）及びヘパリンしかる後ｒＰＦ ４で注射された（図５）ラットにおいて、ＡＰＴＴ、血小板数（Ｐ　Ｃ）及び白 血球（ＷＢＣ）数を比較した統計棒グラフデータが示されている。そのデータは コントロールラット、ヘパリンしかる後硫酸プロタミンで注射されたラット５匹 及びヘパリンしかる後ｒＰＦ４で注射されたラット２匹を含んでいた。

図３は哺乳動物リンゲル液の注射後ラットにおけるＡＰＴＴ、ＰＣ及びＷＢＣに ついて示す。サンプルＡは注射前；サンプルＢは注射の２分間後；サンプルＣは 注射の１０分間後；及びサンプルＤは注射の１８分間後に採取した。データは５ 回の実験からの平均値及びＳ、Ｅ、Ｍ。

を表す。

図４はヘパリン（１００単位八〇〇ｇ）　Ｌかる後硫酸プロタミン（１００μｇ ７１００ｇ）の注射後ラットにおけるＡＰＴＴ、ＰＣ及びＷＢＣについて示す。

サンプルＡは注射前；サンプルＢはヘパリン注射の２分間後；サンプルＣはヘパ リン注射の１０分間後及び硫酸プロタミン注射の８分間後：及びサンプルＤはヘ パリン注射の１８分間後に採取した。データは実験からの平均値及びＳ、Ｅ、Ｍ 、を表すが、但し白血球及び血小板はヘパリン注射の２分後及び１８分後に採取 された３つのサンプルのみで計数した。

図４のデータはヘパリン処置ラットに硫酸プロタミン注射後サンプルにおける血 小板及び白血球数の低下について示す。減少はヘパリン注射前に得られたサンプ ルと比較したところ統計学上有意（ｐ＜０．０１）であった。

図５はヘパリンしかる後ｒＰＦ４　（７，５μｇ／ｇ）の注射後ラットにおける ＡＰＴＴＳＰＣ及びＷＢＣについて示す。データは図４に関する前議論で示され たように時間Ａ−Ｄで採取されたサンプルに関する２回の実験からの平均値及び Ｓ、Ｅ、Ｍ、を表す、ｒＰＦ４の注射は血小板及び白血球数に関して統計学的減 少を生じなかった。

図３．４及び５の比較から明らかなように、血小板数はプロタミンがヘパリンを 中和するために投与された場合（図４）と比較してｒＰＦ４がヘパリンを中和す るために投与された場合（図５）に比較的一定である。統計学上、血小板数はプ ロタミン（初期の４８±１２，２％）の存在下で有意に減少したが、但しｒＰＦ ４後は正常のままである（８９±４．９％）。ＷＢＣ数も硫酸プロタミン処置後 に減少した。これらの結果はＰＦ４かい（つかの点でヘパリン中和に関してプロ タミンよりも優れていることを示している。

用途 精製されたｒＰＦ４は厳格に制御された操作で製造され、汚染物質を実質上含有 していない。

ＰＦ４は、例えば１０分間にわたるスロードリップ１、ｖ、注入を用いてヘパリ ン処置後に静脈内投与することができる。ＰＦ４はヘパリンが用いられるいずれ の外科処置においてもヘパリン処置後に、又は、ヘパリンが凝固を回避するため に用いられる場合に治療上用いてよい。

ｒＰＦ４の典型的な有効量は約３．６ｍｇ／ｋｇ体重の有効プロタミン用量に基 づくと約６　、　３５　ｍｇ／　ｋｇ体重である。

しかしながら、実際の投与量はヘパリンの投与量に応じて変わるかもしれない。

他の態様も下記請求の範囲内である。

ＰＣ（１０５／μＬ）　ＷＢＣ（１０３／μＬ）ＡＰＴＴ　（ＳＥＣ） ＰＣ（１０／μＬ）　ＷＢＣ（１０３／μＬ）ＡＰＴＴ　（ＳＥＣ） ＰＣ（１０／μＬ）　ＷＢＣ（１０／μＬ）ＡＰＴＴ　（ＳＥＣ） 要　約　書 噴孔動物における循環ヘパリンは、ヘパリン中和量の精製されたＰＦ４もしくは ｒＰＦ４又はそのヘパリン中和断片を哺乳動物に投与することにより血小板又は 白血球の実質的枯渇なしに中和される。

国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．医療処置に関連したヘパリン投与に起因して望ましくない高レベルの循環ヘ パリンを有する哺乳動物におけるヘパリンの中和方法であって、 上記哺乳動物にヘパリン中和量の精製されたＰＦ４又はそのヘパリン結合断片を 投与することからなる方法。
2. ２．ＰＦ４又は断片がｒＰＦ４又はその断片である、請求項１に記載の方法。
3. ３．ＰＦ４又は断片が合成ＰＦ４又はその断片である、請求項１に記載の方法。
4. ４．ＰＦ４のヘパリン結合断片がアミノ酸６１−６６を含む、請求項１に記載の 方法。
5. ５．断片がＣ−４１である、請求項４に記載の方法。
6. ６．量が５０単位／ｋｇ体重以上で投与されたヘパリンを中和する上で十分な量 である、請求項１に記載の方法。
7. ７．量が約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１に記載の方法。
8. ８．量が約６ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項７に記載の方法。
9. ９．血小板又は白血球の実質的枯渇なしにヘパリン投与後ヒト患者で正常凝固状 態を回復させる方法であって、 上記ヘパリンとＰＦ４又は断片との複合体を形成させるため精製されたＰＦ４又 はそのヘパリン結合断片を上記患者に投与することからなる方法。
10. １０．医療処置に際するヒト患者の治療方法であって、 凝固を阻止するため治療有効量のヘパリンを上記患者に投与する；しかる後 上記ヘパリンを中和するため治療有効量の精製されたＰＦ４又はそのヘパリン結 合断片を上記患者に投与する；ことからなる方法。
11. １１．医療処置が心臓外科を伴う、請求項１０に記載の方法。
12. １２．医療処置が心肺バイパスを要する、請求項１０に記載の方法。
13. １３．医療処置が臓器移植である、請求項１０に記載の方法。
14. １４．医療処置が腎臓透析である、請求項１０に記載の方法。
15. １５．医療処置がカテーテル法である、請求項１０に記載の方法。
16. １６．カテーテル法が心臓カテーテル法である、請求項１５に記載の方法。
17. １７．カテーテル法が診断用である、請求項１５に記載の方法。
18. １８．カテーテル法が血管形成用である、請求項１５に記載の方法。
19. １９．医療処置が血餅形成の予防用である、請求項１０に記載の方法。