JPH05506568A - ウイルス／除草剤耐性遺伝子、その作成法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス／除草剤耐性遺伝子、その作成法および使用 植物のウィルスコートタンパク質を合成することにより、対応するウィルスに対 する植物の耐性が増す。例えば、欧州特許出願第０２４０３３１号明細書には、 このようなコートタンパク質を含有する植物細胞の作成が記載されている。

チューマー（ＴｕＩＩｅｒ）ら［ＥＭＢＯＪ、　６．１１８１　（１９１１１７ ）］は、アルファルファモザイクウィルスのコートタンパク質をコードするキメ ラ遺伝子を用いてタバコおよびトマト植物の形質転換を行った。これらの子孫は 、対応するウィルスによる感染の徴候がかなり減少し、場合によってはウィルス 耐性でさえある形質転換植物である。

これらのウィルス遺伝子は、除草剤耐性遺伝子と組み合わせて、トランスジェニ ック植物の選択を容易にすることができる。同時に、実際の屋外栽培では、これ らの植物の活力がこのウィルス耐性によって増し、除草剤耐性遺伝子により植物 の保護を向上させることが可能である。一般的に、除草剤を適用すると、成長を 刺激する効果があることが観察されている。本発明により形質転換された植物で は、この効果が増強することにより、植物の収率を向上させることができること が示されている。

除草剤耐性遺伝子は、既に開示されている。ドイツ国特許出願公開第３７　１６ 　３０９号明細書には、ホスフィノトリシンに耐性である非真菌様細菌の選択が 記載されている。ホスフィノトリシン耐性遺伝子を、これらの選択体（ｓｅｌｅ ｃｔａｎｔｓ）のＤＮＡ上において大きさが２ｋｂのフラグメントに局在させる ことができる。

ドイツ国特許出願公開第３７　３７　９１８号明細書には、ストレプトミセス・ ビリドクロモゲンス（Ｓｔｒｅｐｔ−ｏｉｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ ｇｅｎｅｓ）のゲノムからホスフィノトリシン耐性遺伝子を合成する方法が示さ れている。遺伝子構造の助けによって形質転換した植物が除草剤に耐性になる遺 伝子構造の組み込みも、同様にそこに記載されしたがって、本発明は、除草剤耐 性と組み合わせたウィルス耐性をコードする遺伝子に関する。

本発明は、以下において、特にその好ましい態様において、詳細に説明されてい る。更に、本発明は、請求の範囲の内容によって定義される。

ウィルス耐性についての遺伝子、特にウィルスコートタンパク質は、宿主生物に おけるｃＤＮＡクローニングにより単離されたウィルスＲＮＡから出発して得る ことができる。このための好ましい出発材料は、キュウリモザイクウィルス、ア ルファルファモザイクウィルスまたはブロム（ｂｒｏｍ）モザイクウィルスのＲ ＮＡである。

除草剤耐性遺伝子は、細菌、例えばストレプトミセスまたはアルカリ土類金属の 細菌から単離することができる。好ましく用いられるのは、ストレプトミセス・ ビリドクロモゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｉｏｇ ｅｎｅｓ）由来のホスフィノトリシン耐性遺伝子（ヴオールレーペン・ダブリュ （ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ、　Ｗ、）　ら、Ｇｅｎｅ　８０．２５−５７　（１９８ ８）　）であり、これは植物での発現のために適当に修飾することができる。

これらの遺伝子を、ベクターｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔを用いてそれぞれの場合にクローニングし、配列決定する（ストラタジーン （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ハイデルベルグ、プロダクト・インフォメーション （Ｐｒｏｄｕｃｔ　ＩｎｆｏｒＩｌａｔｌｏｎ）　）。

遺伝子は、植物プロモーターを有する中間ベクター中でクローニングされる。こ のようなベクターの例は、プラスミドｐＰｃＶ７０１　（ヴエルテンージエイ（ ＶｅｌｔｅｎＪ、）　ら、ＥＭＢＯＪ、　３．２７２３−２７３０　（Ｌ’１ｌ ｌｉ４）　）　、ｐ　Ｎ　ＣＮ（フロムーエイチ（Ｆｒｏｍｍ　Ｈ，）ら、ＰＮ ＡＳ　８２．５８２４−５８２６（１９８５））またはｐＮＯ３（アン・ジー（ ａｎ、　Ｇ、）ら、ＥＭＢＯＪ、　４．２７７−２７８　（ＩＨ５）　）である 。好ましく用いられるのは、３５Ｓプロモーターを有するベクターｐＤＨ５１（ ビエトルツァック・エム（Ｐｔｅｔｒｚａｋ、　Ｍ、）ら、ＮＡＩ？　１４゜５ ８５７　（１９８［ｉ）　）またはＮｏｓプロモーターを有するベクターｐＮＣ Ｎである。

次いで、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、例えば大腸菌ＭＣ１０６１，ＤＨＩ、Ｄ ＫＩ、０Ｍ４８またはＸＬ−１の形質転換の後に、プラスミドミニ調製（ｉｉｎ ｉ−ｐｒｅｐａｒａ↑ｊｏｎ）および適当な制限酵素による開裂のような自体公 知の方法（マニアチス（Ｍａｎ＋ａｔ　Ｉｓ）ら、実験室マニュアル（Ｌａｂ、 　Ｍａｎｕａｌ）　）によって陽性クローンを同定す次に、これらの陽性クロー ンを一緒に、バイナリ−植物ベクターにサブクローニングする。用いることがで きる植物ベクターは、ｐＧＶ３８５０　（ザンブリスク・ビー（Ｚａｍｂｒｉｓ ｋ、　Ｐ、）ら、ＥＭＢＯＪ、２．２１４３−２１５０（１９８３）　）または ｐＯｃＡ１８　（オルスゼウスキー・エヌ（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ、　Ｎ、）　、 ＮＡＲ１８，１０７８５−１０７８２（１９８８））である。ｐＯｃＡ１８が好 ましく用いられる。

Ｔ−ＤＮＡにおけるウィルスコートタンパク質およびフォスフイノトリシン耐性 の発現のための付着ＤＮＡフラグメントを有する植物プロモーターを含む生成バ イナリ−植物ベクターを植物を形質転換するために用いる。

これは、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのような技法 によって行うことができる。好ましく用いられるのは、プロトプラストの共培養 またはアゲロバクチリア（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を用いる葉片の形質転換 である。このために、植物ベクター構造体を、精製ＤＮＡによる形質転換によっ て転移させるか、または大腸菌５Ｍｌ０（サイモン・アール（Ｓｉｍｏｎ　Ｒ， ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌ、　７８４−７９１（１９８３））のよ うなヘルパー株によって、Ｔｉプラスミドを有するＡ２８２のようなアグロバク テリウム−ツメ’７７シエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｔｕｍｅｆａ ｃｌｅｎｓ）中にトリペアレント交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ａａｔｉｎｇ ）を介して媒介される。直接形質転換およびトリペアレント交配は、「植物分子 生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕ ａｌ）Ｊ　（クルーヴア−・アカデミツク・パブリッジ＋　−（Ｋｌｕｖｅｒ　 Ａｃａｄｅｎｊｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）　、ダードレック（１９８８））に記 載の方法で行った。

原則としては、本発明によって構成されたＤＮＡを有するバイナリ−植物ベクタ ーを有する総ての植物を形質転換することが可能である。双子葉植物、特に澱粉 、炭水化物、タンパク質または脂肪をそれらの器官で゛利用可能な量で生産する 、または果実および野菜を生産する、またはスパイス、繊維および産業上有用な 生成物または医薬、染料またはワックスを提供する生産的植物、更には飼料植物 が好ましい。例えば、トマト、苺、アボカド、および熱帯性の果実、例えばパパ イヤ、マンゴ−をつける植物、或いは洋梨、林檎、ネクタリン、アプリコツトま たは桃を挙げることができる。形質転換される植物の他の例には、あらゆる種類 の穀類、アブラナ、鳥アブラナ（ｂｉｒｄ　ｒａｐｅ）などがある。形質転換細 胞を選択媒地を用いて選択し、培養を行ってカルスとし、適当な培地で植物に再 生する（シャイン・エム（Ｓｈａｉｎ　Ｍ、）ら、Ｔｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　７２．７７０−７７０　（１９Ｈ））　；　７　ッ ソン・ジニイ（Ｍａｓｓｏｎ　Ｊ、）　ら、Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　５３ ．１８７−１７８　（１９８７）　；ツァーン・エックス（Ｚｈａｎ　Ｘ、）ら 、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｌｌ、　５５１−５５９　（１９８８） 　；　７　ツクグラナハム・ジー（ＭｃＧｒａｎａｈａｓ　Ｇ、）ら、Ｂｆｏｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＶ　８．８００−８０４　（１９Ｈ）　；ノヴ７　ツク−エ フ・ジェイ（Ｎｏｖａｋ　Ｆ、Ｊ、）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙγ、　 １５４−１５９　（ＩＨ９））。

下記の例により、本発明は更に説明される。

例 １、ウィルスコートタンパク質遺伝子の単離ウィルスを、ロット−ｊＬム（Ｌｏ ｔ、　Ｍ、）ら、Ａｎｕａ　ＩＰｈｙｔｏｐａｔｈ、４．２５−３２　（１９７ ２）の方法の変法によって精製した。アルファルファをアルファルファモザイク ウィルスで感染させ、］４日後に等容の０．５Ｍクエン酸士トリウム（ｐＨ６， ５）１５ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、５％チオグリコール酸中で破砕した。次いで、ク ロロホルム１容を加え、混合物を１２．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離した。上 澄液を１０％ＰＥ０６０００　（ｗ／ｗ）と混合し、慎重に一晩撹拌した。次に 、これを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、５ｍＭホウ酸ナトナトリウム １０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ９）５０ｍｌに再懸濁した。

トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００（最終濃度２％）を加えた後、混合物 を３０分間撹拌し、１９，０００Ｘｇで１５分間遠心分離した。ウィルスペレッ トを１０５．０００ｘｇで２時間遠心分離した後、５ｍＭホウ酸緩衝液／　０　 、　５　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ　Ｈ９、０）に吸収させ、スクロース遠 心分離（５〜２５％）を施した。

ウィルス含有区分を見出すために、グラジェントからのそれぞれの画分をアガロ ースゲル上で分析した。ウィルスＲＮＡをコートタンパク質についてフェノール ／ＳＤＳ抽出（ベデン、ケイ・ダブリュ（Ｐｅｄｅｎ、　Ｋ、Ｗ、）ら、Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ　５３．４１１７−４９２　（１９７３）　）によって精製した。Ｒ ＮＡ成分をジノウス、アール・エイチ（Ｓｙｎｏｕｓ、　Ｒ，Ｈ，）、Ａｕ５ｔ 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｊ、　３１．２５−３７　（１９７８）に記載の方 法によって４０　ｍ　Ｍ　トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７，５）にょる２、８％ポリ アクリルアミドを用いて分画化した。ＲＮＡは、透析管中での電気泳動によりゲ ルから除がれて沈澱した。

ＲＮＡ３またはＲＮＡ４のｃＤＮＡ転写体は、ランゲンライス、ケイ（Ｌａｎｇ ｅｎｒｅｉｓ、　Ｋ、）ら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、Ｂｆｏｌ　。

６、２８１−２８８　（１９８６））に記載のように、鋳型に対する３′−相補 的ヌクレオチドを有する合成オリゴヌクレオチドブライマーであってそれらのそ れぞれが５′末端にＳｍａＩまたはＰｓｔＩ開裂部位を有するものを用いて調製 した。

ｃＤＮＡ合成の反応は、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ イオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ−ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏ ｌ、）　、アウスーヘル、エフ（Ａｕｓｕｂｅｌ。

Ｆ、）ら監修、ジョン・ウィーリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　 ａｎｄ　５ｏｎｓ）に従って行った。

ｃＤＮＡをＳｍａｌ／ＰｓｔＩ切断ｐＵｃ１９ベクターにクローニングした。挿 入物をＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて再度欠失させることが可能であった。

前記の方法は、同様にＣＭＶコートタンパク質遺伝子を単離するのに用いること もできる。

２、　除草剤耐性遺伝子の単離 次の配列を有するホスフィノトリシン耐性遺伝子を、ホスホアミダイト法を用い てシンセサイザーで合成した。

２３４　２４３　２５２　２ｂＬ　２７０２７’？　２Ｅ’８　２９７　′Ｓ０ ６　）１５これは、ヴオールレーペン（Ｖｏｈｌｌｅｂｅｎ）　（Ｇｅｎｅ　７ ０゜２５−３７　（１９１１１ｇ））によって公表されたアセチル−トランスフ ェラーゼ遺伝子の配列を修飾したものである。

同様に、ホスフィノトリシンのアセチル化のため大腸菌におけるＥＭＢＬ３にお いて、ヴオールレーペンが用いたストレプトミセス・ピリドクロモゲネス（Ｓｔ ｒｅｐｔｏ−＊ｙｃｅｓ　ｖｊｒｌｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）からのゲノム ＤＮＡバンクを検討することが可能である。アセチル化生成物は、薄層クロマト グラフィによって極めて容易に分画化することができる。

遺伝子をｐＵｃ１９においてクローニングして、配列決定した。植物での発現は 、５ａｌＩフラグメントとして行った。

３、　除草剤耐性遺伝子とＮｏｓプロモーターとの融合ベクターｐＮＣＮをＢａ ｍ／５ａｌｌで消化し、生成する２、５ｂｐ片を単離した。突出末端を緑豆ヌク レアーゼで消化した。５ａｌＩ消化の後に、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子 を０．　５ｂｐ片として単離し、フレノウで補充した。リガーゼの後、プラスミ ドミニ調製により陽性クローンを単離することが可能であった。配向は、５ａｌ Ｉ／Ｂａｍ消化から明らがであった。

４、コートタンパク質遺伝子と３５５プロモーターとの融合 Ｓｍａ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化した後に、ｐＡＩＲＮＡ３　（コート タンパク質遺伝子挿入物を有するｐＵＣ１９ベクター）からの長さ０．５塩基対 のフラグメントを単離した。突出末端を、緑豆ヌクレアーゼで消化した。ベクタ ーｐＤＨ５１８Ｘｂａｌて切断し、末端をフレノウポリメラーゼで補充した。フ ラグメントとベクターを連結して、ＭＣ１０６１（ｐ３５／ＡＩ）に形質転換し た。同じ構築をＣＭＶ（ｐ３５／ＣＭ）のコートタンパク質について、ｐＣＭ　 ＲＮＡ３を用いて行った。

５、３５５／コートタンパク質遺伝子とｎｏｓ／アセチルトランスフェラーゼ遺 伝子との融合ＥｃｏＲＩ消化の後に、３５Ｓ／コートタンパク質構築物（ｐ３５ ／ＡＩ、ｐ３５／ＣＭ）からの１゜Ｂｋｂ片を低融解アガロースゲルから単離し た。植物ベクターｐＯｃＡ１８をＥｃｏＲＩで消化し、１．３ｋｂｐのＤＮＡ片 に連結した。このｐＯｃＡ／３５ＲＮＡ３ベクターを、フレノウを用いて補充し た。末端のフレノウ処理の後、ｎ　ｏ　ｓ　／　Ａ　Ｃからの２．５ｋｂｐのＨ ＬｎｄＩＩＩ片を、補充されたＣｌａＩ部位に挿入した。

構成：ｐＯＣＡ／ＡｃＡｌ３ ｐＯｃＡ／ＡｃＣＭ３ ６、７グロバクテリアの形質転換 アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｐ　Ｍ　Ｐ　９０　ＲＫ 株を、ＳＭＩ　Ｏによるトリペアレント交配においてｐＯＣＡ／ＡｃＡｌ３また はｐ　ＯＣＡ　／　Ａ　ｃ　ＣＭ　３によって形質転換した。ＳＭＩ　Ｏを一晩 培養したものからの細菌１００μｌの部分と、この構成を有するＭＣ１０６１と 、アゲロバクチリアとを遠心分離し、−緒にしてＬＢ培地３０μｍに懸濁させた 。これらの細胞を、抗生物質なしのＬＢプレート上の小さな円形フィルター上に 置いた。

３７℃で１２時間インキュベーションした後、フィルターを１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　 ｇ　ＣＩ　２の２．５ｍｌで洗浄し、その等全部分をリファンピシン、テトラサ イクリンおよびカナマイシンを含有するＬＢプレート上で選択した。陽性コロニ ーを、遺伝子の３２Ｐで標識したＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって同 定した。

７、アルファルファの形質転換 マートン、ニス（Ｍａｒｔｏｎ、　Ｓ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２７７、１２９− １３０　（１９７９）の共培養法の変法をアルファルファの形質転換に用いた。

無菌植物からの長さ約１ｃｍの茎部分をエルシンマイヤーフラスコ中の無菌ＭＳ 培地４０ｍ１に入れ、アゲロバクチリアの希釈した一晩培養したもの（５ｘ　１ ０７細胞／ｍｌ）１１ｍｌを加えた。インキュベーションを、２５℃で３日間継 続した。次いで、茎部分を滅菌水で３回洗浄し、３００■／ｌのカルバミシリン と１０Ｃ）＊ｇ／ｌのカナマイシンを含有するＭＳ培地上に置いた。完全な植物 体を再生することが可能なカルスが、３週間後に生じた。

８、　植物の試験 ＲＮＡの作成および遺伝子の放射能標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの後 、植物は、アルファルファモザイクウィルスコートタンパク質遺伝子を有するＡ Ｃ遺伝子を発現した。

植物はホスフィノトリシン含有培地上で生育し、アルファルファモザイクウィル スに感染した後に明らかな耐性を示した。

要　約　書 ウィルス／除草剤耐性遺伝子、その作成法および使用 対応するウィルスによる感染の徴候の減少をもたらし、またはウィルス耐性をも たらすウィルス遺伝子、例えばコートタンパク質遺伝子を、植物の形質転換のた めに除草剤耐性遺伝子と組み合わせることができる。

このタイプの組み合わせは、トランスジェニック植物の選択が容易になる。更に 、実際の屋外栽培では、これらの植物の活力がこのウィルス耐性によって増し、 除草剤耐性遺伝子により植物の保護を向上させることが可能である。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　４　年　７　月　３１日 １、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＥＰ　９１１００１３０ ２、発明の名称 ウィルス／除草剤耐性遺伝子、その作成法および使用３、特許出願人 住　所　ドイツ連邦共和国フランクフルト、アム、マイン、８ｏ１ポストフアツ ハ、８００３２０ 名　称　ヘキスト、アクチェンゲゼルシャフト（１）　補正書の翻訳文　１　通 請求の範囲 １、ウィルス耐性と組み合わせたホスフィノスリシン耐性をコードする遺伝子。

２、ウィルスコートタンパク質を特徴とする請求の範囲第１項に記載の遺伝子。

３、ウィルス耐性に関与する遺伝子の部分を、キュウリモザイクウィルス、アル ファルファモザイクウィルスまたはブロムモザイクウィルスのＲＮＡがら出発す るｃＤＮＡクローニングによって得ることができる、請求の範囲第１項または第 ２項に記載の遺伝子。

４、ホスフィノスリシン耐性を特徴とする請求の範囲第１〜３項の１または２以 上の項に記載の遺伝子。

５、ストレプトミセス由来のホスフィノトリシン耐性遺伝子を用いる、請求の範 囲第４項に記載の遺伝子。

６、　請求の範囲第１〜５項のいずれがの項に記載の遺伝子を含む宿主細胞。

７、　請求の範囲第１〜５項のいずれがの項に記載の遺伝子を含む植物、植物細 胞および植物の部分または種子。

８、ウィルス−および除草剤−耐性の再生植物を除草剤で処理し、この処理によ り植物の成長を刺激する効果を生じることを特徴とする、ウィルス耐性と組み合 わせた除草剤耐性をコードする遺伝子によって形質転換した改良された特性を有 する形質転換植物の作成法。

９、　生長期に除草剤を用いることを特徴とする、ウィルス耐性と組み合わせた 除草剤耐性をコードする遺伝子によって形質転換した植物からの収率を増加させ る方法。

１０、ウィルス耐性と組み合わせた除草剤耐性をコードする遺伝子の、これによ る形質転換植物がらの収率を増加させるための使用。

国際調査報告 Ｉｎ＋ａ＋ａｍ＋ｉ＋ｍａｌ　＾ＰｐＩ＝ａ＋ｗｏａ　Ｎ６．　ＰＣＴ／ＥＰ　 ９１１００１３０１ｆｉ１！ｌＩ１ｍｌｉｏａｍｌ＾ＰＰ１ｉｅａ＋ｉｏ＋＋　 Ｈａ、　ＰＣＴ／Ｆア引）００１３０国際調査報告 ＥＰ　９１００１３０

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．除草剤耐性と組み合わせたウイルス耐性をコードする遺伝子。
2. ２．ウイルスコートタンパク質をコードする、請求の範囲第１項に記載の遺伝子 。
3. ３．ウイルス耐性に関与する遺伝子の部分を、キュウリモザイクウイルス、アル ファルファモザイクウイルスまたはブロムモザイクウイルスのＲＮＡから出発す るｃＤＮＡクローニングによって得ることができる、請求の範囲第１項または第 ２項に記載の遺伝子。
4. ４．ホスフィノトリシン耐性をコードする、請求の範囲第１〜３項の１または２ 以上の項に記載の遺伝子。
5. ５．・・・由来のホスフィノトリシン耐性遺伝子を用いる、請求の範囲第４項に 記載の遺伝子。
6. ６．請求の範囲第１〜５項のいずれかの項に記載の遺伝子を含む宿主細胞。
7. ７．請求の範囲第１〜５項のいずれかの項に記載の遺伝子を含む植物、植物細胞 および植物の部分または種子。