JPH10507913A

JPH10507913A - ジャガイモ由来のプロモーター配列

Info

Publication number: JPH10507913A
Application number: JP8513605A
Authority: JP
Inventors: ペダーセン，ヘルフロスト; ジェット，ディナクレイバーグ，; マリアンヌランド，; フィンツーグオッケルズ，
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1998-08-04
Also published as: US6184443B1; EP0787194A1; AU2788195A; GB9421286D0; MX9702881A; WO1996012814A1; CA2202896A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも双子葉類植物の根、塊茎、芽、および塊根組織のいずれか一つのGOIを表現し得るプロモーターを記載する。特に、プロモーターはα-アミラーゼのプロモーターである。

Description

【発明の詳細な説明】ジャガイモ由来のプロモーター配列本発明は、プロモーターに関し、該プロモーターを含む構築物および発現ベクター、ならびに該プロモーターを含む形質転換細胞を包含する。さらに本発明は、該プロモーターを含む植物に関する。植物のような生物の組織において、目的の遺伝子（「GOI」）の発現を指向することが望ましいことが知られている。例えば、最適化されたアミノ酸組成物を有する穀物タンパク質産物を生産すること、そして穀物の栄養価を増加させることは望ましくあり得る。哺乳動物の産物の遺伝子のような非植物遺伝子を発現させるために、穀物を使用する事はさらに望ましくあり得る。後者の産物の例としては、インターフェロン、インスリン、血液因子、およびプラスミノーゲンアクチベーターが挙げられる。しかし、ある組織においてGOIの発現を達成することが望ましくあり得るが、有害な影響が生じ得る様式でGOIが他の組織において発現しないことを確実にすることが時には重要（そうでないかもしれないが）である。さらに、有害な影響が生じない程度まで、生物の正常な代謝（normal metabolism）を狂わさないことが重要である。例えば、植物の葉または根冠における正常な代謝の妨害は、植物の生育阻害を導き得る。 CA-A-2006454は、ジャガイモ塊茎特異的調節領域が配置された発現カセットの DNA配列を記載する。発現カセットは、パタチン（patatin）遺伝子プロモーターを有するパタチン遺伝子を含む。DNA配列は、Agrobacteriumを用いて植物ゲノムに移される。CA-A-2006454に従えば、DNA配列は異種の産物が穀物中に調製される事を可能にする。重要な植物酵素の一つは、α-アミラーゼである。α-アミラーゼは、ジャガイモ塊茎においてデンプンの還元糖への分解を担う経路に関与する。ジャガイモ植物においてα-アミラーゼをコードする遺伝子は、単離されており、そして特徴付けられている。例えば、EP-B-0470145中の教示を参照のこと。簡単に述べると、 α-アミラーゼは、少なくとも５つの個々の遺伝子からなる遺伝子ファミリーによりコードされている。それらの相同性に基づくと、遺伝子は、２つのサブファミリー（一方は３型アミラーゼ（１つまたは複数）、他方は１型アミラーゼ（１つまたは複数））に分類され得る。α-アミラーゼの２つの群は、分子レベルにおいてのみでなく、ジャガイモ植物の異なる組織においても異って発現する。この点に関して、３型α-アミラーゼは、根、塊茎、芽、および茎組織において発現する；一方、１型α-アミラーゼは、芽および茎組織において発現するが、塊茎においては発現しない。本発明は、生物、代表的には植物の特定の組織において、または特定の組織のみにおいて目的遺伝子の発現を指向し得る、植物プロモーターを提供することを試みる。本発明の第１の局面によれば、Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR 1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメントを提供する。 Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントの制限地図を図１、２、および８に示す（これらは後で考察する）。本発明の第２の局面によれば、Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR 1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメントを提供するが、少なくともプロモーターの一部分は不活性化されている。本発明の第３の局面によれば、少なくとも配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメントを提供する。本発明の第４の局面によれば、配列番号４〜17に示す配列のいずれか一つ、好ましくは配列番号４〜16に示す配列のいずれか一つのヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメントを提供する。本発明の第５の局面によれば、Solanum tuberosumから単離された5.5．Kb Eco R1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメントを提供するが、少なくとも配列番号１に示すヌクレオチド配列は不活性化されている。本発明の第６の局面によれば、Solanum tuberosumから単離された5.5．Kb Eco R1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメントを提供するが、少なくとも配列番号２〜 16に示す配列のいずれか一つは不活性化されている。本発明の第７の局面によれば、GOIに融合された本発明よるプロモーターを含む構築物を提供する。本発明の第８の局面によれば、本発明によるプロモーターを含む発現ベクターを提供する。本発明の第９の局面によれば、本発明によるプロモーターを含む形質転換ベクターを提供する。本発明の第10の局面によれば、本発明によるプロモーターを含む形質転換細胞を提供する。本発明の第11の局面によれば、本発明によるプロモーターを含むトランスジェニック生物を提供する。本発明の第12の局面によれば、本発明によるプロモーターの低温（cold）誘導性プロモーターとしての使用を提供する。本発明の第13の局面によれば、本発明のプロモーターおよびアンチセンスα- アミラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を提供する。本発明の第14の局面によれば、植物の塊茎および／または芽および／または根および／または茎において、好ましくは、植物の塊茎においてのみか、または少なくとも植物の塊茎において、GOIを発現するための本発明に記載のプロモーターの使用を提供する。本発明の他の局面は、発現ベクター、形質転換ベクター、形質転換細胞のいずれか一つを発現または形質転換する方法を包含し、トランスジェニック生物内でのインサイチュ発現、ならびにその産物を包含する。本発明のさらなる局面は、インビトロにおいて（例えば、ブロスのような培地において）、およびインビボにおいて（例えば、形質転換生物において）GOIを発現するためのプロモーターの使用を包含する。好ましくは、発現ベクター、形質転換ベクター、形質転換細胞、またはトランスジェニック生物のいずれか一つにおいて、プロモーターは、少なくとも一つの GOIと結合して存在する。好ましくは、形質転換ベクターは、Agrobacteriumに由来する。好ましくは、プロモーターは、トランスジェニック生物のゲノム内で安定に組み込まれている。好ましくは、上記のトランスジェニック生物は植物である。好ましくは、上記植物は双子葉植物である。より好ましくは、上記植物はジャガイモ植物である。本発明の利点は、Solanum tuberosumから単離した5.5．Kb EcoR1フラグメントに対応するプロモーターが、双子葉植物（例えば、ジャガイモ）の根、塊茎、芽、および茎組織のいずれか１つにおけるGOIの発現を指向し得ることである。上記利点は、その変異体、ホモログ、またはフラグメントについても有効である。しかし、さらに驚くべきことは、プロモーター配列の少なくとも一部分が不活性化され得（例えば、短縮される）、そしてプロモーターは、なおGOIを発現し得るという事実である。より驚くべきことは、部分的に不活性化された（例えば、短縮された）プロモーター配列が、根、塊茎、芽、および茎組織との組み合わせよりも、１つ以上の特定の組織（例えば、塊茎組織のみ）においてGOIの発現を指向し得るという事実である。この点に関して、Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応する改変プロモーター（図３を参照して-691位の上流（すなわち、５’ 末端に向かって）に不活性化されたヌクレオチド配列を含む）は、根、塊茎、芽、および茎組織のいずれにおいても発現を生じないことを見出した。そのような改変プロモーターの例としては、-692位の下流のヌクレオチド配列のみを含む改変プロモーター（例えば、配列番号２〜３）が挙げられる。しかし、Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するプロモーター（（図３を参照して）-1535位の上流に不活性化されたヌクレオチド配列を含む）は、塊茎組織においてのみ発現を生じることが見出された。これらのタイプのプロモーターの例としては、-1535位の下流のヌクレオチド配列のみを含むプロモーターが挙げられるが、ここでプロモーターは、（図３を参照して）-691位の上流に少なくともヌクレオチド配列を含む（例えば、配列番号４〜17、特に、配列番号６〜17、さらに特に、配列番号６〜16）。さらに、残りのタイプのプロモーターは、これらのプロモーターが少なくとも配列番号１を包含した場合、高発現収率が塊茎組織において観察されたことが見出された。従って、GOIの塊茎特異的発現のための少なくとも配列番号１に示す配列を含むプロモーター配列の好ましい例としては、配列番号４〜17に示す配列、より好ましくは、配列番号６〜17に示す配列、さらにより好ましくは配列番号６〜16に示す配列が挙げられる。さらに、Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するプロモーター（（図３を参照して）-1535位の下流に不活性化されたヌクレオチド配列を含む）は、根および／または芽および／または茎組織において発現を生じることが見出された。これらのタイプのプロモーターの例としては、（図３を参照して）-1535位の上流のヌクレオチド配列のみを含むプロモーターが挙げられる。さらに、Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するプロモーター（不活性な配列番号１を含む）は、根および／または芽および／または茎組織においてのみ発現することが見出された。これらのタイプのプロモーターの例として、配列番号１を含まないプロモーターが挙げられる。特に好ましい配列は、配列番号４〜16である。塊茎特異的発現のような組織特異的発現は、多くの理由のために特に有利である。第１に、GOI（以下で定義する）は、特定の組織のタイプにおいて発現される。これは、GOIが目的の生物に対して、内因性のアンチセンスである場合、特に有利である。なぜなら、他の組織におけるアンチセンス配列の発現は、有害であり得るからである。第２に、特定の組織（１つまたは複数）に関連する病気に対して、生物に耐性を与える薬剤をコードするGOIを発現させることが可能である。例えば、GOIは、一般的な瘡痂病（通常塊茎組織に影響する）に対する毒素となり得る。第３に、GOIが、例えば、人間または動物に対して利益のある所望の化合物（例えば、所望の食糧、または有益な薬学的効果を有する酵素）である場合、大量のGOIの発現産物が達成され得る。さらに、その産物は容易に回収し得る。第４に、本発明によるプロモーターの使用により、特定の部位で生物の代謝を変化させる（例えば、塊茎におけるデンプン量のレベルを増加させる、または塊茎において改変デンプンを生産する）ために、適切なヌクレオチドを発現させ得る。さらに驚くべき利点は、本発明のプロモーター、特に、本発明の第１の局面のプロモーターは、低温誘導性であることである。（すなわち、約０℃〜12℃の条件、約４℃で発現を導く）。従って、このプロモーターは、特にEP-B-0470145（配列番号18として示す）のα-アミラーゼ遺伝子（または、その活性フラグメント）の発現のように、低温条件でいくつか有益である条件においてGOIを発現するために非常に有用である。より好ましくは、GOIは、配列番号19として示すような、α-アミラーゼ遺伝子（または、その活性フラグメント）に対してアンチセンスなヌクレオチド配列である。本発明の各局面の高度に好ましい実施様態は、自然環境における天然のプロモーターを包含しない。用語「プロモーター」は、当該分野の標準的意味において使用される（例えば、遺伝子発現のJacob-Monod理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位）。本発明のプロモーターは、GOIを発現し得る。上記のヌクレオチド配列に加えて、本発明のプロモーターは、プリブナウボックス、またはTATAボックスのような保存領域をさらに含み得る。プロモーターは、さらに、GOIの発現のレベルに影響する（例えば、保持、増進、減少）ための他の配列を含み得る。例えば、適切な他の配列として、Sh1-イントロンまたはADHイントロンが挙げられる。他の配列としては、温度、化学的、光、またはストレス誘導性エレメントのような、誘導性エレメントが挙げられる。転写または翻訳を増強するための適切なエレメントが存在し得る。後者のエレメントの例は、TMV 5'リーダー配列（Sleat Gene 217［1987 ］21 7-225；およびDawson Plant Mol．Biol．23［1993］97を参照のこと）である。本発明のプロモーターはまた、Amy 3プロモーター、またはAmy 351プロモーター、またはα-Amy 351プロモーター、またはα-Amy 3プロモーターと呼ばれ得る。さらに本発明はまたプロモーターまたはエレメントの組み合わせを包含する。例えば本発明のプロモーター（例えば、塊茎特異的プロモーター(上記参照のこと)）は、茎特異的プロモーター(上記参照のこと)と組み合わせて使用され得る。他の組み合わせも可能である。例えば、本発明のプロモーター（例えば、茎または塊茎特異的プロモーター）は、根プロモーターおよび／もしくは葉プロモーターと組み合わせて使用され得る。本発明に関して、用語「対応する」は、プロモーター配列が必ずしもSolanum tuberosumに由来する必要がないことを意味する。例えば、プロモーターは合成的に調製され得る。それは他の供給源に由来し得る。用語「変異体」、「ホモログ」、または「フラグメント」は、得られるヌクレオチド配列が、発現系（例えば、本発明に記載の形質転換細胞またはトランスジェニック生物）においてプロモーターとして作用する能力を有する場合、配列からの１つ(またはそれ以上)の核酸の任意の置換(substitution)、変化、改変、置換(replacement)、欠失または配列への付加を含む。特に、用語「ホモログ」は、得られるヌクレオチド配列がプロモーターとして作用する能力を有する場合、構造および／または機能に関して相同性を含む。配列相同性に関して、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90 %の相同性、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは98%の相同性がある。用語「不活性化された」は、図８の完全なプロモーターの発現パターンが改変されるが、部分的に不活性化されたプロモーターはなおプロモーターとして機能するという意味で、部分的不活性化を意味する。しかしながら、上述したように、改変されたプロモーターは、図８の完全なプロモーターの少なくとも１つ(しかしすべてではない)の特異的組織において、GOIを発現する能力がある。それゆえ、本発明のこの特定の局面にともなって、不活性化された部分を有するプロモーターは、なおプロモーターとして機能し得る(それゆえなおプロモーターと呼ばれる)が、このプロモーターは、GOIが図８に示した完全なプロモーターによって発現されるような１つまたはそれ以上の組織（しかしすべてではない）において、 GOIを発現する能力がある。部分的な不活性化の例は、ヌクレオチド配列の一部が、例えばRNAポリメラーゼによって認識されないようにプロモーター配列の折りたたみパターンを変えること、またはヌクレオチド配列の一部と種を結合させることを包含する。プロモーターを部分的に不活性化する別のかつ好ましい方法は、それを短縮し、それのフラグメントを形成することである。別の方法は、RNAポリメラーゼがその一部または別の一部と結合し得ないように、配列の少なくとも一部を変異させることである。従って、本発明の好ましい実施態様について、Solanum tuberosumから単離された5.5Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列、あるいはその変異体、ホモログ、またはフラグメントを含有するプロモーターが提供されるが、このプロモーターは短縮されている。用語「短縮された」は、図８に示されるプロモーターの短縮形を包含する。従って、本発明の好ましい実施態様について、Solanum tuberosumから単離された5.5Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列、あるいはその変異体、ホモログまたはフラグメントを含有するプロモーターがまた提供されるが、このプロモーターは少なくとも配列番号４から１６に示されるいずれか１つの配列のヌクレオチド配列を含有していない。さらに、本発明の好ましい実施態様について、Solanum tuberosumから単離された5.5Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列、あるいはその変異体、ホモログまたはフラグメントを含有するプロモーターがまた提供されるが、このプロモーターは少なくとも配列番号１として示される配列を含有していない。用語「構築物」（それは例えば用語「接合体」、「カセット」、および「ハイブリット」と同意語である）は、直接的または間接的にプロモーターに付着されているGOIを包含する。間接的な付着の例としては、イントロン配列（例えばSh- 1イントロンまたはADHイントロン）のような適切なスペーサー基がプロモーターとGOIとの間にある場合である。同様のことが、本発明に関して直接的または間接的付着を包含する用語「融合された」について当てはまる。各場合において、この用語は、野生型遺伝子プロモーターおよび野生型プロモーターならびに天然環境においてそれら両方が存在するときと通例結びつけられる野生型αアミラーゼ遺伝子の天然の結合を包含していないことが、非常に好ましい。その構築物はまた、例えばそれが転移されている植物細胞において遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含有し得、または発現し得る。例えば植物に使用され得る様々なマーカーが存在する（例えばマンノース）。マーカーの他の例は、抗生物質耐性（例えばG418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性）を提供するマーカーを包含する。本発明に関して、用語「GOI」は、目的とする任意の遺伝子を意味する。GOIは、当の生物(例えば植物)に対し外来または天然のいずれかである任意のヌクレオチドであり得る。 GOIの典型的な例は、代謝および異化のプロセスを改変するタンパク質および酵素をコードする遺伝子を包含する。例えば、GOIは、食物または作物のような植物へ加えられた栄養価を与えるタンパク質であり得る。典型的な例は、より望ましいアミノ酸組成（例えば非トランスジェニック植物より高いリジン含量）を有する非栄養因子および植物タンパク質の形成を阻害し得る植物タンパク質を包含する。 GOIはまた、食物加工において使用され得る酵素（例えばキモシン、タウマチン、およびα−ガラクトシダーゼ）をコードし得る。GOIはまた、病原体耐性を導入または増加させる因子をコードし得る。GOIはまた、関連する組織に存在する天然転写物の発現を改変するためのアンチセンス構築物であり得る。 GOIはまた、動物またはヒトにとって有益な非天然植物化合物をコードし得る。例えば、GOIは、治療用化合物である、インシュリン、インターフェロン、ヒト血清アルブミン、ヒト成長因子および血液凝固因子のいずれか１つのような薬学的に活性なタンパク質または酵素をコードし得る。この点については、形質転換された細胞および生物は、例えば塊茎から容易に回収可能な望ましい化合物の許容量を調製し得る。好ましくは、GOIは、高い栄養価を有するタンパク質、有害な毒素、アンチセンス転写物（例えばパタチンのアンチセンス転写物）、ADPグルコースピロホスホリラーゼ（例えばEP-A-455316参照）、αアミラーゼ（例えばEP-B-0470145参照）、プロテアーゼアンチセンス、またはグルカナーゼのいずれか１つをコードする遺伝子である。好ましいGOIは、EP-B-0470145に記載のαアミラーゼ遺伝子に対するアンチセンス配列である。本発明に関して、用語「生物」は、本発明のプロモーターを活性化し得る任意の生物、例えばアミラーゼ（例えばαアミラーゼ）生産生物を包含し、この生物は植物、藻類、真菌類、および細菌類、ならびにそれらの細胞株を包含する。好ましくは、この用語は植物またはその細胞、好ましくは双子葉植物、より好ましくはジャガイモを意味する。本発明に関して、用語「トランスジェニック生物」は、本発明に従う発現可能な構築物またはそのような構築物の生産物のいずれかを含有する生物を意味する。例えばトランスジェニック生物は、本発明に従うプロモーターの制御下で外因性ヌクレオチド配列（例えば本明細書中に記載のGOI）を；または本発明に従う部分的に不活性化された（例えば短縮型）プロモーターの制御下で天然ヌクレオチド配列を含有し得る。用語「細胞」、「組織」、および「器官」は、細胞、組織、および器官、ならびに生物の中にあるときを包含する。本発明に従うプロモーターの１つのクラス／タイプについて、その用語は、ジャガイモ塊茎細胞、組織または器官、および／またはジャガイモ根細胞、組織または器官、および／またはジャガイモ芽細胞、組織または器官、および／またはジャガイモ茎細胞、組織または器官を意味する。好ましくは、用語は単にまたは少なくともジャガイモ塊茎細胞、組織または器官を意味する。好ましくは、発現可能な構築物は生物のゲノムに取り込まれる。用語「取り込まれた」は、好ましくはゲノムへの安定した取り込みを含む。 GOIに関して用語「ヌクレオチド」は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、およびRNA を包含する。それは好ましくはDNA、より好ましくはcDNAを意味する。用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロでの発現能力を有する構築物を意味する。用語「形質転換ベクター」は、１つの種から別の種へ（例えばE.coliプラスミドから植物細胞へ）の転移能力を有する構築物を意味する。本発明のプロモーターがEP-B-0470145およびCA-A-2006454に開示されていないとしても、これら２つの文書は本発明を実行するのに使用され得る技術のタイプについてのいくつかの有用な背景的解説を提供する。これらの背景教示のいくつかは次の解説に含まれる。遺伝子改変植物の構築における基本的原理は、挿入された遺伝物質の安定した維持を得るように、植物ゲノムにおいて遺伝情報を挿入することである。遺伝情報を挿入するためにいくつかの技術が存在し、２つの主な原理は遺伝情報の直接導入およびベクター系の使用による遺伝情報の導入である。一般的な技術の総説はPotrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol［1991］42:205-225）およびChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）の論文に見出され得る。ゆえに、ある局面では、本発明はベクター系に関し、その系は本発明に従うプロモーターまたは構築物を有し、そして植物（例えばSolanaceae科の植物、特に Solanum属の植物、その中でも特にSolanum tuberosum）のゲノムにプロモーターまたは構築物を導入し得る。ベクター系は１つのベクターを含有し得るが、好ましくは２つのベクターを含有する；２つのベクターの場合、そのベクター系はバイナリーベクター系と通常称される。バイナリーベクター系はさらに詳細にGynheung Anら（1980）,バイナリーベクター,Plant Molecular Biology Manual A3,1-19に記載されている。所定のプロモーターまたは構築物による植物細胞の形質転換のために広範囲に使用される系は、Agrobacterium tumefaciens由来のTi−プラスミドまたはAgrob acterium rhizogenes由来のRi−プラスミドの使用を基礎にしている（Anら(1986 ),Plant Physiol.81,301-305およびButcher D.N.ら(1980),Tissue Culture Meth ods for Plant Pathologists,D.S.IngramsおよびJ.P.Helgeson編,203-208）。いくつかの異なるTi-およびRi-プラスミドが構築されており、それは上述の植物または植物細胞構築物の構築に適している。そのようなTi-プラスミドの制限されない例はpGV3850である。本発明のプロモーターまたは構築物は、T-DNAボーダーのすぐ周囲の配列の分解を避けるように、好ましくはT-DNAの末端配列間でまたはT-DNA配列に隣接して Ti-プラスミドへ挿入されるべきである。それは、これらの少なくとも１つの領域が植物ゲノムへの改変されたT-DNAの挿入に不可欠であると考えられるからである。上記の説明から理解されるように、本発明のベクター系は好ましくは、植物に感染するのに必要な配列（例えばvir領域）およびT-DNA配列の少なくとも１つのボーダー部分を含有するものであり、そのボーダー部分は同じベクター上で遺伝子構築物として位置付けられる。さらに、ベクター系は好ましくはAgrobacteriu m tumefaciens Ti-プラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes Ri-プラスミドまたはその誘導体である。それらプラスミドは周知であり、そしてトランスジェニック植物の構築物に広く使用されていて、これらのプラスミドまたはそれらの誘導体を基礎にする多くのベクター系が存在するからである。トランスジェニック植物の構築において、プロモーターまたは構築物はまず、ベクターが複製し得、そして植物に挿入される前にその操作が容易である微生物内で構築され得る。有用な微生物の例はE.coliであるが、上記の性質を有する他の微生物も使用され得る。上記で定義したベクター系のベクターがE.coliにおいて構築されているとき、もし必要であれば、適切なAgrobacterlum株（例えばAgr obacterium tumefaciens）中に転移される。従って、本発明のプロモーターまたは構築物を有するTi-プラスミドは、本発明のプロモーターまたは構築物を有するAgrobacterium細胞を得るように、適切なAgrobacterium株（例えばA.tumefaciens）に好ましくは転移され、続いてDNA が改変される植物細胞に転移される。 Agrobacteriumによる植物組織の直接感染は、広く使用されており、そしてBut cher D.N.ら(1980)、Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,D.S．In gramsおよびJ.P.Helgeson編,203-208に記載されている簡単な技術である。Potry kus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)およびChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)もまた参照のこと。 CA-A-2006454に報告されたように、大量のクローニングベクターが利用可能であり、それはE.coliの複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含有する。ベクターは、例えばpBR332、pUCシリーズ、M13 mpシリーズ、pACYC 1 84などを含有する。このようにして、構築物またはプロモーターはベクターの適切な制限位置へ導入され得る。含有されるプラスミドはE.coliの形質変換のために使用される。E.coli細胞を適切な栄養培地で培養し、そして次いで収集し、そして溶菌する。次いでプラスミドを回収する。分析の方法としては、一般的に配列分析、制限分析、電気泳動法、およびさらに生化学−分子生物学的方法が使用される。各操作後、使用したDNA配列を制限処理し、そして次のDNA配列と連結し得る。各配列は同一のまたは異なるプラスミドにクローン化され得る。植物における望ましいプロモーターまたは構築物の各導入方法の後、さらなるDNA配列決定が必要であり得る。例えば形質転換のために、植物細胞のTi-またはRi-プラスミドが使用される場合、少なくともTi-およびRi-プラスミドのT-DNAのライトボーダー、ならびに、しかししばしばライトボーダーおよびレフトボーダーが、導入された遺伝子の領域を隣接させるように、結合され得る。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は、集中的に調べられていて、そしてEP 120 516;Hoekema, The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.、Alblasserd am,1985,第５章；Fraleyら,Crit.Rev.Plant Sci.,4:1-46、およびAnら,EMBO J.( 1985)4:277-284にも詳しく記載されている。植物組織のAgrobacteriumによる直接感染は、使用され得る別の簡単な技術である。典型的には、感染される植物を傷つける。これは例えば、剃刀で植物に切り目を入れること、または針で植物に穴をあけること、または研磨剤で植物をこすることによって行う。次いで、この傷にAgrobacteriumを（例えば溶液中で）接種する。あるいは植物の感染は植物の特定の部または組織（すなわち葉、根、茎または植物の他の部の一部）で行われ得る。次いで、接種された植物または植物部を適切な培養培地で生育し、そして成熟植物に生長させる。植物細胞が構築されるとき、これらの細胞は、周知の組織培養法（例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなどの必要な成長因子を与えた適切な培養培地でその細胞を培養することによる）に従って増殖および維持され得る。形質転換細胞の遺伝子改変植物への再生は、細胞または組織培養物からの植物の再生についての公知の方法（例えば、抗生物質を用いて形質転換シュートを選択すること、および適度な栄養、植物ホルモンなどを含有する培地でシュートを継代培養することによる）を用いて達成され得る。それゆえ要約すると、本発明は、プロモーターおよびまたそのプロモーターを含有する構築物に関する。特に、本発明は、細胞／組織／生物（例えば植物、特に双子葉植物（例えばジャガイモ）の１つまたはそれ以上の特異的組織）におけるGOIの発現のためのプロモーターの使用に関する。特により好ましい実施態様において、本発明は、部分的に不活性化された（例えば短縮された）３型α−アミラーゼプロモーターに関する。本発明はまた、双子葉植物（特にジャガイモ植物）の塊茎組織においてGOIを発現する部分的に不活性化された遺伝子プロモーターの１つのクラスの適用に関する。次のサンプルは、ブタペスト条約に基づき、以下の認定された寄託機関（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)at 23 St Machar Drive,Aberdeen,Scotland,AB2 1RY,United Kingdom）に1994年8月 26日に寄託されている： DH5α-gPAmy 351(寄託番号NCIMB 40682)。このサンプルは、ジャガイモ（Solanum tuberosum）から単離されたEcoR1 5.5 ゲノムDNAフラグメントを含有するプラスミドpBluescript（その概略マップについては図７を参照のこと）を含有するE.Coli細菌ストックである。EcoR1 5.5フラグメントは、プロモーター領域およびジャガイモα−アミラーゼ遺伝子の構造遺伝子の５’非翻訳配列の一部を含有する。プラスミドは、pBSベクター（Short ら[1988]Nuc.Acid.Res.16:7583-7600）のポリリンカーにEcoR1 5.5kbジャガイモフラグメントを挿入することにより形成された。プロモーターはEcoR1での酵素消化によりプラスミドから単離され得、そして次いで典型的な分離技術（例えばゲル）により抽出され得る。次のサンプルは、ブタペスト条約に基づき、以下の認定された寄託機関（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)at 23 St Machar Drive,Aberdeen,Scotland,AB2 1RY,United Kingdom）に1994年10 月20日に寄託されている： DH5α-pJK4（寄託番号NCIMB 40691）。このサンプルは、プラスミドpJK4（後述する）を含有するE.coli細菌(DH5α-) ストックである。次に、実施例のみを用いて本発明を説明するが、実施例では以下の図を参照する。図１は制限酵素地図を示す；図２は制限酵素地図を示す；図３は本発明のプロモーターのヌクレオチド配列を示す；図４は図２の配列に作製されたいくつかの欠失の表現図である；図５は図２の配列に作製されたいくつかの欠失の表現図である；図６は一連のプライマー配列を示す；図７はpBlueScript KS(2.96 kb)の地図およびpBlueScript M13(3.2 kb)の地図を示す；図８は制限酵素地図である；図９はpJK4の制限地図である；そして図10はpEPLの地図である。さらに詳細に、図１はジャガイモ品種のSaturnaから単離されるゲノムクローンgPAmy 351の制限酵素地図であり、矢印はプロモーターの位置を、黒塗りの棒はコード配列の位置を示し、H=HindIII、E=EcoRI，S=SalI、ATG=α-アミラーゼコード配列の開始コドンであり、そして星印は5.5 kb EcoRIフラグメントの位置を示す。図２はα-Amy３プロモーターの配列地図であり、矢印は配列反応の範囲を示し、HEフラグメントの位置をプロモーターの欠失のシリーズの５'配列決定部分と共にＢに示し、そして個々のフラグメント（図４参照）の名称を矢印の上に示し、ATG＝α-アミラーゼコード配列の開始コドンであり、そして、機能解析について選択された欠失フラグメントをアスタリスクで示す。図３はα-Amy３プロモーターの一部のヌクレオチド配列であり、制限部位を太字で表し、TATA、CCAATおよびATG部位には下線を付し、提唱されたCAP部位の位置および非翻訳リーダー配列を示し、そして二本の強調線の間に挟まれた166 bp ヌクレオチド配列（すなわち、ヌクレオチド-857位〜ヌクレオチド-691位）を配列番号１として表す（後述参照）。この166 bpヌクレオチド配列は”デルタ”フラグメントもしくは配列と呼び得る。図４および図５は、α-Amy３プロモーターの２つの欠失のシリーズを示し、図５の欠失のシリーズは機能解析に使用した；図６は本発明での使用のための一連のプライマー配列を示し、ここでUni＝T７プライマーおよびRev＝T３プライマーである。さらに詳細に、図３のヌクレオチド配列は図１のプロモーター配列の一部であり（以下に記載）、そしてα-アミラーゼの構造遺伝子の一部であり、それはこの順で図８の一部である。このヌクレオチド配列の一部は添付の配列表に示す配列の一部を形成する。図３のヌクレオチド配列は配列番号17のように反復される。図８はプラスミドgPAmy351の表現図である。強調部分はジャガイモ(Solanum t uberosum)から単離されるEcoRI-SalIフラグメントであり、このフラグメントは図１に示されるフラグメントと同一である。EcoRI-SalIフラグメントはEcoRI5.5 kbフラグメント（サブクローンEco 5.5と呼ぶ）を含み、図面の下部に示された線で示す。EcoRI 5.5 kbフラグメントはプロモーター領域およびジャガイモα- アミラーゼの構造遺伝子の５'の非翻訳配列の一部を含む。以下の制限酵素部位を図８に示す：E:EcoRI，Ha:HaeIII、Sp:SspI、H:HindIII、P:PvuI、S:SalI。さらに推定CAATおよびTATAボックスおよびATG開始部位を示す。イントロンは白抜きの棒で、エキソンは黒塗りの棒で示す。 EcoRI 5.5フラグメントはpBluescript M13-プラスミド（図７に示す）またはp BSK-プラスミド（これも図７に示す）にクローン化される。便宜上、チャート１は添付の図に示す参照配列と添付の配列表に示す配列との相関関係を示す。以下の実施例では、以下の原料および方法を用い、それぞれ以下の通りに行った。材料および方法植物材料根組織は開花期のジャガイモ（Solanum tuberosum、cv．Saturna）植物から採収した。根は薄く切って直接液体窒素に入れ、10〜15gの部分は使用するまで-80 ℃で保管した。菌株 LBA4404： Agrobacterium tumefaciens株Ach５(4)のストレプトマイシン耐性の派生体中に、無力化（disarmed）pTiAch５プラスミドpAL4404を含有する。ファージおよびプラスミド λEMBL3: 参考文献（５）を参照 pBR327: 参考文献（６）を参照 pBS+、pBS-: 参考文献（７）を参照 pBSK+、pBSK-: 参考文献（７）を参照 pBI101、pBI121: 参考文献（８、９）を参照培地およびプレート L-Broth（LB）培地：１ｌ当たり：５ｇの酵母エキス、５ｇのNZアミド、５ｇのNaCl，５ｇのバクト−ペプトン。オートクレーブで処理する。 LB-プレート： LB培地に１ｌ当たり15gのBactoアガーを加える。オートクレーブで処理する。プラスチックのペトリ皿に注ぐ（25 ml/皿）。 Amp-プレート： LBプレートに１ｌ当たり35mgのアンピシリンを、オートクレーブで処理後に加える。 AXI-プレート： LBプレートに１ｌ当たり35mgのアンピシリン、120mg のIPTG（イソプロピルチオガラクトシド）、40mgのXgal（ジメチルホルムアミドに溶解）を、オートクレーブで処理後に加える。 Xgal：５−ブロモ−４クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド。 Kan-プレート： LBプレートに１ｌ当たり50mgのカナマイシンを、オートクレーブで処理後に加える。 YMB培地：１ｌ当たり：0.66gのK₂HPO₄-3H₂O。0.2gのMgSO₄。0.1gのNaCl。10.0gのマンニトール。0.4gの酵母エキス。pH7.0に調整する。オートクレーブで処理する。液体MBa培地：１ｌ当たり：MS塩（MurashigeおよびSkoog basal salt(10)、Sigma）。20gのスクロース。NaOHでpH5.7に調整する。固体MBa培地：液体MBa培地に0.8% Difcoアガーを加える。 MBa co：固体MBa培地に１ｌ当たり0.5mg のt-Zeatin（トランス異性体、Sigma）および 2.0mgの2,4 D(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、Sigma)を加える。固体MBb培地：固体MBa培地に、１ｌ当たり20gのスクロースの代わりに30gのスクロースを加える。水：材料および方法において用いられる水は、使用前に常に蒸留し、オートクレーブで処理した。高分子量ジャガイモゲノムDNAの単離高分子量のゲノムDNAを得るために、FischerおよびGoldberg（11）に記載の手順に本質的に従った。この手順は、最初の核の単離、およびその後の核DNAの調製を包含する。 10〜15gのSaturnaの根の組織を液体窒素中で粉末状にし、そして100mlのＨ緩衝液中でホモジナイズした（１×Ｈ緩衝液(11):100ml 10×HB,250ml 2M スクロース,10ml 100mM PMSF,1ml β-メルカプトエタノール,5ml Triton X-100，634ml H₂O。pHを9.5に調整する）。使用の直前にβ-メルカプトエタノールを添加する。10×HB：40 mMスペルミジン、10mMスペルミン、0.1mM Na-EDTA、0.1mM Tris、 0.8mM KCl、10N NaOHを用いてpH9.4〜9.5に調整。PMSF:エタノール中に溶解したフェニルメチルスルホニルフルオリド）。再懸濁した植物材料を70μmのナイロンフィルター（Nitexフィルター,あらかじめ１×Ｈ緩衝液中で湿らしておく）を通して濾過した。得られた濾液を２本の遠心分離ボトル（Sorvall GSA）に移し、そして4000r.p.m.で20分間、４℃で核をペレット化した。上清を棄て、そしてペレットを一本のチューブあたり20mlの1×Ｈ緩衝液を添加することによりおだやかに再懸濁し、次いで、チューブを慎重にゆらした。再び、4000r.p.m.で20分間、４℃で核をペレット化し、上清を取り除き、そしてペレットを10mlの１×Ｈ緩衝液中におだやかに再懸濁した。上清をプールし、そして20mlの冷溶解緩衝液（溶解緩衝液：2% サルコシル、0.1M Tris、0.04M Na₂-EDTA）を、溶液をおだやかに攪拌しながら滴下して添加した。溶解緩衝液の最後の一滴を添加した直後に、 0.972g CsCl/mlの溶液を上記の溶液におだやかに攪拌して加えた（溶液は今や室温にあるべきである）。得られた溶液を45分間、10krpm、４℃で遠心分離した。上清を、上部に浮いている、またはペレットの妨害となるすべてのタンパク質の残渣を回避して、パスツールピペットを用いて慎重に取り除いた。上清の容積を測定し、そして0.2mgエチジウムブロミド／mlを添加した。DNA溶液をクイックシールポリアロマーチューブにおだやかに注ぎ、これを次いでシールした。このチューブを18℃でBeckman VTI 65ローター内で、40kr.p.m.で38時間遠心分離した。UV光下でゲノムのバンドを5-mlシリンジにつけた15〜18ゲージの針で抜き取り、そして５mlのポリアロマーチューブにおだやかに注いだ。次いで、このチューブを50mM Tris-HCl(pH9.5),20mM Na₂-EDTA中の1.57g/mlの CsCl溶液で満たした。チューブあたり75μlのエチジウムブロミド(５mg/ml)を添加した。このチューブを18℃でVTI 65ローター内で、46kr.p.m.で17時間遠心分離した。長波長UV光下でゲノムのバンドを抜き取り、そしてエチジウムブロミドをCsCl飽和イソプロパノールで抽出した（７から８回）。 TE緩衝液(１×TE:10mM Tris-HCl,1mM Na₂-EDTA pH8.0)中で４℃、18時間、３回交換して透析することにより、CsClをDNAより取り除いた。高分子量のジャガイモゲノムDNAをさらに沈殿させず、４℃で保存した。ジャガイモゲノムライブラリーの構築 cv Saturnaの根より上記のように高分子量ジャガイモゲノムDNAを調製した。D NAの質を、制限酵素消化およびゲル電気泳動により試験した。このゲノムDNAをSau3Aで部分消化し、これにより作製されたフラグメント（９〜23 kb）をλEMBL３ベクター（４）のBamHI部位に挿入した。約1.1×10⁶の独立した単離物を、プレーティングし、そして増幅して永久の（permanent）ライブラリーを形成した(12)。このライブラリーをα−アミラーゼ遺伝子についてスクリーニングするために、プラークハイブリダイゼーションを使用した。ライブラリーのスクリーニングジャガイモゲノムライブラリーのスクリーニングを、本質的に引用文献13および14に記載のように行った。増幅させたゲノムライブラリーのpfu/ml(pfu:プラーク形成単位)を、スクリーニングの前に２連で決定した。感染可能細胞（PKL17 またはLE392）を、0.2%スクロースおよび10mM CaCl₂を含む30mlの新鮮なL-Broth 培地中に細胞を接種することにより調製した。細胞を37℃で４〜５時間培養した後、0.1容量の冷CaCl₂を添加し、そして使用するまで氷上においた。適切な数の pfuになるようにファージ緩衝液中で希釈した100μlのファージを（１×ファージ緩衝液：10mM Tris-HCl,pH 7.5,10mM MgCl₂,20mM NaCl）、25〜100μlの新鮮に作製した細胞（実際の細胞数に依存する）と混合し、そして37℃で15〜20分間インキュベートした。この懸濁液を３mlの保温した（42℃）10mM MgCl₂を含む0. 8〜1％のトップアガーと混合し、そして乾燥したLBプレート上に播いた。ゲノムライブラリーのスクリーニングには、22×22cmのLBプレート（３〜４時間37℃で乾燥させた）を使用した。各々のプレートにはy約２×10⁵のプラークが含まれ、それらを１mlの感染可能細胞（上記のように調製した）と混合し、そして37℃で20分インキュベートした。次いで、この混合物に25mlの保温しておいた（42〜45℃）10mM MgCl₂を含む0.3％のトップアガロースを添加し、そしてこの溶液を新鮮な乾燥したLBプレートに注ぎ込んだ。この大きいLBプレートを（上下逆さにせずに）37℃で一晩インキュベートした。プラーク由来のファージをHybo nd Nフィルター(Amersham)へ２連でトランスファーした。１〜２時間プレートを４℃に置いて、アガロース層がフィルターに付くことを防いだ。使用する直前にプレートを氷上に置き、そしてフィルターを用いる作業中に氷上に置いておいたままにした。２枚のHybond Nフィルターおよびプレートに、フィルターの方向を定めるために印をつけておいた。第１のフィルターをプラーク上に45秒間おいた；次いで、変性緩衝液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)上に７分間浮かべ（この際ファージ面を上にした）、次いで中和緩衝液（0.5M Tris-HCl(pH7.4) ,３M NaCl)上に３分間２回浮かべ、そして最後に２×SSC(1×SSC:0.15M NaCl,0. 015クエン酸ナトリウム)で洗浄した。フィルターを風乾し、そしてUV架橋することによってファージDNAをメンブレンに固定した。第２のフィルターを、第１のフィルターの後に、同じプレート上に120秒間おき、次いで第１のフィルターのように処理した。これらのフィルターを、供給業者(Amersham)の説明書によるHy bond Nメンブレンのプロトコルに従ってプラークハイブリダイゼーションに用いた。第１および第２のHybond Nメンブレンの両方由来のＸ線フィルムを、両方のフィルター由来のシグナルが互いに合うように方向付けた。ポジティブプラークをメスで切り出し（１×１cm片）、そして１mlのファージ緩衝液に沈めた。ファージを含んだチューブは、２〜３滴のクロロホルムを添加した後、密閉して（パラフィルム）４℃で保存した。プラークを含むプレート（ 22×22cm）を、蓋に一片の（クロロホルムを）浸した濾紙をおいて保存した。プレートをまた、プラーク面を上にして密閉して４℃で保存した。ポジティブプラークのさらなる精製は、ストックチューブ（１×１cm片を含む）の新たに調製した希釈物を細胞とともに、10mM MgCl₂を含む１％の保温した（42℃）トップアガーとともに円形LBプレートに播いて実施した。新たなフィルターを、22×22cmプレートについて上記した手順に従って、Hybo nd Nを用いて作製した。ポジティブシグナルを示したプラークをパスツールピペットチップをプレートに突き刺し、そしてそれを500μlのファージ緩衝液中へ移すことにより単離した。新たな一連の希釈物を作製し、プレートにまき、そしてポジティブプラークが精製されるまでそれぞれのフィルターをハイブリダイズさせた。ファージは、１滴のクロロホルムを含む500μlのファージ緩衝液中で、またはプレートライゼートより単離したファージとしてのいずれかで密閉して４℃で保存した。プレートライゼートストックを（14）に記載のように作製した。組換えλDNAの単離大規模調製は、CsCl勾配上で組換えファージDNAをバンド化させる行程を包含する、(14)に記載の方法に従った。以下のような２つのバージョン（A,B）の小規模調製を使用した。 A)LE392細胞を、0.2％マルトースおよび10mM MgCl₂を含むLB培地に接種し、そして37℃で一晩増殖させた。細胞を、Sorvall遠心分離機にて10分、４℃で遠心分離することによりペレット化し、そしておだやかに１容量の冷10mM MgSO₄に再懸濁した。細胞は使用するまで４℃で保存した。プレート由来の５つのシングルプラークを500μlのファージ緩衝液へ移し、そして２時間〜２時間半４℃においた。チューブをボルテックスした後、100μlの遊離したファージを200μlの新鮮に調製したLE392細胞と混合した。あるいは、プレートライゼート由来の50〜100 μlの遊離したファージを細胞と混合した。ファージおよび細胞を37℃で20分インキュベートし、次いであらかじめ暖めておいた（37℃）20mM MgCl₂および30mM Tris-HCl（pH7.5）を含んだ25mlのLB培地を加え、そして37℃で一晩振とうしながらインキュベートした。20mM MgSO₄および30mM Tris-HCl（pH7.5）を含んださらなる10mlのあらかじめ暖めておいたLB培地を加え、そして混合物を１〜２時間 37℃で振とうしながらインキュベートした。澄明な溶解（数滴のクロロホルムを補助のために添加した結果）後、その溶液を8000r.p.m.で10分４℃で遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、もし細胞残渣を取り除く必要があればもう一度遠心分離した。次いで、組換えλDNAを供給業者の説明書(15)に従ってQiagenカラムを使用して精製した。 B)この手順は、一晩培養物の最初の遠心分離の後までA)のとおりであった。上清を新たなチューブに移し、そして１μg/mlに対応するようにDNaseを加えた。溶液を37℃で30分インキュベートし、次いでファージ緩衝液中で混合された１容量の冷20％PEG、２M NaClを添加し、そしてこの混合物を氷上で１時間インキュベートした。このファージを10krpmで20分、４℃で遠心分離することによりペレット化した。このPEGペレットを400μlのファージ緩衝液中に再懸濁し、そしてエッペンドルフチューブへ移した。１μlのRNase(10mg/ml)を加え、そしてチューブを37℃で30分インキュベートした。次いで、８μlの0.25M Na₂-EDTA（pH8.0 ）および4μlの10％SDSを加え、チューブを68℃で15分さらにインキュベートした。この混合物を室温になるようにして、次いで等量のTE-緩衝液(１×TE:10mM Tris（pH7.5）,１mM Na₂-EDTA)飽和フェノールを使用して、DNAを抽出した。飽和フェノール-クロロホルムの等量混合物を使用して上部の水層を抽出し、そして最終的なクロロホルム抽出を行った。上層を新たなチューブに移し、そして溶液を0.3Mの酢酸ナトリウムとし、そして２〜３容量の冷エタノールを加えた。DN Aの沈殿を−20℃で一晩保存し、５分間遠心分離することにより達成し、そしてペレットを50〜100μlのTE緩衝液に再懸濁した。組換えファージDNAの量と質は、制限酵素消化およびアガロース（0.8〜１％）ゲル電気泳動で試験した(16)。プラスミドDNAの調製プラスミドの調製は、EP-B-0470145に記載の通りであった。特に、プラスミド DNAの小規模調製は以下のように行った。プラスミドを有する細菌株を、添加したアンピシリン(35μg/ml)を含む２mlのL-Broth(LB)培地中で一晩増殖させた。操作を1.5mlのエッペンドルフチューブ内で行い、そして遠心分離をエッペンドルフ遠心分離機中で４℃で実施した。一晩培養物由来の細胞を２分間遠心分離することにより採集し、１mlの10mM Tris-HCl(pH8.5)、50mM EDTAで洗浄し、そして２分間遠心分離した。ペレットを150μlの15％スクロース、50mM Tris-HCl( pH8.5)、50mM EDTAに、ボルテックスして再懸濁した。50μlの４mg/mlのリゾチームを加え、そして混合物を30分間室温で、そして30分間氷上でインキュベートした。400μlの氷冷した水を加え、そして混合物を５分間氷上に置き、70〜72℃ で15分間インキュベートし、そして15分間遠心分離した。上清に75μlの5.0M過塩素酸ナトリウムおよび200μlのイソプロパノール（イソプロパノールは室温で保存した）を加え、そして混合物を15分間４℃で遠心分離した。ペレットを300 μlの0.3M酢酸ナトリウム中に懸濁し、そして２〜３容量の冷エタノールを加えた。沈殿は、５分間−80℃または、−20℃一晩のいずれかで保存し、５分間遠心分離し、バキュームで２分間乾燥させ、そして20μlの水にペレットを再溶解することにより達成した。収量は５〜10μgのプラスミドDNAであった。プラスミドDNAの大規模調製は、単純に小規模調製を10倍にスケールアップして行った。15ml corexチューブ中で作業し、全ての成分を10倍スケールアップした。遠心分離を、Sorvall冷却遠心分離機中で４℃で行った。上記からの変更のみを以下に示す。70〜72℃のインキュベーションの後は、遠心分離は17,000rpm で30分間であった。イソプロパノールを加えた後と、冷エタノールを加えた後は、遠心分離は17,000rpmで15分間であった。最終的なプラスミドDNAのペレットを水に懸濁し、そしてエッペンドルフチューブに移し、次いで短くスピンして残渣を取り除いた。上清を0.3M酢酸ナトリウムに調整し、そして２〜３容量の冷エタノールを加えた。ペレットを40μlの水に再懸濁した。通常収量は20〜28μgのプラスミドDNAであった。非常に純粋なプラスミドDNAを得るためには、スケールアップした方法由来の2 00〜300μgの単離したプラスミドDNAを、CsCl勾配上でバンド化した。固形のCsC lを水と混合し(１：１w/v)、そして0.2mg/mlのエチジウムブロミドを加えた。この溶液をクイックシールポリアロマーチューブおよびプラスミドDNA（固形のCsC lと混合した（１：１w/v)）に注ぎ込んだ。チューブを満たし、シールして、Bec kman VTI 65ローター中で48,000rpmで16〜18時間、４℃で遠心分離した。遠心分離はブレーキを用いないで停止させた。バンド化されたプラスミドDNAをシリンジを用いてチューブより引き抜き、そしてエチジウムブロミドをCsCl飽和イソプロパノールで７〜８回抽出した。CsClは10mM Tris-HCl(pH8.0)、１mM EDTA中で4 8時間、３回緩衝液をかえながら透析により取り除いた。DNAは0.3M酢酸ナトリウムに調整し、そして２〜３容量の冷エタノールを加えることにより沈殿させた。 E.coliからの小規模のプラスミドの調製の後に、通常LiCl沈殿を行って、DNA 溶液からRNAを取り除いた。小規模で調製したプラスミドDNAを100μlの蒸留水に溶解した。１容量の５M LiClを加え、そして混合物を−20℃で30分間インキュベートし、その後12,000rpmで15分間、４℃で遠心分離した。上清を新たなエッペンドルフチューブに移し、そして２容量のTE緩衝液または水を加えた。2.5容量の96％エタノールでの沈殿を、−80℃で10分間または−20℃で一晩のいずれかで保存することにより達成した。DNAは12,000rpmで15分間、４℃で遠心分離することにより沈殿させ、バキュームで２分間乾燥させ、そして18μlのTEまたは水に再溶解させた。制限酵素消化従ったプロトコルは、EP-B-0470145に記載のプロトコルであった。特に、全ての制限エンドヌクレアーゼはBiolabs，AmershamまたはBoehringer Mannheimより入手し、そして供給業者の説明書に従って使用した。１単位の酵素を１μgのDNA に対して使用し、そしてインキュベーションは２時間であった。緩衝液を、二重消化の際に、容量を変化させるかまたは酵素の説明書に従って必要な成分を加えることによって変化させた。DNA の標識ランダムプライマーDNAラベリングキット（Boehringer Mannheim）を供給業者の説明書に従って使用した。簡潔に述べると、２μlのDNAフラグメント(20〜50n g)を８μlの水と混合し、そして95℃で10分間インキュベートしてDNAを変性させた。短くスピンして、氷上においた。次いで、それぞれ１μlのdGTP、dATPおよびdTTP、２μlのリアクションミックス(reactionsmix)ならびに５μl(約50μCi dCTP³²)を加えた。１μlのKlenow酵素が反応を開始させ、そしてチューブを37℃ で30分間インキュベートした。次いで氷上に置いた。標識されたDNAフラグメントはELUTIPカラム(Schleicher＆Schuell)を用いて精製した。カラムは３mlの高塩濃度緩衝液(1.0M NaCl，20mM Tris-HCl(pH7.5)、1.0mM EDTA)で、次に５mlの低塩濃度緩衝液(0.2M NaCl、20mM Tris-HCl(pH7.5)、1.0mM EDTA)でプレラン（重力）することにより調製した。250μlの低塩濃度緩衝液を標識チューブに添加し、そして溶液全体を調製したカラムにのせた。次いで、カラムを400μlの低塩濃度緩衝液で２回、続いて200μlの高塩濃度緩衝液で３回洗浄した。溶出された放射性プローブを、次いで熱変性し、そしてハイブリダイゼーションに使用した。サザントランスファーおよびハイブリダイゼーショントランスファーすべきDNAフラグメントを非変性アガロースゲル（14）上で分画し、Hybond^TMNまたはHybond^TMN＋のいずれかのポジティブにチャージしたナイロン膜(Amersham Life Science)へサザンブロッティングによりトランスファーした(17、18)。Hybond^TMNナイロン膜へのハイブリダイゼーションは、供給業者の説明書に従った(18)。ベクターの調製ベクターの調製は以下のようにEP-B-0470145に記載のとおりであった：ベクター(pBS−/＋またはpBSK−/＋)を１つまたは２つの制限酵素で消化し、飽和フェノール（フェノールをまず0.1M Tris-HClと混合し、次いで２回TE緩衝液(10mMTr is-HCl（pH８）、１mM Na₂-EDTA)と混合した）で２回、およびクロロホルムで１回抽出し、そして0.3Mの酢酸ナトリウムおよび2.5容量の冷エタノールで沈殿させた。ペレットを70％の冷エタノールでリンスして、濃度が25〜50ng/μlになるように水に溶解した。ベクターは使用する前にバックグラウンドについて試験した（T4-DNA-リガーゼを用いてのおよび用いないでのセルフライゲーション）。必要であれば、ベクターをアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim)で、供給業者により記載されるように処理した。このような処理の後、得られたペレットを最終濃度が10ng/μlになるように水に再懸濁した。ライゲーションサブクローン化されるべきフラグメントを含むファージDNAまたはプラスミドを、１つ以上の制限酵素で消化し、そして５％アクリルアミドゲルまたは適切なアガロースゲルのいずれかで泳動した。サブクローン化されるべきフラグメントを(14)に記載の電気溶出によるかまたはGENECLEAN II Kit(BIO 101 Inc.,La Jol la,California)を供給業者の説明書に従って用いるかのいずれかによってゲルより単離した。ライゲーション反応において、フラグメント対ベクターの種々の比を使用した（２：１から５：１まで、分子数に基づく）。ベクターを含む１μl（10〜100n g)の溶液をフラグメントと連結させ、１μlのT4-ライゲーション緩衝液(10×(20 mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl₂、0.6mM ATP、10mMジチオスレイトール)と１μ lのT4-DNAリガーゼ(Boehringer Mannheim)をフラグメントおよびベクターの混合物に総容量が10μlになるように加えた。反応物を、ライゲートされるDNAフラグメントが付着末端を有した場合は15℃で一晩インキュベートした。 DNAが平滑末端を有した場合は、インキュベーションは室温で１時間であった。ライゲーション混合物は、すぐに使用しない場合は−20℃で保存し、通常５μ lのライゲーション混合物を形質転換に使用した。 DNA平滑末端化キット（「サブクローニングおよび配列決定」を参照のこと）で処理したDNAフラグメントは、DNA平滑末端化キットのプロトコル(Amersham)に従ってライゲーションを行った。コンピテントE.coli細胞の調製と形質転換これはEP-B-0470145に規定されたプロトコールに従って以下のように行った。 JM109細胞(またはDH5α)を、10mM MgSO₄および10mM MgCl₂になるように作製した４mlのL-Brothに接種した。細胞を37℃で一晩増殖させた。１mlの一晩培養物を40mlのあらかじめ暖めておいた（37℃）LB培地（10mM MgSO₄および10mM MgCl₂ を含む）に加えた。培養物を、OD₄₅₀が0.8〜0.9に達するまで250〜275rpmで１〜２時間振とうした。細胞を、5000rpmで10分間、４℃で遠心分離して回収した。ペレットをおだやかに30mlの冷0.1M CaCl₂に再懸濁し、別の遠心分離によって細胞を再びペレット化し、次いでこれを15mlの冷0.1M CaCl₂に再懸濁した。懸濁液を氷上に20分間置き、その後前記のように遠心分離した。最後に、細胞をおだやかに３mlの冷0.1M CaCl₂に再懸濁し、そして形質転換に用いる準備ができる前に少なくとも１時間前氷上に置いた。５μlのライゲーション混合物を95μlの冷滅菌TCM(10mM Tris-HCl（pH7.5）、 10mM CaCl₂、10mM MgCl₂)および0.2mlのコンピテント細胞と合わせた。この混合物を少なくとも40分間氷上で、次いで５分間37℃（または２分間42℃）で放置した。この溶液を0.8mlのL-Broth培地、10mM MgSO₄、10mM MgCl₂に移し、そして45 分間37℃でインキュベートし、次いで0.2ml/プレートで、５AXIまたは他のプレート(例えば、Amp-プレート)に播いた。このプレートは逆さにして37℃で一晩インキュベートする前に、10分間放置した。これらをプラスチックバッグ中で上下逆にして４℃で保存した。ExoIII/Mung Bean ヌクレアーゼ欠失サブクローン化したより大きいゲノムフラグメントの一連の欠失を、ExoIII/M ung Bean Deletion Kit(Stratagene)を用いて行った。一連の欠失のために選択したサブクローンを、大量の超らせんプラスミドDNAを得るために、２回のCsCl 勾配でのバンド化（「プラスミドDNAの調製」を参照のこと）により精製した。欠失の生成には、ExoIII/Mung Bean Deletion kitを、供給業者の説明書に従って使用し、実施した。ExoIII処理の間の温度は23℃であった。なぜなら、この温度において１分間当たり約125bpが取り除かれるはずであるからである。DNA 合成機での合成後のプライマーの精製プライマーをポリスチレンサポートカラム(Applied Biosystems,393 DNA/RNA Synthesizer)で合成し、そしてNH₄OHを用いてカラムから溶出した。カラムを切り開き、そして1.5mlのNH₄OHを小さいガラスチューブの中でポリスチレン物質に加えた。この混合物を85℃で１時間インキュベートし、次いで５分間氷上に置いた。一本鎖DNAを含む上清をエッペンドルフチューブへ移し、そして少なくとも３時間、真空遠心分離機中でNH₄OHを蒸発させた。ペレットを200μlの蒸留水に再懸濁し、そして550μlのエタノールおよび20μlの酢酸ナトリウムで沈殿させた。ペレットを200μlの水に再懸濁し、そしてエタノールおよび酢酸ナトリウムでの沈殿を繰り返した。最後に、ペレットを100〜200μlの蒸留水に再懸濁し、G ene Quant RNA/DNA calculator(Pharmacia)によりOD₂₆₀を測定して、一本鎖DNA を算出した。１OD₂₆₀が約33μg/mlの一本鎖DNAに対応する。サブクローニングと配列決定精製されたλDNAを適切な制限酵素によって消化し、そして作成したフラグメントを、供給者の使用説明書に従ってGeneClean Kit(BIO 101 Inc.,La Jolla,C alifornia)を用いてアガロースゲルから単離した。ゲノム DNA フラグメント（もしくはプラスミドより得られたフラグメント）を、BlueScribe ベクターpBS-/+（もしくはpBSK-/+,Stratagene）のポリリンカー領域にライゲートした。そのライゲートしたプラスミドを用いて E.coli株を形質転換した後、組換えサブクローンを、AXI プレートに播くことによって選択した（ベクターが pBlueScript プラスミドである場合、これらは白色であり、そして非組換えクローンは青色である(107)）。推定サブクローン由来のプラスミドDNA を適切な制限酵素で消化し、ゲル電気泳動に供し、サザンブロッティングの後、さらに適切に標識した DNAプローブとハイブリダイズさせ、挿入フラグメントの起源を確かめた。次いで、作成した pBS ゲノム DNA サブクローンを、EP-B-0470145 に概説されているプラスミド調製プロトコールに従って配列決定した。これに関して、配列決定されるプラスミド（２本鎖のテンプレート）を、プラスミド小規模調製法 (plasmid small scale preparation method)によって精製した。そのDNAを、0.2 M NaOH 中で変性（室温で５分）させ、混合物を、0.4 容量の５M 酢酸アンモニウム（pH 7.5）を添加することによって中和し、その後４容量の冷エタノール（ -80℃にて５分）で沈殿させた。ペレットを-70℃の冷エタノールでリンスし、そして10μlの H₂O に再懸濁した。 ExoIII/Mung Bean Nuclease kit を用いて作成した DNA フラグメントをサブクローニングするために、フラグメントをまずはじめに平滑化するか、または制限酵素で消化した後平滑化した。未知の末端構造(ExoIII/Mung Bean 処理後)あるいは付着末端を用いた DNA の平滑化を、供給者の使用説明書に従い DNA blunting kit(Amersham)を用いることによって行った。作成したライゲートされた欠失プラスミド（「ライゲーション」を参照）を、DH5αコンピテントセルに形質転換し、AXIプレート上で選択された白色のコロニーを、制限酵素消化により、そしてさらに配列決定により挿入物について分析した。配列決定を、United States Biochemical Corp.製のSequenase^TMDNA Sequenci ng kitを用いて、本キットに同封の配列決定プロトコール(Sequenase^TM: Step b y Step Protocols for DNA sequencing with Sequenase,第３版，United States Biochemical Corporation PO Box 22400 Cleveland Ohio 44122)に従って行った。しかし、推奨されているプロトコールに以下の改変をなした。DTT，Labelli ng mixおよび³⁵SdATPをアニールした DNA 混合物に添加する代わりに、４mlの³⁵ Sequetide(DuPont)を添加した。 T3およびT7プライマー（Stratagene）に加えて、DNA 合成機(Applied Biosyst ems,392 DNA/RNA Synthesizer)で作成した他の全範囲のプライマーを使用した。 0.5 pmolのプライマーを使用して１pmol のプラスミドを配列決定した。プライマーの配列を図６に示す。配列決定反応を、６％または８％の変性ポリアクリルアミドゲルに上で40 Wで１〜４時間電気泳動にかけ、次いでゲルドライヤーによって乾燥し、室温で３〜 48時間オートラジオグラフした。変性配列決定用ゲルを、製造者の説明書に従い、予め混合したポリアクリルアミド溶液Gel-Mix6およびGel-Mix8(GIBCO BRL,Life technologies,Inc)から作成した。Agrobacterium コンピテントセルの調製および形質転換 LBA 4404 株を、100mg/mlのリファンピシン（Sigma）および 500 mg/mlのストレプトマイシン(Sigma)を含む YMBプレート(pH7.0)にて維持した。2.5 ml のLB 培地(pH7.4)にこの細菌を接種した。懸濁液を振盪培養機中で 28℃にて 300〜34 0 rpmで 24時間増殖させた。次いで、この懸濁液をLBで 1:9 に希釈し、そしてさらに2〜3時間、28℃、300〜340rpmでインキュベートした。ODが0.5〜１のとき、25 mlの細胞アリコートを 50ml の遠沈管に回収し、10,000 rpm、４℃で５分間冷却遠心分離した。遠沈管を氷上に置き、ペレットを0.5 ml の20 mM CaCl₂に再懸濁した。この再懸濁した細胞の0.1 ml アリコートを、1 ml クリオチューブ (cryotube)にて、液体窒素中で瞬間冷凍し、そして−80度で保存した。凍結融解法（20）を用いた形質転換を以下のように行った： LBA 4404 コンピテントセルの溶液0.1ｍl CaCl₂アリコートを、氷上で解凍し、そして１μgのプラスミドDNA を添加した。混合物を、37℃で５分間インキュベートし、１mlのLB（pH7.4）を添加した。室温で４時間振とう（100rpm）しながらインキュベーションを行い、続いて10,000rpm、４℃で30秒間遠心分離した。ペレットを、100μlのLBで再懸濁し、50 mg/lのカナマイシン(Sigma)を含む YMB プレートに播いた。プレートを、28℃で48時間インキュベートするかもしくはコロニーが適切なサイズになるまでインキュベートした。これは選択の第一ラウンドであった。カナマイシン耐性を付与する NPT II遺伝子を含むプラスミドで形質転換した細菌のみが、カナマイシンプレート上で生存可能である。選択の第２ラウンドのために、６つの得られたコロニーを、100mg/ml のリファンピシン、500mg/lのストレプトマイシン、および 50mg/lのカナマイシンを含む YMBプレートに移した。LBA 4404は、リファンピシンおよびストレプトマイシンに耐性であり、このプラスミドは、カナマイシンに対する耐性を付与する。このプレートを、コロニーが適切なサイズに達するまで（約４〜５日）28℃でインキュベートした。コロニーをプラスミド含有量について試験した。このコロニーのプラスミド調製物を作成し、そしてDNAを適切な制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動を行い、プラスミドと挿入フラグメントが適切な正しいサイズを有していることを確認した。消化したDNAを、Hybond N+メンブレンにブロットし、適切に放射性標識したプローブ（プラスミドDNAフラグメントあるいは挿入物のフラグメント）とハイブリダイズさせた。形質転換したLBA 4404を、−80℃で保存した。100mg/lのリファンピシン、500 mg/lのストレプトマイシン、および 50 mg/lのカナマイシンを含む２mlのLB培地にこの細菌を接種し、28℃で48時間振とうしながら（300〜340rpm）インキュベートした。その懸濁液を滅菌した35％グリセロールで1:1に希釈し、クリオチューブにチューブあたり800μl分注し、−80℃で保存した。ジャガイモの形質転換形質転換したLBA 4404細菌の培養物を、２mlのYMB（pH7.0）にこの細菌を接種し、28℃で24時間インキュベートすることにより作成した。懸濁液を1:10に希釈し、さらに18時間インキュベートした。細菌を、10,000rpm、４℃で10分間遠心分離し、そしてペレットを 2.5mlの２mM 硫酸マグネシウムで２回リンスし、液体 MBa中に、OD 660 nmが0.5になるよう再懸濁した。形質転換に使用したジャガイモ植物材料を、２μMのSTSを添加した MBa 培地でインビトロで維持した（21，22）。先端シュートおよび節の増殖も行い、葉が大きければそれらを取り除いた。80mlの培地を含む容器につき５つのシュートを 25℃で成長させ、そして継代培養の30〜35日後、節を形質転換に用いた。微小増殖（micropropagate）した植物の茎を、節間（これらは移植片が約４mm の長さであるよう分割され得る）のみを使用するために、節のちょうど上と下で切断した。この移植片を、細菌の懸濁液に30分間浮かべ、濾紙上にブロットして乾燥し、同時培養プレート（MBa co）に移した。移植片を、液体 MBaで湿らせた濾紙で覆い、そしてプレートを布で３日間覆い25℃で放置した。次いで移植片を、800 mg/lを含有する液体 MBaで洗浄した。1 mlあたり２つの移植片を18時間振盪し、次いでブロットして乾燥し、そして選択培地に移した。選択培地は、１リットルあたり50mgのカナマイシン、800mgのカルベニシリン( Duchefa)、0.1mgのGA₃（ジベレリン酸、Sigma）、および１mgのt-ゼアチンを添加した固体 MBb培地であった。カルベニシリンを添加して残存するAgrobacteriu mを殺した。移植片を、３週間ごとに継代培養した。ジャガイモ全植物の再生継代培養により１cm以上になった移植片由来のシュートを回収し、400 mg/lのカルベニシリン、2μMのSTS、および 0.5 mg/lのt-ゼアチンを含む固体 MBa培地に移した。約２週間後、シュートを根形成培地に移した。また、根形成培地は、 2μM STSを添加した固体MBa培地である。5μM STSストックを、７mlの水に溶解した 0.19gのNa₂S₂O₃-5H₂O、および 10.19mgのAgNO₃から作成し、そして濾過滅菌した。約２週間後、シュートは根を形成し、土壌に植え付けられる状態であった。苗木を微温水でリンスして、残りの培地を取り除き、TKS 2 instant sphagnum (Flora Gard,Germany)を入れた小さな鉢に植え付けた。苗木は植え付けの間湿気を保ち、その後これに給水した。鉢を、湿度100％で21〜23℃のプラスチック製の「テント」に、苗木が土壌に根付くまで置いた。その後、テントを取り除き、植物に定期的に給水した。４週間の成長後、苗木を、大きい鉢（直径27cm）に植え換え、16時間明で22℃ 、および８時間暗で15℃の成長チャンバーに移した。植物が萎えたとき、塊茎を回収した。インビトロで増殖したジャガイモ植物由来の微小塊茎の生産インビトロで増殖した植物体もしくは選択されたシュートからの節を、節の５ mm下と２mm 上で切り取った。葉を除去し、移植片を固体成長培地に置いた。培地には、１リットルあたり4.4 gのMurashige and Skoog(MS,(10))基本塩類(Sigm a)、60gのスクロース、２mgのBAP(6-ベンジル-アミノプリン、Sigma)、２gのGel rite(Scott Laboratories,Inc.,Carson,California)が含まれていた。移植片を、16時間明／８時間暗で20℃にて７日間インキュベートした。次いで、プレートをアルミホイルに包んで20℃にて21〜28日暗闇に維持した。次いで、微小塊茎を１移植片につき１つ回収した。微小塊茎由来の芽を、塊茎を半分に（上から下へ）切断することによって微小塊茎より生じさせた。次いでこれらを固体 MBa培地に置き、暗所で25℃にて７日間インキュベートし、そして新たに成長した芽をGUS分析した。β−グルクロニダーゼ（GUS）活性の組織化学的位置測定組織を、かみそり刃によって小片に切断し、X-gluc（X-gluc:5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルコロニド)溶液に置いて小片を覆った。X-gluc溶液は、 0.1M NaPO₄(pH7.0)、１mM K₃(Fe(CN)₆)、0.1mM K₄(Fe(CN)₆)-3H₂O、10mM Na₂EDT Aおよび３％スクロースを含む緩衝液に 50mgのX-glucを溶解した溶液である(23) 。微小塊茎を、二等分し、鉢で成長した塊茎を薄切片にスライスし、葉を約0.5c m²の小片に切断し、そして茎組織を約１mm厚の切片に切断した。これらの部分をX-gluc中で37℃で２〜12時間インキュベートした。蒸発を防ぐよう注意した。X-glucを除去し、そして96％エタノールを組織部分に添加してクロロフィルおよび他の色素を抽出した。エタノール中でのインキュベーションは、5℃で一晩行い、翌日組織を２％スクロース溶液に移し、約１時間後に解剖顕微鏡下で検査した。α−アミラーゼゲノムクローンの単離ジャガイモ(Solanum tuberosum)由来のα−アミラーゼをコードするいくつかのcDNAクローンは、以前に単離されている（EP-B-0470145に記載されている）。部分的なα−アミラーゼをコードするプラスミド pAmyZ3(EP-B-0470145)由来の PstI-SalIフラグメントをプローブ（材料および方法の「DNA標識」を参照）として用いて、ゲノムジャガイモλDNAライブラリー(材料および方法の「ジャガイモゲノムライブラリーの構築」を参照)をスクリーニングした。約1.6 × 10⁶のファージのスクリーニングを材料および方法に記載の通りに行った。３ラウンドのプラーク精製によって２つのポジティブなクローンgPAmy351およびgPAmy331を単離した。１つのクローン(gPAmy331)はλDNAの単離（材料および方法の方法を参照）の間不安定であることがわかった。このことにより、gPAmy351クローンのみを詳細に分析した。挿入物（挿入物サイズは約22kb）の制限酵素地図を図１に示す。ゲノム配列のα−アミラーゼをコードする部分のマッピングを、クローンの種種の切断物のサザントランスファーによって行い、続いて、pAmyZ3 のPstI-SalI フラグメントとのハイブリダイゼーションを行った。gPAmy351はα−アミラーゼ遺伝子の全プロモーター領域とさらに1270bpの構造遺伝子を含んでいる。これは Amy 3/4タイプのジャガイモα−アミラーゼによってコードされる全アミノ酸配列（407アミノ酸、EP-B-0470145 を参照）の約1/3に対応する142アミノ酸をコードする配列をカバーする。α−アミラーゼプロモーターを含むゲノムフラグメントのサブクローニング約 5.5 kbのEcoR1フラグメント（これは図１中で星印により示される）をgPAm y351ゲノムクローンからpBS-ベクターの脱リン酸化EcoRI部位にサブクローニングした(材料および方法を参照)。このサブクローンをEco 5.5と名付け、それはATG開始コドンとその上流配列を含んでいる（この配列のより詳細な記載については次の段落を参照せよ）。これらの上流配列を、以下でα−Amy 3プロモーターと呼ぶ。 Eco 5.5 プラスミドの大規模プラスミド調製物を、EcoRIとHaeIIIで消化し、これによりATG開始コドンならびに推定CAATボックスとTATAボックスを含む1350b pフラグメントが得られた。その他のもの(例えば24-31 を参照)によって示されるように、それはしばしば ATG開始コドンから数え約1000〜1500 bp上流にある全プロモーターを含む配列領域であり、正しい時間および場所で遺伝子の転写を媒介するに十分である。EcoR I-HaeIIIフラグメントを、EcoRIおよびSmaIで消化し、そしてアルカリ性ホスファターゼによって脱リン酸化したpBSK-ベクター中にサブクローニングした（材料および方法を参照）。このサブクローンをEH8と呼び、このサブクローンが有するゲノムジャガイモフラグメントを機能分析のために選択した。EH8プラスミドにおける挿入物の同一性を、T3およびT7プライマーを用いる配列決定によって証明した(図2Bならびに材料および方法を参照)。α−アミラーゼプロモーターの配列決定 gPAmy351(図１)中の約2900bpの挿入物を、様々なフラグメントをサブクローニングし、図６に示されたプライマーを用いることによって配列決定した(材料および方法を参照)。これは、開始(ATG)コドンの1734bp上流および 1440bp下流をカバーする。ATG開始コドンの上流領域の配列地図を図 2A に示し、DNA配列を図３に示す。この配列は、Eco 5.5 kbフラグメントの一部ならびに開始コドンの上流のHindIIIおよびEcoRI部位をカバーしているgPAmy351挿入物(図１を参照)の3' 末端付近に位置し、そのことによって機能分析のために選択されるHaeIII-EcoRI (EH)フラグメントを含む。 ATG（Aが＋１位）コドンから−1734位上流のα−Amy３プロモーター配列（図３を参照）を、公開されている植物配列のデータベース(EMBL)と比較し（Intell iGenetics,Inc.,California製のPC-遺伝子プログラムを使用）、また、すべての生物の配列とも比較した。α−Amy 3プロモーターと著しい全体相同性を有する配列は存在しなかった。TATAボックスは−365位に位置している。 α−Amy3プロモーターと公開されているDNA結合部位とを比較したところ、TAT Aボックスの21bp下流に位置する CAP部位（−344位）と、二つの CAATボックス（一方は TATAボックスの103bp上流で CAP部位の124bp上流の−468位に位置し、他方は、TATAボックスの192bp上流で CAP部位の213bp上流の−557位に位置する）が示唆された。 CAP部位、TATAボックスおよびCCAATボックスの位置は他の真核生物ポリメラーゼIIプロモーターにみられる位置(32-33)と良く対応する。α−アミラーゼプロモーターの欠失 EH8サブクローンの大規模調製物由来のプラスミドを、CsClグラジエントで２回バンド化して(材料および方法を参照)、純粋な超らせんDNAを得た。アガロースゲル上でプラスミド DNA のサンプルを泳動すると、少なくとも85％の調製物が超らせんであることが示された。次いで、EH8プラスミドを、Bst XIで消化して3'オーバーハングを形成し、そしてBamHIで消化して5'オーバーハング末端を形成した。消化物が確実に完全であるよう注意した。ExoIII/Mung Bean処理を材料および方法に記載の通り行い、そしてアリコートを0、1、2、3、4、5、6、6.5 、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10および10.5分で採取した。ここで、EH8プラスミドのネストされた(nested)欠失を含む異なった混合物を、材料および方法での説明に従って、ライゲーションおよび形質転換において直接使用した。すべての範囲の欠失サブクローンが得られた。これらを図４に示す。それらを全て、T3およびT7プライマー（図８を参照）を用いて配列決定してα−Amy 3プロモーターに対して5'末端側に位置づけた。個々の開始位置を図2Aに示した。ここで、矢印は欠失サブクローンの配列反応の開始および伸長を示している。３つのネストされた欠失サブクローンを、機能分析のために選択した。これらは4-1、6-15および8.5-Eであった(図2Bにおいて星印で示す)。大規模プラスミド調製物を選択されたクローニングした欠失（4-1,6-15,8.5-E ）およびEH8クローンから作成した。次いで、これらをpBSK-ベクターのポリリンカー中で切断するSacIで消化し、そしてこれらをプロモーター挿入物の反対側の部位で切断するSalIで消化する前に、SacI部位を平滑化した（材料および方法を参照）。プロモーターのないβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を含むpBI101プラスミド(材料および方法を参照)を、HindIIIで完全に消化し、そしてこのHindIII部位を、材料および方法の記載通りに平滑化した。その後、開裂した(open)プラスミドを、SalIを用いて消化し、それによって pBI101 HindIII^Blunt/SalIベクターを作製した。サブクローニングおよび形質転換次いで、4-1、6-15、8.5-EおよびEH8クローンより得られた Sac IBlunt/SalI フラグメントを、pBI101 HindIII^Blunt/SalIベクターにサブクローニングし、ラーゲートしたプラスミドをAgrobacterium LBA 4404株に形質転換した(材料および方法を参照)。得られたコロニーを、挿入されたフラグメントのいずれかの側で消化する制限酵素PstIおよびSalIを用いて試験した。次いで、正しいサイズの挿入物を含むクローンを#589と名付けられたプライマーを用いた配列決定によって分析した（図６を参照）。#589プライマーはpBI101のGUS遺伝子内でプライムし、プロモーターのないGUS遺伝子の上流配列の読み取りを可能にし、それによって、挿入されたプロモーター欠失をカバーしている。選択されたプロモーター欠失を含むpBI101プラスミドを、EH、HFP4、HFP6およびHFP8 と命名した。さらに、PstIとSalIとで消化されたプラスミドのサザントランスファーを、α −Amy 3プロモーター領域の最長フラグメントを含む EH8クローン由来の標識された挿入物とハイブリダイズさせ、挿入物の起源を確認した。 4-1、6-15、8.5-EまたはEH8 によってカバーされるものより小さなフラグメントを生産するために、別のサブクローンであるHEサブクローンを作製した。このことを、EH8サブクローンをEcoRIで消化し、EcoRI部位を平滑末端化し、続いてH indIIIで消化し、次いで、3'末端プロモーター配列を含む288bpフラグメントを単離することによって達成した（HEフラグメントの位置については図2Bを参照）。サブクローニングのために、pBI101ベクター中のSmaIとHindIIIで消化されたH indIII/EcoRI^Bluntフラグメントをライゲーション反応に用いた。得られたプラスミドを HEと呼び、Agrobacterium LBA4404株に形質転換した（材料および方法を参照）。カナマイシンプレート上で得られたコロニーを、精製されたプラスミドを制限酵素HindIIIおよびSnaBIを用いて消化することによって試験した。選択されたコロニー由来のプラスミドを、先に説明したように#589プライマーを用いた配列分析に供した。合計で、前節で説明された方法によりα−Amy 3プロモーター構築物の５つの欠失が作製された。それらは、ATGコドンの5'側のEcoRI部位の上流の1350bp配列 (EH8)、853bp配列(HFP4)、672bp配列(HFP6)、506bp配列(HFP8)および288bp配列( HE)をカバーする（図２および５を参照）。それらをpBI101ベクターのプロモーターのないGUS遺伝子の前にクローニングした(材料および方法を参照)。プロモーター構築物でのジャガイモの形質転換５つの欠失構築物とpBI101とを含む６つのLBA4404 コロニーを選択し、材料および方法に記載されたようにSaturnaの茎組織の形質転換に用いた。ネガティブコントロールとして、いくつかのSaturna移植片を、カナマイシン無添加の選択プレートから得られた非形質転換LBA4404細菌および非形質転換シュートと共にインキュベートした。ポジティブコントロールとして、いくつかの Saturnaの移植片を、pBI121プラスミドで事前に形質転換したLBA 4404と共にインキュベートした。pBI121は、ほとんどの植物組織において構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターにより制御されるGUSカセットを含んでいる(34-38)。最初の回収（22日目）および２度目の回収（49日目）後に再生したシュートは全て廃棄した。68日後各々の欠失構築物から40シュートを、ネガティブコントロールから10シュートを、そしてポジティブコントロールから15シュートを回収し、そして根誘導培地に移した（材料および方法を参照）。各シュートはおそらく個々の形質転換事象を表し、以下で株と呼ばれる。各株は、その植物が形質転換されている場合に、独立した形質転換事象を表す。予想される形質転換系統の葉におけるGUS発現根形成後、再生系統由来の葉をすべてGUS試験した。本発明のα-アミラーゼ遺伝子の発現分析によって、3/4タイプのα-アミラーゼは、塊茎組織、芽組織、茎組織および根組織で発現するが、葉での発現は見られなかったことが明らかにされた。予想される形質転換された欠失系統、pBI101プラスミドで形質転換された系統、および非形質転換コントロール系統由来の葉のGUS試験は、これらのいずれにもGUS活性がないことを明らかにした。対照的に、ポジティブコントロールのプラスミドpBI121で形質転換された植物のGUS試験は、ほとんど全ての植物の葉でG US発現を示した。（表1を参照のこと）微小塊茎および芽でのGUS発現上記の系統由来の微小塊茎を、材料と方法で述べたように生成させた。これらの微小塊茎をそのGUS活性について調べ、そしてEH8、HFP4、および有FP6欠失構築物を含む系統はポジティブなGUS染色を示した。さらに、pBI121コントロール系統はGUSのポジティブな微小塊茎を生じたが、pBI101プラスミド含有系統はネガティブな微小塊茎を示した。非形質転換系統の微小塊茎もまた、欠失構築物HF P8およびHEで形質転換された系統と同様にGUS活性を示さなかった。微小塊茎から発生した芽（材料と方法を参照のこと）はまた、GUS分析された。そしてpBI121（ポジティブコントロール）で形質転換された系統のみがGUS活性を示した。表１にこれらの結果を要約し、以下に示す。苗木の他の部分におけるGUS発現微小塊茎が生じる場合、それらは茎外植片の末端で形成される。外植片の先端には、たいてい２つの葉様構造体が形成される。これらの茎様外植片および葉様先端をGUS活性について調べた。表１に要約されているように、欠失を含む系統はどれも、外植片の茎様組織または葉様組織のいずれにおいてもGUS活性を示さなかった。微小塊茎でGUS活性を示したpBI121系統の全てはまた、外植片の茎様構造体および葉様構造体においてGUS活性を示した。ポット生育系統の葉、根、茎、および塊茎におけるGUS発現再生したジャガイモ系統はまた、生育室内のポットで生育させ（22℃で16時間の明期および15℃で８時間の暗期）、そして葉、根、茎、および塊茎をGUS分析した。表１および表２で要約されるように、pBI121構築物を含むコントロール系統を除いて、植物系統のどれも、葉でGUS活性を示さなかった。ポット生育植物から採取した塊茎でのGUS発現の調査は、微小塊茎で試験した系統ですでに見られたパターンを再現した。 EH8、HFP4およびHFP6の３つの構築物のうちの１つを有する植物は塊茎でGUS活性を示したが、HFP8、HEまたはpBI101の構築物を有する植物体はそれらの塊茎で GUS活性を示さなかった。さらにpBI121構築物を有する植物は、予想されたようにポット生育塊茎でGUS 活性を有した。表２に列記した系統（pBI121を有するポジティブコントロール植物を除いて）のGUS分析により、EH8、HFP4およびHFP6を含む系統は、微小塊茎とポット生育塊茎の両方でGUS活性を明瞭に示していても、根、茎または葉の組織ではGUS活性が見られないことが示された。結論として、ATG開始コドンの上流1534bpにわたるα-Amy3 プロモーター欠失構築物はいずれも、苗木またはポット生育植物の葉、微小塊茎外植片の葉様組織および茎様組織、またはポット生育植物の根と茎において、他のプロモーターのないGUS遺伝子の発現を導かないことは明らかである。 GUS発現は微小塊茎およびポット生育塊茎でのみ見い出される。このことは、このα-Amy 3プロモーターがEH8欠失5'末端の上流に位置する茎、芽、および根の発現エレメント（単数または複数）とは明らかに分離できる塊茎特異的なエレメントを含むことを明瞭に示している。さらに、本発明はまた、塊茎特異的なエレメントがHFP8欠失5'末端の近傍および上流に位置し、デルタ配列によって覆われていることを示している。本発明はまた、EH8、HFP4、HFP6、HFP8またはEH構築物のいずれも、これらの組織でGUS発現をもたらさないので、茎、芽および根発現エレメント（単数、複数）はEH8の5 '末端の上流に位置していることを示している。従って、根特異的、茎特異的および芽特異的な発現を支配しているエレメントは351プロモーターの遥か上流に位置することが結論づけられる。プロモーターの適用性は広範囲に及ぶ。プロモーターを使うことで、ジャガイモ植物において異なる組織にタンパク質の発現を指向することは可能である。他の双子葉植物において異なる組織にタンパク質の発現を指向することさえ可能である。pJK4 ジャガイモα-アミラーゼをコードする配列は、プラスミドpAmyZ4に由来する（EP-B-0470145の詳細な説明を参照のこと）。簡単に述べると、pAmyZ4は407アミノ酸長のジャガイモα-アミラーゼ前駆体をコードし、そして、さらにプラスミドpBSK-のポリリンカーのEcoRI部位に位置する149bpの5'非翻訳配列および201 bpの3'非翻訳配列を含んでいる。配列番号19として示される配列を含むアンチセンスα-アミラーゼ構築物pJK4 は、pAMYZ4由来のSacIおよびEcoRVフラグメントを使用し、そしてそのフラグメントをSmaIおよびSacIで消化したpEPLプラスミドのような適切なプラスミド中にサブクローニングして作製された（図10を参照のこと）。これは、強化した35S プロモーター(E35S)の下流およびDW2tターミネーターの上流にアンチセンス配列を配置している。このプラスミドをpEPLZ4Sac-Ecoと名付け、そしてE35Sプロモーター、アンチセンスジャガイモ配列およびDW2tターミネーターを含む部分的な HindIIIフラグメントをHindIIIフラグメントしたpBI121中にさらにサブクローニングし、それによってバイナリープラスミドpJK4を作製した。図９を参照のこと。本発明の他の改変は、発明の範囲から逸脱することなく当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ランド，マリアンヌデンマーク国ガルテンディーケイ− 8464，ベスターブロ 35 (72)発明者オッケルズ，フィンツーグデンマーク国ロスキルドディーケイ− 4000，コンジェマーケン 11

Claims

【特許請求の範囲】１．Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメント。２．少なくともプロモーターの一部分が不活性化されているSolanum tuberosum から単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメント。３．少なくとも配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメント。４．配列番号４〜17に示す配列のいずれか１つを含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメント。５．少なくとも配列番号１に示すヌクレオチド配列が不活性化されているSolanu m tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメント。６．少なくとも配列番号２〜16に示す配列のいずれか１つが不活性化されている Solanum tuberosumから単離された5.5 Kb EcoR1フラグメントに対応するヌクレオチド配列を含むプロモーター、またはその変異体、ホモログ、あるいはフラグメント。７．GOIに融合された請求項１から６のいずれか１つに記載されるプロモーターを含む、構築物。８．請求項１から６のいずれか１つに記載されるプロモーターを含む、発現ベクター。９．請求項１から６のいずれか１つに記載されるプロモーターを含む、形質転換ベクター。１０．請求項１から６のいずれか１つに記載されるプロモーターを含む、形質転換細胞、または器官。１１．請求項１から６のいずれか１つに記載されるプロモーター、または請求項７から１０のいずれかの発明を含む、トランスジェニック生物。１２．植物がジャガイモ植物である、請求項１１に記載のトランスジェニック生物。１３．請求項１に定義されるプロモーターの、低温誘導性プロモーターとしての使用。１４．請求項１に記載のプロモーター、およびアンチセンスα-アミラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む構築物。１５．植物の塊茎および／または芽および／または根および／または茎において、GOIを発現するための請求項１から６のいずれか１つに定義される、プロモーターの使用。