JPH05506777A - キモトリプシン様プロテアーゼ及びそれらの阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 意する（式中： Ｒは水素又はＮ末端保護基である； Ｒ１はリポータ−基である）； （ｂ）上記候補プロテアーゼを上記基質と接触させる及び （ｃ）上記候補プロテアーゼが上記基質を開裂させるか否かについて調べる； 工程からなる方法。

４３、　アルツハイマー病にかかった患者の治療方法であって、 上記患者に薬学上許容されるキャリア中におけるキマーゼの阻害剤を投与するこ とからなる方法。

４４、　アルツハイマー病にかかった患者の治療方法であって、 上記患者に薬学上許容されるキャリア中における多触媒プロテアーゼの阻害剤を 投与することからなる方法。

キモトリプシン様プロテアーゼ及びそれらの阻害剤発明の背景 本発明はアルツハイマー病の原因に関与するキモトリプシン様プロテアーゼとそ の基質及び阻害剤に関する。

アルツハイマー病（ＡＤ）は米国で４百万Å以上に罹患する脳の進行性変性障害 である。有効な治療法は現在ない。ＡＤは死後の組織病理学的方法で限定的に診 断されるだけである。その最終段階であっても、ＡＤは、正確に診断されたなら ば治療できるうつ病のような痴呆症を発現する障害と時々混同される。このため 、ＡＤ診断法及び治療法を開発する多大な必要性が存在する。

ＡＤ神経病理の不変的特徴は神経突起及び脳血管プラークへのβ−アミロイド又 はＡ４として知られるタンパク質の沈着である。大脳皮質の大領域における濃β −アミロイドプラークの存在はナショナルｔインステイチュート・オンΦエージ ング（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｎ　Ａｇｉｎｇ）のガイドラ インによるとＡＤに関して診断上特徴的である（Ｋｈａｃｈａｔｕｒｉａｎ、Ａ ｒｃｈ、Ｎｅｕｒｏｌ、　、４２：１０９７．１９８５）。β−アミロイドは３ ９−４２アミノ酸ペプチドである（Ｇｌｅｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｅｈ ｅｓ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｖ＋＋ｕｎ、、１２０：８ｇ５．１９８４ ；Ｍａｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 Ｉ１２：４２４５、１９８５）。それはより大きな前駆タンパク質の一部として 合成される（Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２５＝７３３．１９８ ７；Ｔａｎｚｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５２８，１９８８；Ｐ ｏｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５２５．１９８８；Ｋｉｔａｇｕｃｈｌ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：５３０．１９８８）。これらのβ−アミロイド前駆タ ンパク質（Ａ　Ｐ　Ｐ）のタンパク質分解プロセッシングはβ−アミロイドを形 成するために要求される。β〜ルアミロイドアミノ末端はＭｅｔ　及びＡＳｐ（ Ｋａｎｇら、前掲に従いナンバリング）間のＡＰＰにおけるペプチド結合の開裂 により形成される。

Ａｂｒａｈａｉら＜ＢｌｏｔｅｃｈｎｏＩｏｇＹ、　７：　１４７．　Ｉ　９８ ９）は“β−タンパク質の前駆体内における２つの開裂部位のＮ末端がメチオニ ンを含み、したがってキモトリプシン様プロテアーゼによるプロセッシングから 生じうろことに注目することは興味深い″と述べている。同様に、Ｖａｎ　Ｎｏ ５ｔｒａｎｄら（Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４６，１９８９）は“いくつかの発 見がアルツハイマー病神経突起プラークにおけるアミロイドβ−タンパク質の沈 着でキモトリプシン様プロテアーゼの関与を意味していた”と述べている。Ａｂ ｒａｈａｍら（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ。

Ａｇｉｎｇ、　ＬＯ：４Ｈ，１９８９）は“したがって、プロテアーゼ阻害剤は アルツハイマー病における薬物治療にとり魅力的な標的である１と述べている。

Ｐｏｐｅら（Ｎｅｕｒｏｃｈｃｖ、Ｒｅｓ、　、　９　：　２９１　、１９ｇ４ ）はヒト脳でみられるプロテアーゼについて記載している。彼等はＡＤを特徴付 ける神経突起プラークが、損傷された定常状態タンパク質分解及び／又はタンパ ク質品質コントロールと一致する過剰タンパク質蓄積の結果であると述べている 。

彼等は“神経タンパク質分解機構の総合分析が脳を髄無生活力における分子及び 構造的障害の改善された理解にとり有益である°らしいと示唆している。

補乳動物脳で確認されたプロテアーゼとしてはキモトリプシン様活性を有する２ 種のセリンプロテアーゼがある。１つは“インゲンシン’　（Ｉｓｈｉｕｒａ　 ｅｔ　ａｌ、、ＰＥＢｓＬｅｔｔ、、１８９：１１９，１９８５）又は“多触媒 プロテアーゼ″（Ｖｊｌｋ　ｅｔ　ａｌ、ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅａ、、４０二８ ４２，１９１＋３）と称される酵素複合体である。このプロテアーゼ複合体は、 それが芳香族又は大脂肪族アミノ酸のカルボキシ末端側鎖でペプチド結合を開裂 する点でキモトリプシン様活性を含む。

第二に、肥満細胞が数種の哺乳動物の脳でみられ（Ｄｒｏｐｐ。

Ａｃｔａ　Ａｎａｔ、、９４：１．１９７８）　、これらの細胞はキモトリプシ ン様プロテアーゼを含有している（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ　、＾ｃａｄ、ｓｃ１．．７５：５３１１．１９７１１Ｓ ｃｈｅｃｈｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｉ■υｎｏ１．．１３７：９Ｂ２．１９８８）。

プロテアーゼ（特にセリンプロテアーゼ）用の阻害剤に関していくつかの文献が ある。これらにはＮａｋａｊｌｍａｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｌ、 、２５４：４０２７，１９７９：ｌ１ｐｅｒｉａｌｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、、２５：３７１３０．１９８８；Ｋｅｔｔｎｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅｒＡ、　、　２５９　：１５１０Ｂ　、　１９８４　；Ｋｅｔｔｎｅｒら 、米国特許第４．５８２．８２１号、第４，４９９．０８２号、第４，６４４゜ ０５５号、第４，６３６，４９２号、第４，６５２，５５２号及び欧州特許出願 節０．１８７．７２１号明細書がある。

下記略号がアミノ酸及びアミノ酸残基に関して用いらＬ−アラニン　Ａｌａ　Ａ Ｌ−アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ Ｌ−アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ Ｌ−アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ｌ−システィン　Ｃｙｓ　Ｃ Ｌ−グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ Ｌ−グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グリシン　Ｇｌｙ　Ｇ Ｌ−ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ Ｌ−インロイシン　ｌｉｅ　Ｉ Ｌ−ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ Ｌ−リジン　Ｌｙｓ　Ｋ Ｌ−メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ Ｌ−フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ Ｌ−プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ Ｌ−セリン　Ｓｅｒ　Ｓ Ｌ−トレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ Ｌｌ−リブトファン　Ｔｒｐ　Ｗ Ｌ−ホモアルギニン　Ｈａｒｇ Ｌ−ピログルタミン酸　Ｐｇｌｕ “Ｄ−”で前置されている場合、前記略号はＤ−配置のアミノ酸を示す。

下記略号はＮ末端保護基に関して用いられる二Ｂｏｃ　ｔ−ブチルオキシカルボ ニル ＭｅＯ９ｕｃ　メトキシサクシニル ＤＮＰ　２．４−ジニトロフェニル Ｚ　ベンジルオキシカルボニル Ｆｍｏｃ　フルオレニルメトキシ力ルボニルＭｅＯＡｚ　メトキシアジピル ＭｅＯ＾ｄ　メトキシアジピル ＭｅＯ３ｕｂ　メトキシアジピル 発明の概要 本発明はラット又はヒト脳から得られる“キマーゼ及び“半触媒プロテアーゼと 称されるＡＤに特徴的な２種のキモトリプシン様セリンプロテアーゼの同定、特 徴付は及び精製に関する。キマーゼ及び半触媒プロテアーゼは双方ともＮｅｔ及 びＡｓｐ間を開裂できる酵素活性を有するが、その活性はβ−アミロイドを形成 する上で必要である。ＡＤを診断する上で脳（更に他の組織サンプル及び液体） におけるキマーゼ及び半触媒プロテアーゼの活性を定量しかつその疾患の進行を 遅らせる治療剤として阻害剤を開発するための方法が提供される。新規組成物が ２種の酵素の阻害剤として製造及び確認された。

ヒト脳キマーゼ及び半触媒プロテアーゼのクローニング及び配列決定とそれらに 対する核酸及び抗体プローブの製造に関する方法も提供される。

このため、第一の面において本発明はβ−アミロイド前駆タンパク質においてメ チオニンとアスパラギン酸との間のペプチド結合を加水分解するエンドペプチダ ーゼ酵素活性を有する精製されたペプチド（その用語はポリペプチド及びタンパ ク質を含む）を特徴とする。“精製された′とはペプチドが天然である場合にそ れが細胞又は組織の成分から分離されることを意味する；それは溶液又は調製物 中に存在するペプチドの好ましくは少なく二二二二二二９：、最も好ましくは９ ０重量％を表すよう第二の面において、本発明はアルツハイマー病を示すプロテ アーゼの生物学的サンプル中における検出方法を特徴とする。その方法では下記 式Ｉを有するプロテアーゼに関する基質を用意する： １　：　Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ａｌ−Ｒ１上記式中ＲはＮ末端保護基又は水素 である；Ｒ１はリポータ−基である二Ａ４は共有結合（即ち、Ｒは八３に直接結 合されている）、アミノ酸又は例えば約５以内のＤ−もしくはＬ−アミノ酸を含 むペプチドである；八３は共有結合（即ち、Ａ４はＡ２に直接結合されているか 又はＡ４が共有結合である場合ＲはＡ２に直接結合されている）であるかあるい はＤ−アミノ酸、Ｐｈｅ　ｓ　ＴｙｒもしくはＶａｔ又はＶａｔの保存的アミノ 酸置換基、例えばＬｅｕ、１１ｅ　、　Ｎｌｅ　５Ａｌａ及びＮｖａである；Ａ ２は疎水性アミノ酸、例えばＬｅｕ　、　ｌｌｅ　、　Ｎｌｅ　、　Ｐｈｅ　５ Ｖａｌ　、Ｎｖａ　５ＴｙｒもしくはＰｒｏ又は好ましくはリジンもしくはその 保存的アミノ酸置換基、例えばＡｒｇ　、　Ｏｒｎ　、　Ｃ１ｔ　、　Ｈａｒｇ であるかあるいはＡ４が少なくとも２つのアミノ酸を含む場合Ａ２はいずれかの アミノ酸である；Ａ１はＭｅｔ　ｓ　Ｐｈｅ　５Ｎｌｅ　５Ｌｅｕ　ｓ　Ｉｌｅ 　％　Ｔｙｒ又は３−フェニルプロリンである；Ａ４及び／又はＡ３が共有結合 である場合、Ｒはアルキル、アラルキル又はアリール置換基で場合により置換さ れた炭素原子２〜２０のアルカンジカルボン酸もしくはアルカンカルボン酸又は それらの低級アルキルモノエステルであってもよい；好ましい置換基はイソプロ ピル、イソブチル、ベンジル又はフェニルであり、好ましい鎖長は炭素原子３〜 １０である。その方法では更に生物学的サンプルを基質と接触させ、生物学的サ ンプル中におけるプロテアーゼの存在の指標として基質の開裂を検出する。

Ｒ１はアミノ酸残基Ａ１のＣ末端カルボニルとアミド又はエステル結合鎖を形成 できるリポータ−基であって、開裂反応によりペプチド配列から放出されて視覚 的又は機器的手段により検出される分子Ｒ１−Ｈ又はアニオンＲ１−を形成する 。

リポータ−基Ｒ１の正確な性質は本発明にとり重要でない。“リポータ−基”と は溶解状態で又は適切な表面に結合された場合に特定分析物の検出に用いられる １種以上の技術で検出しつるあらゆる発色源、磁気、ケイ元厚、発光、抗原、安 定なラジカル又は放射性基を意味する。

Ｒ１が発色原基である場合、それは開裂後に共有分子Ｒ１−）１又は共有イオン Ｒ１−を形成するが、これは遊離Ｒ１−Ｈ又はＲ１−を視覚的又は機器的に調べ る溶媒抽出、沈降又は他の化学的もしくは物理的手段により未反応ペプチドから 場合により分離してもよい。例えば、Ｒ１−Ｈがｐ−ニトロアニリンである（Ｒ １−がｐ−二トロアニリド（ｐＮａ）イオンである）場合、それは光度計でその 紫外線もしくは可視光吸収により定量的に測定しても又は一連の標準溶液との比 較で視覚的に測定してもよい。他の適切な発色原基としてはニトロナフチルオキ シ、ナフチルアミノ、ニトロナフチルアミノ及びキノリンアミノがある。

Ｒ１がケイ光原基である場合、遊離Ｒ１−又はＲ１−Ｈは溶液を１波長の光に露 出して別の通常より長い波長でケイ光を検出することにより溶液中で検出される 。適切なケイ光原基としては４−メチルクマリン−７−アミノ（ＡＭＣ）　、２ −ナフチルアミノ、４−トリフルオロメチルクマリン−７−アミノ及び４−メチ ルウンベリフェリルがある。

Ｒ１−Ｈは鋭い共鳴検出を生じる磁気的に特有の核を有する置換基と１９Ｆ磁気 共鳴検出用にフルオロアルキル又はフルオロアリール置換基を組込むことで核磁 気共鳴（ＮＭＲ）により定量的に測定してもよい。

Ｒ１が安定なラジカル（例えば、ニトロキシル又はジフェニルビクリルヒドラジ ル）置換基である場合、これは電子スピン共鳴（ＥＳＲ）により検出される。

ペプチドからのＲ１の開裂がＲ１基の物理的性質に関して著しい変化、例えば紫 外線吸収最大の強度又は波長に関して有意の変化を伴う場合、未反応基質から放 出される置換基（Ｒ１−又はＲ１−Ｈ）の物理的分離は場合により省いてもよい 。開裂の量は紫外線又は可視光吸収最大で又はその近くで放出された置換基Ｒ１ −の吸収の測定により定量的に測定される。

″Ｎ末端保護基”とはペプチド合成の当業者に知られかつアミノペプチダーゼに よる分解から分子を保護することが知られたＤ−アミノ酸、アリールカルボニル 、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ア ラルキルオキシカルボニル、アラルキルスルホニル、アルキルスルホニルもしく はアリールスルホニルペプチド保護基又は他の相当基を意味する（Ｇｒｏｓｓ及 びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ｅｄｓ、、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｖｏｌ、３゜ Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１．ｐｐ、３−８１ は多数の適切なアミン保護基について記載している）。ここで個別的に又はより 大きな基の一部としていずれかで用いられる“アルキル”とは炭素原子１〜２０ の直鎖、環状又は分岐鎖脂肪族部分を意味する。“アリール”とは非置換である か又は１以上のアルキル、置換アルキル、ニトロ、アルコキシもしくはハロ基で 置換された炭素原子６〜１８の芳香族部分、例えばフェニルを意味する；　“置 換アルキル”とはＮ、Ｏ又はＳのようなヘテロ原子を含む置換基を有したアルキ ル基を意味する：　“ハロ″とはＣＩ又はＢｒを意味する：　“アルカリル°と は脂肪族置換基と場合により１以上のアルキル、置換アルキル、アルコキシ又は アミノ基のような他の置換基を有する炭素７〜１９のアリール部分を意味する。

“アラルキル”とはアリール基を含む炭素原子７〜１８の直鎖又は分岐鎖脂肪族 部分を意味する。

適切なＮ末端保護基の例としてはホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、 ベンジルオキシカルボニル（カルボベンジルオキシ）、置換ベンジルオキシカル ボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、イソプロピルオ午ジカルボニル、 アリルオキシカルボニル、フタロイル、ベンゾイル、アセトアセチル、クロロア セチル、フニノキシ力ルボニル、メトキシスクシニル、スクシニル、アジピル、 スベリル、２，４−ジニトロフェニル、ダンシル、ｐ−メトキシベンゼンスルホ ニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル、Ｄ−セリン及びＤ−グルタ ミン酸がある。

好ましい態様において、生物学的サンプルは脳、肝臓、心臓、筋肉、白血球、肥 満細胞、繊維芽細胞、血清又は脳を髄液から単離される；プロテアーゼはキマー ゼである；プロテアーゼは多触媒プロテアーゼである。

第三の面において、本発明は前記式Ｉを有するプロテアーゼ用の基質を特徴とす るが、その場合にＲはＮ末端保護基又は水素である；Ｒ１はリポータ−基である ；Ａ４は共有結合（即ち、ＲはＡ３に直接結合されている）、アミノ酸又は例え ば約５以内のＤ−もしくはＬ−アミノ酸を含むペプチドである；Ａ３は共有結合 （即ち、Ａ４はＡ２に直接結合されているか又はＡ４が共有結合である場合Ｒは Ａ２に直接結合されている）であるかあるいはＤ−アミノ酸、Ｐｈｅ　５Ｔｙｒ もしくはＶａｔ又はＶａｔの保存的アミノ酸置換基、例えばＬｅｕ　５Ｉｌｅ％ Ｎｌｅ　。

Ａｌａ及びＮｖａである；Ａ２は疎水性アミノ酸、例えばＬｅｕ　５Ｉｌｅ　、 　Ｎｌｅ　、　Ｐｈｅ　５ｖａｌ　、　Ｎｖａ　５ＴｙｒもしくはＰｒｏ又は好 ましくはリジンもしくはその保存的アミノ酸置換基、例えばＡｒｇ　、　Ｏｒｎ 　、　ｅｆｔ　、　ＨａｒｇであるかあるいはＡ４が少なくとも２つのアミノ酸 を含む場合Ａ２はいずれかのアミノ酸である；Ａ１はＭｅｔ　５Ｐｈｅ　、　Ｎ ｌｅ　。

Ｌｅｕ　、　Ｉｌｅ　％　Ｔｙｒ又は３−フェニルプロリンである：Ａ４及び／ 又はＡ３が共有結合である場合、Ｒはアルキル、アラルキル又はアリール置換基 で場合により置換された炭素原子２〜２０のアルカンジカルボン酸もしくはアル カンカルボン酸又はそれらの低級アルキルモノエステルであってもよい；好まし い置換基はイソプロピル、イソブチル、ベンジル又はフェニルであり、好ましい 鎖長は炭素原子３〜１０である。好ましい態様において、Ａ３はＶａｌ　、Ｎｌ ｅ　５Ｎｖａ　、　ｌｉｅ　、　Ｌｅｕ　５Ｔｙｒ又はＰｈｅである。Ａ２はＬ ｙｓ　ＳＡｒｇ　、　Ｏｒｎ　、　Ｃ１ｔ又はＨａｒｇである；Ａ４はＧｌｕ又 はＡｓｐである；ＲはＢｏｃ　、　Ｆｍｏｃ、　Ａｃ、　Ｅｔ。

Ｓｕｅ　、ＭｅＯ８ｕｃ、Ａｚ、ＭｅＯＡｚ　、、Ａｄ、ＭｅＯＡｄ　、Ｓｕｂ 　、ＭｅＯ９ｕｂ。

ＤＮＳ　％Ｄ［’　、　Ｚ又はＤ−アミノ酸である；Ｒ２はｐＮａ又はＡＮＣで ある。

第四の面において、本発明は下記式ＩＩを有するプロテアーゼの阻害剤を特徴と する： ＋Ｉ　：　ｌ？−Ａ４−＾３−Ａ２−Ｙ上記式中Ｒ，Ａ４、Ａ３及びＡ２は前記 のとおりである；Ｙはプロテアーゼの活性部位と反応性の基である。これらの阻 害剤は酵素“キマーゼ、酵素“多触媒プロテアーゼ又は関連酵素を阻害するそれ らの能力に由来した治療有用性を有する。これらの阻害剤としては保護基により それらのＮ末端で保護され及び酵素の反応部位近くに位置する官能基と強く相互 作用する部分Ｙと共有結合によりそれらのＣ末端で結合されたペプチド配列があ る。

Ｎ末端保護基は内在性アミノペプチダーゼにより分解されるその能力を減少又は 消失させることで組成物に代謝安定性を付与する。カルボキシル末端部分Ｙは酵 素を効果的に不活化するため酵素の活性部位において共有又は非共有結合形成で 媒介される強い化学的相互作用を起こす。

Ｙは酵素活性部位又はその近くで官能基と強く相互作用しかつアミド結合により アミノ酸Ａ２のカルボニル基に共有結合された基である。それは阻害される酵素 、例えばキマーゼ又は多触媒プロテアーゼの親油性置換基認識部位と相互作用す る親油性側鎖置換基Ｒ２及び遷移状態アナログを形成するため隣接セリンヒドロ キシル基と反応又は相互作用できる官能基Ｒ３で形成される（Ｒｌｃｈ、Ｐｒｏ ｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ｅｄ、Ｂａｒｒｅｔｔ及び５ａｌｖｅｒｓ ｅｎ。

Ｅｌｓｅｖｌｅｒ、１９８Ｂ、ｐ、１６７）。

ＹはＹが下記式ＩＩ＋を有する場合にアミノ酸アナログＹ−Ｈから誘導してもよ い： Ｉｌｌ：　−ＨＮ−ＣＨ−Ｒ３ 上記式中Ｒ２は炭素原子２〜１０の飽和もしくは不飽和アルキルもしくは置換ア ルキル基、炭素原子５〜１０の脂環式もしくは芳香族基又は炭素原子１１以内の アリールアルキル基である。適切なＲ２基の例としてはエチル、ｎ−プロピル、 イソプロピル、ｎ−ブチル、５ｅｃ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、ロー ヘキシル、イソへキシル、ｎ−デシル、フェニル、ベンジル、β−フェニルエチ ル、α−ナフチル、β−ナフチルメチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチ ル、アダマンチル、α−スチリル、β−スチリル及びプロパルギルがある。

適切なＲ３基の例としてはアルデヒド及びケトン官能基−Ｃ）１０、−Ｃｏ−Ｃ Ｈ、−Ｃｏ−ＣＨ２Ｃｌ−Ｃｏ−ＣＨ２Ｂｒ及びホウ酸残基、例えば−Ｂ−（Ｏ Ｈ）２、 −Ｂ　−０，−Ｂ　−０−（ＣＨ２）　ｑＯ−（ＣＨ２）ｐ　Ｏ−（ＣＨ２）ｑ −ＮＨ（ｐ及びｑは２又は３である）並びにα−ジケトン、例えばＯＯＯＯ がある。

他の適切なＲ３基としては−ＳＯＦ、−Ｃ６Ｈ４−８０２Ｆ及び−ＰＯ（ＯＲ４ ）Ｆ　（Ｒ４は低級アルキル又はアラルキル置換基である）がある。

追加の適切なＹ基としてはＰｏｗｅｒｓ及びＨａｒｐｅｒ。

Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ａ、Ｊ、Ｂａｒｒｅｔｔ及びＧ 、５ａｌｖｅｒｓｅｎ。

ｅｄｓ、、ＥＩｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８Ｂ、ｐｐ、１０８−１ ３２）で記載されたアシル化へテロ環系がある。これらの置換基は通常酵素活性 部位セリンと相互反応し、その後にヒスチジン側鎖のような他の隣接官能基と反 応する。このようなＹ基の例としてはＮ−置換サッカリン類並びにベンゾオキサ ジン−４−オン類、３−アルコキシ−４−クロロイソクマリン類、オキサジン− ２，６−ジオン類、置換イサト酸類、ハロメチルクマリン類、Ｎ−ニトロソイソ キノリノン類、ハロエノールラクトン類、イソベンゾフラノン類、インエノール テトラヒドロ−２−フラノン類、２−ピラノン類、クロロピロン類、クロロイソ クマリン類等の誘導体がある。

他のＹ基はα−アザアミノ酸及びそれらのアミド、エステルと下記式ＩＶのペプ チド誘導体から誘導してもよい：ｊ 上記式中Ｒ２は式ＩＩ＋で定義されたとおりである。Ｒ５はアミンもしくはアン モニア、アルコール又はアミノ末端で置換されたペプチド配列から各々誘導され る。このようなアザアミノ酸及びアザペプチドの合成の例はＪ、Ｇａｎｔｅ、５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ、４０５−４１３．１９８９で概説されている。

Ｒ５の好ましい基はβ−アミロイドのアミノ末端でみられるアミノ酸又はペプチ ド配列、例えばａｓｐ　５ａｓｐ−ａｌａ　。

ａｓｐ−ａｌａ−ｇｌｕ　、　ａｓｐ−ａｌａ−ｇｌｕ−ｐｈｅ並びにそれらの エステル及びアミドである。

好ましい態様において、Ｙは下記式を有する；上記式中Ｒ２は親油性側鎖置換基 、Ｒ３は遷移状態アナログを形成するためプロテアーゼのヒドロキシル基と反応 する官能基である；Ｒ２は炭素原子２〜１０を有する飽和もしくは不飽和アルキ ルもしくは置換アルキル基、炭素原子５〜１０を有する脂環式もしくは芳香族基 又は１１以下の炭素原子を有するアリールアルキル基である；Ｒ２はエチル、ｎ −プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル又は５ｅＣ−ブチル基である：Ｒ３は一 〇）ＩＱ、−ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２Ｃ１又はＣＯＣＨ２Ｂｒである；プロテア ーゼはキマーゼである；プロテアーゼは多触媒プロテアーゼである。

第五の面において、本発明はプロテアーゼを生物学的サンプルから少なくとも７ ０％、好ましくは９０％以上の純度まで精製するための方法を特徴とする。一方 法では生物学的サンプル、例えばヒト、ラット、ウシ又はブタのような哺乳動物 からの生物学的サンプルを界面活性剤含有の低塩緩衝液中でホモゲナイズする： ホモゲナイズされた組織から粒状分画を単離する；粒状分画を高塩緩衝液に溶解 する；可溶性分画を高塩緩衝液から分離する；プロテアーゼをイオン交換又はヘ パリンカラムに結合させ、しかる後それをそれらから溶出させる；プロテアーゼ をアフィニティカラムに結合させ、しかる後それをそれから溶出させる。

好ましい態様において、生物学的サンプルは脳、肝臓、心臓、骨格筋、白血球、 肥満細胞又は繊維芽細胞から単離される；低塩は０．５Ｍ以下の塩を含む；界面 活性剤はイオン系又はノニオン系、例えばトリトンＸ−１００である；粒状分画 はホモゲナイズされた組織から例えば３０，０００〜３００，０００Ｘｇで１５ 〜１２０分間にわたる遠心により分離される；高温は０．５Ｍ以上の塩である； 可溶性分画は例えば３０，０００〜３００．０００Ｘｇで１５〜１２０分間ニワ タル遠心ニより高温から分離される；プロテアーゼはヘパリンカラムに結合され るニブロチアーゼはキマーゼである；プロテアーゼは多触媒プロテアーゼである ；アフィニティカラムは酵素用の基質を含有している。このアフィニティカラム において、基質のアミノ末端は共有結合、好ましくはアミド結合によりキャリア カラム物質に結合される；最も好ましくは基質は下記式Ｖを有する：Ｖ・Ｗ−Ｘ −Ｙ−Ｚ 上記式中Ｗは不存在、アミノ酸又は例えば約５以内のＤ−もしくはＬ−アミノ酸 を含むペプチドである；Ｘは不存在であるかあるいはＰｈｅであるか又はＶａｌ であるか又はＶａｌの保存的アミノ酸置換基、例えばＬｅｕ　、目ｅ１Ｎｌｅ　 ５Ａｌａ及びＮｖａである：Ｙは疎水性アミノ酸、例えばＬｅｕ　、　ｌｌｅ　 、　Ｎｌｅ　、　Ｐｈｅ　、　Ｖａｌ　、Ｎｖａ　５ＰｒｏもしくはＬｙｓ又は Ｌｙｓの保存的アミノ酸置換基、例えば后ｇ１０ｒｎ　５Ｃｉｔ及びＨａｒｇで あるかあるいはＷが少なくとも２つのアミノ酸を含む場合Ｙはいずれかのアミノ 酸である；ＺはＭｅｔ　、　Ｐｈｅ　ｓ　Ｎｌｅ　、　Ｌｅｕ　、　Ｉｌｅ　５ Ｔｙｒ又は３−フェニルプロリンである。

一方、Ｗが不存在である場合、Ｘは不存在でもあるいはアルキル、アラルキル又 はアリール置換基によりα又はβ位で場合により置換された鎖長が炭素原子２〜 ２０のω−アミノアルカンカルボン酸であってもよい。好ましい置換基はイソプ ロピル、イソブチル、ベンジル及びフェニルであり、好ましい鎖長は炭素原子２ 〜８である。

第二の方法では組織を低塩緩衝液中でホモゲナイズする；可溶性分画をホモゲナ イズされた組織から単離する；プロテアーゼをイオン交換又はヘパリンカラムに 結合させ、しかる後それをそれらから溶比させる；プロテアーゼを濃縮し、それ をゲル濾過カラムに通すニブロチアーゼをヒドロキシアパタイト又はヘパリンカ ラムに結合させ、しかる後それをそれらから溶出させる。

第六の面において、本発明はアルツハイマー病の治療方法を特徴とする。その方 法では前記のような式Ｈの阻害剤を用意し、その阻害剤を薬学上許容されるキャ リア中において患者に投与する。

好ましい態様において、投与は脳内に直接行われる；投与は筋肉内、経口又は経 鼻である；プロテアーゼ阻害剤はキマーゼの阻害剤である；プロテアーゼ阻害剤 は多触媒プロテアーゼの阻害剤である。

第七の面において、本発明は候補キマーゼ阻害剤のスクリーニング方法を特徴と する。その方法は（ａ）キマーゼ基質（例えば、前駆Ｉに相当する基質）を１種 以上の候補キマーゼ阻害剤及びキマーゼと共にインキュベートする；及び（ｂ） １種以上の候補キマーゼ阻害剤がキマーゼによる基質の開裂速度を減少させるか 否かについて調べるステップを含む。

第への面において、本発明は候補多触媒プロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方 法を特徴とする。その方法は（ａ）多触媒プロテアーゼ基質（例えば、前駆Ｉに 相当する基質）を１種以上の候補多触媒プロテアーゼ阻害剤及び多触媒プロテア ーゼと共にインキュベートする；及び（ｂ）１種以上の候補多触媒プロテアーゼ 阻害剤が多触媒プロテアーゼによる基質の開裂速度を減少させるか否かについて 調べるステップを含む。

第への面において、本発明はＮｅｔ及びＡｓｐ間のβ−アミロイド前駆タンパク 質を開裂できる候補プロテアーゼのスクリーニング方法を特徴とする。その方法 では（ａ）配列：　ＥＶＫＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨ）ＩＱを有するペプチ ドを用意する；　（ｂ）候補プロテアーゼをそのペプチドと接触させる：及び（ Ｃ）候補プロテアーゼがその基質を開裂させるか否かについて調べるステップを 含む。

第九の面において、本発明はＭｅｔ及びＡｓｐ間のβ−アミロイド前駆タンパク 質を開裂できるプロテアーゼのスクリーニング方法を特徴とする。その方法では （ａ）配列Ｒ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｒｌを有する基質を 用意する（Ｒは水素又はＮ末端保護基である：Ｒ１はリポータ−基である）；　 （ｂ）候補プロテアーゼをその基質と接触させる；及び（ｃ）上記候補プロテア ーゼがその基質を開裂させるか否かについて調べるステップを含む。

第十の面において、本発明はアルツハイマー病にかかった患者の治療方法を特徴 とする。その方法では薬学上許容されるキャリア中においてキマーゼの阻害剤を 患者に投与する。

第十−の面において、本発明はアルツハイマー病にかかった患者の治療方法を特 徴とする。その方法では薬学上許容されるキャリア中において多触媒プロテアー ゼの阻害剤を患者に投与する。

“キマーゼの阻害剤″とはタンパク質のタンパク質分解開裂、特にβ−アミロイ ド前駆タンパク質のタンパク質分解開裂を触媒するキマーゼの能力を減少させる ことができる分子を意味する。

“多触媒プロテアーゼの阻害剤”とはタンパク質のタンパク質分解開裂、特にβ −アミロイド前駆タンパク質のタンパク質分解開裂を触媒するキマーゼの能力を 減少させることができる分子を意味する。

本発明はＡＰＰにおけるＭｅｔ−Ａｓｌ）結合を開裂しうる酵素を提供する。組 織中におけるこのような酵素の量はＡＤの診断上特徴的である；これらの検出法 はＡＤにとり迅速で簡単な非侵襲性のアッセイである。このような検出法は酵素 試験、ウェスタン、サザン又はノーザンブロフト技術による。更に、インビボに おける酵素活性の阻害はＡＤの進行を遅らせる。このような阻害は前記阻害剤と その酵素に対する抗体とに起因する。

本発明の他の特徴及び利点はその好ましい態様の以下の記載と請求の範囲から明 らかであろう。

好ましい態様の説明 図面が最初に簡単に記載される。

図面 図１は精製されたキマーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析について示す； 図２は脳キマーゼに関する精製経路の結果について示す： 図３は精製された脳キマーゼの部分アミノ酸配列（脳）及びラット肥満細胞プロ テアーゼ■の部分アミノ酸配列（ＲＭＣＰ　Ｉ）の比較表示である； 図４はキマーゼを精製するために用いられるカラムクロマトグラフィーの結果に ついて示した一組のグラフである； 図５はプロテアーゼ基質のデザインに用いられるβ／Ａ４タンパク質及びβ／Ａ ４タンパク質の領域の概略図である； 図６は基質脳キマーゼ（パネルＡ）、キモトリプシン（パネルＢ）及びカテプシ ンＧ（パネルＣ）の分解について示した一組のグラフである； 図７はキマーゼ分解で形成されるペプチドのＨＰＬＣ分析の結果について示した 一組のグラフである；図８は精製されたキマーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル分析について示す： 図９はキマーゼに関する精製経路の結果について示す一図１０はキマーゼを精製 するために用いられるカラムクロマトグラフィーの結果について示す；図１１は ラット脳キマーゼによる基質分解の動力学的分析の結果について示す； 図１２は阻害剤によるプロテアーゼ分解の阻害について示した一組のグラフであ る； 図１３は阻害剤による様々なプロテアーゼの阻害について示す； 図１４はプロテアーゼによる基質分解の阻害剤の効果について示す； 図１５はアルツハイマー病脳の様々な部分におけるプロテアーゼ活性のグラフ表 示である： 図１６はいくつかのプロテアーゼ阻害剤の構造につい本発明で有用な基質は前記 一般式Ｉを有する。それらは体組織及び液体中におけるアルツハイマー病に特徴 的なキモトリプシン様プロテアーゼのレベルを測定するために使用できる。これ らの組成物は、好ましくはそれらのアミノ末端で保護基により保護されかつ結合 がプロテアーゼで開裂された場合に放出されるリポータ−基にカルボキシ末端て アミド又はエステル結合により結合されたペプチド配列である。このようなペプ チド組成物には上記一般式の塩も含む。通常、アミノ酸アナログはそれらの同− 性及び配列がＡＰＰにおける酵素キマーゼ又は多触媒プロテアーゼの開裂認識部 位にすぐ隣接してかつその上流に位置するアミノ酸に実質上相当するか又はそれ と同一であるように選択される。

“上流”とは翻訳方向とは逆の方向、即ちペプチドのアミノ末端方向を意味する 。

“実質上相当する°とはペプチド配列が参照配列と同数のアミノ酸残基からなり 、その同−性及び配列が参照配列と比較して正確に相同的であるか又は保存的に 置換されていることを意味する。“保存的に置換された”とは所定のアミノ酸残 基が生物学的に類似した残基で置換されていることを意味する。保存的置換の例 としてはＮｌｅ　％　Ｍｅｔ　５Ｉｌｅ　％　Ｖａｌ　、Ｌｅｕ　％　Ｐｈｅ又 はＴｙｒのようなあるアルキル又は置換アルキル残基から他への互いの置換と　 Ｌｙｓ及びＡｒｇ；　Ｇｌｕ及びＡｓｐ；又はＧｌｎ及びＡｓｎのようなある極 性残基から他への置換がある。“残基”とはアミノ酸又はアミノ酸アナログのい ずれかを意味する。

化合物の許容される塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウ ム及びアンモニウム塩を含めた遊離ペプチド酸の塩並びに塩酸、硫酸、リン酸、 酢酸、クエン酸又はトリフルオロ酢酸のような無機及びａ機酸双方の含めた遊離 ペプチド塩基の酸付加塩がある。

本発明の好ましい化合物としては、Ａ１が基Ｐｈｅ　。

Ｍｅｔ　ｓ　Ｌｅｕ　５ｌｌｅ　５Ｎｌｅ　５Ｔｙｒ又は３−フェニルプロリン から選択される；Ａ２が基Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ　ｓ　Ｏｒｎ　％ＣＨ又はＨａｒ ｇから選択される；Ａ３が基Ｖａｌ　、Ｌｅｕ　５Ｉｌｅ　。

Ｎｌｅ　、　Ｐｈｅ　５Ｎｖａ　％　Ｐｒｏから選択されるかあるいはＤ−アミ ノ酸又は共有結合（即ち、Ａ４はＡ２に直接結合されているか又はＡ４が共有結 合である場合ＲはＡ２に直接結合されている）である、Ａ４がＧｌｕ　ｓ　Ａｓ ｐ　５Ｄ−ＧｌｕもしくはＤ−Ａｓｐであるか又は共有結合（即ち、Ｒは八３に 直接結合されている）である；Ｒが前記のような保護基の１つ又はＤ−アミノ酸 である。Ｒ１がｐＮａ及びＡＭＣから選択される式１のペプチド誘導体がある。

このような化合物の具体例は図１１及び１３で示されている。

阻害剤は前記一般式ＩＴを有する。これらは基質と同様にデザインされるが、但 し前記のような反応性Ｃ末端基を有する。このような阻害剤の具体例としては図 １２．１３及び１６で示されたものがある。

上記組成物は体組織及び液体中における酵素キマーゼ及び多触媒プロテアーゼの レベルを測定しかつそれらの活性を阻害するために使用できる。これらの組成物 は通常保護基によりアミノ末端で保護されたペプチド又は擬似ペプチド配列であ る。これらの化合物は前駆ペプチド誘導体、例えばＲ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＨ とアミノ酸誘導体＋（−Ａ　Ｉ　−Ｒ１又はトＹ各々との反応から製造できる。

ペプチド前駆体は”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｌｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｌｓ、５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ。

Ｂｌｏｌｏｇｙ”、Ｖｏｌｕｍｅ　Ｉ（１９７９）、Ｇｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ、 （ｅｄｓ、）。

Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅｓｓで記載された液相技術又は上記シリーズのＶｏｌ ｕｍｅ　１１　（１９８０）で記載された固相技術のいずれかを用いて周知の合 成操作により製造される。

適所に保護基を有するペプチド前駆体Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＲはＭｅｒｇｌ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、２９：４００９（ １９８ｇ）で記載され及びベーチェムφバイオサイエンシス社（Ｂａｃｈｅ＋ｓ 　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｌｎｃ、）−フイラデルフイア、ＰＡ。

１９１０４から名称“サスリン”（Ｓａｓｒｉｎ）として市販された支持樹脂を 用いて固相法により製造される。そのペプチド配列は＾ｔｈｅｒｔｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、ｃｈｅＬｓｏｃ、、ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　Ｔ、 ２０５７（１９８５）で記載されたようにベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジ メチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェ　）（ＢＯＰ）のようなカ ップリング試薬の存在下でアミノ酸Ａ２のフルオレニルメトキシカルボニル誘導 体（Ｆｍｏｃ−Ａ２）から始めるアミノ酸誘導体による樹脂の連続処理しかる後 ＦＩＩｏｃ保護基を除去するためピペリジンによる処理から樹脂上で組立てられ る。ＢＯＰ試薬の使用はＣａ５ｔｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ。

７５１−２（１９７［ｉ）で記載されている。

次いで八３のＰｍｏｃ誘導体及びＲ−Ａ４の対応成分（下記参照）が加えらえ、 連続的アミノ酸添加の間にピペリジンでＦ■Ｏｅを脱保護する。アミノ酸Ａ２、 八３及びＡ４の官能基側鎖は下記のように保護される：リジンはｔ−ブトキシカ ルボニル（Ｂｏｃ）基で保護される；ヒスチジン及びシスティンはＮ−トリフェ ニルメチル（トリチル）基で保護される；アルギニンは４−メトキシ−２，３， ６−ドリメチルフエニルスルホニル（Ｍｔｒ）基で保護される；チロシン、セリ ン及びトレオニンはｔ−ブチルエーテル（ｔ−Ｂｕ）として保護される；グルタ ミン酸及びアスパラギン酸はｔ−ブチルエステル（Ｏｔ−Ｂｕ）として保護され る。

これらの具体的な保護基は樹脂上でペプチドＲ−Ａ４−Ａ３−Ａ２の固相合成中 に及び塩化メチレン中トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の希溶液で樹脂からペプチド 前駆体Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＨの開裂中にペプチド−樹脂複合体上で留まる 。

一方、このペプチド前駆体はＧｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ。

前掲（ｖｏｌｕｒＡｅ　ｌ）で記載された戦略を用いて液相法により組立てても よい。液相戦略はＡ４が１又は２のアミノ酸である短いペプチドと特にうまく適 している。このためＡ４が単一アミノ酸である場合、ペプチドはＮ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルとしてＡ４のＦＩｌｏＣ誘導体（Ｆｍｏｃ−Ａ４−Ｏ３ ｕ）をアミノ酸Ａ３の緩衝液と反応させることにより組立てられる。次いで得ら れたＦｍｏｃ−Ａ４−Ａ３−０）１はＦ！ｔｏｅ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＢＺＩ を得るためアミノ酸Ａ２のベンジルエステル（Ａ２−ＯＢｚｌ）と反応させるこ とができる。一方、Ｆｓｏｃ−Ａ４−Ｏ３ｕは同様の生成物を得るためジペプチ ドエステルＡ３−Ａ２−０Ｂｚｌと直接反応させてもよい。

次いでＦｉｏｃ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＢｚｌはＦｍｏｃ保護基を除去するため ピペリジンで処理され、Ｒ−Ａ５−Ａ４−Ａ３−＾２−ＯＢｚｌを得るためＢＯ Ｐの存在下でＲ−Ａ５　（Ａ　５は任意のアミノ酸である；下記参照）と反応さ せることができる。一方、Ｆｍｏｃ−＾３−＾２−ＯＢｚｌが製造され、Ｒ−Ａ ４−Ａ３−Ａ２−ＯＢｚｌを得るためこの方法を用いて反応させてもよい。

末端基Ｒ−Ａ５　（又はＲ−Ａ４）はＲのアシル化誘導体による側鎖保護末端ア ミノ酸基Ａ３−ＯＨの処理から製造される。

このためＲがアシル（例えば、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アル コキシカルボニル、アリールオキシカルボニル又はアラルキルオキシカルボニル ）又はスルホニル（例えば、アリールスルホニル、アルキルスルホニル又はアラ ルキルスルホニル）官能基である場合、基Ｒは炭酸水素ナトリウム又はＮ−メチ ルモルホリンのようなｐＨ緩衝剤の存在下でＲの酸クロリド（Ｒ−Ｃ１）、Ｒの 対称無水物（Ｒ−ＯＲ）、Ｒの混合炭酸無水物（例えば、Ｒ−ｏ−ｃｏｏ−イソ ブチル）又は好ましくはそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなＲ の活性エステルを用いて側鎖保護基Ａ３−ＯＨに結合させてもよい。

Ｎ末端基ＲがＤ−アミノ酸である場合、それはＢｏｃ−Ｒ−Ａ５−０）１を得る ためＲのＢｏｃ誘導体として側鎖保護アミノ酸官能基Ａ３−ＯＨに加えられるこ とが最も都合よい。次いでＢｏｃ保護基は保護ペプチドの合成中に保有され、Ｔ ＦＡとの処理で最後に除去される。

次いで前記のように製造された側鎖保護Ｐｉｏｃ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＢｚｌ はピペリジンで脱保護されてＡ４−Ａ３−Ａ２−０Ｂｚｌを生じ、しかる後これ はＢＯＰ又はジイソプロピルカルボジイミドを用いて側鎖保護１？−Ａ５−ＯＨ と縮合されてＲ−Ａ５−Ａ４−Ａ３−Ａ２−ＯＢｚｌを生じる。この後者の化合 物の化学的還元又は接触水素添加から側鎖保護前駆ペプチド誘導体を得る。

次いでこの側鎖保護前駆ペプチドは活性エステル又は混合無水物に変換され（Ｇ ｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｉ、前掲）、しかる後これはＨ−Ｙと反 応されて式１１の阻害剤を生じる。

基質化合物１（−Ａｌ−Ｒ１は購入されるか又はＨ−Ｒ１によるＢｏｃ−Ａ１の 活性エステルの処理しかる後塩酸又はＴＦＡによる得られたＢｏｃ−ＡＩ−Ｒ１ の処理から製造される。このためＢｏｃ−Ｐｈｅヒドロキシスクシンイミド〔フ ル力・ケミカル社（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）、ロンコンコ ア　、　Ｎ、Ｙ、］はＢｏｃ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを得るためｐ−ニト ロアニリンで処理される。このＴＦＡによる処理からＰｈｅ−ｐ　−二トロアニ リドを得る。

化合物Ｈ−Ｙは文献で詳細に記載された方法により合成される： Ｈ−Ｙがα−アミノアルデヒドである場合（即ち、Ｒ３はＣＨＯである）、対応 メチル、エチル又はブチルアセタールはＧａｃｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ、３０．４２３３（１９７４）又は１９８８年５月５日付で出願さ れたＥｄｖａｒｄｓの欧州特許出願第２９１２３４号明細書で記載されたように 製造される。

Ｈ−Ｙがクロロメチルケトンである場合（即ち、Ｒ３はＣＯＣＨ２Ｃ１である） 、クロロメチノはトンの塩酸塩は購入されるか（ベーチェム・バイオサイエンス 社、フィラデルフィア、ＰＡ、）又はＢｏｃ保護アミノ酸から混合炭酸無水物へ の変換しかる後ジアゾケトンを得るためジアゾメタンと次いで無水塩化水素との 反応により製造することができる（Ｋｅｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、。

１８２：５８（１９７４）及びＦｉｔｔｋａｕ、Ｊ、Ｐｒａｋｔ、Ｃｈｅｍ、、 ３１５：１０３７゜１９７３）。対応ブロモメチルケトン（即ち、Ｒ３はＣＯＣ Ｈ２Ｂｒである）は塩化水素に代わる臭化水素の代用で同様に製造される（Ｃ， Ｋｅｔｔｎｅｒら、前掲）。対応メチルケトンはメタノール中でパラジウム炭に よるクロロメチルケトンの水素添加分解から製造される（Ｋｅｔｔｎｅｒら、米 国特許第４．６５２，５５２号）。

Ｈ−Ｙがボロアミノ酸（即ち、Ｒ３はＢ（ＯＨ）２である）誘導体である場合、 ボロアミノ酸の環状エステルは実質上５ｈｅｎｖｉの米国特許第４．５３７，７ ７３号明細書で記載されたように製造されるが、前駆ペプチドへのカップリング 後に５ｈｅｎｖｉ及びＫｅｔｔｎｅｒの米国特許第４，４９９゜０８２号明細書 とＪ　、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｇ＋、　、　２５９　：１５１０Ｂ　（１９８４） で記載されたように場合により遊離ペプチドホウ酸に変換してもよい。

Ｈ−Ｙがα−ジケトン又はα−ケトエステルである場合（即ち、Ｒ３はＣ０ＣＯ ＣＨ又はＣ０Ｃ００Ｃ２Ｈ５である）、必要なアミノジケトン又はα−ケトエス テルはＡｎｇｅｌａｓｔｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、３３： １３（１９９０）及びそこの参考文献で記載されたように製造される。

Ｈ−Ｙがトリフルオロメチルケトンである場合（即ち、Ｒ３はＣ０ＣＦ３である ）、必要なアミノケトンは＋５ｐｅｒｉａ＋＋及びＡｂｅｌｅｓ、Ｂｌｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、２５：３７６０及び補足頁（１９１！６）で記載されたように製 造される。

式ＩＩ、ＩＩ＋及びＶにおけるアミノ末端置換基Ｗ及びＲは対応カルボン酸Ｖ− ＯＨ及びＲ−０）１から誘導されるが、これらは〔例えばＩＬ、シカゴのナーチ ェム社（Ｎａｒｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から〕市販されているか又 は当業者に周知の技術を用いて下記段落で記載されたように製造される。

アミノアルカンカルボン酸（式Ｖ化合物に関して要求されるＶ−ＯＨ）はアルキ ル又はアリールアルキルプロミドしかる後ω−フタルイミド−α−ブロモアルカ ンによるマロン酸エチルの連続アルキル化から製造される。得られた置換マロン 酸エステルはマイルドな塩基で加水分解され、マイルドな酸との処理で脱カルボ キシル化されて、ω−フタルイミド−α−アルキル（又はアリールアルキル）置 換アルカンカルボン酸を生じる。この中間体はアルンツ・アイスタート（Ａｒｎ ｄｔ　Ｅｉｓｔｅｒｔ）ホモロゲーション反応（Ｅｌｓｔｅｒｔ　ｉｎ″Ｎｅｖ ｅｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＰｒｅｐａｒａｔｌｖｅＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ−，１：５１３）により鎖延長される。最後に、強塩基加水分解が フタルイミド保護基を除去してＷ−ＯＨを得るために用いられる。

式Ｉ及び１１で要求される置換アルカンカルボン酸（Ｒ−０）１）も同様にアル キル又はアリールアルキルプロミドによるマロン酸エチルの連続アルキル化しか る後前記のようにマイルドな塩基性加水分解及びマイルドな酸膜カルボキシル化 から製造される。得られたα−置換アルカンカルボン酸はアルンツーアイスター ト争ホモロゲーション反応により前記のように延長してもよい。

置換アルカンカルボン酸（式Ｉ及びＩ＋においであるケースで要求されるＲ−Ｏ Ｈ）のω−モノエステルはアルキル又はアリールアルキルプロミドによるマロン 酸エチルの連続アルキル化しかる後ω−ブロモ（又は−クロロ）アルカンカルボ ン酸のメチル又はエチルエステルによるアルキル化から製造される。マイルドな 酸加水分解及び脱カルボキシル化の後に、得られたα−置換アルカンジカルボン 酸ω−エステルはアルンツーアイスタート・ホモロゲーション反応により前記の ように延長される。

得られたラセミカルボン酸（トＯＨ及びＲ−ＯＨ）はキラルクロマトグラフィー 力ラム通過により又はキニン、シンコニン、ブルシン等のような不斉塩基のジア ステレオマー塩への変換しかる後分別結晶化によりそれらのエナンチオマー形に 分割してもよい。

例１；前駆ペプチドの製造 これらの化合物はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８８：１８３９．１９Ｂ４）又 は混合炭酸無水物（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、ｃｈｅｓ、ｓ ｏｃ、。

８９：５０１２，１９８７）を用いて液相法により製造した。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは分子当量のＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド及び分子当量のジイソプロピルカルボジイミド＜ＤＩＰＣＤＩ）によるジオ キサン２５１中保護アミノ酸又はペプチド２ｇの溶液の処理から製造した。その 溶液を室温で一夜攪拌し、しかる後溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を酢酸エチ ルに溶解し、水、５％水性クエン酸及び再度水で洗浄した。混合液を（ＭｇＳ０ ４）乾燥し、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターにおいて減圧下で除去し た。得られた固体生成物の純度は薄層クロマトグラフィーにより確認した。

Ｐｇ＋ｏｃ−Ｖａｌ２．　０　ｇＳＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．７５ｇ及 びＤＩＰＣＤＩ　０　、　７０　ｓｏｌからＦｓｏｃ４ａｌ　−Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｏｓｕ）　２．６ｇを得た。ジオ キサン６０１中コハク酸モノメチルエステル６．５ｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシン イミド６．１ｇ及びＤＩＰＣＤＩ６　、　５　ｍｌからメトキシスクシニルＮ− ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭｅＯ８ｕｃ−Ｏｓｕ）８．４　ｇを得た 。最後のケースにおいて水洗は生成物の有意の喪失を起こし、このため最少量の 水が用いられたことがわかった。

これらのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは下記のように高収率でペプチ ドを得るため水性又は部分的水性溶液中でアミノ酸の一級又は二級アミノ基と容 易に反応する活性エステルと呼ばれる化合物の群に属する：ａ　）　ＭｅＯ３ｕ ｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）水５１及びトリエチルアミン０．４１中グルタミン酸− γ−ｔ−ブチルエステル１．Ｏｇの溶液をジオキサン１０１１中ＭｅＯ３ｕｃ− Ｏｓｕｌ　、１　ｇの溶液で処理した。その溶液を３時間攪拌し、有機溶媒をロ ータリーエバポレーターにおいて減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル５０１１ に溶解し、得られた溶液を水で１回、５％水性クエン酸で３回及び最後に水で洗 浄した。有機層を（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。残留 淡黄色油状物をエーテルに溶解し、ジシクロヘキシルアミン４００μｇを加えた 。得られた結晶沈澱物を濾取し、少量のエーテル及び石油エーテルで洗浄した。

Ｎ−メトキシスクシニルグルタミン酸γ−ｔ−ブチルエステル（ＭｅＯ８ｕｃ− Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ））の収率は０，９ｇであった。

ｂ　）Ｐｓｏｃ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ（ＢｏＣ）水１０１１及びＮ−メチルモルホリ ン（ＮＭＭ）０．４０ｓｌ中ε−ｔ−ブチルオキシカルボニルリジン１、Ｏｇの 懸濁液をジオキサン１０１１中Ｐｓｏｃ−Ｖａｔ−Ｏｓｕｌ、３ｇの溶液で処理 した。最初濁った懸濁液は一夜攪拌後透明になった。得られた溶液を２％炭酸水 素ナトリウム水溶液２０ｍ１で処理し、エーテルで２回抽出した。

エーテル抽出液を捨て、水溶液を希塩酸でｐＨ１，５に酸性化し、７５■１ずつ 酢酸エチルで３回抽出した。合わせた抽出液を水で１回洗浄し、（Ｍｇ’５Ｏ４ ）乾燥し、溶媒を減圧下で除去し、固体物Ｆｌｏｅ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ（ＢｏＣ） １．２ｇを得た。

ｃ　）　ＭｅＯ３ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ塩化メチレン５ ０ｍ１中Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−ＯＢｚｌｌｌ。６ｇの溶液を ピペリジン２０ｉ＋１で処理し、室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去 し、残留した微量のピペリジンを少しずつ酢酸エチルの反復添加及び蒸発により 除去した。残留したγ−ｔ−ブチルグルタミルバリンベンジルエステルは淡黄色 固体物であった。それをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメチルスルホキ シド（ＤＭＳＯ）　のｌ　：　１混合液３０ｍ１！、：溶解し、メトキシコハク 酸４０ｍ１ｏｌ（５，２８ｇ）から得たモノメチルコハク酸Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステルの溶液と混ぜた。この溶液にＮＭＭ２．６ｍｌを加え、反応 混合液を室温で一夜攪拌した。酢酸エチル（２５Ｃ１＋１）を加え、得られた溶 液を水１００１で１回、３％クエン酸１００１で３回、２％炭酸水素ナトリウム １００１で３回及び最後に水１００１で抽出した。有機層を（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４ ）乾燥し、蒸発させて、淡黄色固体物Ｎ−メトキシスクシニルγ−ｔ−ブチルグ ルタミルバリンベンジルエステル７．８ｇをｍた。

ｄ　）　ＭｅＯ９ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−Ｏｓｕ酢酸６０１中Ｍｅ Ｏ８ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ　７．６　ｇの溶液を５０％ 水中１０％パラジウム炭素２ｇと混ぜ、４０ｐｓｉ（約２．８　ｋｇ／ｃｄ）で ３．５時間水素添加した。

生成物を濾過し、溶媒を蒸発させて、粘着性固体物メトキシスクシニルγ−ｔ− ブチル−グルタミル−バリン７．１ｇを得た。この生成物をテトラヒドロフラン （ＴＨＦ）６０ａｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｇ及びＤＩ ＰＣＤＩ　２　、　６　ｉｆを加えた。反応混合液を一夜攪拌し、しかる後溶媒 を蒸発させた。残渣を酢酸エチル２００ｍ１と共に攪拌し、沈澱したジイソプロ ピル尿素を濾去し、捨てた。濾液を水１００ｍ１．２％炭酸水素ナトリウム（３ Ｘ　１００１）及び水１００１で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、しかる後蒸発さ せた、得られた固体物メトキシスクシニルｔ−プチルグルタミルノくリンＮ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステルは８．２ｇであつた。

ｅ　）　ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＢｏＣ）上記で 製造されたＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−Ｏｓｕ　（８、２ｇ） をＴＨＦ７０ｉ１に溶解し、水６０１及びトリエチルアミン２．　６＋＋ｌ中ε −ｔ−ブチルオキシカルボニルリジン４．９ｇの溶液に加えた。−夜攪拌後に反 応混合液を２％炭酸水素ナトリウム溶液１００１で希釈し、エーテルで抽出した 。水溶液を３％クエン酸で酸性化し、１００ｍ１ずつ酢酸エチルで４回抽出した 。合わせたを機層を水１００　ｍｌテ洗浄し、（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）乾燥し、蒸 発させて、吸湿性固体物メトキシスクシニル−γ−ｔ−ブチルオキシカルボニル リジン７、Ｏｇを得た。

ｆ　）　Ｐｉｏｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−ＯＢｚｌこの化合物と次の例 におけるいくつかはＡｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔａｌ、　、　Ｊ、Ａ＋ｇ、Ｃｈｅｍ 、Ｓｏｃ、　、　８９：　５０１２（１９８７）の方法の修正法により製造した 。

無水ＤＭＦ８０ｉｌ中Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−γ−ｔ−ブチルグ ルタミル酸８．　５　ｇ　（２０ｓｖｏｌ）の溶液をＮＭＭ２．２ｉ１で処理し 　乾燥アルゴン下で一２０℃まで冷却した。次いでクロロギ酸イソブチルを全量 で２．　６ｉ１？Ｉｉ下した。溶液を１０分間攪拌し、ＤＭＦ５０１中バリンベ レバリンベンジルエステル塩酸塩６２５　ｍ５ｏｌ）及びＮＭＭ３．３ｍｌの前 冷却（−２０℃）混合液をゆっくりと加えた。反応混合液を一夜攪拌し、しかる 後酢酸エチル３００ｍ１に溶解し、水（ＩＸ１００■Ｉ）、３％クエン酸（３Ｘ 　１０　Ｃ１＋ｌ）で連続洗浄し、（ＭｇＳ０４）乾燥し、蒸発させた。残渣を 酢酸エチルに溶解し、エーテルで希釈して、綿毛状白色結晶フルオレニルメトキ シカルボニル−γ−ｔ−ブチルーグルタミルーバリンベンジルエステル１１．８ ｇを得た。

例２：ベブチド基質の製造 ａ　）　Ｆ＋ｇｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｎｅｔ−ｐＮａＤＭＦ１０ｍ ｌ中Ｆａ＋ｏｃ４ａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｅ）　１　、　１　ｇ　、　Ｂ　ＯＰｏ、 ８ｇ及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（）ＩＯＢｔ）　１　、　３　ｇの 溶液を１０分間攪拌した。次いでＤＭＦ５１及びＮＭＭｏ、３ｍｌ中メチオニン ｐ−ニトロアニリド０．６ｇ及び酢酸１．５ｍｌの溶液を加えた。反応混合液を 一夜攪拌し、酢酸エチル７５１で希釈した。溶液を水（２Ｘ３０１）　、２％炭 酸水素ナトリウム（３Ｘ　３０Ｉｌｌ）　、水（ＩＸ３０ｍｌ）、３％クエン酸 （２Ｘ３０ｍｌ）及び水（ＩＸ３０ｏ＋Ｉ）で洗浄し、（ＭｇＳ０４）乾燥し、 減圧下で蒸発させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、エーテルを加えて、淡黄色固 体物フルオレニルメトキシカルボニル−バリル−ε−ｔ−ブチルオキシカルボニ ル−リシル−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド１，５ｇを沈澱させた。

ｂ　）　Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｍｅｔ−ｐＮａ塩化メチレン２０１中ＦＩ Ｉｌｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＢｏＣ）−Ｎｅｔ−ｐＮａｌ、５ｇの溶液をピロリ ジン１０１１で処理した。２０分間後に溶媒を減圧下で蒸発させた。残留した微 量のピロリジンを酢酸エチルで反復希釈しかる後減圧蒸発により除去した。得ら れた固体物：バリル−ε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−リシル−メチオニン− ｐ−ニトロアニリドは石油エーテルで洗浄後１．３５ｇであった。

ｃ　）　ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ｐＮａＤＭＦ１０ｍ ｌ中ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）ジシクロヘキシルアミン塩０　、　８　 ｇ　ＳＶａｔ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｍｅｔ−ｐＮａｌ　、３　ｇ　、　ＨＯＢｔ ２００ｍｇ、ＢＯＰ　０．６６ｇの溶液をＮＭＭ１００μｇで処理した。反応混 合液を３日間攪拌し、しかる後酢酸エチルで希釈し、前記のように水、クエン酸 、炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。有機層を（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）乾燥し 、蒸発させて、淡黄色固体物を得、これをクロロホルム中シリガゲル８５ｇで調 製されたカラムからの溶出により精製した。クロロホルム１５０１で溶出した第 一分画を捨てた。次いで生成物をクロロホルム９２％メタノールの溶液３００ｉ １で溶出させた。得られた溶出液を蒸発させて無色固体物（０，４５ｇ）を得、 これを塩化メチレン１０ｍ１及びＴＦＡｌｏｍｌに溶解した。２０分間後に溶媒 を減圧下で蒸発させて綿毛状白色固体物メトキシスクシニル−グルタミル−バリ ル−リシル−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド２７０ｍｇを得、これを０，１％ ＴＦＡ含有１０〜８０％アセトニトリルの勾配を用いて水中で高圧液体クロマト グラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により精製した。純粋な生成物は８０ｍｇであった 。

ｄ　）　ＭｅＯ９ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ｐＮａこの化合物と 下記の２つは混合炭酸無水物操作により製造した。ＤＭＦｌｏｉｌ及びＮＭＭｏ 、３３ｍ１中ＭｅＯ３ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）　 １　、９３　ｇ　（３，０ｇｍｏｌ）の溶液を一２０℃に冷却し、クロロギ酸イ ソブチル０．３９ｍ１を加えた。反応混合液を一２０℃で１０分間攪拌し、この 及び下記２つのセクションのために３分割した。

ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｔ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の混合炭酸イソ ブチル無水物１．２ｍｍｏｌ含有の反応溶液４０％部分をアルゴン下で一１５℃ に冷却されたＤＭＦ５ｍｌ中フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ベーチェ ム・バイオサイエンシス、フィラデルフィア、ＰＡ、）２８５ｏ＋ｇの溶液に加 えた。３０分間後に反応混合液を氷水に移し、２．５時間かけて室温まで加温し た。次いで反応混合液をエーテル２０１で希釈して固体物を沈澱させ、これを濾 取し、エーテル及び石油エーテルで洗浄し、乾燥させた。この固体物を塩化メチ レン及びＴＦＡの１＝１混合液１０１に溶解した。１５分間後に溶媒を減圧下で 蒸発させ、残渣をエーテルで摩砕し、粗製固体物メトキシスクシニル−グルタミ ル−バリル−リシル−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリドを得た。これを０ ，１％ＴＦＡ含有２５〜９０％アセトニトリルの４０分間勾配を用いて０．１％ ＴＦＡ含有水中でＨＰＬＣにより精製した。

ｅ　）　ＭｅＯ３ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ｐＮａこの化合 物は前セクション（ｄ）で記載された操作により得たが、但しＤ−フェニルアラ ニン−ニトロアニリドをＬ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリドの代わりに 用いた。

ｆ　）　ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ｐＮａこの化合物は 前セクション（ｄ）で記載された操作により得たが、但しロイシン−ｐ−ニトロ アニリドをフェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリドの代わりに用いた。

図１１で示された他のプロテアーゼ基質も同様の方法これらの化合物は前例で記 載された混合炭酸無水物操作により製造した。一般に、完全に保護された前駆ペ プチドカルボキシレートを混合炭酸イソブチル無水物に変換し、場合によりエス テル、エーテル又はアセタールとして保護されたその遊離官能基を有するＡ１残 基の遊離アミノ基と低温で反応させる。

ａ　）　ＭｅＯ３ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−フェニルアラニンクロロメチ ルケトン〔Ｎ−メトキシスクシニル−グルタミル−バリル−リシル−（１−クロ ロ−４−フェニル−２−ケト−３−ブチルアミド）〕 メトキシスクシニル＝γ−ｔ−ブチル−グルタミル−バリル−ε−ｔ−ブトキシ カルボニルリジンの混合炭酸イソブチル無水物はこの保護された前駆ペプチド１ ．９３ｇ　（３，０−膳ｏ１）をＤＭＦ　１０■Ｉ及びＮＭＭｏ、３３ｍ１に溶 解させて製造した。その溶液を乾燥アルゴン下で一２０℃に冷却し、クロロギ酸 イソブチル０．３９ｍ１を加えた。この反応混合液を一２０℃で１０分間攪拌し 、この及び下記２つのセクションのために分割した。

反応溶液（前駆ペプチド混合炭酸無水物０．６膳■ｏ１含有）の２０％部分を取 出し、フェニルアラニンクロロメチルケトン塩酸塩（ベーチェム・バイオサイエ ンシス。

フィラデルフィア、ＰＡ、）１４２ｍｇ（０，５ａ＋ｅｏｌ）の溶液に加えた。

得られた溶液を室温で３時間攪拌し、しかる後エーテルで希釈し、濾過した。

濾液を石油エーテルで希釈してＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）４ａｌ−Ｌｙ ｓ　（Ｂｏｃ）−フェニルアラニンクロロメチルケトンを沈澱させ、これを濾取 した。この生成物を塩化メチレン及びＴＦＡの１＝１混合液１０■１に加えた。

１５分間後に溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をエーテルで摩砕して固体物Ｍｅ Ｏ８ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−フェニルアラニンクロロメチルケトンを得 た。これをＣ１８カラムで０．１％水性ＴＦＡ中ＨＰＬＣにより２５〜９０％ア セトニトリルの４０分間勾配で精製した。

ｂ　）　ＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ボロフェニルアラニンピナコ ールエステル 前セクション（ａ）で製造された ＭｅＯＳｕｃ−Ｇ　Ｉ　ｕ　（ｔ−Ｂｕ）　−Ｖａ　ｌ　−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ） の混合炭酸無水物の２０％部分を一１５℃に冷却されたＤＭＦ２ｓｌ中ボロフェ ニルアラニンピナコールエステル（Ｓｈｅｎｖｉ、米国特許第４．５３７，７７ ３号明細書；　５ｈｅｎｖｉ及びＫｅｔｔｎｅｒ、Ｊ。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｖ、、２５９．１５１０８．１９８４）　１４２　ｍｇで処理 した。溶液を一１５℃で３０分間攪拌し、しかる後水中におき、２．５時間かけ て室温まで加温した。反応混合液をエーテルで希釈し、濾過した。濾液を蒸発さ せ、残渣をクロロホルムに溶解し、シリカゲル（Ｌｏｇ；Ｅ、メルクキーゼルゲ ル１００）カラムにいれた。生成物をクロロホルム：メタノール１：１で溶出さ せ、分画を薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）でモニターした。

溶出液を蒸発させ、残渣を塩化メチレン：　ＴＦＡＩ　：１１０１に溶解して保 護基を除去した。１５分間後に溶媒を蒸発させ、残渣をエーテルで摩砕した。得 られた固体ペプチド生成物をセクション（ａ）で用いられた場合と同様の条件を 用いてＨＰＬＣにより精製した。

ｃ　）　ＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ボロノルロイシンピナコール エステル 前セクション（ａ）で製造されたＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ− Ｌｙｓ（Ｂｏａ）の混合炭酸無水物の２０％部分をＤＭＦ２１中ボロノルロイシ ンピナコールエステル（５ｈｅｎｖｉ及びＫｅｔｔｎｅｒ、前掲で記載された方 法により製造）８３ＩＩｇで処理した。反応、後処理及び精製を前記（ｂ）でボ ローＰｈｅアナログに関して記載されたように実施した。

ｄ　）　ＭｅＯＳｕｃ−（ｌｉｔｕ−１／ａｔ−Ｌｙｓ−ノルロイ；／ナル混合 炭酸無水物２　、　０　ｇａｏｌの溶液を前セクション（ａ）で記載された操作 によりＭｅＯＳｕｃ−Ｇ　ｌ　ｕ　（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｙｓ　（Ｂｏ ｃ）１．２９　ｇＳＤＭＦ７ｓＬ　ＮＭＭｏ、２２ｍ１及びクロロギ酸イソブチ ル０．２５ｍ１から製造した。

得られた溶液をＤＭＦＢｍｌ中ノルロイシナル　ジ−ｎ−ブチルアセタール（Ｇ ａｃｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３０：４２３３．１９７４ ）　５００　Ｂの溶液に加えた。反応を前セクション（ｂ）で記載されたように 実施及び後処理し、得られた生成物をＨＰＬＣにより精製した。

ｅ　）　ＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−フェニルアラニンルこの化合 物は例３Ｄの操作により製造したが、但しフェニルアラニナルジエチルアセクー ルをノルロイシナル誘導体の代わりに用い、１：１塩化メチレン／ＴＦＡで１時 間の脱保護を用いた。生成物をＨＰＬＣで精製し、構造を高速原子衝突質量スペ クトル測定（ＦＡＢ−ＭＳ）により確認した。要求Ｍ＋１−６２０゜実測値Ｍ＋ １−６２０゜ ｆ　）　ＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ４ａｌ−Ｌｙｓ−Ａｚａ−Ｐｈｅ−ＮＨ，。

シアン化カリウム（０，７３ｇ、０．００９ａ＋ｏｌ）を水５１及びジオキサン ５１中３−ベンジルカルバジン酸ｔ−ブチル１．００ｇ　（０，００４５ｍｗｏ ｌ）及び４Ｎ塩酸４．５１の溶液に３０分間かけて少しずつ加えた。混合液を一 夜攪拌し、白色結晶生成物を濾取し、水性２０％クエン酸、水で洗浄したところ 、真空乾燥後で０，８１ｇであった。この固体物を酢酸エチル−ヘキサンから再 結晶化して、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−α−アザフ二二ルアラニンアミド（ Ｂｏｃ−ＡｚａＰｈｅ−ＮＨ２）　０　、　６３　ｇを得た；　ｍ、ｐ、１３１ −１３１５℃［：Ｌｉｔ、ｓ、ｐ、１２４−１２５℃、Ｄｕｔｔａｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｌ、ｎ　！　（１９７５）１７１２　）ジオ キサン５１中上記アミド０．６ｇ及びジオキサン中４Ｎ　ＨＣｌ　５■Ｉの溶液 を１時間放置し、溶媒を蒸発させ、エーテル２０１を加えた。沈澱物（０，５２ ｇ）を集め、エーテルで洗浄し、乾燥した。Ｄ　Ｍ　Ｆ　３　ｓ、ｌ中その固体 物の一部０．２８ｇをＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂ ｏｃ）　（前例１（ｅ）で記載）１．２ｇ及びＢＯＰｏ、３３ｇで処理し、ＨＯ ＢＴＯ，ｌ１ｇを加えた。

ｐＨを湿潤ｐＨ紙に適用された反応溶液の小滴を用いてＮＭＭ（約０．　２ｒＡ ｌ）の滴下により調整し、７．５のｐＨ測定値を得た。溶液を２日間放置し、酢 酸エチル７５１で希釈し、前例１（Ｃ）における操作で後処理した。有機層を蒸 発させてゴム状固体物０．２５ｇを得、これを１　：　Ｉ　ＣＨＣ１２／　Ｔ　 Ｆ　Ａ　１０　ｍ　ｌに溶解した。

１時間後、エーテル２５ｍ１を加えて ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｚａ−Ｐｈｅ−ＮＨ２０，１５ｇを 沈澱させた。生成物をＨＰＬＣにより精製し、同一性をＦＡＢ−ＭＳにより確認 した。

プロテアーゼ 本発明のプロテアーゼは哺乳動物組織がら得られるキモトリプシン様セリンプロ テアーゼである。これらのプロテアーゼはβ−アミロイド前駆タンパク質におい てＮｅｔ−Ａｓｐ結合を開裂できる点で普通にはない基質特異性を共有する。こ の異常な開裂はアルツハイマー病でβ−アミロイドを遊離させるために要求され る。包括されるプロテアーゼはこのような哺乳動物で天然で存在する活性と類似 した又は同一の前記のような酵素活性を有する。

これらのプロテアーゼは一般的に前記されたように単離及び精製され、精製品と して用いられる。一方、単離されたプロテアーゼ又はそのトリプシン処理もしく は他の断片のアミノ酸配列は標準的技術と単離されたそのプロテアーゼについて コードする核酸により決定できる。そのプロテアーゼの活性部位は、例えば下記 のように酵素を断片化してその活性を試験することにより同様に決定できる。望 ましい活性を有するそれらの断片は本発明で有用である。完全酵素のような酵素 の断片も標準組換えＤＮＡ技術により作製できる。これらのプロテアーゼ又はそ の断片に対する抗体、例えばモノクローナル抗体は標準技術により作製される。

精製されたプロテアーゼは酵素活性部位と適合してその活性を阻害する有機分子 の合理的デザインのために使用できる。高分解における精製プロテアーゼのＸ線 結晶学的構造の解明はこの努力を著しく助ける。精製された酵素はプロテアーゼ 活性を阻害する化合物を発見するため有機分子のライブラリーの大規模スクリー ニングにも使用できる。

２種のこのようなプロテアーゼ、キマーゼ及び多触媒プロテアーゼの単離例は以 下で記載されている。その例は本発明に対する制限ではない。当業者であれば下 記プロトコール又は相当プロトコールを用いてこのような酵素活性を有する他の プロテアーゼを容易に単離することができる。同様に、他のプロテアーゼもキマ ーゼ、多触媒プロテアーゼ又は関連酵素についてコードする核酸の逆工学処理を 行うためキマーゼ又は多触媒プロテアーゼのアミノ酸配列を用いて標準組換えＤ ＮＡ技術により単離できる。

様々なプロテアーゼ精製ステップにおいて、全分画のプロテアーゼ活性は基質と して発色原又はケイ光原性ペプチドアナログを用いて測定した。他の方法も利用 可能であり、当業者に公知である。活性測定の１つの具体例がここで記載されて いる。プロテアーゼ活性アッセイは９６ウ工ル微量滴定プレート中全容量０．２ ｍｌで実施した。基質はＤ〜ＩＳＯ中１０〜２０Ｘ濃縮ストック溶液として調製 した。したがって、各反応液は５〜１０％ＤＭＳＯを含有していた。反応は既に 基質を含有したウェルへのプロテアーゼ含有サンプルの添加により開始させ、３ ７℃で維持した。コントロールウェルは基質なしでプロテアーゼ又はプロテアー ゼなしで基質を保有した。

タンパク質分解開裂によるリポータ一部分の放出は分光光度測定（例えば、ｐＮ ａ基質に関して、４０５ｎｍで経時的な吸光度の変化）又はケイ光測定（例えば 、ＡＭＣ基質に関して、３９０　ｎｇの励起及び４６０　ｎｉの放射を用いた経 時的なケイ光の変化）のいずれかによる時間の関数として追跡した。反応の最大 速度を測定したが、基質加水分解は時間の関数として直線的に増加した。

例４：キマーゼ精製 キマーゼ（肥満細胞プロテアーゼエとしても知られる）は一般的に下記のように ラット脳から均一に精製した。

組織ホモゲナイズ及び遠心によると、その酵素は粒状分画に存在した。キマーゼ は界面活性剤可溶性タンパク質の除去により豊富化させた。次いでキマーゼは１ ＭＭｇＣ１２又は２ＭＮａＣ１のような高温を用いて粒状分画から可溶化させた 。次いでそれを低イオン強度緩衝液中への透析で沈降させ、遠心により集めた。

ペレットを緩衝液に懸濁し、ヘパリン−セファロースカラムでクロマトグラフィ ーにより分別した。最後に、キマーゼは樹脂に結合された基質を用いてアフィニ ティクロマトグラフィーにより均一に精製した。精製ステップは一般的キモトリ ブシン様プロテアーゼ基質５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａ　 （Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＊、、２５４：４０ ２７゜１９７９）とＡＰＰ基質擬似体ＭｅＯ３ｕｃ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｖａ　ｌ　− Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ｐＮａ及びＭｅＯ３ｕｃ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｐ ｈｅ−ｐＮａの加水分解によりモニターした。すべての操作は他に指摘のないか ぎり４℃で行った。

ａ）組織抽出 ５〜７日齢日齢フラット７ｇ）の前脳を２９５１の２０口Ｍリン酸ナトリウム（ ｐＨ７，５）　、１騰ＭＥＤＴＡ及び１％トリトンＸ−１００中でガラス／テフ ロン電動ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした。時々攪拌しながら３０分間 後に、このホモゲネートを５Ｓ３４０−ターにおいて４０．ＯＯＯＸｇで１時間 遠心した。ペレットを大きなドーンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイザーを用いて ４０１の２０ｍＭリン酸ナトリウムＣｐＨ７，５）、１．２Ｍ　ＭｇＣｌ２及び ０．１％トリトンＸ−１００に再懸濁した。次の遠心で強固なペレットを得るた め、その混合液の粘度を２０ゲージ針に２回通して減少させ、核酸を剪断した。

時々攪拌しながら４０分間後に、混合液を超音波処理し、しかる後前記のように １時間遠心し、上澄を保留した。次いでこの上澄を低イオン強度緩衝液（５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７，５）に対して十分に透析した。翌日、透析バッグ中 に存在する粒子を最初に端部対端部ミキシングで再懸濁し、しかる後透析液を前 記のように１時間遠心した。得られたベレットを全量で８−１の２０５Ｍリン酸 ナトリウム（ｐＨ７，５）　、１■ＭＥＤＴＡ、０．１％トＩＪトンＸ−１００ （−緩衝液Ａ”）＋０．４Ｍ　ＮａＣ１に溶解し、ヘパリンアガロースカラムで 直接用いた。

ｂ）ヘバリンアフィニティクロマトグラフィー再懸濁液を超音波処理し、しかる 後緩衝液Ａ＋０．４Ｍ　ＮａＣ１で平衡化されたヘパリン−アガロース〔パイオ ーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　、バーリンゲーム、ＣＡ、）のカラム（１，５Ｘ ２ｃ■）に１１ずつ適用した。カラムは溶出タンパク質の濃度が０　、　１　ｍ ｇ／ｍｌ以下になるまで同緩衝液で洗浄した。次いでタンパク質は緩衝液Ａ中の ＮａＣ１濃度を増加させながら段階的勾配を用いてカラムから溶出させた。プロ テアーゼはヘパリンとの結合活性を示したが、これを０．９〜１．２ＭＮａｃ１ で溶出させ、約２Ｑ倍豊富化させた。キマーゼ（肥満細胞プロテアーゼＩ）の部 分精製に関する上記方法は文献（例えば、Ｖｏｏｄｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍ ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、８０：５８８，１９８１及びそこの参考文献）で記 載されている。

Ｃ）基質アフィニティクロマトグラフィー濃縮された部分精製キマーゼ含有サン プルをキマーゼ基質アナログＡｈａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅが共有結合されたセファ０ −ス樹脂含有カラムにいれた。基質アナログの遊離アミノ基を臭化シアンで活性 化されたセファロースに結合させた。高濃度のＮａＣ１又はＭｇＣ１例えば１Ｍ ２ゝ ＮａＣ１の存在下で樹脂に結合されたキマーゼを１Ｍ炭酸水素アンモニウムで溶 出させた。他の方法もキマーゼ溶出、例えば４０％エチレングリコール中０．５ ＭまでＮａＣ１の減少のために利用できる。溶出分画は下記のようにキマーゼ活 性に関してモニターした。

ｄ）精製キマーゼの分析 最終カラムからの溶出液は超高感度銀染色と共にＳＤＳポリアクリルアミドゲル 電気泳動で検出しうる〜２５−２６ｋＤａの密着したダブレットを含有していた （Ｎｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、、５３：６４１，１ ９８９；Ｍｅｒｒｉｌ　ｅｔａｌ、、Ａｎａｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、、１１０：２ ０１，１９８１）　。実例が図１で示されている。銀染色キマーゼダブレットは ０列で示されている。これらのポリペプチドはエンザイモグラフィーによりプロ テアーゼとして確認した。この技術（ＭｌｓｋＪｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１１８：２５２．１９８１；Ｎｅ１ｓｏｎ及び５ＬＩＩａｎ 、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、、前掲）において、プロテアーゼを含有するタンパ ク質サンプルはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分別されるが、その場 合にプロテアーゼ基質（例えば、ゼラチン）はゲルマトリックス中に共有結合で 組み込まれている。電気泳動後、ＳＤｓを除去し、ゲルを高温（例えば、３７℃ ）でインキュベートして存在するあらゆるプロテアーゼを活性化する。活性プロ テアーゼを含有するゲル内の位置において、基質はゲルマトリックスから開裂さ れる。ゲル内に残留した未開裂基質はクマシーブルー又はアミドブラックのよう なタンパク質結合色素で染色される。この技術によれば、プロテアーゼは暗染色 バックグラウンドに対して（基質がゲルマトリックスから遊離された）明るい領 域としてみえる。精製されたキマーゼはＩＮＩで示されたエンザイモグラフィー により試験した（Ａ列はヘパリン溶出液、Ｂ列は精製されたキマーゼである；左 列はｋＤａ　Ｘ　１０−３で分子量標準を示している）。精製キマーゼ品におけ る２つの密着したポリペプチド（０列）は双方ともプロテアーゼ活性を示す（Ｂ 列）。キマーゼ活性は銀染色で検出されるタンパク質と正確に同時移動した。

精製経路は図２で要約されている。１８ｇラット脳から出発して、約１０μｇの 均一キマーゼを得た。精製プロテアーゼはキモトリプシン様プロテアーゼキマー ゼの特徴：　（１）　〜２５−２６ｋＤａの分子量；　（２）カルボキシル末端 に芳香族又は大きな脂肪族アミノ酸を有するペプチドアナログ基質（例えば、５ ｕｅ−Ａ　ｌ　ａ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａ　、、ＭｅＯ８ｕｃ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮａ）の加水分解；　（３）α−抗キモトリブ シンとのＳＤＳ安定性複合体の形成による不可逆的阻害を示した。

アミノ酸配列決定はプロテアーゼの同一性を確認するため精製された脳キマーゼ で行った。この操作はＡｅｂｅｒｓｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８４：８９７０（１９８７）から修正された方法を用い てバーバード・マイクロケミストリー・ファシリティ（Ｈａｒｖａｒｄ　１４ｉ ｃｒｏｃｈｅｓｌｓｔｒｙＦａｃｉｌｉｔｙ）により実施した。炭酸水素アンモ ニウムで最終基質アフィニティ力ラムから溶出されたキマーゼを凍結乾燥した。

次いでキマーゼ〜１５０　ｐｍｏ＋をトリプシン（１：　２０の酵素二基質）で 切断し、得られたキマーゼ断片を細口径逆相ＨＰＬＣで分離した。３つの断片を それらの収率及び予想鎖長に基づき自動Ｎ末端微量配列決定用に選択し、気相シ ークエネーターで配列決定した。

図３は精製プロテアーゼの３断片から得られた部分アミノ酸配列を真正キマーゼ に関して公表された配列（ＬｅＴｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、２Ｂ、８９８８−８９９４．１９１１７）と比較している。３つのドメ インから全部で３２の残基がキマーゼに関して公表された配列と正確に一致する 。

例５：ヒト脳からの多触媒プロテアーゼ精製晴乳動物脳で確認された多触媒プロ テアーゼ（Ｗｉｌｋ及びＯｒｌｏｗｓｋｉ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｃｖ、、４０： ８４２．１９８３）は“インゲンシン”　（Ｋａｍａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、Ｎｅｕｒｓｅｆ、Ｒｅｓ、、２０：４７３．１９８８）、“レンズ中性エン ドペプチダーゼ″（Ｒａｙ及びＨａｒｒｆｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４８：Ｂ４３．１９８７）　、’プロテアソーム”（ Ｔａｎａｋａ　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｌ、ｃｈｅｗ、、２６１：１５１９７ ．１９８８；Ｊ、Ｂｆｏｌ。

Ｃｈｅｉ、、２８３：１６２０９．１９８８）又は“マクロベイン”　（Ｒｊｖ ｅｔｔ。

Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ＊、Ｂｌｏｐｈｙｓ、　、　２８８　：　１　、　Ｌ９ １！９）としても文献で呼ばれている。我々は多触媒プロテアーゼといくつかの 特徴を共有する酵素をヒト脳から確認及び精製した。その活性はヒト脳ホモゲネ ートの可溶性分画に存在し、アニオン交換及びヒドロキシアパタイトカラムと結 合した。

そのプロテアーゼの分子量は酵素を有意に精製するゲル濾過ステップにより極端 に大きい（＞６００，０００）コトがわかった。各精製段階におけるプロテアー ゼ活性は前記のように測定した。ヒト脳からの多触媒プロテアーゼ精製の具体例 は以下で記載されている。

ａ）組織抽出及びイオン交換クロマトグラフィーヒト大脳皮質［ＣＡ、、ロサン ゼルス、ナショナル・ニューロロジカル争リサーチ　、（ンク（Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂａｎｋ）の提供〕をオー ドブシーで得て、使用まで一７０℃で貯蔵した。すべての操作は他に指摘されな いかぎり４℃で行った。これらのサンプル（３５ｇ）をプールし、ウェアリング （Ｗａｒｉｎｇ）ブレングー中２００１の１０ＩＩＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７ ，４）　、０．５ＩｉＭＥＤＴＡでホモゲナイズした。トリトンＸ−１００を０ ．５％まで加え、ホモゲネートを１時間攪拌し、しかる後４０，０００Ｘｇで１ 時間遠心した。多触媒プロテアーゼ含有上澄を２Ｃ１ｎＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ ８，０）　、１％グリセロールに対して透析した。翌日、透析液を透析緩衝液で 平衡化されたＤＥＡＥ−セファロース・ファースト−フロー（ＤＥＡＥ−９ｅｐ ｈａｒｏｓｅ　Ｐａ５ｔ　Ｆｌｏｗ）　Ｃファルマシア（Ｐａｒｓａｃｉａ）。

ビスカッタウェイ、　Ｎ、Ｊ、）のカラムにいれた。未結合物質を透析緩衝液〜 ３００１で除去し、しかる後結合物質を０〜４００ＩＩＭの直線ＮａＣ１勾配（ 全量１．５１）で溶出させた。１５ｍ１の分画を集め、多触媒プロテアーゼ活性 に関して調べた（以下参照）。図４（上）はこのカラムからのプロテアーゼの溶 出プロフィールについて示す。プロテアーゼ活性は多触媒プロテアーゼ活性を刺 激することが知られた０、０５％ＳＤＳの存在下でＡＰＰ擬似基質ＭｅＯ８ｕｃ −Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｎｅｔ−ｐＮａの加水分解（詳細に関して下記例６ 参照）によりこの及び後の精製ステップで検出した（ｌｓｈｉｕｒａら、前掲） 。

ｂ）ゲル濾過 活性分画をプールし、３０％飽和硫酸アンモニウムとし、３０分間攪拌し、４０ ，０００層ｇで３０分間遠心した。ベレットを捨て、その一方で上澄を８５％飽 和にし、前記のように攪拌及び遠心した。多触媒プロテアーゼ含有ベレットをゲ ル濾過ランニング緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ５ｐＨ７，５，１％グリセロー ル）５１に懸濁し、セファクリル５３００ＨＲ（ファルマシア）の５００１層で ランさせた。カラムを分子量マーカーブルーデキストラン（＞　２０００　ｋＤ ａ）、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、γ−グロブリン（１５０ｋＤａ）及び オボアルブミン（４３ｋＤａ）で標準化した。多触媒プロテアーゼは見掛は分子 量約７００　ｋＤａでカラムから溶出した（図４、中間）。

Ｃ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーヒト脳多触媒プロテアーゼはヒド ロキシアパタイト−ウルトラゲル（ＩＢＦ、コロンビア、ＭＤ、）を用いて更に 精製した；４１１層を４ｓＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）で平衡化した。ゲ ル濾過からプールされた活性分画を平衡緩衝液で希釈し、室温でカラムにいれた 。未結合タンパク質を数倍カラム容量の平衡緩衝液で洗いだし、しかる後結合タ ンパク質を４〜４００ｓ＋Ｈのリン酸ナトリウムの直線勾配（６０ｍｌ）で溶出 させた。多触媒プロテアーゼは図４（下）で示されたように溶出した。このクロ マトグラフィーステップは多触媒プロテアーゼのヒドロキシアパタイト精製に関 して既に証明されたようにヒト脳プロテアーゼ活性を２つのピークに分けた（Ｉ ｓｈｉｕｒａら、前掲）。

上記のように精製されたプロテアーゼ活性のいくつかの特徴はそれが多触媒プロ テアーゼのヒト脳ホモログであることを示している：　（１）サイズ〜７００ｋ Ｄａ；（２）同時精製；　（３）カルボキシ末端に芳香族又は大きな脂肪族アミ ノ酸を有するペプチドアナログ基質を加水分解するキモトリプシン様活性；　（ ４）低濃度のＳＤＳによる活性の著しい刺激（ｌｓｈｉｕｒａら、前掲’）：　 （５）いくつかの普通のプロテアーゼブロッカ−（例えば、フェニルメチルスル ホニルフルオリド、ロイペプチン、ペプスタチン、０−フェナントロリン、ＥＤ ＴＡ）ではなくキモスタチンによる阻害。

例６：アルツハイマー病に重要なプロテアーゼの確認神経突起プラークはアルツ ハイマー病においてβ−アミロイドのその前駆タンパク質（ＡＰＰ）からの異常 な遊離により脳内で形成される。ＡＰＰ内に含まれるβ−アミロイドの配列は図 ５で示されている。Ｎｅｔ　（−文字アミノ酸コードでＭ）及びＡｓｐ　（Ｄ） 間の結合の開裂はβ−アミロイド形成に要求され、キモトリプシン様プロテアー ゼの作用により生じると提案された（Ａｌ）ｒａｈａｍ及びＰｏｔｔｅｒ、Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７．１４７−１５３．１９１１９；Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔ ｒａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３４１．５４６−５４９．１９８９） 。図５はアルツハイマー病においてβ−アミロイドを遊離できるキモトリプシン 様プロテアーゼを確認するために本発明者らにより用いられた戦略について示す 。２種の新規なプロテアーゼ基質をデザイン及び合成した：ＭｅＯ９ｕｃ−Ｇ　 Ｉ　ｕ−Ｖａ　ｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ｐＮａ及び“ジャンクションペプチド“と 称される１９アミノ酸ペプチド。−Ｇ　Ｉ　ｕ４ａ　Ｉ　−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ及び Ａｓｐ−間の開裂はβ−アミロイドを遊離させるため、Ｎｅｔのカルボキシ末端 側鎖でこれらの基質を開裂するプロテアーゼはアルツハイマー病に関与しうる。

予想とは逆に、すべてのキモトリプシン様ブロテアーゼがＭｅＯＳｕｃ−Ｇ　ｌ 　ｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ｐＮａを開裂できるわけではなかった（図６ ；−文字アミノ酸コードを用いたＥＶＫＭ）。

キマーゼ及び多触媒プロテアーゼは双方ともこの基質を容易に分解したが、但し キモトリプシン様酵素カテプシンＧ及びキモトリプシンは本質的に効果なしであ った。

これはカテプシンＧ及びキモトリプシンが双方ともカルボキシル末端ににｅｔを 有する別の基質Ｎｅ０３ｕｃ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮａを容易 に分解したことから特に意外である（例えば、Ｎａｋａｊ　ｉｍａら、前掲）。

キマーゼ及び多触媒プロテアーゼによるＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ４ａｌ−Ｌｙｓ− Ｎｅｔ−ｐＮａの選択的開裂は、プロテアーゼ基質特異性が開裂部位から上流の アミノ酸残基により著しく影響されがつすべてのキモトリプシン様プロテアーゼ がβ−アミロイドを遊離できるわけではないことを示す。その結果はキマーゼ及 び多触媒プロテアーゼを神経突起プラークβ−アミロイドの異常産生に強く関連 付けている。

キマーゼは配列がβ−アミロイドドメインのアミノ末端（Ａｓ、５９７　、のジ ャンクションに及ぶ長鎖ペプチドの開裂に関しても試験した。１９アミノ酸ジヤ ンクシヨンペプチドＧ　Ｉ　ｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａ　Ｉ　 ａ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｐｈｅ−Ａ　ｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ −Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｆｌｉｓ−Ｇｌｎ（Ａ　Ｐ　Ｐ残基５９３−６１１ に相当、Ｋａｎｇら、前掲に従いナンバリング）を同相法により合成し、逆相Ｈ ＰＬＣにより精製した。構造はＦＡＢ質量スペクトル測定及び自動微量配列決定 により確認した。精製されたキマーゼを精製ジャンクションペプチドと共に１＝ ５０の酵素二基質モル比で室温においてインキュベートした。反応混合液は酵素 添加直後と４５及び９０分間目、２４及び４８時間目に逆相ＨＰＬＣで分別した 。完全ジャンクションペプチドも単独でその保持時間を確認するため同ＨＰＬＣ カラムでランさせた。４５分間もの短時間で完全ジャンクションペプチドは消失 し、３つの顕著なペプチド断片で置き換えられた（図７）。これら断片の各々は 自動微量配列決定で確認した。ジャンクションペプチド断片の配列に基づき、キ マーゼはＮｅｔ及びＡｓｐ間でジャンクションペプチドを分解した。これはアル ツハイマー病におけるβ−アミロイドの異常遊離にキマーゼを更に関連付けてい る。

ヒト脳から精製された多触媒プロテアーゼもキモトリプシン様酵素キモトリプシ ン及びカテプシンＧではなくキマーゼのようにＡＰＰ擬似基質 ＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ−１／ａｌ−Ｌｙｓ−Ｎｅｔ−ｐＮａを開裂する普通には ない能力を示した（下記例８参照）。これはアルツハイマー病におけるβ−アミ ロイドの異常遊離に多触媒プロテアーゼを強く関連付けている。

例７：キマーゼのヒトホモログ ヒト脳はラットキマーゼのホモログを含有している。

そのホモログはキマーゼ活性の同じ２種のアッセイ、発色原基質５ｕｅ−Ａ　Ｉ 　ａ−＾１　ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａ及びＭｅＯＳｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ− Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ｐＮａの加水分解とエンザイモグラフイーを用いて確認し、ラ ット脳プロテアーゼに関して前記されたものに類似した経路で精製した。ヒト脳 キマーゼはその同時精製、α−抗キモトリブシンによるその阻害、キマーゼのペ プチドアナログ基質のその加水分解及び非還元エンザイモグラフィーゲルによる 約２２，０００のその見掛は分子量に関してそのラット対合体と類似している。

キマーゼは真正ヒト肥満細胞キマーゼ（ペンシルバニア大学のＮ、５ｅｈｅｃｈ ｔｅｒから提供、Ｎ、５ｃｈｅｃｈｔｅｒら、前掲で記載）に対する抗体を用い てヒトアルツハイマー病脳における肥満細胞でも検出した。これらの方法の具体 例は以下で記載されている。

ヒト大脳皮質から死後に得られたサンプル（＋ショナル・ニューロロジカル・リ サーチ・バンクの提供）をラット脳キマーゼの調製のため前記のように分別した 。ヒト脳活性は界面活性剤不溶性、高塩溶解性及び低塩不溶性を示した。プロテ アーゼをラット脳キマーゼの精製と類似した方法によりヘパリン−セファロース カラムで更に精製した。プロテアーゼ活性はラットキマーゼに関して前記された ように基質５ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａの加水分解により モニターした。０．４ＭＮａＣ１でカラムに結合した酵素はＮａＣ１濃度を０． ７〜０，９Ｍまで増加することにより溶出させた。

次いで、キマーゼは樹脂、ライマビーントリブシン阻害剤−アガロース〔シグマ （Ｓｉｇｍａ）　、セントルイス。

ＭＯ，）にカップリングされたキマーゼ阻害剤を用いて精製した。このトリプシ ン阻害剤はヒト肥満細胞キマーゼと結合して、それを阻止する（Ｓｃｈｅｃｈｔ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ。

Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８：２９７３．１９１ｔ３）　。ヘパリン溶出液か らのキマーゼ含有分画をプールし、１０１まで濃縮し、１１層容量のライマビー ントリブシン阻害剤−アガロースにいれた。カラムを０．５Ｍ　Ｎａ１ｌ含有ヘ ペス緩衝液（５倍容量）しかる換水（５倍容量）で洗浄した。キマーゼを２１１ ＭＨＣｌで溶出させ、０．５ＭＮａＣ１含有トリスＨＣＩ　（０，２Ｍ最終濃度 、ｐＨ８，０’）で直ちに中和した。図８（右パネル）はヒト脳プロテアーゼの 精製についてまさめている。この酵素は一般的キモトリブシン基質５ｕｅ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａと更に特異性基質ＭｅＯ９ｕｃ−Ｇ　Ｉ　 ｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ｐＮａを加水分解した。その酵素活性はα−抗 キモトリプシンで阻害された。図８で示されたようなエンザイモグラフィーゲル によると、ヒト脳キマーゼはラット脳キマーゼ（前記のように精製）及び真正ヒ ト肥満細胞キマーゼ（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら、１９８３．前掲）と同時移動する プロテアーゼ活性を示した。図９及び１０は精製の結果について示す。

肥満細胞キマーゼは前記キマーゼに対する抗血清を用いた免疫組織化学分析によ ってもヒト脳で突きとめられた。この操作では、ヒト脳の薄い切片（死後に入手 、アルデヒドで固定及びパラフィンで包埋）をヒト肥満細胞キマーゼに対するウ サギ抗体でプローブ探査する。次いで結合ウサギ抗キマーゼを間接免疫ペルオキ シダーゼ操作により検出する （Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、Ｉｍｓｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｇ＋１ｓｔｒｙ、Ｃｏ ｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、。

ｐｐ、１０４−１６９．ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、１９７９；Ｓｉｍａｎ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｎ。

３：２７９．１９８９）。この操作を用いて、キマーゼ免疫反応性をコントロー ル及びアルツハイマー病大脳皮質の双方において肥満細胞の分泌顆粒内で突きと めた。

例８；プロテアーゼ阻害剤 アルツハイマー病におけるβ−アミロイドの異常遊離に関与するプロテアーゼの 阻害はその疾患の進行を遅延させる。候補プロテアーゼが確認されれば、ＡＰＰ においてＭｅｔ５９６−＾５ｐ５９７結合を開裂するそれらの能力に基づき、そ の精製酵素はプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするために使用できる。この アプローチの２例がキモトリプシン様プロテアーゼのキマーゼ及び多触媒プロテ アーゼに関する高度に強力でかつ選択的な阻害剤の開発について以下で示されて いる。

２種のプロテアーゼに関する阻害剤を開発するため、４０以上のペプチドアナロ グ基質を前記例１及び２で記載された方法により製造した。更に基質をシグマ又 はべ−チェムから購入した。これらの基質は系統的な単一の残基置換により互い に異なっているニブロチアーゼによるそれらの開裂を比較することにより、各プ ロテアーゼの正確な基質優先性を決定した。次いでこの最も好ましい配列をカル ボキシ末端残基の修正と一緒に用いて、高度に特異的な阻害剤を得た。当業者で あればセリンプロテアーゼ基質を阻害剤に変換するいくつかのカルボキシ末端修 正が利用しうることを認識するであろう（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｌｔｏｒｓ、Ｂａｒｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ 。

（ｅｄｓ）　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｐｐ、５５−１５２．１９８８）。以下で記載 された阻害剤は本発明に対する制限ではない；相当アプローチを用いて、非ペプ チド性分子が有機分子コレクションのスクリーニングから確認でき又は一連のペ プチド基質から得られる酵素活性部位の知識に基づき合理的にデザインできる。

ａ）キマーゼ阻害剤 脳キマーゼによる５４ペプチドアナログｐ−ニトロアニリド基質の開裂は図１１ で示されている。各基質の少なくとも５つの濃度を試験した。二重逆数プロット を用いて、動力学的定数を得た。図面において、各基質に関するＶ＋ａｘ／Ｋｍ は基質＃　Ｉ　ＭｅＯ３ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ｐＮａと比較 して示されている。開裂される結合の上流にある残基はそれらの“Ｐ°位で示さ れる（ＰＩは開裂部位のすぐ上流にあり、Ｐ２は２残基上流にある、等々）。

化合物１〜１０は別個のＰ１アミノ酸を比較していることに留意せよ。試験され たものの中で、ＰｈｅはＮｌｅよりも８倍好ましく、更にこれはＮｅｔ及びＬｅ ｕよりも好ましかった。他の残基は開裂しえなかった。同様の系統的比較をＰ２ 、Ｐ３及び更に上流部位で行った。Ｐ２及び２４位におけるキマーゼ優先性が特 に注目される：正荷電側鎖がＰ２で好ましく、負荷電側鎖がＰ４で好ましい。

この基質特異性はキモトリプシン群の他の酵素からキマーゼを区別する。前例６ で既に記載されたように、キモトリプシンのみならずカテプシンＧもＭｅＯ８ｕ ｃ−Ｇ　ｌ　ｕ４ａ　ｌ　−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−１）ＮａのようなＰ４に負電荷（ Ｇｌｕ）及びＰ２に正電荷（Ｌｙｓ）を有する基質を開裂しなかった。

前記キマーゼ優先性に基づき、プロテアーゼの高度に強力で選択的な阻害剤を製 造した。好ましい基質におけるカルボキシ末端アミノ酸からアミノアルデヒド、 ホウ酸又はクロロメチルケトンへの変換による。図１２はＭｅＯ８ｕｃ−Ｇ　Ｉ 　ｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ｐＮａのアルデヒド、ホウ酸及びクロロメチ ルケトンアナログが各々２０ｎＭ以下のに１でキマーゼを阻害したことを示す。

これらは文献で以前に記載されたいかなるキマーゼ阻害剤よりも実質上強力であ る。更に、それらは非常に高い用量のみで他のキモトリプシン様プロテアーゼ（ 図１２）又は他のプロテアーゼ（図１１、パネルＡ）を阻害したため、それらは キマーゼに関して高度に選択性である。例えば、ＭｅＯ８ｕｃ−ＧＩｕ４ａｌ− Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ａｌは１５ｎ１４のＫｌでキマーゼを阻害するが、但し１００ 倍以上の用量でキモトリプシン又はカテブンンＧを阻害しなかった（図１２）。

更に、その阻害剤は１０μＭ以上の濃度のみてプロテアーゼトリプシン、トロン ビン、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プラスミン又は血漿カリクレインの実質的 阻止を起こした（図１１、パネルＡ）。

ＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ及びＭｅＯ８ｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖ ａｔ−Ｌｙｓ−Ｎｌｅのアルデヒドアナログをキマーゼ阻害剤として比較した。

Ｐｈｅ化合物はＮｌｅ阻害剤よりも約２０倍強力であったが、その発見はこれら 化合物の２種のｐ−ニトロアニリド基質バージョンの示差的開裂と一致した。

ｂ）多触媒プロテアーゼ阻害剤 キマーゼ阻害剤をデザインするために用いられた場合に相当する戦略をヒト扇子 触媒プロテアーゼに関して用いた。図１４は単一基質濃度で比較された４８ペプ チドアナログ基質の相対的加水分解速度について示す。基質優先性は脳キマーゼ の場合と異なることに留意せよ。例えば、キマーゼはＰｌでＰｈｅ及びＰ２でＬ ｙｓを優先するが、一方多触媒プロチアーゼはＰｌでＬｅｕ　（但し、Ｐｈｅ　 。

Ｎｌｅ及びＭｅｔもここでは優れている）及びＰ２でＡｒｇを優先する。２３位 でこれまでに試験された残基の中では、１１ｅが最も好ましい。このため、多触 媒プロテアーゼを標的にするが、但し関連キモトリプシン様酵素を無視するペプ チドアナログが慎重に作製できる。

キマーゼに関して前記されたように、多触媒プロテアーゼの好ましい基質は強力 な酵素阻害剤を得るためそれらのカルボキシ末端で修正することができる。図１ ３のパネルＢは一部のペプチドアナログ及び市販プロテアーゼ阻害剤による多触 媒プロテアーゼの阻害について示す。

新規なペプチドアナログ阻害剤はいかなる前記阻害剤よりも実質上強力な多触媒 プロテアーゼキモトリプシン活性の遮断剤である。

例９　：　ＡＤ及びプロテアーゼ活性 キモトリプシン様プロテアーゼ活性は、キマーゼがＡＤの脳で異常なタンパク質 分解に関与するか否かを調べるためいくつかのヒト脳サンプルで定量した。４脳 領域からの９５脳サンプルをナショナル・ニューロロジカル・リサーチ・バンク 、ロサンゼルス、ＣＡ、から得た。

４７はＡＤを有すると診断（死亡時に確認された診断）された患者からであり、 ４８は様々な原因で死んだ非痴呆の同年齢個体からであった。キマーゼは豊富で あり、界面活性剤及び低塩緩衝液におけるその不溶性しかる後ＩＭ　ＭｇＣ１２ （前記で詳述されたような高温抽出物品）における可溶性により他のプロテアー ゼ活性から分離した。キマーゼ活性は一般的キモトリブシン基質ＭｅＯ８ｕｃ− Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａの加水分解により評価し、全 タンパク質内容物に対して標準化した。

ＡＤ側頭皮質において、キマーゼ活性は約２倍まで有意に高まる（ｎ−１７；　 ｐ＜Ｑ、　０５　；図１５）。活性は前頭皮質（ｎ−２４）でも高まるが、但し 後頭皮質（ｎ−２６）及び小脳（ｎ−２８）では未変化である。

側頭及び前頭皮質における差異は年齢又は死後サンプル自己分解時間の関数とし ての変化に単純に帰すことができなかった。更に、２種の他のプロテアーゼ、カ テプシンＢ及びプロリルエンドペプチダーゼの活性は同側頭皮質サンプルで上昇 しなかったが、これはＡＤにおけるプロテアーゼ活性に関して一般的増加がない ことを示す。

高いキモトリプシン様活性を示す２つの脳領域がＡＤによりかなり影響され、一 方プロチアーゼ活性の上昇を示さない２つの領域がその疾患で比較的無視されて いることは注目すべきである（Ｂｒｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｌｓｔｏｐａｔｈｏ ｌｏｇｙ、５゜５４９．１９８１；ＫｅＩＩｐｅｒ、ｊｎＫ、Ｎａｎｄｙ、ｅｄ 、、ＳｅｎｌｌｅＤｅｍｅｎｔｉａ：ＡＢｉｏｒＡｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａ ｃｈ、ＥＩｓｅｖｉｅｒ、ｐｐ、１０５−１１３．１９７８）　ｏ　これらの結 果は、キマーゼの異常タンパク質分解活性がＡＤの病因の根底にあるという考え に関して直接的支持を前記阻害剤はＡＤ又はダウン症候群にかかった患者に投与 用のいずれかの標準的な薬学上許容される緩衝剤中において提供できる。このよ うな阻害剤は脳組織に静脈内、筋肉内、経鼻内、経口で又は直接的に好ましくは １０〜１０００μｇ／ｋｇのレベルで標準操作により投与できる。

他の態様 ａ）プロテアーゼコード核酸 精製されたキマーゼ又は多触媒プロテアーゼはタンパク質の分子生物学の当業者 に現在周知の方法によりキマーゼ及び多触媒プロテアーゼｃ　ＤＮＡ及びタンパ ク質のクローニング及び配列決定のために使用できる。部分アミノ酸配列はエド マン分解又は他の化学による自動又は手動ペプチド配列決定を用いて精製ヒト脳 キマーゼから得ることができる。部分タンパク質配列は２方法で使用できる。第 一に、抗体がキマーゼに対して高められる。

合成ペプチドは部分配列に基づき製造され、キャリアタンパク質と複合化され、 常法によりポリクローナル及びモノクローナル抗体を高めるために用いられる（ Ｈａｒｌｏｖｅｔ　ａｌ、、、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、１９８ｇ）　ｏ第二に、キマーゼｃＤＮＡがクローニング 及び配列決定され、こうしてタンパク質の全ヌクレオチド及びアミノ酸配列を得 る。

オリゴヌクレオチドは部分タンパク質配列に基づき製造され、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａラ イブラリーをスクリーニングしてキマーゼｃＤＮＡ発現組換え細菌を選択するた めに用いられる。選択により、キマーゼｃ　ＤＮＡが常法によりクローニング及 び配列決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩ ｏｎｌｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、１９８９）。

一方、ラットキマーゼの公表アミノ酸配列（ＬｅＴｒｏｎｇ　ａｔ　ａｌ、、Ｂ ｉｏｃｈｅｌｌｉｓｔｒｙ、２６：６９８８．１９８７）ｌ：基づくオリゴヌク レオチドはラット又はヒトキマーゼに関するｃＤＮＡのクローニングでポリメラ ーゼ鎖反応用のプライマーとして用いることができる。ヒトｃＤＮＡは反応を行 うためヒトｍＲＮＡを用いて直接得られるか又はラットｃＤＮＡは（反応を行う ためラットｍ　ＲＮ　Ａを用いて）得られ、しかる後常法によりヒト対合体をク ローニングするためプローブとして用いられる。

キマーゼ又は多触媒プロテアーゼに特異的な核酸プローブは容易に入手しうる細 胞を用いた診断方式において有用性を有する。クリプシン又は多触媒プロテアー ゼに関する遺伝子の変異、複製又は過剰発現は当業者に公知の様々な方法により 検出できる。

ｂ）プロテアーゼに対する抗体 キマーゼ、多触媒プロテアーゼ又は関連プロテアーゼに対する抗体はアルツハイ マー病に存在するプロテアーゼ異常を検出するためにデザインされた様々な方式 で用いることができる。これらはその疾患用の診断試験として有用性を有する。

例えば、変形体を産生ずるキマーゼタンパク質の量的変化又はキマーゼタンパク 質の変異は皮膚繊維芽細胞、肥満細胞又は白血球のような容易に入手しつる細胞 で検出しうる。抗体ベース検出はウェスタンブロッティング及び酵素結合免疫吸 着剤アツセイ（ＥＬＩＳＡＪａｒｌｏｖ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｌｂｏｄｌ、ｅｓ 、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８８）を含めた当業者に 現在広く使用されるいくつかの手段で実現できる。

Ｃ）プロテアーゼ阻害剤 列中で記載された阻害剤に加えて、当業者であれば前記方法を用いて本発明の酵 素の他の阻害剤を製造できるであろう。いくつかの有用な阻害剤が図１６で示さ れている。こうした本発明のペプチド基質に関する酵素認識要求の提示は同様に 配列されたペプチド側鎖を用いて阻害剤のデザインを可能にすることができる。

しかしながら、得られた分子からペプチド結合の除去はこのような結合の存在が 阻害剤をタンパク質分解酵素の攻撃にさらしやすくすることから望ましい目標で ある。更に、このようなペプチド結合は得られる治療分子の生物学的利用可能性 に影響を及ぼすかもしれない。Ｐ３及びＰ４位への“脱ペプチド化″の適用に関 するいくつかの例（Ｂｅｒｇｅｒ及び５ｃｈｅｃｈｔｅｒ、Ｐｈ１１．Ｔｒａｎ ｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｓｅｒ。

Ｂ　（１９７０）　２５７コ２４９の表示法）が図１６における相当物のリスト で示されている。原則的に、このアプローチは空間的に類似したー〇ＨＣ８−１ −Ｃ）（２０−１−ＣＨ−ＣＨ−及び−ＣＨ２５−基によるアミド結合−ＣＯＮ Ｈ−の置換でＰｌ及び２２位において用いてもよい。

ＦＩＧ、　１ 」 脳　ＱＩＶＨＰＮＹ ”ＩＭｃＰＩ　７６　ＱＩＶＨＰＮＹ　８２多触媒プロテアーゼのヒト脳プロテ アーゼホモログの精智ＤＥＡＥ−セファ０−ス・ファースト・フローゲル濾過・ セファクリル５３００ＨＲ プロテアーゼ基質： 発色原性　：　ＭｅＯ３ｕｃ−ＥＶＫＭ　−ｐ−ニドｏｙ二ｕ　ｌ’ジ＋：／ク シｉ：／ベブ％Ｆ：　ＥＶＫＭＯＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＩ−ＩＨＱ１、　ホモ ゲネート　９０００ ２　界Ｉ活性剤不溶分　４６００ ３、水不溶分　３７５０ ４、　高塩抽出物　５２００　５２５　ｊ５、〜（リンーセフｙｏ−ス３１００ 　６．０　５２６、トリプシン阻害剤−７ガロース　７６５　０．０７０　１１ ００ＦＩＧ、　９ ライマビーントリブシン阻害剤−７ガロースによる精製分Ｎ　Ｎｏ　ｏ活性 ■　タンパク質 ＦＩＧ、１１　ラフト脳キマーゼｐ−ニトロアニリド基質相対的 ｔ ［ＭｅＯＳｕｃ−ＥＶＫＦ−Ｃ）（２ＣＩ］　（ｎＭ）　ＦＩＧ、　”１２１） エラスターゼ、ブタ膵臓　０ トロピン、ヒト血漿　Ｏ プラスミン、ヒト血漿　８０ カテプシンＢ、ウシ牌９　８３ ウロキナーゼ、ヒト腎臓　１５ ドーリプシン、ウシ膵ｇ　２０ カリクレイン、ヒト血漿 ＦＩＧ、１３ａ 多触媒プロテアーゼの阻害 １　阻害剤なし ２　坑キモトリプシン、５ｕ９／ｍ１ ５　Ｎ−エチルマレイミド、１ｍＭ ６　ペプスタチン、１０μＭ ＦＩＧ、　１４　＊ニーｙ。＋７−１’４：　＄ＩｊＨａ’１ｍ７に一９口口 ＣＨ２Ｃ６Ｈ３ ＣＨ２Ｃ８Ｈ５ ６Ｈ５ Ｃｌ−１２０６Ｈ５ ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ ＣＨ２−（ＣＨ２）２ＣＨ３ ＣＨ２Ｃ６１−１５ ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ ＣＨ２Ｃ６８５ Ｃ１−１２ｃ６Ｈ５ ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ Ｃ）１２ｃ６１−１５ （ＣＨ２）３−ＣＨ３ ６Ｈ５ Ｃ）４２Ｃ６Ｈ５ ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ ＣＨ２Ｃ）（（ＣＨ３）２ ＣＨ２Ｃ６Ｈ５ Ｃ）４２０６Ｈ５ ＣＨ２０６Ｈ５ ＣＨ２０６Ｈ５ ＣＩ−１２０６Ｈ５ Ｃ）ｔ２ｃ６）４５ Ｃ）４２ＣＢＨ５ ＭｅｏＳｕｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡｚａＰｈｅ−ＯＣＨ３Ａｄ−Ｖａｌ −Ａｒｇ−ＡｚａＰｈｅ−ＯＣ６Ｈ５−Ｎ○２Ｓｕｂ−Ｖａｌ−Ｏｒｎ−Ａｚａ Ｐｈｅ−ＮＨ２Ｚ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡｚａＰｈｅ−Ｇｌｕ−ＮＨ２Ａ ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡｚａＰｈｅ−Ａｓｐ−ＯＨ８ｕｂ−Ｐｈｅ−Ｏｍ−Ａｚ ａＰｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＮＨ２ＭｅＯ８ｕｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡｚａＰｈ ｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＯＨ２−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ａｚ ａＬｅｕ−ＯＣＨ３Ａｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＡｚａＬｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇ ｌｕ−ＮＨ２Ｓｕｂ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＡｚａＭｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＮＨ２ Ａｃ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡｚａＮＩｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｎ）−１２Ａ ｄ−Ｖａｌ−Ｏｍ−ＡｚａＮｌｅ−Ａｓｐ−ＮＨ２ＦＩＧ、　１６ｈ 要　約　書 “キマーゼ”及び“多触媒プロテアーゼと称されるＡＤに特徴的な２種のキモト リプシン様セリンプロテアーゼの同定、特徴付は及び精製が開示されている。キ マーゼ及び多触媒プロテアーゼは双方ともＮｅｔ及びＡｓｐ間を開裂できる酵素 活性を有するが、その活性はβ−アミロイドを形成する上で必要である。ＡＤを 診断する上で脳（更に他の組織サンプル及び液体）におけるキマーゼ及び多触媒 プロテアーゼの活性を定量しかつその疾患の進行を遅らせる治療剤として阻害剤 を開発するための方法が提供される。新規組成物が２種の酵素の阻害剤として製 造及び確認された。基質もまた開示されている。

ＡＤの治療方法及びβ−アミロイドタンパク質を発生させるプロテアーゼの同定 法が提供される。ヒト脳キマーゼ及び多触媒プロテアーゼのクローニング及び配 列決定とそれらに対する核酸及び抗体プローブの製造に関する方法も提供される 。

国際調査報告

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．β−アミロイド前駆タンパク質においてメチオニンとアスパラギン酸との間 のペプチド結合の加水分解を起こすエンドペプチダーゼ酵素活性を有する精製ペ プチド。
2. ２．アルツハイマー病を示すプロテアーゼの生物学的サンプル中における検出方 法であって、（ａ）式Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ａ１−Ｒ１を有する上記プロテア ーゼ用の基質を用意する〔上記式中： Ｒは水素又はＮ末端保護基である； Ａ４は共有結合、アミノ酸又はペプチドである；Ｒ１はリポーター基である； Ａ３は共有結合、Ｄ−アミノ酸、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＶａｌの保存的ア ミノ酸置換基である；Ａ２は疎水性アミノ酸、Ｌｙｓ又はＬｙｓの保存的アミノ 酸置換基であるかあるいはＡ４が少なくとも２つのアミノ酸を含む場合Ａ２はい ずれかのアミノ酸である；及びＡ１はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、ｌｌｅ 、Ｔｙｒ及び３−フェニルプロリンからなる群より選択される〕；（ｂ）上記生 物学的サンプルを上記基質と接触させる；及び （ｃ）上記生物学的サンプル中における上記プロテアーゼの存在の指標として上 記基質の開裂を検出する；工程からなる方法。
3. ３．生物学的サンプルが脳、肝臓、心臓、筋肉、白血球、肥満細胞、繊維芽細胞 、血清又は脳脊髄液から単離される、請求項２に記載の方法。
4. ４．プロテアーゼがキマーゼである、請求項２に記載の方法。
5. ５．プロテアーゼが多触媒プロテアーゼである、請求項２に記載の方法。
6. ６．式Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ａ１−Ｒ１〔式中：Ｒは水素又はＮ末端保護基で ある； Ａ４は共有結合、アミノ酸又はペプチドである；Ｒ１はリポーター基である； Ａ３は共有結合、Ｄ−アミノ酸、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＶａｌの保存的ア ミノ酸置換基である；Ａ２は疎水性アミノ酸、Ｌｙｓ又はＬｙｓの保存的アミノ 酸置換基であるかあるいはＡ４が少なくとも２つのアミノ酸を含む場合Ａ２はい ずれかのアミノ酸である；及びＡ１はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、ｌｌｅ 、Ｔｙｒ及び３−フェニルプロリンからなる群より選択される〕を有するプロテ アーゼ用の基質。
7. ７．Ａ３がＶａｌ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、ｌｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ及びＰｈｅからな る群より選択される、請求項６に記載の基質。
8. ８．Ａ２がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ及びＨａｒｇからなる群より選択さ れる、請求項６に記載の基質。
9. ９．Ａ４がＧｌｕ及びＡｓｐから選択される、請求項６に記載の基質。
10. １０．ＲがＢｏｃ、Ｐｍｏｃ、Ａｃ、Ｅｔ、Ｓｕｃ、ＭｅＯＳｕｃ、Ａｚ、Ｍｅ ＯＡｚ、Ａｄ、ＭｅＯＡｄ、Ｓｕｂ、ＭｅＯＳｕｂ、ＤＮＳ、ＤＮＰ、Ｚ又はＤ −アミノ酸から選択される、請求項６に記載の基質。
11. １１．Ｒ２がＰＮａ又はＡＭＣから選択される、請求項６に記載の基質。
12. １２．式Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ｙ〔式中：Ｒは水素又はＮ末端保護基である； Ａ４は共有結合、アミノ酸又はペプチドである；Ａ３は共有結合、Ｄ−アミノ酸 、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＶａｌの保存的アミノ酸置換基である；Ａ２は疎 水性アミノ酸、Ｌｙｓ又はその保存的アミノ酸置換基であるかあるいはＡ４が少 なくとも２つのアミノ酸を含む場合Ａ２はいずれかのアミノ酸である；及びＹは プロテアーゼの活性部位と反応性の基である〕を有するプロテアーゼの阻害剤。
13. １３．Ｙが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上記式中： Ｒ２は親油性側鎖置換基である；及び Ｒ３は遷移状態アナログを形成するためプロテアーゼのヒドロキシル基と反応す る官能基である〕を有する、請求項１２に記載の阻害剤。
14. １４．Ｒ２が炭素原子２〜１０を有する飽和もしくは不飽和アルキルもしくは置 換アルキル基、炭素原子５〜１０を有する脂環式もしくは芳香族基又は１１以下 の炭素原子を有するアリールアルキル基である、請求項１３に記載の阻害剤。
15. １５．Ｒ２がエチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル又はｓｅｃ−ブ チル基である、請求項１４に記載の阻害剤。
16. １６．Ｒ３基が−ＣＨＯ、−ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２Ｃ１又はＣＯＣＨ２Ｂｒで ある、請求項１３に記載の阻害剤。
17. １７．プロテアーゼがキマーゼである、請求項１２に記載の阻害剤。
18. １８．プロテアーゼが多触媒プロテアーゼである、請求項１２に記載の阻害剤。
19. １９．生物学的サンプルから少なくとも純度８０％までプロテアーゼを精製する ための方法であって、（ａ）上記生物学的サンプルを界面活性剤含有低塩緩衝液 中でホモゲナイズする； （ｂ）上記ホモゲナイズされた生物学的サンプルから粒状分画を単離する； （ｃ）上記粒状分画を高塩緩衝液に溶解する；（ｄ）上記溶解粒状分画の可溶性 部分を単離する；（ｅ）上記プロテアーゼをイオン交換又はヘバリンカラムに結 合させ、しかる後上記プロテアーゼを上記イオン交換又はヘバリンカラムから溶 出させる；及び（ｆ）上記プロテアーゼを基質アフィニティカラムに結合させ、 しかる後上記プロテアーゼを上記基質アフィニティカラムから溶出させる； ステップからなる方法。
20. ２０．生物学的サンプルが哺乳動物から単離される、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．哺乳動物がヒト、ラット、ウシ及びプタからなる群より選択される、請求 項２０に記載の方法。
22. ２２．生物学的サンプルが脳、肝臓、心臓、筋肉、白血球、肥満細胞又は繊維芽 細胞から単離される、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．低塩が０．５Ｍ以下の塩からなる、請求項１９に記載の方法。
24. ２４．界面活性剤がイオン系又は非イオン系である、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．界面活性剤がトリトンＸ−１００である、請求項２４に記載の方法。
26. ２６．粒状分画がホモゲナイズされた生物学的サンプルから遠心により分離され る、請求項１９に記載の方法。
27. ２７．遠心が３０，０００〜３００，０００×ｇで１５〜１２０分間にわたる、 請求項２６に記載の方法。
28. ２８．高塩が０．５Ｍ以上の塩である、請求項２７に記載の方法。
29. ２９．可溶性分画が高塩から遠心により分離される、請求項１９に記載の方法。
30. ３０．遠心が３０，０００〜３００，０００×ｇで１５〜１２０分間にわたる、 請求項２９に記載の方法。
31. ３１．プロテアーゼがヘバリンカラムに結合される、請求項１９に記載の方法。
32. ３２．アフィニティカラムが酵素用の基質を含む、請求項１９に記載の方法。
33. ３３．基質が式：Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ〔式中：Ｗは共有結合、アミノ酸又はペプチド である；Ｘはバリン又はその保存的アミノ酸置換基である；Ｙは疎水性アミノ酸 、Ｌｙｓ又はＬｙｓの保存的置換基であるかあるいはＷが少なくとも２つのアミ ノ酸を含む場合Ｙはいずれかのアミノ酸である；及びＺはＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｎｌ ｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ及び４−フェニルプロリンからなる群より選択され る〕を有する、請求項１９に記載の方法。
34. ３４．プロテアーゼがキマーゼである、請求項１９に記載の方法。
35. ３５．プロテアーゼが多触媒プロテアーゼである、請求項１９に記載の方法。
36. ３６．アルツハイマー病にかかった患者の治療方法であって、 式Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ｙ〔式中： Ｒは水素又はＮ末端保護基である； Ａ４は共有結合、アミノ酸又はペプチドである；Ａ３は共有結合、Ｄ−アミノ酸 、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＶａｌの保存的アミノ酸置換基である；Ａ２は疎 水性アミノ酸、Ｌｙｓ又はその保存的アミノ酸置換基であるかあるいはＡ４が少 なくとも２つのアミノ酸を含む場合Ａ２はいずれかのアミノ酸である；及びＹは プロテアーゼの活性部位と反応性の基である〕を有するプロテアーゼ阻害剤を上 記患者に投与することからなる方法。
37. ３７．投与が脳内に直接的である、請求項３６に記載の方法。
38. ３８．投与が筋肉内、経口又は経鼻である、請求項３６に記載の方法。
39. ３９．候補キマーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、 （ａ）キマーゼ基質を１種以上の上記候補キマーゼ阻害剤及びキマーゼと共にイ ンキユベートする；及び（ｂ）上記１種以上の候補キマーゼ阻害剤が上記キマー ゼによる上記基質の開裂速度を減少させるか否かについて調べる； 工程からなる方法。
40. ４０．候補多触媒プロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、 （ａ）多触媒プロテアーゼ基質を１種以上の上記候補多触媒プロテアーゼ阻害剤 及び多触媒プロテアーゼと共にインキユベートする；及び （ｂ）上記１種以上の候補多触媒プロテアーゼ阻害剤が上記多触媒プロテアーゼ による上記基質の開裂速度を減少させるか否かについて調べる； 工程からなる方法。
41. ４１．Ｍｅｔ及びＡｓｐ間のβ−アミロイド前駆タンパク質を開裂できる候補プ ロテアーゼのスクリーニング方法であって、 （ａ）配列：ＥＶＫＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱを有するペプチドを用意 する； （ｂ）上記候補プロテアーゼを上記ペプチドと接触させる；及び （ｃ）上記候補プロテアーゼが上記基質を開裂させるか否かについて調べる； 工程からなる方法。
42. ４２．Ｍｅｔ及びＡｓｐ間のβ−アミロイド前駆タンパク質を開裂できる候補プ ロテアーゼのスクリーニング方法であって、 （ａ）配列：【配列があります】を有する基質を用意する（式中： Ｒは水素又はＮ末端保護基である； Ｒ１はリポーター基である）； （ｂ）上記候補プロテアーゼを上記基質と接触させる；及び （ｃ）上記候補プロテアーゼが上記基質を開裂させるか否かについて調べる； 工程からなる方法。
43. ４３．アルツハイマー病にかかった患者の治療方法であって、 上記患者に薬学上許容されるキャリア中におけるキマーゼの阻害剤を投与するこ とからなる方法。
44. ４４．アルツハイマー病にかかった患者の治療方法であって、 上記患者に薬学上許容されるキャリア中における多触媒プロテアーゼの阻害剤を 投与することからなる方法。