JPH05507276A - 動脈造影用合成ペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動脈造影用合成ペプチド類 本願の主題は、各々、１９８８年５月２日、１９９０年５月３日および１９９０ 年５月３日に出願されたＵＳＳＮ１８９．１３０、ならびにその一部継続ＵＳＳ Ｎ５１８．２１５およびＵｓｓＮ）１８．１４２の一１１ｍ続である。

発明の背景 アメリカ合衆国政府はＮＩＨ許可番号第ＨＬ３２９７５号に従って本発明の権利 を有する。

本発明は、アテローム性動脈硬化症のような血管病の早期検出に有用な方法およ び手段、特に動脈損傷を検出するために標識合成ペプチド類を使用する方法およ び手段に関する。

アテローム性動脈硬化症は動脈、特により大きい動脈壁の肥厚化および硬化の原 因となる疾患である。それは、動脈管腔内に形成される病変または浮き出た線維 斑（ｒａｉｓｅｄ　ｆｉｂｒｏｕｓ　ｐｌａｑｕｅｓ）によって特性付けられる 。該斑は腹部大動脈、冠状動脈または頚動脈において最も発病し、それらは年齢 ともに徐々に増加する。

それらは、一般に、管腔を歪めるドーム型の不透明なきらきら輝（表面を示す。

病変は、典型的には、脂質の中心コアおよびコラーゲン線維性筋性層によってキ ャップをかぶせられた壊死性細胞デブリからなっている。複雑な病変は、石灰沈 着も含み、様々な程度の壊死、血栓、および潰瘍を呈するであろう。

斑および関連沈着物によって生じさせられる動脈管腔での損傷またはその変形に よって、血流が閉塞され、治療しないと、最後には、アンギナ、大脳虚血、腎性 高血圧症、虚血性心臓病、発作、および他の器官の疾患を生じる。現在、冠状ア テローム性動脈硬化症は、まだ、アメリカ合衆国における死亡の主要原因であり 、毎年、癌によって死亡する人のおよそ２倍の、５０万Å以上のアメリカ人の命 を奪う。

残念なことに、アテローム性動脈硬化症の初期、およびしばしば臨床学的に何も 言及していない関連血管病を検出することができる診断方法は存在していない。

生活形態の変化、薬物治療および他の手段がアテローム性動脈硬化症病変から生 じる血管閉塞または様々な身体器官のストレスを遅延または軽減するために存在 するので、血管系におけるしゅく状斑の早期検出は、それが最も効果的であり得 る場合に、同時に予防的に介入させるのに非常に価値があるものであろう。

血管病の診断への慣用アプローチである動脈造影は特性付け、および動脈の閉塞 を造影するために放射線不透過性物質の血流中への注入を含む。この方法は、有 意な病的状態、すなわち、感染、動脈の穿孔、不整脈、発作、梗塞形成を含み、 さらに、死に至ることもある。含まれる該危険性のために、動脈造影は、典型的 には、後生的または急性のアテローム性動脈硬化症に罹患している個体のために 動脈造影図が用意される。

血管損傷および疾患の治療に関するあまり侵食的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）ではない 種々の技術が提案されてきた。これらの技術としては、ブレチスモグラフィ、サ ーモグラフィおよび超音波スキャニングが挙げられる（リーズ（Ｌｅｅｓ）およ びマイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、Ａｄｖ、　Ｉ　ｎｔ、　Ｍｅｄ、、２７　：　４ ７５．１９８２）。

本発明で提案される血管損傷の診断に関する他の非侵食性（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓ ｉｖｅ）アプローチは、標識標的を追求する生物学的活性分子または動脈病変を 優先的に探し出す抗体の投与（Ｕ、　Ｓ、特許出願第９２９．０１２号、発明の 名称「血管病の検出」（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉ ｓｅａｓｅ）、１９８６年１１月１０日出願）および標識低密度リボ蛋白（ＬＤ Ｌ）の患者の血管系への投与（Ｕ、　Ｓ、特許第４．６４７．４４５号および第 ４．６６０．５６３号）を含む。血液中を循環するＬＤＬはアテローム性動脈硬 化症斑と結合することが知られている（リーズ（Ｌｅｅｓ）ら、ジャーナル・オ ブ・ヌークリア・メディンン（Ｊ　、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　）、２４　＋１ ５４．１９８３）。

この結合は、たぶん、種々の細胞型におけるレセプター媒介摂取によって循環か らＬＤＬを除去する原因となるＬＤＬ分子の蛋白部分であるアポリボ蛋白Ｂ’− １００（ａｐｏ　Ｂ−１００）を介して生じるであろう。放射活性標識にコンジ ュゲートしたＬＤＬを使用して、放射線検出器でそれらを造影することによって 血管系における斑の位置および大きさについての情報を得ることができる。別法 としては、ＬＤＬを、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）システムにおいて検出可能な非放 射性常磁性造影剤で標識することができる。

この方法の１つの欠点は、患者の血液からＬＤＬを単離し、それらを標識するの に、典型的には数日間を必要とすることである。しばしば、このような診断およ びその後の治療の遅延は危険な状態の病気の也者に関して有害である。さらに、 ドナー血液がＬＤＬ源として使用されるならば、ウィルス性感染のさらなる危険 を被る。

その結果、非狭窄性、非流動障害性アテローム性動脈硬化症動脈病変を早期に検 出およびマツピングできるより良好な非侵食性技術および試薬が必要とされてい る。

したがって、本発明の目的は、血管病または損傷を検出および造影するのに有用 な合成ペプチド類を提供することである。

また、本発明の目的は、安価で、かつ調製し易い、造影に有用な合成ペプチド類 を提供することである。

さらに、本発明の目的は、その初期の血管損傷を含む血管損傷の検出およびマツ ピングの改良方法を提供することでもある。

さらにまた、本発明の目的は、非侵食性である、血管損傷を検出およびマツピン グする方法を提供することでもある。

最後に、本発明の目的は、血管損傷の予防または治療用の合成ペプチド類を提供 することである。

発明の概要 概して、本発明は、ペプチドまたはペプチドアナログがＴｙｒ−Ｌｙｓ　−Ｌｅ ｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａｌａ　−Ａ　ｌａ　−Ａｒｇ　− Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ｌｙｓ’；Ｔｙｒ−Ｌ　ｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　 −Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ−Ａ ｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ　；Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ、−Ｌ ｅｕ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｈｅ　− Ｖａｌ　−Ｔｈｒ　−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ； Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　 ；Ｔ　ｙｒ　−Ａｌａ、−Ｌｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔｈｒ 　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ　−Ａｓｐ−Ａｒｇ− Ｍｅｔ−Ｔｙｒ　； Ｔｙｒ　−Ａ　ｌａ　−Ａ、１ａ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ　 −Ａｌａ　−Ｖａｌ　−Ａｌａ、−Ａｓｎ　−Ｌ　ｙｓ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ａ ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ：Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａ、　ｌａ　−Ｌｅｕ　 −Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐｈｅ　−Ｖａｌ　 −Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃ；１ｙ−ＡＬａ　＋またはＴ ｙｒ　−Ａｒｇ　−，４１１ａ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　− Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ　−Ｌ　ｙｓ@− Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓからなる群から選択されるア ミノ酸配列を含む、血管損傷部位に対する親和性および該部位に蓄積する性質を 有するペプチドまたはペプチドアナログを特徴する。

「ペプチド」なる語は、３０個以下のアミノ酸の鎖のいずれかを意味する。「ペ プチドアナログ」なる語は、例えばＶａｌをＬｅｕに、もしくはＬｙｓを−Ａｒ ｇになどのような保存的アミノ酸置換によって、あるいは、ペプチドの生物学的 活性（この場合、ペプチドの血管病変を標的とする能力）を破壊しない位！にあ る１以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によってのみ、天然ペプチ ド由来のアミノ酸配列において相異するペプチドを意味する。本明細書に記載の ペプチド類似物は、その配列の一部分または全体として、１以上のアミノ酸アナ ログ類、アミノ酸の構造によく似ている分子、および／またはペプチドまたはペ プチドアナログ類以外の分子中にある天然のアミノ酸を含む。

さらに、本発明は、血管損傷部位に対する親和性およびその部位に蓄積する性質 を有するペプチドまたはペプチドアナログを特徴とするものであり：該ペプチド またはペプチドアナログは、アポリボ蛋白Ａ　−１（ａ　ｐ　ｏＡ−１）の、好 ましくはα−螺旋を含む両親媒性ドメインから誘導され、−２以上の正味電荷有 し、その結果、該ペプチドまたはペプチドアナログは損傷部位に蓄積する。

「正味電荷」なる語は、中性ｐＨでのペプチドの合計電荷を意味し、ペプチドの アミノ酸の各々についての電荷（中性ｐＨで）を−緒に加えることによって計算 される。「から誘導される」なる語は、ここで使用する場合、アポリボ蛋白Ａ− １の配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「 実質的に同一」なる語は、（上記のとおり）保存的アミノ酸置換によって、ある いは（上記のとおり）ペプチドの生物学的活性を破壊しない位置にある非保存的 アミノ酸置換、欠失または挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を有することを 意味する。

好ましい具体例において、ペプチドまたはペプチドアナログは、〜２以上の正味 電荷を有し、アポリボ蛋白Ａ−Ｉの両親媒性ドメインの少なくとも一部分のアミ ノ酸配列と充分に重複している（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｖｅ）アミノ酸配列を有し 、その結果、ペプチドまたはペプチドアナログは血管損傷部位で蓄積する。好ま しいペプチドまたはペプチドアナログは、 Ｔｙｒ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ−Ａｒｇ　−Ｃｌｕ 　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓである。

さらにまた、本発明は、血管損傷部位に対する親和性および該部位に蓄積する性 質を有するペプチドまたはペプチドアナログを特徴とい該ペプチドまたはペプチ ドアナログは疎水性ドメインを含み、−２以上の正味電荷を有し、その結果、該 ペプチドまたはペプチドアナログは損傷部位に蓄積する。好ましくは、ペプチド またはペプチドアナログは、血管関連蛋白、例えばエラスチンから誘導される。

「から誘導されるゴなる語は、ここで使用する場合、血管関連蛋白の配列と（上 記のように）同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。

「血管関連蛋白」なる語は、血管壁または血管系の細胞外成分のいずれかに天然 に関連する蛋白を意味し、蛋白エラスチンおよびコラーゲンならびにプロテオグ リカンのような炭水化物を含む。

他の好ましい具体例では、該ペプチドまたはペプチドアナログは血管壁成分、例 えば、コラーゲン、プロテオグリカンまたはエラスチンに対する親和性を有し； 該ペプチドまたはペプチドアナログは１０−’以下の解離定数で（すなわち、ま たは、ボデノド（Ｐｏｄｅｔ）ら、アテローム性動脈硬化症および血栓症ぐＡｒ ｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、１１　：１ １６．１９９１の方法によってイン・ビトロで測定した場合、より大きい親和性 で）エラスチンを結合し、ペプチドまたはペプチドアナログの疎水性ドメインは β−鎖を含む。さらＩこ池の好ましい具体例では、血管関連蛋白は一２以上の正 味電荷およびエラスチンの少な（とも一部分のアミノ酸配列と充分に重複してい るアミノ酸配列を有するペプチドまたはペプチドアナログであり、その結果、該 ペプチドまたはペプチドアナログは血管損傷部位に蓄積する。好ましいペプチド またはペプチドアナログはアミノ酸配列 Ｔｙｒ−（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）。

［式中、Ｘは少なくとも１、好ましくは３コを含んでもよく：または該ペプチド またはペプチドアナログはアミノ酸配列：Ｔｙｒ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ）。

［式中、Ｘは少なくとも１、好ましくは３、またはより好ましくは４〕を含んで もよい。

本発明全体の好ましい具体例において、該ペプチドまたはペプチドアナログはア セチル化アミノ末端および／またはアミノ化カルボキシ末端を有する。このよう なベプキドまた（盆ペプチドアナログ類の例としては、ＨＩＮ　−Ｔｙｒ　−Ｌ ｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａｌａ−Ａ ｒｇ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−、Ａ１．５ｌ）−、へ１ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌ ｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２；ＣＨ，ＣＯＮ　Ｈ−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ　−、Ａ’ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−Ａｌａ−、Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ｌ ｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ−Ａｓｐ　−Ａｌａ　−Ｃｒ１ｕ　−Ｇｌｙ　−Ａ　 ｌａ　−Ｌｙｓ　−ＣＯＮＨ！　；Ｈ、Ｎ　−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　− Ａｌａ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ　−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２＋ ＣＨ３Ｃ０ＮＨ−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−、Ａ、１ａ　−Ｌｅｕ　−Ｇ ｌｕ　−Ａｌａ−Ａｌａ、−Ａｒｇ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ 　−Ａｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ｌｙｓ　−ＣＯＮＨ２：ＣＨ ３ＣＯＮ　Ｈ−Ｔｙｒ−、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ　−ＶａＬ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｃ０ＮＨ２ ；ＣＨ３ＣＯＮＨ−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａｈａ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ−Ａｓｐ 　−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−ＣＯＮＨ２； ＣＨ３ＣＯＮＨ−Ｔｙｒ−Ａｌａ　−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ　−Ｔｈ ｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−、Ａｓｐ−、Ａｒｇ−Ｍ ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｃ０ＮＨ２；Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ−、Ａ、ｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａ ｓｐ−Ｌｅｕ−、Ａｓｎ−Ａｌａ−ＶａＩ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ　−Ｉ　１ ｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＣＯＮＨ，；ＣＨ３ＣＯＮＨ− Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｌ ｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＣＯＮＨ，；ＣＨ３ＣＯＮＨ−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａｌａ 　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　− Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｇｉｎ　−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ１．ｙ−Ａｌａ　−Ｌｙｓ 　−Ｃ０ＮＨ２；ＣＨ３ＣＯＮＨ−Ｔｙｒ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ−Ｇ ｌｕ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ　− Ｇ１．ｕ　−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　 −Ｇｌｎ　−Ｌ　ｙｓ　−ＣＯＮＨ，； Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ 　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ　−Ｖ ａｌ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−ＣＯＮ Ｈ２，および Ｈ４Ｎ　−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａ ｌ−Ｇｕｙ−Ｖａｌ−ＡＩａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌ ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＯＮＨ２が挙げられる。

該合成ペプチドまたはペプチドアナログ類は、被験体の血管系において損傷を検 出および造影するのに有用である。他の有用な合成ペプチドまたはペプチドアナ ログ類は、アミノ酸アナログ類、アミノ酸構造に似ている分子、およびペプチド またはペプチド類似物以外の分子中にある天然アミノ酸を含む。

本発明全体の他の好ましい具体例では、該ペプチドまたはペプチドアナログは水 溶性であるか二または生理的液体、好ましくは生理的ｐＨのもの、例えば血漿に 可溶性であり：ペプチドまたはペプチドアナログを、被験体内でそのモニターリ ングを可能にする検出可能な標識に連結する。好ましい標識は、放射性同位体、 例えば＋３１　Ｊ　、　＋！５１．１２４７、”　’　Ｉ　ｎｓ　””Ｔｃｓ　 ””　Ｐ　ｂｓ　’　”　Ｈｇ、　Ｒｕ”、または２０１Ｔ７Ｂあるいは常磁性 造影剤が挙げられる。このような標識は例えばガンマシンチレーションカメラま たはＭＨＩシステムでの被験体の血管系内の合成ペプチドまたはペプチドアナロ グ類の体外モニターリングを可能にし得る。

また、本発明は、上記形態のペプチドまたはペプチドアナログを被験体中に導入 することを含む被験体の血管系における損傷（例えば、アテローム性動脈硬化症 ）の検出方法を特徴とする。該方法は、さらに、上記形態の第２のペプチドまた はペプチドアナログを投与することを含み得る。導入されるべきペプチドまたは ペプチドアナログを、動脈または静脈注射によって投与することもできる。別法 としては、加水分解不可能な誘導体を経口または経鼻投与することもできる。

次いで、導入した合成ペプチドまたはペプチドアナログを被験体の血管系内で循 環させ、これによってその少なくとも一部分が損傷部位に蓄積する。次いで、損 傷部位に蓄積した合成ペプチドまたはペプチドアナログの一部分を検出する。該 検出工程は、さらに、血管損傷部位に蓄積した標識ペプチドまたはペプチドアナ ログの量を定量する二と：または例えば、ガンマ・シンチレーション・カメラま たは磁気共鳴造影システムで検出可能な標識（例えば、放射性標識または常磁性 造影剤）を有するペプチドまたはペプチドアナログの体外モニターリングによっ て、合成ペプチドまたはペプチドアナログが蓄積した被験体の血管系の領域を造 影することを含み得る。

最後に、本発明は、上記形態のペプチドまたはペプチドアナログの治療学的に有 効な量を被験体に投与することを含む被験体の血管！への低密度リポ蛋白の結合 を抑制する方法を含む。

本発明者らは、合成ペプチドを被験体に投与し、次いで、該被験体の血管系内の 損傷部位でのその蓄積の後に該ペプチドの位置、パターンおよび濃度を検出する ことによって無症候性アテローム性動脈硬化症を含む血管病を診断できることを 見いだした。該技術は多くの長所をもたらす。それは非侵食性であり：それは複 雑な医学的装置または成功裏に行うための非常に熟練された開業医のいずれも必 要とせず；血管病変を標的とするのに使用されたペプチド類は、安価に、迅速に 、かつ大量に（例えば、組換えＤＮＡ技術によって）生産され得る。

さらに、本発明のペプチド類は、アテローム性動脈硬化症のような血管病の予防 または軽減に使用され得る。治療学的に有効な投与量の本発明のペプチドの投与 は、ＬＤＬ結合部位を遮蔽することによってＬＤＬの蓄積を予防することができ る。

本発明の他の特徴および長所は、以下の好ましい具体例の記載および請求の範囲 から明らかであろう。

図面の簡単な説明 本発明の前記および他の目的、その種々の特徴、ならびに本発明自体は、添付し た図面と一緒に読むと以下の説明からより充分に理解されるであろう。

第１図は、ＬＤＬ分子中に含まれる場合のａｐｏ　Ｂ−１００形および表面暴露 領域の略モデルを示す。

第２図は、代表的な合成ペプチド類の両親媒性特徴を示す一連の螺旋状ホイール ダイアグラムである。

第３図は、１２５１標識合成ペプチド５Ｐ−１７で処理したウサギの腹部大動脈 の写真（Ａ）およびアンレー・オートラジオグラフ（Ｂ）を示す。

第４図は、ｌ　！Ｉｔ　ｌ　［ｉ１合合成ペプチド類−１９ａで処理したウサギ の腹部大動脈の写真（Ａ）およびアンレー・オートラジオグラフ（Ｂ）を示す。

第５図は、１１５■標識合成ペプチド５Ｐ−２１ａで処理したウサギの腹部大動 脈の写真（Ａ）およびアンレー・オートラジオグラフ（Ｂ）を示す。

第６図は、Ｉ’ｌＳ■標識合成ペプチド５Ｐ−２８で処理したウサギの腹部大動 脈の写真（Ａ）およびアンレー・オートラジオグラフ（Ｂ）を示す。

第７図は、＋ｚｓ１標識合成ペプチド５Ｐ−２９で処理したウサギの腹部大動脈 の写真（Ａ）およびアンし−・オートラジオグラフ（Ｂ）を示す。

第８図は、＋２５１標識合成ペプチド５Ｐ−３０で処理したウサギの腹部大動脈 の写真（Ａ）およびアンレー・オートラジオグラフ（Ｂ）を示す。

詳細な説明 本発明は、血管損傷部位に対する親和性およびその部位に蓄積する性質を有し、 したがって、血管病の検出、診断、モニターリングおよび治療に有用である合成 ペプチド類を提供する。

これらの特徴を有するこのような合成ペプチド類の特定の例は、血管損傷部位に 対する親和性を有する、すなわち、動脈病変に対するその親和性の原因となるポ リペプチド（例えば、低密度リボ蛋白またはエラスチン）の一部分のアミノ酸配 列と類似の分子構造、電荷、および／またはサイズを有する既知のポリペプチド 類の部分と類似しているアミノ酸配列を有し得る。別法では、本発明の合成ペプ チド類はＬＤＬのａｐｏ　Ｂ−１００部分、ＨＤＬのａｐｏＡ−Ｉ部分またはエ ラスチンの一部分と相同であってもよい。

ペプチド類の設計および合成 本発明で有用なペプチド類は、血管病変を成功裏に標的とするものである。かく して、「血管関連」である、すなわち血管細胞表面または該血管系の細胞外成分 （例えば、プロテオグリカン類、コラーゲン、またはエラスチン）と天然に関連 している蛋白の配列の後にこのようなペプチド類を作るのが好ましい。この類の 蛋白類としては、アポリポ蛋白Ｂ（すなわち、低密度リボ蛋白の蛋白部分）およ びエラスチン（動脈壁の天然成分）が挙げられる。全蛋白分子を使用するのは必 要ではなく、しばしば不都合である（上記参照）。本発明者らは、蛋白断片が血 管病変を有効に標的とするのに使用できることも見いだした。有用な断片の例を ここに記載する。本発明者らは、このような断片が低い正味電荷（すなわち、− ２〜＋２）のものであり、例えば、非常に負に荷電した血管！と相互作用するこ とを示した。本発明者らは、また、このようなペプチド類が一般に２つの類：（ １）好ましくはα−螺旋特徴の、両親媒性ドメインを含むペプチド類；および（ ２）（血管表面または血管関連細胞外成分との相互作用を促進ｒる）疎水性ドメ インおよび溶解性を促進する正の電荷または低い負の電荷（すなわち、−２以上 、すなわち、またはより正）の親水性ドメインを含むペプチド類のうちの１つに なることも示した。

■類、すなわち、両親媒性ドメイン（すなわち、疎水性表面および親水性表面の 両方を有するドメイン）を含むペプチド類の好ましいペプチド類は、例えば、カ イザー（Ｋａｉｓｅｒ）およびケッジイ−（ＫｅｚｄｙＸＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ。

Ｃｈｅｍ、、１６：５６１．１９８７；サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２ ３：２４９．１９８４）に開示されているように、同定される。典型的には、両 親媒性ドメインは、二次構造の領域、最も一般的にはα−螺旋またはβ−鎖を含 む。α−螺旋含有ベブチド項は一般にβ−鎖含有ベブチド類よりも可溶性である ので、それらは、本発明においてより好ましく：増大した溶解性はイン・ビトロ ・ペプチド合成および患者へのペプチド投与を促進する。

■類、すなわち、（ａ）血管細胞表面または疎水性血管関連成分（例えば、エラ スチン）との相互作用を促進する疎水性ドメインおよび（ｂ）溶解性を促進する 正に荷電したかまたは僅かに負に荷電したドメインの両方を含むペプチド類の好 ましいペプチド類は、例えば、以下の疎水性および親水性を予想する方法を使用 して同定する。本発明者らは、この分類のペプチド類が、β−鎖を形成すると予 想される１以上のドメインを含むペプチド類でさえ、被験体に投与され、動脈病 変を充分に標的とするのに使用され得ることを示した。この分類のペプチド類は 疎水性血管関連細胞外成分と相互作用すると思われる。

ペプチドの正味電荷は中性ｐＨでの該ペプチドのアミノ酸上の電荷を一緒に加え て計算する。局在的荷電特性（すなわち、例えばペプチドのある領域の、両親媒 性、親水性、または疎水性特性）およびアミノ酸の個々の配列の二次構造（すな わち、α−螺旋またはβ−鎖の存在）は、多くのモデル作成アプローチのいずれ かを使用してその１次的配列から予想され得る。例えば、両親媒性α−螺旋を同 定するためには、「エドムンドソン・ホイールＪ　（Ｅｄ＋ａｕｎｄｓｏｎ　ｗ ｈｅｅｌ）を構築し、得られたシリンダーの対向面上の疎水性残基および親水性 残基の存在を探すことができる（シッフ−ｒ−（Ｓｅｈｉｆｆｅｒ）およびエド ムンドソン（Ｅ　ｄｍｕｎｄｓｏｎ）、Ｐくイガフィジカル・ジャーナル（Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ｊ　、　）、７・１２１．１９６７　；本明細書に引用記載する ）。別法として、両親媒性、疎水性または親水性ドメインあるいは２次構造の領 域を同定するために、コウーファスマン（Ｃｈｏｕ　−Ｆ　ａｓｍａｎ）法（コ ラ（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、４７：２５１．１９７８；本明細書に引用記載する）のような半 実験式、またはプログラムＰＲＥＤＩＣＴ（二次構造予想のＧＯＲ法に基づく） （ロブソン（Ｒｏｂｓｏｎ）ら、蛋白類および蛋白工学入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃ ｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ）　；ニルスヴイアー（Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク、１９８ ６：本明細書に引用記載下る）を使用し得る。このようなプログラムは方程式 〔式中、Ｉ（Ｓ、＝Ｘ：　Ｘ　：　Ｒ，、、）値は、構造Ｘ中にあるべき残基」 に関する統計的な優先から誘導される］ を使用する。」の状態は、」のいずれか側の配列のｍ個を超える残基の合計から 評価され、パラメータ値は、各位置の残基の同一性および４つのタイプの構造の 各々への貢献度に依存する。値は、状態Ｈ，Ｅ、ＴおよびＣの各々について計算 し、最高値は予想構造（Ｈ−α−螺旋、Ｅ＝β−ノート、Ｔ二曲線、またはＣ＝ シランムコイルのいずわか）を決定する。最後に、両親媒性は、「疎水性モーメ ント」の計算、すなわち周期的なペプチド構造の軸に対して垂直な両親媒性の測 定から誘導され得る。このアプローチはアイゼンハーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ） （Ａｎｎ、　ＲｅｖＢｉｏｃｈｅＩＱ、５３　５９５．１．９８４；本明細書中 に引用記載する）に開示されている。

蛋白の荷電特性（Ｔなわち両親媒性、＠水性または疎水性）および／または二次 構造は判明したが、池の荷電した（または疎水性の）表面との蛋白の相互作用を 促進する個々のアミノ酸配列は判明していない（例えば、カイデー（Ｋａｉｓｅ ｒ）およびケッジイ（Ｋｅｚｄｙ）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２３ 　：　２４９．１９８４を参照）。

したがって、局在的電荷寄与（および全正味電荷）および二次構造、それによる 生物学的活性（この場合、血管病変を標的とする能力）を維持することを条件と する、種々のアミノ酸配列を有する多くのペプチドアナログ類のいくつかを設計 することが可能である。このようなペプチドアナログ類は、生化学の分野の当業 者によく知られている保存的アミノ酸置換（例えば、ＶａｌからＬ　ｅｕ、また はＬｙｓからＡｒｇへの置換）によって天然蛋白配列とは一般に異なるであろう 。さらにまた、より長いアミノ酸ストレッチ内にある両親媒性、疎水性、親水性 の領域および／または二次構造を含むペプチド類を設計し得る。一般に、このよ うな領域の荷電特性および二次構造は周囲のアミノ酸残基によって影響されない 。さらにその上、血管病変を標的とすることができるこれらのペプチドだけが本 発明において有用であると考えられる。

本発明において有用なペプチド類に関する良好なものは、表面暴露蛋白ドメイン （すなわち、蛋白分子、好ましくは血管関連蛋白分子の外面にある蛋白の領域） に基づ（ペプチド類である。というのは、このような領域は血管壁または血管関 連細胞外成分と相互作用すると思われるからである。表面暴露ドメインの同一性 は、トリプンン消化分析（下記参照）および／または領域の疎水仕度／親水性度 の計算によって決定され得る（例えば、コウーファスマン法、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４７：２５１．１９７８による）：細胞外ドメインは一 般に親水性または両親媒性の性質であり：このようなドメインはしばしば膜内外 ドメインに相当する疎水性ストレッチによって囲まれる。

該ペプチド類を、設計した後、例えば、適当な宿主細胞中のペプチドをコードす る組換えＤＮＡの発現を含む、多くの確立された方法のいずれかによって合成す ることができる。別法としては、これらのペプチド類は固相ペプチド合成の確立 された方法によって製造され得る。すなわち、この方法は、成長してしするペプ チドの末端が不溶性支持体に連結させつつ、適当なアミノ酸を所望の配列のペプ チドに連続的に組み込むことを必要とする。通常、該ペプチドのカルボモンル末 端を、切断藁による処理で遊離し得るポリマーに連結する。次いで、このように して合成されたペプチド類を、叡者に投与した後に該ペプチドのモニターリング を可能にさせる試薬で標識する。

ペプチド類は、イン・ビボ動物アッセイ（例えば、本明細書に記載したアッセイ ）を使用して血管病変を有効に標的とする能力について試験され得る。ＬＤＬは ウサギのバルーン内皮剥離治癒動脈ｆｉ（ｂａｌｌｏｏｎ　ｄｅ−ｅｎｄｏｔｈ ｅｌｉａｌｉｚｅｄ　ｈｅａｌｉｎｇａｒｔｅｒｉａｌ　ｗａｌｌ）およびヒト のアテロームの両方に蓄積することが知られている（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ）ら、ジャーナル・オブ・リビド・リサーチ（Ｊ　、　Ｌ　１ｐｉｄ　Ｒｅｓ、 　）、２４：１１６０．１９８３１リーズ（Ｌｅｅｓ）ら、ジャーナル・オブ− ，ｉ＋−”１Ｊ７−メデイスン（Ｊ　、　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄ、　）、２４ ：１５４．１９８３）。したがって、約４週間前に腹部大動脈をバルーン内皮剥 離したウサギをヒト動脈疾患に関する試験モデルとして使用し得る。ＬＤＬレセ プターにおける欠失に対して二次的に高い血液コレステロールを遺伝的に受け継 いだワタナベ遺伝性高脂血症ウサギ（Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ　 Ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉｃ　ｒａｂｂｉｔ）のような池の動物または実験系も同 様に使用することができる。このウサギの系は約２カ月齢で突発性アテローム性 動脈硬化症を発病し、それらは、しばしば心臓発作で死亡する。

該ウサギのモデルは１２５■標識ＬＤＬによるアンレー・オートラジオグラフィ 、およびガンマ・シンチレーション・カメラを使用する９９”Ｔｃ標識ＬＤＬに よる体外造影の両方によって造影された。各々の場合、切除したウサギの大動脈 のアンレー・オートラジオグラフィは、体外造影によるイン・ビボ結果を確実に 予想した。血管投与用調製物において、各標識合成ペプチドは遊離状態で注射さ れてもよく、あるいは、別法として、コレステロールエステルリン脂質マイクロ エマルジョンのような脂質エマルジョンの表面に結合されてもよい。次いで、該 エマルジョンを該ウサギに静脈内注射する。約２４時間後、該ウサギを、該ペプ チド上の特異的標識に対して適当な体外モニター１ルグに付す。別法として、ウ サギを殺し、その大動脈を取り出し、洗浄する。該大動脈は、系列部分（ｓｅｑ ｕｅｎｔｉａｌｐｏｒｔｉｏｎｓ）に切断し、次いで液体シンチレーション・カ ウンターでモニターするか、あるいは、乾燥し、ポリエステル・ラップの層で被 覆し、Ｘ線フィルムのソート上に置き、次いで、暗所で適当な貯蔵時間の後、そ れを現像してアンレー・オートラジオグラムを得る。

玉塗 本発明のペプチド類は血管損傷を診断するため、または別法として血管壁へのＬ ＤＬの結合を抑制するために使用され得る。いずれの場合も、該ペプチドをまず 、被験体、例えば患者に投与する。投与は、動脈注射または静脈注射によって行 われ得る。別法としては、ペプチドの加水分解不可能な誘導体（例えば、ケトメ チレン誘導体）を口を介して投与し得るか、または投与は経鼻的に行われ得る。

血管投与用調製物において、標識合成ペプチドを医薬的に許容される担体（例え ば、生理食塩水溶液）に懸濁するか、または別法としては、コレステロールエス テルリン脂質マイクロエマルジョン（ＭＶ）のような脂質エマルジョンの表面に 結合させ、次いで、該エマルジョンを静脈内注射する。

診断用途に関しては、標識ペプチドを後の検出のために充分な量（一般に、静脈 内０５〜１藁９または経口５〜１００１９）で投与する。本発明の好ましい具体 例では、該ペプチドは、例えば１２１１１１１１５１または９９”Ｔｃのような 放射性同位体で標識されており、損傷部位でのペプチド蓄積をガンマ・ンンチレ ーション・カメラのような放射線検出法によって体外的に造影するか、別法とし ては、合成ペプチドをＭＲＩシステムで検出され得る非放射性常磁性造影剤で標 識する。このようなシステムでは、強い磁場を使用して、患者の身体における原 子のコアスピンベクターを整列させる。次いで、該磁場を妨害し、患者の造影を 、それらの平衡整列へのコア復帰として測定する。本発明において、合成ペプチ ド類はガドリニウム、コバルト、ニッケル、マグネシウムまたは鉄錯体のような 常磁性造影剤と結合してＭＲＩシステムで体外的に造影されるコンジュゲート診 断薬を形成できる。

血管病の治療のためには（すなわち、血管壁へのＬＤＬ結合を抑制するためには ）、該ペプチドを治療学的に有効な量、一般に、５〜１００即で静脈内または筋 肉的投与する。所望により、該治療を繰り返して血管損傷を予防または軽減でき る。

好ましい具体例の記載 本発明において有用な試料ペプチド類の設計および合成について以下に記載する 。このようなペプチド類の血管損傷を標的とする能力を試験するのに使用するイ ン・ビボ・アッセイについても記載する。これらの実施例は本発明を説明するも のであり、本発明を限定するものではない。

アポリポ蛋白ペプチド類 アポリポ蛋白Ｂ（ａ　ｐ　ｏ　Ｂ）は低密度リポ蛋白の蛋白部分である。ａｐｏ Ｂ−１００の一次的構造は、そのクローニングによって入手可能である（例えば 、ノット（Ｋｎｏｔｔ）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、３２３　：　７３ ４−７４２．１９８６　：ヤング（Ｙａｎｇ）ら、ネイチャー、３２３　：　７ ３８．１９８６　：カールソン（Ｃａｌｓｓｏｎ）ら、ヌクレイツク・アシッズ ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、１３：８８１３．１９８ ５参照）。さらに、ａｐｏ　Ｂ−１００のトリプンンによる酵素処理は、ＬＤＬ の種々の細胞および組織への結合において明らかに含まれるこれらの表面領域の 同定を可能にした（フォーゲズ（Ｆ　ｏｒｇｅｚ）ら、バイオケミカル・アンド ・バイオフィンカル・リサーチ・コミｓニケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　 Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｅ、）、１４０：２５０．１９８６　：ノットら、ネイチャー、３２３　 ：　７３４．１９８６）。表面暴露領域は第１図に略図で示す。代表的なトリプ シンペプチドのアミノ酸配列分析を第１表に示す。

第　１　表Ｘ ”アポリポ蛋白Ｂの完全な一次的配列から得た残基番号。

Ｘフォーゲズら（同書）から。

フォーゲズら（同書）のデータ、公表されたａｐｏ　Ｂ配列（上記）ならびに生 化学およびペプチド設計の分野の当業者に知られている情報（例えば、上記のも の）に基づいて、ＬＤＬのａｐｏ　Ｂ部分の表面領域のアミノ酸配列と同様のア ミノ酸配列を有する合成ペプチドを設計した。場合によっては、該ペプチド類を それらのカルボキシ末端でアミド化し、および／またはそれらのアミノ末端でア セチル化した（すなわち、「Ａ」またはｒａＪペプチド類）。８種類の代表的な ａｐ。

Ｂペプチド類およびその修飾された相手を以下に示す。アミノ酸残基の上の数は ａｐｏＢの一次的配列に関する。

Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＣＯＮＨ２；ＣＨ３ＣＯＮＢ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−＾１ ａ−ＬｅｕＪａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＣＯＮ［Ｉｚ　；Ｇｌｕ −Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−＾１ａ−ＣＯＮｔ５　：およびａｐｏ　Ｂ 誘導ペプチド、５Ｐ−４（ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１８５４参照）のアミノ酸２〜 １３個を保存的に置換して５Ｐ−６および５ｐ−ｓを生産した。５Ｐ−１２は、 最後の５個のアミノ酸残基を１個のロイシン（Ｌｅｕ）残基ど置換した５Ｐ−４ の平滑末端形態である。５Ｐ−１４は、最後の５個のアミン酸残基を欠失し、７ 位のチロシン（Ｔ　ｙｒ）残基をトレオニン（Ｔｈｒ）残基と置換した５Ｐ−１ ２の平滑末端形態である。５Ｐ−１５ａおよび５Ｐ−１７は、各々、アミノ酸２ ４８３〜２４９７（すなわち、Ｔｐ４９を含む）およびアミノ酸３８０９〜３８ ２５（すなわち、Ｔｐ５９を含む）を含む。５Ｐ−１９ａおよび５Ｐ−２１８の 配列は５Ｐ−４の配列上での修飾体である。ペプチドＳＰＩ；３ａ、５Ｐ１７． ５Ｐ１９ａおよび５Ｐ２１．ａについて得られた物理的データーを第２表に示す 。これらのペプチド類の両親媒性およびα−螺旋性を示す螺旋状ホイールダイア グラム（ｈｅｌｉｃａｌｗｈｅｅｌ　ｄｉａｇｒａｍｓ）を第２図に示す、疎水 性残基を丸く囲み、荷電された残基を示す。符号は以下のとおりである：Ａ１ア ラニン；Ｄ１アスパルテート：Ｅ１グルタメート、Ｆ１フェニルアラニン：０１ グリシン：に１リンン：Ｌ１０イシン：Ｎ１アスパラギン：Ｑ１グルタミン；Ｒ ，アルギニン、Ｔ１　トレオニン、■、バリン；Ｙ１チロシン；Ａｃ、アセチル 。

ａｐｏＡ−１コンセンサスペプチド（ＡＰＯＡ−Ｉ　Ｃ０Ｎ５ＥＮＳＵＳと称さ れる）、すなわちアポリポ蛋白Ａ−１の多くの領域から誘導された理想化α−螺 旋に基づいて別の両親媒性ペプチド（すなわち、５Ｐ３４ａ）を合成した：この コンセンサスペプチドの配列はアンアンサラマイアー（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａ ｉａｈＸＭｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１２８：６３０．１９８６）に開示されている。アポリポ蛋 白Ａ−１とは異なって、該合成ペプチドはごく僅かに荷電しており、該配列はア ミノ末端チロシン残基によって前置きされている。このペプチドをそのカルボキ シ末端でアミド化し、そのアミノ末端でアセチル化した。このペプチドは弱い負 の正味電荷（すなわち、−２，第２表を参照）を有する。

５Ｐ−３４３： ＣＨ３Ｃ０ＮＨ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−＾ｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ− Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−＾５ｎ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ａ　 １　ａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２ＳＰ−３４ａについて得 られた物理的データを第２表に示す。５Ｐ−３４ａの螺旋状ホイールダイアグラ ムを第２図（上記した）に示す。

第２表 °分子量（計算値／測定値）；間遠原子衝撃質量分析によって測定した親イオン （Ｍ＋Ｈ）’で表した。

１平均疎水性、アイゼンバーブ（Ｅ　ｉｓｅｎｂｅｒｇ）　（ジャーナル・オブ ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、　）、２７９ 　：１２５．１９８４）の方法およびスケールを使用して計算した。

１電荷は中性ｐＨでペプチド上の正に荷電した基と負に荷電した基の間の差で表 す。

エラスチンペプチド エラスチンは皮膚、動脈、肺、および他の組織の主要成分である（ローゼンブル ーム（Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ）　；　ｏバート・アンド−ｏバート（Ｒｏｂｅｒ ｔ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔ）、マトリックス生物学の分野（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ 　ｏｆ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第８巻、弾性組織の生物学および病 理学（Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｅｌａｓｔｉｃ　 Ｔｉ５ｓｕｅｓ）、１９８０：レッディ（Ｒｅｄｄｉ）、細胞外マトリックス： 構造および機能（Ｅ　ｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｔｘ　：　Ｓ　ｔｒｕ ｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆ　ｕｎｃｔｉｏｎ）、１９８５）。種々のエラスチン配 列の分析（ローゼンブルーム、Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、１４４　：１ ７２．１９８７を参照）は、エラスチン蛋白が一般的に多くの繰り返し単位から なっていることを示す。２種類のこのような繰り返し単位はペンタペプチド、Ｖ ａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（ＶＰＧＶＧ）およびヘキサペプチド、 Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（■ＧＶＡＰＧ）である。

構造的には、ニラスチン繰り返しは、円偏光二色性（ラーマン（Ｒａｈｍａｎ） ら、コレクンヨン・オブ・チェコスロバーク・ケミカル・コミュニケーションズ （Ｃｏｉｌ、　Ｃｚｅｃｈ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｗｎ、　）１．５２　：１３５ ６．１９８７）および広範囲な核磁気共鳴研究（アーリイ（Ｕｒｒｙ）ら、パイ オポリマーズ（Ｂ　ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、２５　＋１９３９．１９８６）に よって繰り返しβ一回転構造（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ サーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃａｍｍ、　）、１５３　：　８３２．１９８８）を含むことが示さ れた。ヘキサペプチドは走化性を有する（ソニアー（Ｓ　ｅｎｉｏｒ）ら、ジャ ーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ。Ｂ　ｉｏｌ、　）、９９　 ：　８７０．１９８４）。

動脈病変を標的とするのに有用なエラスチン誘導ペプチドは、疎水性結自部位を 含み、この結合部位は疎水性細胞外血管壁成分（すなわち、エラスチン）との相 互作用を促進し、および／または該ペプチドを負に荷電した血管壁と相互作用さ せる。生理的液体において溶解性を促進するために、該ペプチドは親水性ドメイ ンまたは正または弱い負の正味電荷を含むのが好ましい。

３種類の代表的なエラスチンペプチドを以下に示す。５Ｐ−２８はエラスチンへ キサペプチドＶ　Ｇ　Ｖ　Ａ　Ｐ　Ｇの３回繰り返しを含む。５Ｐ−３０および ５Ｐ−２９は、各々、エラスチンベ〉タペプチドＶＰＧＶＧの４回および３回繰 り返しを含む。５Ｐ−３０および５Ｐ−２９ペプチドはそれらのカルボキシ末端 でアミド１１２　Ｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ　−ＧｌｙＪａｌ　−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ− Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−ＧｌｙＪａｌ　−Ａ　１ａ、−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ ｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−６１ｙ−ＯＨ；５Ｐ−３０： Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　 １−Ｐｒｏ−ＧｌｙＪａ　１−Ｇｌ　ｙ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ| Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧｌｙＪａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＣＯＮＨ２ ：および５Ｐ−２９： ■２Ｎ−ＴｙｒＪａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇ １．ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＣＯＮＨ ２ エラスチンペプチド類について得られた物理的データを第２表に示す。

ペプチド合成および標識化 スチュワード（Ｓ　ｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）の確立された方 法（固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ）、第２版、第５３〜１２３頁、１９８４、ザ・ピアス・ケミカル・カ ンパニー（Ｔｈｅ　Ｐｏｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、、　Ｃｏ、　）、ロック フォード、イリノイ州、本明細書に引用記載する）に従って、固相ペプチド合成 によってペプチド類５Ｐ−６，５Ｐ−６Ａ、５Ｐ−８，５Ｐ−８Ａ、５Ｐ−１２ Ａおよび５Ｐ−１４Ａを合成した。第２表に挙げた計画を使用してこれらのペプ チドを合成したが、この文献に挙げられた他の計画のいずれも、いずれの所望の ペプチド類（例えば、本明細書に記載のいずれのペプチドも）を得るのにも使用 され得る。

第２表 ！ジクロロへキノルカルボンイミド キトリフルオロ酢酸 ｍジイソプロピルエチルアミン ＝＝ｔｅｒｔ−プチルオキシ力ルポニルアミノ酸＝Ｉα２．２．２−トリフルオ ロエタノールｔｅｒｔ−ブトキンカルボニル（ｔ−Ｂｏａ）ベース化学を使用す る手動式固相法（バラエイ（Ｂ　ａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ）、ペプチド類０分析、合成、生物学（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ 　：　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデ ミツク・プレス、ニューヨーク、１９８０；スチュワードおよびヤング、固相ペ プチド合成、第２版、ピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノ イ州、１９８４）によってペプチド類５Ｐ−１５ａ、５Ｐ−１７，５Ｐ−１９ａ ＳＳＰ−２１ａＳＳＰ−３４ａ、５Ｐ−２８，５Ｐ−３０および５Ｐ−２９を合 成した。アミノ酸誘導体の側鎖保護基としては、ＡｓｐおよびＧｌｕのためのベ ンジルエステル類、ＳｅｔおよびＴｈｒのためのベンジルエーテル類、Ｌｙｓの ためのクロロベンジルオキシカルボニル、Ｔｙｒのためのプロモベンジルオキシ 、ならびにＡｒｇのためのメシチレンスルホニルが挙げられる。スチュワードお よびヤングの方法（前記文献）によってジイソプロピルカルボジイミド（Ｄ　Ｉ 　Ｃ）でカルボキシル末端アミノ酸残基をメチルベンズヒドリルアミン樹脂に結 合させた。該ペプチド樹脂をＣＨ２（Ｊ２で２回、次いで、ＣＨ，ＣＡｌ２／１ ％ジメチルスルフィド中５０％ＴＦＡで１回洗浄し、ＣＨｚＣ４／１％ジメチル スルフィド中５０％ＴＦＡで２０分間またはＣＨ２ＣＩ２／　１％ジメチルスル フィド中２５％ＴＦＡで３０分間処理することによってｔ−Ｂｏａ基を除去した 。次に、該ペプチド樹脂を５Ｘ　ＣＨ２Ｃｌ２で５回洗浄し；　ＣＨ２Ｃｌ！中 １０％ジ中ソ０％ジイソプロピルエチルアミン）で２回洗浄して中和し；Ｃ１４ ２ＣＡ’２で５回洗浄した。１．５当量のＤＩＥＡの存在下、３当量の対称性無 水物（下記参照）で４５分間または４当量の活性エステル（下記参照）で２時間 処理して次のアミノ酸を結合した。次いで、該ペプチド樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で４ 回：　ＣＨ，ｃｌ、中３３％エタノールで２回：次いで、ＣＨ２Ｃ／２で２回洗 浄した。

氷上で、６．１当量のアミノ酸をＣＨ２Ｃ１ｔ中３当量のＤＥＣで２０分間処理 することによって対称性無水物活性化アミノ酸類を調製した。氷上で３０分間、 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、各々４当量のアミノ酸、ＨＯＢｔおよびＤ ＩＣからヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の活性エステル類を調製し た。氷上で３０分間、ＣＨ，（Ｊ！、中、各々４当量のアミノ酸、ＥＡＣＮＯｘ およびＤＩＣからエチルヒドロキシイミノシアノアセテート（ＥＡＣＮＯｘ）の 活性エステル類を調製した。カイザー・ニンヒドリン試験（カイザー（Ｋａｉｓ ｅｒ）ら、Ａｎａｌ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、３４　：　、５９５．１９７０）によって各工程の結合の 完了を確認した。

不完全な結合は１または２回繰り返され、まだ不完全である場合、合成を継続す る前に該ペプチド樹脂を無水酢酸でアセチル化した。ペプチド類を脱保護し、Ｈ Ｆ処理（イムノダイナミクス（Ｉ　ｍｍｕｎｏｄｙｎａｍｉｃｓ）、サンディエ イ、カリフォルニア州による指標に従って行った）によって、またはヤジマ（Ｙ ａｊｉｍａ）らの方法（ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ（ケミカル ・コミニニケーノヨンズＸＪＣｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃ、　、　Ｃｈｅｍ、　Ｃａｉ ｍ、　）、第１０７〜１０８頁、１９７４）による１：１０１．０５のトリフル オロメタンスルホン酸：ＴＦＡ：チオアニソール、ニタンジチτ−ルでの処理に よって該樹脂から切断した。粗製脱保護ペプチド類を、５％酢酸で溶離したセフ ァデツクスＧ−２５のカラム上で脱塩するか、または１０〜１００容量のエチル エーテルでＴＦＡ溶液から２回沈殿させた。次いで、ペプチド類をビイダック（ Ｖｙｄａｃ）Ｃ＋ａカラムおよび０１％ＴＦＡを含有する０％〜９０％ＣＨ３Ｃ Ｎ／Ｈ２０の勾配液を使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。精製したペプチ ド類の溶液を蒸発させ、水に再溶解し、凍結乾燥して乾固した。高速原子衝撃質 量分光（Ｆ　、Ａ　Ｂ　Ｍ　Ｓ　）分析によってペプチド類の同一性を確認した 。

シー（Ｓ　ｈｉｈ）ら（ブロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズー！−−ニスーエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳ、Ａ）、８７１４３６．１９９０、本明細書に引用記載する）に記載の クロラミンＴ法によって、該合成ペプチド類５Ｐ−６，５Ｐ−６ＡＳＳＰ−８， ５Ｐ−８Ａ、、５Ｐ−１２Ａ。

および５Ｐ−１４Ａを放射性標識した。ある実験は放射性標識ＬＤＬを必要とし た。これらの場合、前記したリーズ（Ｌｅｅｓ）ら（プロシーディンゲス・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ、８０：５ ０９８．１９８３、本明細書に引用記載する）に開示されたマクファーレイン（ ＭｃＦ　ａｒｌａｎｅ）ヨウ素−塩素化物法の変形によってＬＤＬを１２５ヨウ 素で標識した。セファデックスＧ−２５のゲル濾過「脱塩」カラムまたは等仮初 を通して通過させることによって、放射性標識リボ蛋白または合成ペプチドを未 結合放射性同位体と分離し以下のとおり、クロラミン−Ｔを使用して１２５Ｉで 合成へブチド類５Ｐ−１５ａ、５Ｐ−１７，５Ｐ−１９ａＳＳＰ−２１ａＳＳＰ −３４ａ、　５Ｐ−２訳５Ｐ２９および５Ｐ３０を放射性標識した。

２．５１Ｍリン酸ナトリウム／３７．５１Ｍ　ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，４）２ ００μＡにペプチド（４００Ｉｇ）を溶解し、１ｍｃｉ（３μＩ）＋２５１と混 合した。該混合物にタロラミン−Ｔ（３０μ７．Ｈ２０中８　ｕ／　ｌ／）を添 加し、３５分後、該反応を重亜硫酸ナトリウム（６μＩ！ｓ　８富９／富ｌ）の 添加によってクエンチした。放射性標識ペプチド類をＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−２（ バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、バーキュリーズ、カリフォルニア州）カラ ム（ＩＣｉｘ３０ｃｍ）上でゲル濾過し、０．ＩＭ酢酸中０．１％ＢＳＡで溶離 した。５富ｌの先頭画分を収集し、次いで、両分０．４５ｍ１を収集した。おお よその画分９〜１２で溶出したヨウ素化ペプチドをプールし、ｌＮＮａ　ＯＨで ｐＨを５に調節し、次いで、１ＭＮａＨＣＯ３で７．５に調節した。

反応混合物を最終濃度５０％エタノールに調節した以外は実買的には上記と同様 に５Ｐ−１７のヨウ素化を行った。ヨウ素化後、最終濃度１０％までウノ血清ア ルブミンを添加して放射性標識ペプチドを沈殿させ、該沈殿物を２０００ｒｐ層 で１５分間の遠心によって収集した。次いで、該ベレットを各１冨１の水で４回 洗浄し、最終洗浄の後、該沈殿物を１０％ＢＳＡ５ｍ／に溶解した。別法として 、２０％ＢＳＡを、最終濃度１０％および５１Ｎを超えない容量まで、ヨウ素化 ペプチド（５０％エタノール中）に添加した。次いで、上記と同様に、該溶液を ＢｉｏＧｅｌＰ　２（１０ｃｍＸ　１．５ｃｍ）カラムを通して通過させ、０． １酢酸中０１％Ｂ　Ｓ　Ａで溶離した。窒素圧を使用して過剰の緩衝液を除去し 、該カラムを１１％Ｂ５Ａ１０．１Ｍ酢酸５ｍＡで洗浄し、最も高い放射性の両 分を注射用にプールした。

別法では、合成ペプチド類を、テクネチウム（Ｔｃ）で直接的に、またはＩＩ＋ インジウムのような放射性同位体類を含む種々の金属をキレート化することが知 られているジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のようなキレート化基の共 有結合を介して間接的に標識する。

ｓｅｍｉｃへの直接結合は以下のとおり行う。水溶液Ｑ、５ｄ中５Ｃ１＋Ｃｉ’ ”Ｔｃ（９＠″Ｔ　ｃ　Ｏ４−の形態で）を、０．２Ｍ１ｉ炭酸ナトリウム溶液 （ｐＨ８，０）０．５ｍｌ中合成ペプチド１〜６１１ｇ、好ましくは２菖９に添 加し、室温で１０分間完全に混合する。

所望により０．２５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを８．０〜９．０に上げる。次い で、該混合物に蒸留水０．５ｄに新しく溶解した還元ナトリウムジチオナイト（ ５７゜５ミリモル）１０１１９を添加する。該混合物を室温で３０分間ゆっくり と撹拌する。

モレキュラーンーブクロマトグラフィーによって未結合テクネチウムおよびナト リウムジチオナイトから放射性標識合成ペプチド画分を分離する。ＥＤＴＡ−重 炭酸塩緩ｉ液（０，２Ｍ重炭酸ナトＩＪ　ウニ、ｐＨ８，０、Ｏ，ＯＯＩＭ　Ｅ ＤＴＡ）で平衡化したセファデックスＧ−２５の１×５Ｑｃｍカラムは分離に適 している。

該カラムをブルー・デキストランおよびヨウ化カリウムで標準化して、各々、溶 媒容積およびカラム容量を測定する。該反応混合物を該カラムに付して、重炭酸 塩−ＥＤＴＡ緩衝液を使用してカラム画分を溶離する。合成ペプチドに対して特 徴的な位置で溶出するマクロ分子放射性ピークを単離し、使用する準備をする。

懺和Ｔｃへの間接結合は以下のとおり行う。キレート化リガンド、例えばＤＴＰ Ａ（フナトヴイッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ ）、２２０　＋　６１３．１９８３による）またはブロモアセチルパラアミノベ ンジルＥＤＴＡ（ＢＡＢＥ　。

メアーズ（Ｍｅａｒｅｓ）ら１．Ａｎａｌｙｔ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　、　１ ４２　：１４２．１９８４による）はペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に共有 結合する。これらの文献は本明細書中に引用記載する。次いで、合成ペプチドの 直接標識に関する上記方法によってテクネチウムをＤＴＰＡ−合成ペプチドまた はＢＡＢＥ−合成ペプチドにキレート化する。”’Ｔｃ０４−の形態のテクネチ ウムをＤＴＰＡ−合成ペプチドに添加し、該混合物に還元ナトリウムジチオナイ ト溶液（ｐＨ８，０〜９．０）を添加する。カラムクロマトグラフィー（上記と 同様）によって””Ｔｅｌ［議会成りＴＰＡペプチドを未結合９９′″Ｔｃおよ びナトリウムジチオナイトから分離する。次いで、該調製物を、メアーズら（同 １）による実質的に記載されたシリカゲルクロマトグラフィーによって、または ＨＰＬＣによって特徴付ける。９°Ｔｅ１ｌｔ識ペプチドを、医薬的に許容され る担体溶液中で投与するかまたは脂質エマルジョンに結合させる。

構造 合成ａｐｏＢペプチド類の分子構成または構造がＬＤＬのａｐｏＢ部分の構成と 類似しているかを決定するために、ポリクローナル抗血清を各ペプチドに高め、 そのＬＤＬを結合する能力を試験した。ヒトＬＤＬに高めた抗血清を対照として 使用した。

特異的抗ＬＤＬ抗血清を多くの供給源（例えば、ヘキスト・ファーマシューテイ カル・インコーホレイテッド（Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ 、　Ｉ　ｎｃ、　）、シンシナティ、オハイオ州およびマルブルクーラーン（Ｍ ａｒｂｕｒｇ　−Ｌａｈｎ）、西ドイツ、ならびにハイランド・ラボラトリーズ ・インコーホレイテッド（Ｈｙｌａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、）、４５０１コロラド・ブールバード、ロサンジエルス、カリフォルニ ア州）から購入し得る。別法として、抗血清は当業者に知られている多くのプロ トコルのいずれかによって調製され得る。本明細書に記載のアッセイについては 抗ＬＤＬ抗血清を以下のとおり調製した。生理食塩水またはバルビタール緩衝液 １ｉｕＦ中でフィッシュマン（Ｆ　ｉｓｃｈｍａｎ）ら（アテローム性動脈硬化 症（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、７　：　３６１．１９８７）の方法 に従うて調製したＬＤＬ　５〜２０１Ｉｇを等量のフロイント完全アジュバント （ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デト ロイト、ミシガン州）で乳化した。これは、２０ゲージの針を装着した５ｄのル アー−ロック（Ｌ　ｕｅｒ　−Ｌｏｃｋ）注射器にリポ蛋白およびアジュバント を別々に入れ、内径０．０３０インチのポリエチレン管の１インチ片を介して２ つの針を連結することによって最も容易に行われた。次いで、２つの針および連 結管を介して、数十回、該注射器の内容物をある注射器から別の注射器に有効に 放出する。

安定なりリーム状エマルジョンを調製し、これを最終的に注射器の１つに完全に 移し、連結管を取り外す。乳化した抗原を実験ウサギの背中に皮下注射した。数 匹のウサギに同一抗原を注射しなければならない場合、より大きい注射器および より多量の物質を使用し、各ウサギに初期抗原溶液１．　ｚｌに相当するエマル ジョン２＊Ｉを注射した。多量のエマルジョンを調製するための別法は、ミクル （Ｍｉｃｋｌｅ）粉砕機（ミクル・カンパニー（Ｍｉｃｋｌｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ ）、ハンプトン、ミドルセックス、イギリス、ブリンクマン・インストウルメン ツ・インコーホレイテッド（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 　Ｉ　ｎｃ、　）、ウエストバーリー、ニューヨーク〕の１本の管中に当量の抗 原溶液およびアジュバントを入れ、それに栓をし、この磁気振盪器のスチールリ ードのうつの１つの上に置くことである。第２の試料または水バランスを他のリ ード上に置き、機械をつけ、該リードを約１０分間最大偏倚運動に変える。得ら れたエマルジョンを丸い１８−ゲージ針を介して注射器に引き込み、２０ゲーン 針を介して皮下注射する。

高い抗体力価の抗血清の調製のために、該動物を１回目の注射用として正確に３ 〜５週間ごとに「ブーストＪ　（ｂｏｏｓｔ）Ｌ得る。通常、２回の注射の後に 良好な抗血清が得られる。この方法で処置した動物は免疫状態に長期間維持され 得、非常に多量の抗血清を生産するであろう。１１以上の範囲で抗血清の量を必 要とする場合、２〜３倍の免疫化抗原の量が必要である以外は、同様の方法でヒ ツジを使用し得る。各ブースター注射の６〜１０日後に動物から採血する。所望 により、少量の試験出血を行って抗体レベルおよび純度を検査してもよい。

血液を数時間室温で凝血させ、次いで、冷蔵庫に一晩放置する。該試料を冷所で 遠心し、綿棒（ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ　５ｔｉｃｋ）で血餅を取り除き、残存す る血球を沈殿物に再遠心し、血清をデカントする。保存薬として１諺ｇ／ｍｌの アジ化ナトリウムを添加する。一定に使用する抗血清は冷蔵庫中に維持するか、 または−１５’〜−２０℃で貯蔵し得る。

抗合成ペプチド抗血清を調製するために、端型した合成ペプチドを１　ｚｑ／　 ｍｌの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７，４）に溶解した。ペプチド溶液を等量のフロイン ト完全アジュバントと混合し、粘性エマルジョンが得られるまで完全に渦動した 。ニューシーラント白ウサギ（ミルブルーフ・ファームズ（Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ 　Ｆ　ａｒｔＩｓ）、アムノ為−スト、マサチューセッツ州）の４つの背面四分 円に皮下投与した合計０．５ｔｑの合成ペプチドを注射した。２〜３週間後、該 ウサギに、フロイント不完全アジュバントに乳化したペプチド０．５１９でブー ストを投与した（同一部位に注射した）。最初のブーストの８〜１０日後、該動 物に第２の同一ブーストを投与し、８〜１０日後、３０冨ｌを採血した。

免疫学的交差活性ついて試験するため、５０１Ｍ重炭酸塩（ｐＨ９，６）中ペプ チド１１００ｎ／ウェルと一緒に４℃で一晩インキユベートすることによって精 製した合成ペプチドまたはＬＤＬを微量滴定プレート（イムロン・■・ダイナチ ック・ラブダ（Ｉｍａ＋ｕｌｏｎ　ＩＩ　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ）、チャ ンチリイ、バージニア州）に塗布し、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，４０ ＰＢＳ）、１％ウン血清アルブミン（ＢＳＡ）と−緒にさらに一晩インキユベー ションして非特異的結合についてブロックした。対照ウェルにはＢＳＡだけを塗 布した。ＰＢＳで２回洗浄した後、該ウェルを、合成ペプチドに対して得られた ウサギ・ポリクローナル抗体の連続希釈（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ中で作った１：１ ０〜１　：　１００．０００）で満たし、室温で４５分間インキュベートした。

完全に洗浄した後（ＰＢＳ、Ｏ１１％ＢＳＡで３回）、該ウェルを、ヤギ抗つサ ギＩｇＧホースラディツシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲート（アトランチ ツク・アンチボディズ（Ａｔｌａｎｔｆｃ　Ａｎｔｆｂｏｄｉｅｓ）、スケアポ ロウ、メイン州）の１　：　２０００希釈で満たした。最終洗浄後、該ウェルを ３．３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウニルベルオ キシダーゼ基質（カークガード・アンド・ベリイ・ラブダ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ ｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｒｙＬ　ａｂｓ）、ゲイザースバーグ、メリーランド州）で 満たし、ＥＬＩＳＡ−５自動化プレート測定器（フィジカ（Ｐ　ｈｙｓｉｃａ） 、ニューヨーク、ニューヨーク）で２分ごとに６５０止で測定した。結果は、基 質転換の初期速度（ＯＤｓｓｅ／時の変化）として表され、これはウェル当たり １５データポインの直線回帰によって決定された。

各データポイントは、同時に行った同一プレートからの３つの測定データポイン トの平均を表した。

ＥＬＩ　ＳＡプレートにＬＤＬを塗布し、５Ｐ−４（ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１８ ５４を参照）抗血清で処理した。抗５Ｐ−４抗血清は該プレート上でＬＤＬを結 合することができ、５Ｐ−４およびＬＤＬが構造類似性を有することを免疫学的 に確認した。同様の実験では、抗５Ｐ−４抗血清は、５Ｐ−４および５Ｐ−４Ａ ならびに保存的置換ペプチド類５Ｐ−６，５Ｐ−６Ａ、５Ｐ−８，５Ｐ−８Ａ。

５Ｐ−４２ＡおよびＡＰ−１４Ａを結きすることが判明し、これらのペプチド類 が５Ｐ−４に対する構造類似性、したがって、ＬＤＬに対する構造類似性を有す ることを示した。

動物モデル・ 以下のとおり、本明細書に記載のペプチド類を、血管損傷部位を標的とする能力 についてアッセイした。雄性ニューシーラント白ウサギ（各２〜３＆９）をエイ ・アール・アイ・ブリーディング・ラング（ＡＲＩ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂ ｓＸウェスト・ブリッジウォーター、マサチューセッツ州）から入手した。血管 損傷を誘発するために、バウムガートナー（Ｂ　ａｕＩｌｇａｒｔｎｅｒ　）法 （フィッシュマン（Ｆ　ｉｓｃｈｍａｎ）ら、アテローム性動脈硬化症（Ａｒｔ ｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、７：３６１．１９８７）の変形によってそれら の種部大動脈の内皮を剥いだ。すなわち、各動物を、ケタミンおよびエーテルで 、あるいは別法として、キノラジン（２０ｕ／ｘｉ）およびケタラー（Ｋｅｔａ ｌａｒ）（５０＋ｇ／ｍ／）で麻酔した後、左大腿動脈を単離し；大腿動脈の動 脈切開を介して、４Ｆフオガーテイ塞栓摘出カテーテル（モデル１２−０４０− ４Ｆ。

エドワーズ・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｅ　ｄｗａｒｄｓ　Ｌ　 ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩ　ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ラング・アンテ、カリ フォルニア州）を導入し、横隔膜のレベルまでＸ線透視視覚化下で前進させた。

該カテーテルを、ラジオグラフィ造影剤（コン・レイ（Ｃｏｎｒａｙ）、マリン クロット、セントフレイス、ミズーリ州）でバル−ン膨張圧よりも約３　ｐｓｉ 高い圧力に膨張させた。カテーテルの除去、大腿動脈の結紮、および創傷の閉鎖 前、大動脈内皮を除去するために膨張カテーテルで腹部大動脈を３回通過させた 。該動物は、標識合成ペプチド類の注射の４〜５週間前に治癒した。

ワタナベ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギも動物モデルとして使用した。それ らは、ナショナル・ハート・ラング・アンド・ブラッド・インスティチュート（ Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｌｕｎｇ　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｉ　ｎ５ｔｉ ｔｕｔｅＸベセスダ、メリーランド州）のＷＨＨＬウサギ・プログラムから約３ カ月齢で体重的１．５４ｇのものを入手した。該動物を体重３〜４ｋｑになるま で飼育した。この体重の時、それらは顕著な大動脈アテローム性動脈硬化症を示 した。

カラム溶離緩衝液中の各標識合成ペプチド調製物（例えば、１５０〜４００μＣ ｉ以上の１２５１標識ペプチドを含有する）を、膨張させ治癒したニューシーラ ント白ウサギまたはＷＨＨＬウサギの周縁耳血管に注射した。０〜２４時間の間 に反対側の耳から連続血液試料を得、放射能について分析した。注射後、最初の １０分間にわたって採血した血液試料中の標識ペプチド濃度を０時まで補性して 平均血漿放射能の計算で０時の放射能を測定した。約１分以下の半減期を有する 血漿からペプチド類５Ｐ１５ａ、５Ｐ１７．５Ｐ１９ａ、５Ｐ２１ａ、ＳＰ２ｇ 、５Ｐ３４ａおよび５Ｐ３０を迅速に取り出す７１時間後、血漿レベルは注射し た用量の１０％未満であり、次の３時間にわたってさらに１％だけ低下した。ペ プチド類５Ｐ１５ａ、５Ｐ１７．５Ｐ２１ａ、５Ｐ２８．５Ｐ３４ａおよび５Ｐ ３０は３〜６％血漿レベルに低下し、ペプチド５Ｐ１９ａはより迅速に取り出さ れ、０．３％の濃度に低下した（４時間目で）。

標識合成ペプチド調製物の注射の１〜２４時間後、各動物に脱内皮大動脈の領域 を青色に染色するエバンス・ブルー染料（アライド・ケミカル・カンパニー（Ａ ｌｌｉｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ＋ｔｐａｎｙ）、ナショナル・アニリン・ ディビジＢン、ニューヨーク、ニューヨーク）の０５％溶液４ｍｌを静脈内注射 した。３０分後、該動物をベンドパルビクールの致死注射によって殺した。殺し た後、大動脈を完全に取り出し、生理食塩水で洗浄し、１０％トリクロロ酢酸中 で固化した。

放射性標識合成ペプチドを注射した動物由来の洗浄および固化した大動脈を腹側 面に沿って開いた。次いで、これらの断片をピンで留め、１０％トリクロロ酢酸 中で２時間固化し、写真を撮った。次いで、固化し、開いた血管を一層のプラス チック（サラン（Ｓａｒａｎ））ラップで被覆し、高速Ｘ線フィルム（コダック ・オルトフィルム（Ｋｏｄａｋ　Ｏｒｔｈｏｆｉｌｍ）　０Ｈ−１）上に載せ、 ９０秒Ｘ−ＯＭＡＴ中での現像前に、−７０℃でコダック「Ｘ−オマチック・カ セット」（“Ｘ−〇ｍａｔｉｃＣａｓｓｅｔｔｅ”）（２４×３０ｃｘ）中に３ 日〜４週間貯蔵した。

代表的な結果を第８図〜第１３図に示す。税内皮動脈璧は青色に染色され（上記 のエバンス・ブルー染料で）、写真の暗い領域として現れる（策３図〜第８図、 Ａ）、放射性標識の蓄積はオートラジオグラフの暗い領域によって示される（第 ３図〜第８図、Ｂ）。全てのペプチド類はＬＤＬの特徴的なパターンで内皮組織 を再生するリーディングエツジで集中的に蓄積した。各々の場合、オートラジオ グラフ（第３図〜第８図、Ｂ）は、以前の損傷によって生じた大動脈病変のヒー リング（再内皮）エツジでの造影について合成ペプチドの明らかな切断位置を示 す、この病変は、リポ蛋白の蓄積および他の病理学的変化を含む多くの重要な点 でヒトのアテローム性動脈硬化症に似ていることが知られているので、該合成ペ プチドの損傷部位での局在化およびそれを造影させる能力は血管病を造影する際 の本発明の利用性を示す。

これらおよび他の結果を第３表および第４表に示す。使用される対照ペプチド類 は５Ｐ−２（アポリポ蛋白ＥのヘパリンおよびＬＤＬレセプター結合部位の一部 分）およびアポリポ蛋白Ｂのレセプターおよびヘパリン結合ドメインであるＳＰ 　−１，１，Ａである。大動脈および副腎における１２ＳＩ標識合成ペプチド類 の相対的蓄積と比較するために、標識化合物の平均血漿濃度の差についての修正 が必要であった。合成ペプチド関連＋２５１放射能の平均濃度は、血漿崩壊曲線 の数値的積分および同位体の注射からの時間による割り算によって算出された。

第３表 Ｂ５９　５１）６．Ａ”＋ＭＶ”　３１２　’２５１　２４　？１：Ｂ１２７　 ５ｐ６Ａｘ　３５０　Ｉ２５Ｉ　４　↓１：Ｂ１２２　５ｐ６Ａ”　３４８　Ｉ ２５１　４　＋１！Ｂ１３９　ｓｐ６．Ａ工　５５２　”Ｉ　４　＋ｊ■ １Ｂ１４６　５ｐ６Ａ”　５５０．４　”Ｉ　５　：ｉ’ＪＬ−４５ｐ６Ａ”　 ２８２　′２’Ｉ　５　。

第　３　表（続き） １Ｂ１１５　５ｐ５Ｋ　４１８　”’Ｉ　４　＋ｊ□ １Ｂ１１５−１　ａｐ６”　３９８゜９　１２５ｉ　４　＋ＩＩＢＩＩＩ　ｓｐ ８”−４−ＭＶｔｘ４１９　１２３１　４　＋１ｉＢ１０３　ｓｐ８”　４２４ 　”Ｉ　５　＝−１■ １Ｂ　１２４　ｓ　ｐ　８・　４６６２　・・・Ｉ　４　＋１ＭＶ＝コレステロ ールエステル微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）寡＝放射性 ヰ＝冷たい ｊｌ！４表 全てのペプチドは、約１分間の血漿単減期を有する。０．２〜ｌ、ＱｍＣｉの投 与量で放射性標識ペプチド類を静脈内注射した。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ −−一−→ ＄＋Ｊ声−パジ 要　約　書 血管損傷部位に対する親和性および該部位に蓄積する性質を有する合成ペプチド またはペプチドアナログを患者に投与し、次いで、該患者の血管系内の該ペプチ ドまたはペプチドアナログの位置を検出することによって無症候性アテローム性 動脈硬化症を含む血管病を診断することができる。該合成ペプチドまたはペプチ ドアナログは、アポリボ蛋白Ｂ１アポリポ蛋白Ａ−１、またはエラスチン蛋白の 領域のアミノ酸配列に充分に重複するアミノ酸配列を含み得、その結果、該ペプ チドまたはペプチドアナログが血管損傷部位に蓄積する。

国際調査報告 ””””−”’Ｑ−−、、ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３禰［＋２６５ｅｒｉａｌ　Ｎ ｏ、ＰＣ丁／Ｌ１３９１／Ｑ：１３ｊ６＾ｒｔ　ｕｒ＋ｉｔ　Ｌａ９Ｂ Ｘ、　Ｃ１ａｓｓ寝　１−９．　ｄｒａｗｎ　ｔ６　＠　ｆｌｒｓｔ　ｐｒｏｄ ｕｃｔ、ａ０６１Ｌｏｏｏｒ６ｔｅｌ＊−９ｐｅｐｔｉｃｎ＊、　Ｃ１ａｓｓ　 ５り飢　ｔｕｂｃ↓ａｓｓ　。５り。

Ｃ１５ｉ＋ｓｓ　４の、　４１　聡ｎｄ　４７−６２．　ｄｒａｗｒ＋　ｔａ　 ａ　ｆｉｒ璽ｔｍ・ｔｈｏｄ　ロヱ　ｕｓｅ、ｆｏｒ５　ｄｓｔｅｃｔ４ａｎ　 ６１　１ｎ）ｕｒｙ、　Ｃ４ａｓｇ　５１４．　ｍｕｂｃ↓暑１１１コ。

１１　Ｃｌａｉｍｓ　１の一１コ＊　ｄｒａｗＩ′Ｉ　ｔ−Ｃ３−ｇｅｅｏｎｄ 　ｐｒｏｄｕｃｔ、ａｐｏＡｉｐｏｐｒｏｔ＊１ｎ−Ａｐｅｐｔ４ｄｅ雪、　Ｃ １ａｓｓ　５Ｗ、ｓｕｂｃｌａｉｍ　３５９゜＝１１１１　ｆ！！　Ｃ１ｍ１ｓ ｓ　１４−２１１．　ｄｒｓｗｎ　ｔｏ　ａ　ｔｈｉｒｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ、ｅ ｌｓｇｔＬｎ　ｐｅｐｔｔр■{＋。

Ｃ１１１Ｃ１１ｌ　５コ（ａ、ｍｕｂｅＬｍｍ＊　コ５３゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ペプチドまたはペプチドアナログが【配列があります】： 【配列があります】： 【配列があります】： 【配列があります】： 【配列があります】： 【配列があります】： 【配列があります】；および 【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、血管損傷部 位に対する親和性および該部位に蓄積する性質を有するペプチドまたはペプチド アナログ。 ２．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ４．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ５．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ６．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ７．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ８．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ９．アミノ酸配列が 【配列があります】 からなる請求項１記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 １０．ペプチドまたはペプチドアナログがアポリポ蛋白Ａ−Ｉの両親媒性ドメイ ンからなり、かつ−２以上の正味電荷を有しており、これによって該ペプチドま たはペプチドアナログが血管損傷部位に蓄積することを特徴とする、血管損傷部 位に対する親和性および該部位に蓄積する性質を有するペプチドまたはペプチド アナログ。 １１．両親媒性ドメインがさらにα−螺旋からなる請求項１０記載のペプチドま たはペプチドアナログ。 １２．−２以上の正味電荷およびａｐｏＡ−Ｉの両親媒性ドメインの少なくとも 一部分のアミノ酸配列と充分に重複するアミノ酸配列を有し、それによってペプ チドまたはペプチドアナログが血管損傷部位に蓄積する請求項１０記載のペプチ ドまたはペプチドアナログ。 １３．ペプチドまたはペプチドアナログが【配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する請求項１０記載のペプチドまたはペプチドアナロ グ。 １４．ペプチドまたはペプチドアナログが疎水性ドメインからなり、かつ−２以 上の正味電荷を有し、それによってペプチドまたはペプチド類似物が血管損傷部 位に蓄積することを特徴とする、血管損傷部位に対する親和性および該部位に蓄 積する性質を有するペプチドまたはペプチドアナログ。 １５．ペプチドまたはペプチドアナログが血管関連蛋白から誘導される請求項１ ４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 １６．血管関連蛋白がエラスチンである請求項１５記載のペプチドまたはペプチ ドアナログ。 １７．ペプチドまたはペプチドアナログが血管壁成分に対する親和性を有する請 求項１４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 １８．血管壁成分がコラーゲンである請求項１７記載のペプチドまたはペプチド アナログ。 １９．血管壁成分がプロテオグリカンである請求項１７記載のペプチドまたはペ プチドアナログ。 ２０．血管壁成分がエラスチンである請求項１７記載のペプチドまたはペプチド アナログ。 ２１．ペプチドまたはペプチドアナログが１０−６以下の解離定数でエラスチン を結合する請求項２０記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ２２．疎水性ドメインがβ−鎖からなる請求項１４記載のペプチドまたはペプチ ドアナログ。 ２３．−２以上の正味電荷およびエラスチンの少なくとも一部分のアミノ酸配列 と充分に重複するアミノ酸配列を有し、それによってペプチドまたはペプチドア ナログが該部位に蓄積する請求項１４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ２４．ペプチドアナログが 【配列があります】 （式中、Ｘは少なくとも１である） からなるアミノ酸配列を有する請求項１６記載のペプチドまたはペプチドアナロ グ。 ２５．Ｘが３である請求項２４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ２６．アミノ酸配列が 【配列があります】 （式中、Ｘは少なくとも１である） からなる請求項１６記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ２７．Ｘが４である請求項２６記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ２８．Ｘが３である請求項２６記載のペプチドたまはペプチドアナログ。 ２９．ペプチドまたはペプチドアナログのアミノ末端がアセチル化される請求項 １、１０または１４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３０．ペプチドまたはペプチドアナログのカルボキシ末端がアミド化される請求 項１、１０または１４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３１．ペプチドまたはペプチドアナログが水溶性である請求項１、１０または１ ４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３２．ペプチドまたはペプチドアナログが生理的液体に溶解する請求項１、１０ または１４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３３．生理的液体が生理的なｐＨである請求項３２記載のペプチドまたはペプチ ドアナログ。 ３４．生理的液体が血漿である請求項３３記載のペプチドまたはペプチドアナロ グ。 ３５．さらに、それに結合した検出可能な標識からなる請求項１、１０または１ ４記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３６．標識が放射性である請求項３５記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３７．放射性標識が１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、 ２０３Ｐｂ、１９８Ｈｇ、９７Ｒｕおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される 請求項３６記載のペプチドまたはペプチドアナログ。 ３８．放射性標識が９９ｍＴｃである請求項３７記載のペプチドまたはペプチド アナログ。 ３９．標識が常磁性造影剤からなる請求項３５記載のペプチドまたはペプチドア ナログ。 ４０．（ａ）請求項１、１０または１４記載のペプチドまたはペプチドアナログ を被験体に導入し、 （ｂ）導入したペプチドまたはペプチドアナログを血管系内に循環させて、該ペ プチドまたはペプチドアナログの少なくとも一部分を該部位に蓄積させ、次いで （ｃ）該部位に蓄積したペプチドまたはペプチドアナログの血管系における位置 を検出する工程 からなることを特徴とする、被験体の血管系における損傷の検出方法。 ４１．血管系中の血管損傷がアテローム性動脈硬化症からなる請求項４０記載の 方法。 ４２．ペプチドまたはペプチドアナログがアポリポ蛋白Ａ−Ｉの両親媒性ドメイ ンからなり、かつ−２以上の正味電荷を有し、それによってペプチドまたはペプ チドアナログが血管損傷部位に蓄積する請求項４０記載の方法。 ４３．両親媒性ドメインがさらにα−螺旋からなる請求項４２記載の方法。 ４４．ペプチドまたはペプチドアナログが疎水性ドメインからなり、かつ−２以 上の正味電荷を有し、それによってペプチドまたはペプチドアナコグが血管損傷 部位に蓄積する請求項４０記載の方法。 ４５．ペプチドまたはペプチドアナログが血管関連蛋白から誘導される請求項４ ４記載の方法。 ４６．血管関連蛋白がエラスチンである請求項４５記載の方法。 ４７．導入工程（ａ）がアセチル化アミノ末端を有するペプチドまたはペプチド アナログを被験体に導入することからなる請求項４０記載の方法。 ４８．導入工程（ａ）が活性化カルボキシ末端を有するペプチドまたはペプチド アナログを被験体に導入することからなる請求項４０記載の方法。 ４９．導入工程（ａ）がそれに結合した検出可能な標識を有するペプチドまたは ペプチドアナログを投与することからなる請求項４０記載の方法。 ５０．検出可能な標識が常磁性造影剤である請求項４９記載の方法。 ５１．検出可能な標識が放射性標識である請求項４９記載の方法。 ５２．放射性標識が１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、 ２０３Ｐｂ、１９８Ｈｇ、９７Ｒｕおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される 請求項５１記載の方法。 ５３．導入工程（ａ）が動脈注射によるペプチドまたはペプチドアナログの投与 からなる請求項４０記載の方法。 ５４．導入工程（ａ）が静脈注射によるペプチドまたはペプチドアナログの投与 からなる請求項４０記載の方法。 ５５．導入工程（ａ）がペプチドまたはペプチドアナログの経口投与からなる請 求項４０記載の方法。 ５６．導入工程（ａ）がペプチドまたはペプチドアナログの経鼻投与からなる請 求項４０記載の方法。 ５７．検出工程（ｃ）がさらにペプチドまたはペプチドアナログが蓄積した血管 系の領域を造影することからなる請求項４０記載の方法。 ５８．さらに、標識ペプチドまたはペプチドアナログの検出量を定量化する工程 からなる請求項４０記載の方法。 ５９、導入工程（ａ）が動脈損傷部位に対する親和性および該部位で蓄積する性 質を有する第２のペプチドまたはペプチドアナログを投与することからなる請求 項４０記載の方法。 ６０．検出工程（ｃ）が、さらに、標識ペプチドまたはペプチドアナログの体外 モニターリングを含む請求項４０記載の方法。 ６１．検出工程（ｃ）がガンマ・シンチレーション・カメラによる放射性標識の 体外モニターリングからなる請求項５１記載の方法。 ６２．検出工程（ｃ）が磁気共鳴造影システムによる常磁性造影剤の体外モニタ ーリングからなる請求項５０記載の方法。 ６３．請求項１、１０または１４記載のペプチドまたはペプチドアナログの治療 的に有効な量を被験体に投与することからなる被験体の血管壁への低密度リポ蛋 白の結合を抑制する方法。