JPH05508312A - 永久的ヒト肝細胞の細胞系および肝臓補助装置（ｌａｄ）におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅｐ Ｇ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第１項記載の細胞系。

４、肝欠損または不全に悩む被検体を支持する肝臓補助装置であって、前記肝臓 補助装置は肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特 異的生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系の細胞か らなり、前記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面 成長において、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク ｉＦ／２４時間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミ ン／アルファフェトプロティンの比が少なくとも１５であるように、アルブミン およびアルファフェトプロティンを産生ずる、肝臓補助装置。

５、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タン パク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロティンの 比は少なくとも約２５である、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。

６、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅｐ Ｇ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。

７、さらに反対第１および第２の表面を有する半透膜を含み、前記細胞系は前記 第１面と接触している、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。

８、前記膜は管からなり、そして前記第１表面は前記管の外部の表面である、請 求の範囲第７項記載の肝臓補助装置。

９、前記肝臓補助装置は複数の前記管からなる、請求の範囲第８項記載の肝臓補 助装置。

置。

１１、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロティンの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトブロテインを産生ずる、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系の細胞を、反 対の第１および第２の表面を有する半透膜に準備し、そして（ｂ）前記第１表面 上の前記細胞を、細胞が全面成長に到達するまで、培養し、前記培養工程は、 （ｊ）前記第１表面に前記細胞を接種し、そして（ｉ　ｉ）前記細胞を成長を支 持する培地を、細胞が全面成長に到達するまで、連続的に循環させる、 からなる、 からなる、肝欠損または不全に悩む被検体を支持する肝臓補助装置を調製する方 法。

１２、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロティン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第１１項記載の方法。

１３、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有する）’ １ｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第１１項記載の方法。

１４、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置と 接触させ、前記接触は血液中の分子を前記細胞と接触させて前記血液に含まれる 分子の吸収および代謝的プロセスを達成し、そして前記接触はさらに前記細胞中 で産生されたタンパク質および低分子量の分子を血液の中に入れさせ、そして （ｂ）分泌された代謝廃棄物を肝臓補助装置から除去する、からなる、肝欠損ま たは不全に悩む被検体を支持する方法。

１５、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロティン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第１４項記載の方法。

１６、前記肝臓補助装置はさらに反対の第１および第２の表面を有する半透膜を 含み、前記細胞は前記第１表面と接触し、そして工程（ａ）において血液は前記 第２表面と接触する、請求の範囲第１４項記載の方法。

１７、前記工程（ｂ）は浸漬溶液を前記細胞と接触させ、これにより前記分泌し た代謝廃棄物を除去することによって実施する、請求の範囲第１４項記載の方法 。

１８、前記方法は体外で実施する、請求の範囲第１４．１５．１６または１７項 記載の方法。

１９、前記方法は体内で実施する、請求の範囲第１４．１５．１６または１７項 記載の方法。

２０、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１（７）同定特性を有する ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第１４．１５．１６または１７項記載の 方法。

２１、前記被検体はヒトである、請求の範囲第１４項記載の方法。

２２、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロティンの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロティンを産生ずる、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系を培地中で維 持し、（ｂ）上澄み液を前記培養物から回収し、（Ｃ）血漿タンパク質を前記上 澄み液を分離し、そして（ｄ）前記血漿タンパク質を精製する、からなる、肝欠 損または不全に悩む被検体を支持する方法。

２３、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロティン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第２２項記載の方法。

２４、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅ ｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第２２項記載の方法。

２５、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロティンの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロティンを産生ずる、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系を培地中で維 持し、（ｂ）前記細胞系を試験すべき薬物に暴露し、そして（ｃ）前記培養物を 前記薬物の代謝物の存在下に分析する、からなる、薬物および薬理学的化合物の 代謝的活性を評価する方法。

２６、さらに、工程： （ｄ）前記代謝物を池の細胞培養物の中に導入して、それらの突然変異誘発また は有害作用を決定する、 を含む、請求の範囲第２５項記載の方法。

２７、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファ７エトプロテイン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第２５項記載の方法。

２８、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅ ｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第２５項記載の方法。

２９、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロティンの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロティンを産生ずる、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系を培地中で維 持し、（ｂ）前記細胞系を肝炎の菌株で感染させ、そして（Ｃ）前記菌株により 引き起こされた前記細胞系への作用を観察する、からなる、ウィルスの肝炎を研 究する方法。

３０、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロティン の比は少な（とも約２５である、請求の範囲第２９項記載の方法。

３１、前記細胞系はＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅ ｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第２９項記載の方法。

明　細　書 永久的ヒト肝細胞の細胞系および肝臓補助装置（ＬＡＤ）におけるその使用 本発明は米国政府の支持でなされた。米国政府は本発明においである種の権利を 有する。

細胞生物学的および医学の分野における本発明は、正常の機能をもつ肝細胞の永 久的細胞系およびそれらの使用方法、とくに肝臓補助装置および肝細胞の代謝お よび調節の研究における細胞系の使用方法に関する。

発明の背景 激症の肝不全（ＦＨＦ）は、脳障害が症状の発生の８週以内に起こる、きびしい 肝細胞の機能障害として定義され［ベルナラ（Ｂｅｒｕｎａｕ）、５８６−５９ １　（１９８８）；カテラリス（Ｋａｔｅｌａｒｉｓ）、Ｐ。

Ｈｌら、Ｍｅｄ、Ｃ１１ｎｉｃｓ　Ｎ、Ａｍｅｒｉ、、ヱ３：９５５−９７０　 （１９８９）］は、一般に、ウィルス性肝炎、薬物反応または中毒により引き起 こされる。肝移植の不存在下に、生存率は約２０％であるが、患者の年令および 病気の病因論に依存して劇的に変化する（６〜７９％）　［ベルナラ（Ｂｅｒｕ ｎａｕ）ら、５ｕｐｒａ　；ヤング（Ｙａｎａａ）　、５ｕｐｒａ　；カテラリ ス（Ｋａｅｌａｒｉｓ）ら、５ｕｐｒａ］。

ＦＨＦの臨床的過程は多器官の不全の発生により影響を受け、そして死亡率はき びしい凝固の異常の発生、腎不全、肺水腫または心臓血管の崩壊とともに増加す る［ビハリ（Ｂｉｈａｒｉ）、Ｄ、Ｊ、ら、Ｓｅｍ。

Ｌ　ｉ　ｖ、Ｄｉｓ　、６　：１１９−１２８　（１９８６）］ｏ多器官の不全 の発生は、循環するトキシン、例えば、メルカプタン類、フェノール類、脂肪酸 類、アンモニアおよび脈管の透過性を増加する分子の結果である［ベルナラ（Ｂ ｅｒｕｎａｕ）ら、５ｕｐｒａ；ヤング（Ｙａｎｄａ）ら、５ｕｐｒａ：カテラ リス（Ｋａｒｅｌａｒｔｓ）ら、５ｕｐｒａ］。

この透過性の増加の最もきびしい結果は脳において見られる。トキシンは血液− 脳障壁を横切り、そしてＮａ’−に’ＡＴＰアーゼの阻害に似た作用およびＧＡ ＢＡ−ベンゾジアゼピンレセプタの占有による意識のレベルの低下を生成する［ バラセット（Ｂａｓ　ｅ　ｔ　ｔ）　、Ｄ、Ｊ、ら、Ｇａｓ　ｔ　ｒｏｅｎｔｅ ｒｏ　Ｉｏｇｙ、、９３　：１０６９−１０７７　（１９８７）］。この漸進的 中枢神経系の障害における最後の段階は大脳の水腫、ＦＩ４Ｆにおける死亡の最 も普通の原因［ニブ（Ｅｄｅ）　、Ｒ，Ｊ、ら、Ｓｅｍ、Ｌｉｖ、Ｄｉｓ、　、 ６　：１０７−１１８　（１９８６）］。

正常位の肝臓移植は、遺伝学的欠陥から腫瘍までの範囲の肝機能を破壊する広範 な種類の状態に対する有効な処置である［スタルズル（Ｓｔａ、ｒｚｌ）、Ｔ、 Ｅ、ら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３２１　：　１０１４−１０２２　（１ ９８９）］。これは米国における増加している普通の処置であり、はぼ２０００ の移植７年であり、そして米国において次の数年以内に４０００／年の上昇、お よびヨーロッパにおいて同様な数が期待される。財政および医学的源が入手可能 であったが、実際の必要性は米国単独で５０，０００件の肝臓移植／年程度の高 さに到達しうることが推定された。

移植の主要な問題の１つは、肝機能の十分な量と不十分な量との間のかなりの微 細な区別である。例えば、ラットは典型的には７０％の肝切除に生き残るが、肝 臓の８０％の除去は一般に致死的である。この事実は患者が頻繁にＦＨＦに急に なることである。人工的肝臓の支持の満足すべき方法は現在入手可能でないので 、治療的決定は局所的に入手可能な医学的源に基づいて、患者の同意を得ないで 、しばしばなされる。

正常位の肝臓移植による多器官の不全の逆転は、それを他の治療的物理療法が測 定しなくてはならない治療の標準とした。肝移植の必要性が明らかとなるまで、 それを遅延したとき、患者の６０％が死亡したとという観察に基づいて、ＦＨＦ で存在するすべての患者において支持されている。

この可能な過度の熱心な観察は、ＦＨＦが均一な致死的でないという事実を無視 する。比較的すぐれた予後をもつグループ、例えば、アセトアミノフェンの中毒 の患者は同定された。ＦＨＦからの回復は正常の肝機能の回復に通常関連し、そ して移植は患者を一生の医学的監督および免疫抑制にさらすので、致死的結果を 病気の過程において早い時期に予測することができないかぎり、初期の移植は最 良のオプションと考えることができない。

他方において、緊急の移植はまた不満足である。昏睡の段階ＩＩＩに入る患者は 死の直ちの危険の増加であり、それらの状態はしばしば急速に悪化する。これは 不適合性のドナーからの肝臓の移植を必要とことがある。事実、欠損した器官の 獲得によるいくつかの死亡が報告されたしビッカース（Ｖｉｃｋｅｒｓ）　、Ｃ ，ら、Ｊ、Ｈｅｐａｔｏｌ、　、７：１５８３−１５８８　（１９８９）］。

緊急の正常位の肝臓移植は、現在、この分野において知られている急性の肝臓の 支持の唯一の方法である。それは高い死亡率、禁止的コスト、および生命の患者 の性質への有意のマイナスの衝撃を有する。肝機能を支持する別法は、それが肝 臓の再生が起こるために十分な時間を提供できることにおいて、高度に望ましい であろう。個体に対する利益は任意の合理的な計算を越えるが、財政上の節約は ｉｏｏ、ｏｏｏドルになる；移植単独の実際のコストは患者の状態に依存して７ ０，０００〜２４ｏ、ｏｏｏ−ｃ’ある［ディンドザンス（Ｄｉｎｄｚａｎｓ） 　、Ｖ、Ｊ、ら、Ｄｉｇ、Ｄｉｓ、ａｎｄ　Ｓｃｊ、、３４　：　１６１−１６ ６（１９８９）］。

肝臓の二次的損傷は循環するトキシンにより引き起こされうるので、早期の肝臓 の支持は、また、内部の環境を改良し、これにより肝臓の再生を促進する。再生 が起こらない場合、肝臓の支持は多器官の不全を妨害または防止するであろう。

こうして、患者を過度に長く「見ること」およびドナーを待つ患者の死亡という 恐れは肝臓補助装置の入手可能性により最小となるであろう。さらに、再生でき ない肝臓をもつ患者のみに移植され、そして肝臓移植の外科の前に一般の健康の 改良は外科の改良と相関関係をもつ。

肝臓の移植の１０〜２０％において、移植されたは再潅流のとき欠損する。次い で、これらの患者は緊急の第２の移植片を必要とする。体外の肝臓補助装置の入 手可能性は、主要な外科の第２ラウンドの前に、移植片の回復を可能とする。し たがって、肝機能を支持する手段は緊急に必要とされる。

人工的支持装置の使用は、腎臓、心臓および肺の移植への劇的な作用を有したが 、このような装置は肝臓の支持に利用可能である。したがって、肝機能の長期間 の保存のための支持系が必要とされている。このような肝臓補助装置はある数の 移植の場合において用途を有するであろう。

第１に、それは激症の肝不全の患者は第２に、それは移植後の患者を安定化およ び補助するとき、とくに再潅流のときグラフが応答することができない場合にお いて使用される。第３に、ある場合において、それは移植の代替手段として働く 。この装置は患者の自然の肝臓が再生する時間を許し、手術の費用、免疫抑制へ の一緒の依存および早期の死亡の可能性をなくすであろう。

関係する文献 ヒト肝腫瘍細胞系ＨｅｐＧ２は米国特許第４，３９３．１３３号に開示されてい る。ＨｅｐＧ２細胞系を利用する他の実験は、ケリイ（Ｋｅｌｌｙ）　ら、Ｉｎ 　Ｖｆｔｒｏ　Ｃｅ１１．ａｎｄ　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、、２５：２１７−２２２ 　（１９８９）、およびダーリントン（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ）ら、Ｉｎ　Ｖｉ ｔｒｏ　Ｃｅ１１．ａｎｄ　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、、ス旦：　３４９−３５４（１ ９８７）に報告されている。ヒト肝腫瘍細胞系は、ナカバヤシら、Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４２：３８５８−３８６３　（１９８２）に論じられてい る。

人工肝臓についての概観の論文は、ジャウレグイ（Ｊａｕｒｅｇｕｉ）ら、Ｂｉ ｏｃｏｍｐａｔｆｂｌｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｍｅｔａｌｓ。

ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ、Ｍ、スジチェル（Ｓｚｙｃｈｅｒ）編、Ｔｅｃ ｈｎｉｃａ！　Ｐｕｂ、ペンシルベニア州ランカスター、ｐｐ。

９０７〜９２８　（１９８３）に記載されている。

先行技術に開示されている肝臓補助装置は、次のものを包含する：米国特許第４ ．８５３．３２４号；米国特許第４．６７５，００２号；英国特許出願第ＧＢ２ ，２１１．８５７．Ａ号、欧州特許出願公開第０゜０７９．７８１号：エールリ ッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）ら、Ｉｎ　ＶｉｔｒＯ１±４　＋４４３−４５０　（１ ９７８）；ウォルフ（Ｗｏｌｆ）ら、Ｔｒａｎｓ、　Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　Ａ ｒｔｉｆ、　Ｉｎｔ、　Ｏｒｇａｎｓ。

Ｖｏ　１．ＸＸＩ　：　１６−２７　（１９７５）：ウォルフ（Ｗｏｌｆ）　ら 、Ｔｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｒｔｉｃｉｃｉａｌ 　Ｏｒｇａｎｓ、１：４５−５　（１９７８）；およびウォルフ（Ｗｏｌｆ）　 ら、　■　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｒｔｉｃｉｃｉ ａｌ　Ｏｒｇａｎｓ、２：９７−１０３（１９７９）。

組繊細胞または肝細胞のエンカブスレージョンは、米国特許第４，３９１、．９ ０９号：米国特許第４．３５３．８８８号：サン（Ｓｕｎ、）ら、Ｔｒａｎｓ、 Ａ、ｍ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎｓ。

Ｖｏｗ、ＸＸＸＩ　：３９−４１　（１９８６）；およびカイ（Ｃａｉ）ら、Ａ ｒｔｉｆｉｃａｌ　Ｏｒｇａｎｓ、１２＋３８８−３９３（１９８８）に記載さ れている。

人工膵臓として使用するための細胞培養装置は、米国特許第４，２４２．４６０ 号に開示されている。

発明の要約 本発明は、肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特 異的生物学的活性を構成的に提供する、永久的細胞系に関する。細胞は胚芽細胞 腫からクローナル的に誘導され、そして正常のヒト肝細胞の特性の多くを示す。

細胞は種々の肝疾患の処置似有用である。

と（に、細胞は激症の肝不全の被検体の処置するための肝臓補助装置（ＬＡＤ） において有用である。より典型的には、本発明の装置および方法は肝移植をまつ 患者における待期的手段として有用である。　４ｉｏ、ｏｏｏ細胞／ｃｍ２でプ レイティングし、そして毎日培地を交換して示した密度に成長させた。培地を二 重反復実験の培養物から除去し、そしてアルブミン、ＡＦＰおよびトランスフェ リンについてアッセイした。特異的産生はμｇのタンパク質／ｍｇの合計の細胞 タンパク質／２４時間として表す。密度はｍｇの合計の細胞タンパク質／ｃｍ” として表す。すべての値は二重反復実験の試料について二重反復実験の決定の平 均である。標準偏差はすべての場合において１０％より小さい。

第２図。ミリセル（Ｍｕ　ｌ　］　ｃｅ　ｌ　＋”）を含有する培養ウェルの断 面。

細胞は上のチャンバー内で培養プレートのインサートの支持膜上で成長エンの吸 収。メチオニン不含培地中で１時間インキュベーションした後、１００μＣｉ／ ｍｌのトラン（Ｔ　ｒ　ａ　ｎ）　”Ｓ−ラベル（ｌａｂｅｌ’）を上または下 のチャンバーに添加し、そして細胞を３７℃においてインキュベーションした。

インサートを示した時間に取り出し、水冷リン酸塩緩衝液中でよくすすぎ、モし てカウンティング溶液の中に入れた。各時点は平均±３つのインサートのＳＥＭ を表す。

！土層。ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞中のグルコースの利用へのニトロプロピオン酸 の作用。１７５ｃｍ”のフラスコ中の全面成長の細胞の単一層を、１９モルのニ トロプロピオン酸（ＮＯＰ）の不存在（正方形）または存在（円形）下に２４時 間インキュベーションした。培地を交換し、そしてインキュベーションを正規の 培地（閉じた記号）または使用前に９５％の酸素、５％の二酸化炭素で２０分間 気体処理した培地（開いた記号）中で続けた。

ｌ−正規の培地、−−酸素化培地、・−正規の培地十ＮＯＰ、Ｑ−酸素化培地＋ ＮＯＰ； ！互層。乳酸塩＋または−オレイン酸からのＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡｍＦｉｉ：よる グルコースの合成。細胞をアール（Ｅａｒｌｅ）のバランス塩溶液（ＥＢＳＳ） （グルコース不含）中で５ミリモルの乳酸（正方形）または５ミリモルの乳酸、 １ミリモルのすレイン酸（円形）の存在下に使用前に９５％の酸素、５％の二酸 化炭素で２０分間気体処理した培地中でインキュベーションした。

専旦客。Ｈｅ　ｐ　Ｇ　２　／　Ｃ３Ａ細胞中のグリコーゲンの合成。全面成長 の１（ｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を５ミリモルの乳酸および１ミリモルのオレイン酸 を含有する、酸素化ＥＢＳＳ（グルコース不含）中の一夜インキユベーションし た。時間Ｏにおいて、細胞に正規のＭＥＭ／ＭＡＲ培地、１４３ミリモルのグル コース濃度を有する１０％の血清を供給した。再供給後示した時間に、５０μＣ ｊの３Ｈ−水および１０μＣｉのｌ　１４ｃｍグルコースを添加した。細胞を１ ５分間インキュベーションし、そしてグリコーゲンをチャン（Ｃｈ　ａ　ｎ）お よびエクストン（Ｅｘｔｏｎ）の方法により抽出した（参照、実施例ｖ１下）。

次いで、３Ｈ−またはＩ４０標識したグリコーゲンを液体シンチレーション分光 光度計中でカウントした。結果をｃｐｍ（グリコーゲン）／分／ｇの細胞の湿式 重量として表す。各時点は単一の実験からの３回反復決定の平均である。各点は ほぼ２ｇの細胞を含有する１つの８５０ｃｍ”のローラーびんに基づ（。

インセットはグリコーゲン中の３Ｈ／１４Ｃの比を示す。

！ユ臣。ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の尿素合成。細胞は添加前に９５％の酸素、５ ％の二酸化炭素で２０分間気体処理した、５ミリモルの乳酸塩および１０ミリモ ルの塩化アンモニウムを含有するＥＢＳＳ　（グルコース不含）中で一夜インキ ユベーションした。時間Ｏにおいて、細胞に同一培地を再供給した。アリコート を示した時間に取り出し、そして下の実施例Ｖｌに記載するように尿素の産生に ついてアッセイした。各点は２回の実験からの３回反復の決定の平均である。各 実験はほぼ２ｇの細胞を含有する単一の８５０ｃｍ２のローラーびんに基づ（。

！旦丙。フロバス（ＦｌｏＰａｔｈ）１４００カートリツジ中のＨｅｐＧ２／Ｃ ３Ａ細胞によるアルブミンの産生。カートリッジをほぼ０．５ｇの細胞とインキ ュベーションした。２０ｍ１の培地を第５日後毛管外の空間から毎日取り出し、 そして固相のラジオイムノアッセイを使用してヒト血清アルブミンについてアッ セイした（参照、実施例Ｖｌｌ、下）。

結果を産生じた合計のアルブミン／２４時間として表す。

好ましい実施態様の説明 新規な細胞系、それらの調製、およびそれらの使用方法が提供される。

細胞系は、ヒト肝細胞の特性のほとんどを保持する胚芽細胞腫から誘導された肝 細胞系である。細胞系は定性的および定量的の両者で肝臓をまねることができる 。それらはほぼ正常のレベルの、グリコーリシス、グリコネオゲネシス、グリコ ゲネシスおよびウレオゲネシスを包含する、いくつかの中央の代謝経路を発現す る。さらに、これらの細胞はほぼ正常のレベルのアルブミンおよび他の血清タン パク質を合成し、高いレベルの肝特異的転写因子を含有し、そしてヒト肝細胞の 構造および極性の特性を示す。

本発明の細胞系は既知の胚芽細胞腫の細胞系、ＨｅｐＧ２から誘導される。「誘 導」とは、細胞系がＨｅｐＧ２から、下に提供する、定められた選抜法により得 られるか、あるいはクローニングされることを意図する。）（ｅ　ｐ　Ｇ　２系 は、正常のヒト肝細胞のある種の特性を示す、ヒト胚芽細胞腫細胞系である。こ の細胞系は米国特許第４，３９３．１３３号に開示されており、そしてアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクシコン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ。

１１　ｅｃ　ｔ　１ｏｎ）（ＡＴＣＣ）米国マリイランド州Ｄツクビレ）から、 ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８０６５として入手可能である。この細胞系の特性は、次の ものを包含する刊行物に開示されている：ダーリントン（Ｄａｒｌｎｇｔｏｎ） ら、試験管内細胞および発育の生物学（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　 ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｐｍｅｎｔａｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、λ３　：　３４９−３ ５４　：ケリイ（Ｋｅｌｙ）ら、試験管内細胞および発育の生物学（Ｉｎ　Ｖｉ ｔｒｏ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇ ）ｒ）、２５＋２１７−２２２：ダーリントン（Ｄｉｒ　Ｉｎｇｔｏｎ）　、Ｇ 、Ｊ、メソッズ・インーｘンジ（−ｏジー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１ ５１：１９−３８　（１９８７）；　Ｉ−リフト（Ｔｈｒｊｆｔ）、Ｒ，Ｎ、ら 、Ｊ、Ｌｉｐ、Ｒｅｓ、　、２７＋２３６−２５０　（１９８６）。はとんどの 他ノヒト肝系と異なり、ＨｅｐＧ２はヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）遺伝学的 配列をもたない。こうして、本発明の細胞系は、ＨｅｐＧ２からクローン的に誘 導され、ＨＢＶの遺伝学的配列をもたない。さらに、細胞系は非腫瘍形成性であ る。それらはヌードマウスにおいて腫瘍を形成しないＨｅｐＧ２から誘導される 。

本発明の細胞系は、次の性質を示す細胞について選抜することによって、Ｈｅｐ Ｇ２系から得ることができる：　（１）強い接触阻害；　（２）アルブミンの高 い発現：　（一般に、少なくとも約２０μｇのタンパク質／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間、より一般に少なくとも約２５μｇのタンパク質／ｍｇの合 計の細胞タンパク質／２４時間）；および（３）全面成長において高いアルブミ ン／アルファフェトプロティンの比（一般に、少なくとも約１５、より一般に少 な（とも約２５の比）。

胞系、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ コン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｆ ｏｎ）にＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１０７４１で受託された、を、より詳しく下に 記載する。

選抜された細胞系は、正常のヒト肝細胞により産生されるレベルに類似するレベ ルのヒトアルブミンおよび他の血清タンパク質を合成し、そして発育するか、あ るいは再生する正常の肝細胞について予測されるように、遺伝子の発現の調節を 実証する。示すように、このような細胞系は高いアルブミンの産生および、全面 成長に到達したとき、高いアルブミソ／アルファフェトプロティン（ＡＦＰ）の 比について選抜することによってクローニングされる。用語全面成長は、細胞が 互いに接触しそして有効成長表面の大部分またはすべてを覆い始めるとき、培養 中の細胞密度を呼ぶ。

成長の全面成長前において、選抜した細胞は再生する肝臓に似た挙動をする。そ れらは急速な倍加時間（約２４時間）を有し、そしてＡＦＰ、アルドラーゼＡ／ ＣおよびピルベートキナーゼＫを包含する、ある数の胎児タンパク質を発現する 。全面成長に到達すると、細胞は大人の表現型を取り、ここで細胞分割は劇的に 遅くなり（倍加時間〉２００時間）そして胎児タンパク質の発現は停止する。大 人の表現型を発現する細胞は優勢となり、これはアルブミン、アルドラーゼ、ピ ルベートキナーゼＬの産生、および正常の肝臓の組織学的特徴の発生により証明 される。

本発明の細胞系は、本発明の目的に対してこの分野において知られている肝腫瘍 細胞系を越えたいくつかの明確な利点を有する。それらは極めてよく分化する。

結局、それらは肝欠損または不全の被検体を短いか、あるいは長い期間の間支持 するために有効なレベルで肝特異的生物学的活性を構成的に発現する。

用語「構成的に」は、これらの細胞が、特定の形態の誘発を必要としないで、肝 特異的生物学的活性を通常発現するという事実を意味する。

いったんこれらの細胞が全面成長に到達すると、それらは正常の肝特異的生物学 的活性を維持する。

用語「肝特異的生物学的活性」は、ここで使用するとき、特異的に肝細胞の中で 、ならびに本発明の細胞の中で起こる、ある数の生理学的／生化学的反応を意味 する。また、この用語は、これらの細胞が合成および分泌するタンパク質および 低分子量の産生物を意図する。

肝細胞は、ホメオスタシスに対して重要である、多数の巧妙に調節された機能を 実行する。哺乳動物の体における種々の細胞の型のうちで、肝細胞のみは炭水化 物、脂質、アミノ酸、タンパク質、核酸および補酵素を同時に合成および破壊し て独特の生物学的仕事を達成する経路を兼備する。主要な「肝特異的」生物学的 機能は次のものを包含する：　（１）糖生成：　（２）グリコーゲンの合成、貯 蔵および破壊；　（３）アルブミン、ヘモベクシン、セルロブラスミン、血液凝 固因子（因子ＶＳＶＩＩ、Ｘ、プロトロンビンおよびフィブリノゲンを包含する ）、α１−抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、およびＡＦＰを包含する血清タ ンパク質の合成；　（４）胆汁酸類の接合；　（５）へムの胆汁顔料への転化； 　（６）リポタンパク質の合成；　（８）コレステロールの合成：　（９）尿素 の合成およびグルタミンの合成を包含する、アンモニアの代謝；　（１０）芳香 族アミノ酸の代謝的転化および再利用を包含する、アミノ酸の代謝：および（１ １）無毒化および薬物の代謝。

本発明の細胞は多分「肝特異的」生物学的機能のすべてのクラスを実行すること ができる。すべての機能はクラス４および５を除外して試験した。機能の例は、 アンモニアの代謝、アミノ酸の代謝、解毒、およびタンパク質、ことに凝固因子 、の産生を実施する能力を包含する。これらの機能は、細胞を肝臓補助装置にお いて使用すべきとき、とくに重要である。

比較的短い時間のＬＡＤの形態の被検体、例えば、肝移植を待つか、あるいは肝 拒絶反応後のかつ再移植を待つＦ　ＨＦ患者を支持するために、前述の肝特異的 機能の４つのグループはとくに重要である。他の機能不全は池の手段（例えば、 グルコースの供給およびグルコースレベルのモニター）により提供することがで きるか、あるいは特別な注目を必要としない（例えば、胆汁酸類の接合または胆 汁顔料の産生、または薬物代謝活性）。

肝欠損または不全に悩む被検体を「支持するために有効な」レベルは、正常なま たは正常に近いレベルの血清タンパク質、凝固因子、アミノ酸、および肝臓の中 で産生末端か、あるいは肝臓により代謝される他の代謝物を生ずるレベルである 。これらの種々の分子および代謝産生物およびそれらの濃度またはレベルの生理 学的ならびに病理学的範囲はこの分野においてよく知られており、そして次の文 献に記載されている：例えば、ブラウンワルド（Ｂｒａｕｎｗａ　Ｉｄ）　、Ｅ 、ら編、内部医学のハリンソンの原理（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’　ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉ ｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｔｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１１版、マクグロ ー・ヒル（ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉ　ｌ　Ｉ）発行社、ニューヨーク州ニューヨーク （１９８７）、これをここに引用によって加える。

いったん特定の細胞系が強い接触阻害、アルブミンの高い発現、および全面成長 における高いアルブミン／アルファフェトプロティンの比の初期の基準に基づい て選抜されると、細胞系は肝特異的生物学的機能の実行について試験することが できる。

こうして、実験を実施して、とくに細胞を肝臓補助装置として使用できる環境に おいて、細胞の代謝機能を検査することができる。試験した代謝機能は、酸素の 依存性、グルコースおよび尿素の合成、ビリルビンの吸収および接合、および凝 固因子の生合成を包含する。

肝臓は極端に好気的器官であり、そして体の酸素消費の２０％を占める。生体内 の肝臓に似て、本発明の培養物は高いレベルの肝特異的機能のために酸素を必要 とすることが認められる（参照、実験の節）。適切な酸素化の準備は、選抜した 細胞における成長および分化の両者を刺激することができる。選抜した細胞系へ の酸素の作用は、次のちを包含する、いくつかの方法で試験することができる： （１）連続的に潅流する細胞培養における細胞の成長速度を、溶解した酸素（４ 〜２０％）の増加する濃度で検査することができる。成長速度は、高い濃度のグ ルコースを含有する標準の培地の中で、そして乳酸塩およびアミノ酸を唯一の炭 素源として含有するグルコース不含培地の中で検査することができる。糖生成は 過度に酸素感受性であるので、細胞の成長は、グルコースの存在下の細胞に比較 して、グルコース不含培地において劇的に影響を受けることが期待されるであろ う。

（２）代謝活性のインジケーターは、また、細胞中で酸素の異なる濃度において 測定することができる。このような代謝活性は、合計の酸素消費、エネルギーの 供給、レドックス状態、およびグルコース消費／酸素消費の比を包含する。

グルコースおよび尿素の合成は、血液から過剰のアミノ酸およびアンモニアを除 去する主要な手段である。アミノ酸の異化は炭素の遊離を生じ、炭素はクエン酸 のサイクルおよびそこからグルコースに転換する。

このプロセスの間に解放された窒素は尿素の合成において使用される。

したがって、選抜された細胞系はグルコースおよび尿素の両者を合成しなくては ならない。グルコースおよび尿素を測定する方法はこの分野において知られてお り、例えば、参照、ケルシャー（Ｋｅｒｓｈｃｅｒ）ら、酵素的分析法（Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｈ，Ｕ、バーグマ イアー（Ｂｅ　ｒｇｍｙｅ　ｒ）編、第３版、Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ１ワ インハイム、Ｖｏｌ、ＶＩＩ。

ｐｐ、５９−６７　（１９８３）。

血清ビリルビンの増加は肝臓の病気の高度に可視のインジケーターである。高い 循環レベルの非接合ビリルビンは、大人において一般に毒性ではないが、脳の損 傷および新生児において死を生成ことかある。この状態は、死後の脳幹核の典型 的な黄色の外観のために、核黄痕として知られている。選抜された細胞系がビリ ルビンを代謝する能力は、例えば、酸素化した単一層の培養物を使用して検査す ることができる。この試験のために、血液ビリルビン過剰の患者からの血清を酸 素化した細胞とインキュベーションして、細胞がビリルビンを接合することがで きるかどうかを倍加時間する。直接の結合の研究は、標識しない競争相手の存在 および不存在下に、［３Ｈ］−ビリルビンを使用して実施して、Ｖｍａｚおよび に、を決定することができる。

細胞系は、また、凝固因子の生合成について試験する。凝固因子の多数は肝臓に より合成され、そしてひどい凝固障害の発生は部層のＦＨＦの全長の徴候である 。ビタミンに依存性グループのすべては影響を受けないが、抗トロンビンＩ［（ ＡＴ　ＩＮＮ）は最も有意な欠乏として同定された。細胞系をフィブリノゲン、 プロトロンビン、因子Ｖｌｌ。

およびＸ、およびＡＴＩＩＩを合成する能力について試験する。これらの因子の 産生レベルは、商業的に入手可能な抗体を使用して定量することができる。

細胞系の性質は肝臓補助装置（ＬＡＤ）において細胞系をと（に有用とする。大 部分について、細胞は細胞を循環する手段ならびにこの装置を通過する血液から 細胞を分離する手段を提供する任意の装置において使用することができる。膜ま たは毛管は文献において利用可能であり、これらは血液から細胞への毒性の溶質 のクロスオーバーならびに膜を横切って血液の中に入る細胞により提供される必 要かくべからざる代謝物の拡散を可能とする。透過選択膜および半透膜は、さら に、免疫系に対する機械的バリヤーを提供する。大部分について、約２０，００ ０ダルトンから約８０，０００ダルトンまで、一般に約３０．０００ダルトンか ら約５０，０００ダルトンまでの分子量のカットオフの特徴を有する、膜または 毛管を使用する。しかしながら、約０．１μ〜約０．　３μ、通常約０．２μの 孔大きさをもつ膜を使用することは好ましい。この範囲の孔大きさは細胞の要素 排除するが、なおタンパク質およびタンパク質複合体を通過させる。こうして、 ＦＨＦの血清タンパク質の欠乏を軽減することができる。

一般に、細胞は肝臓補助装置の中で成長する。細胞の成長後、被検体の血液をこ の装置に通過させ、そして溶解した分子種（例えば、ビリルビン）は膜を通して 拡散し、そして細胞により吸収および代謝される。

大部分について、装置は主として体外の血液の処理に基づく。一般に、装置は血 液の流れに取り付けられた血液潅流装置の中に細胞を収容するように設計されて いる。典型的には、装置は動脈と静脈との間の血流に取り付けられる。

肝臓補助装置のいくつかの設計は文献において既知である。例えば、装置は次の 文献に記載されている・バイルス（Ｖｊｌｅｓ）ら、米国特許第４．６７５，０ ０２号および米国特許第４，８５３．３２４号：ジャウレギン（Ｊａｕｒｇｉｎ ）、英国特許第２．２２１．８５７Ａ号；ウォルフ（Ｗｏｌｆ）ら、インターナ ショナル・ジャーナル・オブ・アーティフィシャル・オーガン（Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｊ、　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｒｇａｎｓ）、２＋９７ −１０３（１９７９）：ウォルフ（Ｗｏｌｆ）ら、インターナショナル・ジャー ナル・オブ・アーティフィシャル・オーガン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ 。

ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｒｇａｎｓ）、１：４５　５１（１９７８）： およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）ら、試験管内（ｉｎＶｉ　ｔ　ｒｏ）　 、１４　：　４４３−４５０　（１９７８）　、：：れラノ開示ヲコこに引用に よって加える。好ましい装置は、中空繊維のカートリッジおよび同様な潅流装置 を包含する。

バイオリアクター、例えば、中空繊維のバイオリアクターを肝臓補助装置として 利用することができる。このようなバイオリアクター、例えば、アンニーネット （Ａｎ、ｃｈｏｒｎｅｔ）系列は文献において知られており、そして商業的に入 手可能である。参照、例えば、ハイフエツツ（Ｈｅｉｆｅｔｚ）ら、バイオテク ニークス（ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ）　、７　：　１．９２−１９９　（１９ ８９）；およびドノフリオ（Ｄ　ｏ　ｎ　。

ｆ　ｒ　ｔｏ）　、Ｄ、　Ｍ、　Ａｍｅｒ、　Ｂｉｏｔｅｅｈ、　Ｌａｂ、　、 ５ｅｐｔ。

１９８９、発行＃９４０、これらの開示をここに引用によって加える。

本発明の細胞は、大きい数の細胞のための容量をもつ、中空繊維のカートリッジ または同様な潅流装置の中で成長させるとき、潅流した肝臓として機能すること ができ、ヒトの肝臓の代謝の補助および肝特異的生物学的活性の置換を可能とす る。したがって、開示した細胞の培養物を含有する潅流装置は肝臓補助装置とし て機能することができる。本発明び静脈の循環へのその接続を呼ぶ。体外のＬＡ Ｄ　（またはＥＬＡＤ）は、Ｆ　ＨＦに悩む被検体のための一時的肝臓の支持を 提供するためにとくに有用である。他の実施態様において、ＬＡ、Ｄは体の中に 移植する、すなわち、「体内」である。この実施態様は、長期間のＬＡＤとして 、有用であり、そして有利であることがある。

肝臓補助装置における使用するために、細胞は一般に膜または多孔質の支持体上 で成長させる。大部分について、細胞は成長のとき支持体に付着する。しかしな がら、結合材料を準備して細胞を支持体に取り付けることができる。適当な結合 材料はこの分野において知られている。参照、例えば、英国特許第２．２２１， ８５７Ａ号。

中空繊維のカートリッジは正常の器官の３次元の特性生成する２つのチャンバー のユニットであるしクナゼク（Ｋｎａｚｅｋ）Ｒ，Ｈ，、Ｆ５　（１９８３）］ 　、これらの開示をここに引用によって加える。培地または成長培地を毛管の空 間を通して循環させ、そして細胞を体外空間の中で成長させる［タラカニ／　（ Ｔｈａｒａｋａｎ）　、Ｊ、Ｐ、ら、Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、　、２旦：１６０５−１６１１　（１９８６） ］。このような中空繊維の培養系は、モノクローナル抗体の産生のためのハイブ リドーマ細胞系の培養のために有用であるとした開示されり［アルトシュルター （Ａｌｔｓｈｌｔｅｒ）Ｇ、Ｌ、ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、、 ２８：６４６−６５８　（１９８６）；／’イフェッッ（Ｈｅｉｆｅｔｚ）Ｈ， Ｈ，ら、バイオテクニークス（Ｂｉオ（Ｄｏｎｏｆ　ｒｉｏ）　Ｄ、　Ｍ、　Ａ ｍｅｒ、　Ｂｊｏｔｅｃｈ、　Ｌａｂ、、５ｅｐｔ、１９８９、発行＃９４０） ］、さらに、肝細胞系ＰＬＣ／ＰＲＦ５およびレウバー（Ｒｅｕｂｅｒ）肝腫瘍 ［マクアレニル（ＭｃＡｌｅｅｒ）Ｗ、Ｊ、ら、Ｊ、Ｖｆｒｌ、Ｍｅｔｈ、、７ ：２６３−２７１　（１９８３）；ウォルフ（Ｗｏ　Ｉ　ｆ）　Ｃ，Ｆ、　Ｗ、 （１９８２）　］および膵臓小島細胞［アラキ（Ａｒａｋｉ）Ｙ、　ら、糖尿病 （Ｄｔａｂｅｔｅｓ）　、３４　：　８５０−８５４　（１９８５）］を包含す る、ある数の他の細胞の型はこの方法において培養されてきている。

いったんある装置が肝臓補助装置としての使用のために選択されると、それに適 当な培地および細胞の接種が準備される。一般に、細胞を複合培地、例えば、ア ール（Ｅａｒｌｅ）塩類を含むイーグルＭＥＭ　（ＧｉｂＣａ）と１０％の規定 した／補充した子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するワイマウス（Ｗａｙｍ ｏｕｔｈ）ＭＡＢ８７／３　（ＧｔｂｃＯ）との３ｌ１混合物の中で成長させる 。次いで、装置を３７℃の室温において培地の一定した循環および新鮮な培地の 一定した流入に維持する。中空繊維のカートリッジとともに使用するために、カ ートリッジに１．５０ｍ１／分の再循環した培地を約０．５ｍｌ／分の一定の流 入で供給する。１４００ｃｍ２のカートリッジに一般に約ｌＸ１０９細胞を接種 する。

装置の中の細胞の機能をここで肝臓補助装置として機能する装置の能力について 試験することができる。これは、前述したように、必須の肝臓の生物学的機能の 測定を包含する。

大部分について、追加の酸素をこの系に添加することは必要がない。

しかしながら、培養物の中の酸素の張力を決定しそして必要に応じて、追加の酸 素を添加することができる。

選抜された細胞系の培養物の中の酸素の張力を変化させて最適な酸素のレベルを 決定するために、細胞を連続的潅流装置中で成長させることができる。この装置 は再循環ポンプ、培地びん、および標準の６ウエルの培養皿上に適合するふたか ら成るであろう。培地は細胞の表面の上に連続的に再循環させ、そして培地の容 器の中に戻し、ここで気体処置することができる。培地は４％〜２０％の酸素、 ５％のＣＯ２および残部の窒素を含有する調製物で気体処置する。このようにし て、細胞は適当な雰囲気の中で維持して、気体混合物の作用を決定することがで きるにする。成長速度は合計のタンパク質含量／ウェルをモニターすることによ って決定できる。

ＡＴＰＳＡＤＰおよびＡＭＰは、ホタルのルシフェラーゼを使用して、ルンジン （Ｌｕｎｄｉｎ）ら、メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ ｏ　１．）　、１３３　：　２７−４１　（１９８６）に記載されているように 測定する。ＮＡＤ／ＮＡＤＨの比は、乳酸デヒドロゲナーゼを横切る乳酸塩／ピ ルベートの比から、およびマレートデヒドロゲナーゼを横切るマレイン酸／オキ サロアセテートの比から計算することができる。これらの代謝物の濃度は、酵素 的分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ ）、Ｈ，Ｕ、バーグマイア−（Ｂｅｒｇｍｙｅｒ）編、第３版、Ｖｅｒｌａｇ　 Ｃｈｅｍｉｅ１ワインハイム、Ｖｏｌ、ＶＬ　ｐｐ、５７０−５８８に記載され ている方法により教示されるように決定することができる。ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰ Ｈの比は、イソクエン酸塩デヒドロゲナーゼを横切るイソクエン酸塩／アルファ ーケトグルタレートの比から、およびリンゴ酸酵素を横切るリンゴ酸塩／ピルベ ートの比から計算することができる。これらの代謝物の決定は、また、酵素的分 析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）に 記載されている。エネルギー変化は方程式（ＡＴＰ＋０．５ＡＤＰ）／　（ＡＴ Ｐ＋ＡＤＰ＋ＡＭＰ）から計算することができる。

肝臓補助装置の酸素依存性を見るほかに、装置は、また、分離した、潅流したヒ トの肝臓を刺激するそれらの能力に関して特性決定されるであろう。これは装置 を、前述したように、グルコースおよび尿素の合成、ビリルビンの吸収および接 合、および凝固因子の生合成について試験する。尿素はカップリングしたグルタ メートデヒドロゲナーゼ／ウレアーゼのアッセイを使用して定量することができ る。グルコースは色素がカップリングしたグルコースオキシダーゼアッセイを使 用して決定できる。

尿素およびグルコースの決定のためのアッセイは、酵素的分析の方法（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）に記載されている。

前に論じたように、種々のビタミンに依存性因子凝固因子、プロトロンビン、因 子Ｖｉｉ、ＩＸおよびＸｌならびに抗トロンビンＩＩＩは、ケリイ（Ｋｅｌｙ） ら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｅｖ、Ｂｊ。

１、．２５　：　２１７−２２２　（１９８７）に記載されているように、固相 ラジオイムノアッセイを使用して決定することができる。イムノアッセイのため の抗体はデイニー・インコポレーテッド（ＤＡＮＫＯ，ｉｎｃ、　）を得ること ができる。

好ましいＬＡＤの実施態様において、細胞系ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａを肝臓補助装置 として使用するための中空繊維のカートリッジの中に供給する。この装置は毛管 外の空間内に含有された中空繊維の毛管からなる。

培地を毛管の空間を通して循環させる、そして細胞を毛管外の空間の中で成長さ せる。

細胞の成長のために、細胞を毛管外の空間の中に接種し、そして新鮮な培地を一 定の流入で供給する。１４００ｃｍ２のカートリッジに有効数、通常的ｌＸｌ０ ”の細胞を接種し、そして全面成長に、通常約１４〜約２１日間成長させる。

供給した培地は一般に複合培地、通常イーグルＭＥＤと１０％の規定した／補充 した子ウシ血清を含有するアール塩類との３ｌ１混合物である。これは細胞の成 長のための栄養を提供する。こうして、細胞は毛管の外側表面上で成長する。全 面成長の細胞を含有する中空繊維のカートリッジは、肝欠損または不全に悩む被 検体を支持する肝臓補助装置として機能することができる。

細胞系は、また、生物人工的肝臓または肝臓支持体として使用することができる 。このようにして、細胞を生物人工的器官として使用するのための中空繊維の毛 管膜の中にエンカブスレージョンするか、あるいはその中で成長させる。細胞を 生物材料、例えば、アルギン酸塩−ポリリジン膜の中に、次の文献により教示さ れるように、エンカブスレージョンする：カイ（Ｃａｉ）ら、人工的器官（Ａｒ ｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｅｇａｎｓ）　、１２　＋　３８８−３９３　；サン（Ｓ 　ｕ　ｎ）ら、Ｔｒａｎｓ。

Ａｍ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎｓ）、ＸＸＸＩＩ　Ｉ　 ：　３９−４１　（１９８６）ニオ・シェア（０’　５ｈｅａ）ら、バイオヒミ カ・ニド・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ　 ｔａ）　、８０４　：１３３−１３６　（１９８４）；サン（Ｓｕｎ）ら、Ｊ、 Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ）、２：１３７−１４１　（１９８５） ：および米国特許第４，３９１，９０９号。次いで、エンカブスレージョンされ た細胞およびベヒクルのカプセルを被検体の腹腔内に注射する。

新規な細胞系はヒトの肝臓の代謝の研究ならびに肝特異的遺伝子の調節に有用で ある。細胞系は、ヒト肝細胞系を使用する通常の場合のように、本来ヒト胚芽細 胞腫から誘導され、ヒト肝腫瘍から誘導されない。

したがって、それらは、代謝機能および肝特異的遺伝子の発現を包含する、すべ ての肝機能の研究に有用である。それらは、また、有用な試験管内杆モデルを提 供する。細胞および細胞系は、また、薬物または他の製剤学的組成物の代謝およ び／または毒物学の研究に使用することができる。膜または肝臓補助装置上で成 長した細胞は、プロトタイプの人工肝臓として働く。こうして、種々の糖剤また は化合物の臨床的指示は試験管内モデルにおいて評価することができる。

肝臓補助装置の中で成長した細胞は、また、血清タンパク質の産生について有用 である。示すように、細胞は肝特異的生物学的活性を示し、そして血清タンパク 質、イソ酵素、凝固因子などを合成する。しまたがって、細胞はこれらのタンパ ク質のための試験管内の工場として利用することができる。この方法において、 上澄み液を細胞培養物から回収し、そして血漿タンパク質を分離し、そして精製 する。便宜上、細胞を半透膜上で成長させることができ、この半透膜は血清タン パク質が膜を横切って拡散するようにさせ、ここでそれらはそれ以上の使用のた めに分離および精製される。

細胞は肝臓のモデルとして機能することができるので、それらは、また、ウィル ス性肝炎の研究に有用である。これはとくに真実である。なぜなら、細胞系はＢ 型肝炎により形質転換されず、モしてＨＢＶ配列をもたないからである。

本発明において開示する肝細胞は、この分野において知られている他の系、例え ば、分離され潅流したラット細胞（ＩＰＲＬ）を越えた利点を有する。培養物は 永久的である。すなわち、それらは無限の寿命を有し、これにより実験的に厳格 な場合において長期間の暴露の作用の研究を可能とする。永久的細胞系の単一層 の培養物は典型的には数カ月間維持され、そして本発明の方法に従い調製された 肝臓補助装置は、通常、アルブミンの産生およびグルコースの利用により決定し て、無限の期間にわたって、一般に８週にわたりて機能する。本発明の培養法の 使用は、現在の米国政府の目標（認可および契約のためのＮＩＨガイド、５ｕｐ ｒａ）に適合する、肝の潅流のために要求される動物の規則的な犠牲の必要性を 減少する。最後に、本発明の培養した細胞を含有するカートリッジは他の種から 分離精製した肝臓よりいっそう密接にヒトの代謝を反映する。

本発明の方法、とくに中空繊維に基づく合成の使用は、肝臓補助装置としていく つかの利点を提供する。カートリッジは非常に高い密度の培養物を支持する。毛 管外の体積に基づいて、１５〜２０ｇの細胞を１４００ｃｍ２単位で成長させる ことができ、そして１００ｇの細胞を７０００ｃｍ”の単位で成長させることが できる。これは一部分１４００ｃｍ２の単位で１日当たりに産生された細胞の量 に基づく（参照、実施例ＩＩ、下）。この単位は肝不全に悩む被検体に肝臓の支 持を提供するするために十分な細胞塊を達成することができる。

カートリッジで成長した細胞は極性化し、そしてそれらの成長は正常の肝臓の構 造に近似する。細胞は毛管の空間から栄養を受け取り、そして廃棄産生物を毛管 外の空間（ＥＣ５）の中に分泌する。ＥＣ３を潅流して、還流産生物の蓄積を防 止することができる。

培地の連続的流れおよびインラインの酸素化装置は、より一定した酸素およびエ ネルギーの供給を提供する。肝臓の代謝の中の酸素の重要な役割は、１ＰＲＬの 文献によく記載されており、前のページで定義したが、細胞培養の文献において 大きく無視されてきている。例えば、Ｉ（ｅｐ　Ｇ　２／Ｃ３または３Ａの普通 の培養は酸素（したがって、エネルギー）が制限される。酸素化した培地の一定 の循環は、細胞の代謝の必要性を議定する［ウォルフ（Ｗｏ　Ｉ　ｆ　）　Ｄ、 ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｊ ｏｃｈｅｍ、）　、１５１　：２９９−３０３　（１９８５）］。追加の酸素を 運ぶ能力を必要とする場合、潅流された器官について記載されているように、赤 血球または溶解したヘモグロビンの使用が提供される［ゴアズ（Ｇｏｒｅｓ）Ｇ 、Ｊ。

ら、ヘパトロジー（ＨｅｐａｔｏｌｏｇＹ）、６：５１１−５１７　（１９８６ ）］。

ここで本発明を全体的に記載したが、例示のために提供された次の実施例を参照 すると、本発明はいっそう容易に理解されるであろう。これらの実施例は、特記 しない限り、本発明を限定しない。

実験 実施例Ｉ ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａについての選抜の概要ＨｅｐＧ２細胞を５つの１５０ｍｍの 組織培養皿の中で０．５細胞／ｃｒｎ２の密度でプレイティングした。１００の 個々のコロニーをこれらのプレートからクローニングリングで取り出した。コロ ニーを最初に平坦の上皮様細胞から丸いゆるく接続する細胞までの範囲の、広い 範囲の形態について選抜した。これらを２４ウエルの皿の中で全面成長に成長さ せ、そして上澄み液を固相ラジオイムノアッセイを使用してアルブミンの産生に ついて試験した。１１００ｎ／ｍｇの合計の細胞のタンパク質／２４時間から２ ５μｇ／ｍｇ／２４時間の範囲の非常に広い範囲の産生レベルが見いだされた。

１０クローン（Ｃ−Ｌ）を１μｇ／ｍｇ／２４時間以上のアルブミンの産生で選 択し、そして再び制限希釈のクローニングにかけてクローン性を保証した。次い で、これらの１０クローンをアルブミンの産生、全面成長におけるアルブミン／ ＡＦＰ比および接触阻害について分析した。これらのパラメーターについての値 を表１に示す。クローンＣ３をそれ以上の分析のために選択する。Ｇ２／Ｃ３細 胞を、エネルギー源として、ピルベートおよびアミノ酸を含有するが、グルコー スを含有しない培地の中でプレイティングした。この培地の完全な処方を下に示 す。血清を透析してグルコースを除去し、そして他の複合炭水化物を添加した。

細胞は新しいヌクレオチドなどの産生のためにグルコースを必要とするので、ピ ルベートおよびアミノ酸からグルコースを合成することができる細胞のみはこの 培地の中で増殖することが期待されるであろう。３０Ｘ１０’の初期のプレイテ ィングから、２つのコロニー３Ａおよび３Ｂをこの培地の中で６週後に分離した 。これらの細胞は平坦化し、小さい核および隆起した核小体をもつ上皮である。

細胞のほぼ１０％は２核である。

塩化カルシウム　０．　１２ｇ 塩化コバルト　２μｇ 硫酸銅　０．　６ｍｇ 硝酸第１鉄　０．　５ｍｇ 塩化カリウム　０．　２５ｇ 硫酸マグネシウム　０．　３５ｇ 塩化ナトリウム　６．８ｇ 重炭酸ナトリウム　２．２ｇ リン酸ナトリウム、２塩基性　０．３ｇ硫酸亜鉛　１ｍｇ モリブデン酸　１５μｇ 塩化マグネシウム　１５μｇ アルギニン　１２６ｍｇ システィン　２４ｍｇ グルタミン　２９２ｍｇ ヒスチジン　４２ｍｇ イソロイシン　５２．５ｍｇ ロイシン　５２．４ｍｇ リジン　７２．５ｍｇ メチオニン　１５．１ｍｇ フェニルアラニン　３３ｍｇ スレオニン　１０．２ｍｇ トリプトファン　１０．２ｍｇ チロシン　４６．８ｍｇ バリン　４６．８ｍｇ アラニン　８．　９ｍｇ アスパラギン　１５ｍｇ アスパルテート　ｆ３．３ｍｇ グルタメート　１４．７ｍｇ グリシン　７．　５ｍｇ プロリン　１１．５ｍｇ セリン　Ｌｏ、５ｍｇ すべてのアミノ酸はＬ対掌体である。

ビオチン　１ｍｇ Ｄ−Ｃａパントテン酸塩　１ｍｇ 塩化コリン　１ｍｇ 葉酸　１ｍｇ イノシトール　２ｍｇ ニコチンアミド　Ｉｍｇ ビリドキサルＨＣＩ　１ｍｇ リボフラビン　０．　１ｍｇ チアミＩＣＩ　１ｍｇ アスコルビン酸　１２５μｇ エルゴカルシフェロール　１０μｇ メナジオン　１１００ｎ トコフエロール　２０μｍ レチン酸　１０μｇ グルタチオン　５０μｇ ハイポキサンチン　２００μｇ リルイン酸　５μｇ リポ酸　ｌＯμｇ チミジン　２５μｇ ビリビン酸ナトリウム　１．１ｇ 表１ ＨｅｐＧ２の種々のクローンの特性 クローン　最終密度　アルブミン　ＡＦＰ　比Ｃ３０，３０２９，５１，１２５ ，７ Ｄ５　０．６２　２０．５　３．９　５．３Ｅ２　０．８１　３．１　４．１　 ０．８Ｆｌ　Ｏ，４４９，３６，５１，４ Ｇ６　０．７８　３．５　４．６　０．８Ｈ１Ｏ，４７９，７５，７１，７ Ｉｆ　Ｏ，３８２２，５６，１３，７ Ｊ５　０．３５　３２．７　３．１　１０．５Ｋｌ　Ｏ，３１２３，７０，８２ ９，６Ｌ３　０．３４　１２．８　０．９　１４．２密度はｍｇの合計の細胞の タンパク質／　ｃ　ｍ　”として報告する。アルブミンおよびＡＦＰはμｇのタ ンパク質／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時間として報告する。

表２ ＨｅｐＧ２およびＧ　２／Ｃ３およびＧ２／Ｃ５ＡＨｅｐＧ２　Ｇ２／Ｃ３Ｇ２ ／Ｃ３Ａ 最終密度　０．７　０．３　０．３ アルブミン　１６．８　２９，５　４１．２ＡＦＰ　３．０　１．１　０．８ アルブミン／ＡＦＰ　５．６　２５．７　５１．５したがって、示すように、ク ローン的に誘導された細胞系、とくにＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａは、高いアルブミンの 産生および全面成長における高いアルブミン／アルファフェトプロティンの比を 実証する。細胞系は正常の肝細胞の多数の追加の特徴を表す。細胞により産生さ れたヒトアルブミンおよび他の血清タンパク質のほぼ正常のレベルは、肝機能を まねるそれらの可能性を強調する。さらに実証するように、Ｇ２／Ｃ３Ａ細胞は 、糖生成および尿素合成を包含する、正常のレベルの中枢の代謝プロセスを実行 する。これらの理由のために、本発明の細胞系、とくにＧ２／Ｃ３Ａは、ヒト肝 臓のシミュレーションのための、実験の肝臓学における使用のための、およびわ れわれの体外肝臓補助装置として、ＨｅｐＧ２を包含する、この分野において知 られている他の細胞を越えた明確な利点を提供する。

ＨｅｐＧ２／Ｃの培養物を低い密度でプレイティングするとき、それらは２４時 間の倍加時間により、およびアルファフェトプロティン、アルドラーゼＡおよび ＣおよびピルベートキナーゼＫを包含する胎児肝細胞のい（つかのマーカーの発 現により、特性決定される急速な分割の期間に入る。培養物が全面成長となると き、成長は遅くなり、そして新しい定常状態が２００時間を越えた倍加時間で確 立される。同時に、遺伝子の調節の同調スイッチが起こり、胎児タンパク質の急 な減少およびそれらの大人の相手の増加を生ずる。例として、培養物が成熟する ときのアルブミン合成の増加は第１図に示されている。

肝臓補助装置において使用するためのＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の可能性を検査す る努力において、培養における正常のヒト肝細胞のモデルとしてこれらの細胞の 活性を、とくにいくつかの肝特異的構造および輸送現象に注意して、研究した。

Ａ１材料および方法 ミリセル−ＣＭ（Ｍｉｌｌｃｅｌｌ−ＣＭ”）およびミリセル−ＨＡ（Ｍｉ　ｌ 　Ｉｃｅ　１　］−ＨＡ”）培養プレートインサート（１２ｍｍの直径）を、ミ リボア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ。

、マサチュセッツ州ベッドフォード）から入手した。この−ＣＭインサートはナ イロン膜を含有し、そしてこの膜は湿潤したとき透明となるが、それが細胞の付 着を支持する前に、生物学的材料（例えば、コラーゲンまたは細胞外マトリック ス）でコーティングしな（ではならない。−ＨＡ膜はニトロセルロースを含有し 、これは不透明に止まるが、コーティングの不存在下に細胞の付着を支持する（ 第２図）。各チャンバーにおける培地の体積は０．５ｍｌであった。

トラン５ｉ３−ラベル（Ｔｒａｎ”Ｓ−１ａｂｅｌ”）（＞ｌ、ＱＱＱＣｉ　／ 　ミリモルのメチオニンを含有する）はＩＣＮ　（Ｉ　ｒｖｉｎｅ、カリフォル ニア州）から入手した。［２，４，３Ｈ］−コール酸（１０〜２５Ｃｔ／ミリモ ル）はニュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ）（７サチユセツツ州ボストン）から入手した。組織培地はギブコ（ ＧｉＢＣＯ）にューヨーク州グランドアイランド）から入手し、そして補充物質 は１１イクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）（ユタ州ローガン）から入手した。マトリゲ ル（Ｍａｔｒｉｇｅ！”）、すなわち、エンゲルベスーホルムースワーム（Ｅｎ ｇｅｌｂｅ　ｔｈ−Ｈｏ　１ｍ−８ｗａｒｍ）（ＥＨ３）腫瘍により産生した細 胞外マトリックスの抽出物は、コラボレイティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒ ａｔ　ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（マサチュセツツ州ベッドフォード）から入 手した。抗ヒトアルブミン抗体はアトランチツク・アンチボディイス（Ａｔｌａ ｎｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（メイン州スカーボロー）から入手した。す べての他の化学物質は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、）（ミゾリー州セントルイス）から入手した。

１、組織培養 ＨｅｐＧ２／Ｃ３サブクローンは、その肝特異的遺伝子のよく調節された発現の ために、研究のために選択した。細胞は１０％の補充した子ウシ血清（Ｈｙｃｌ ｏｎｅ）を補充したＭＥＭ／ＭＡＲの中の１２ｍｍの培養プレートのインサート の中で成長させた。−ＣＭインサートをマトリゲルでコーティングして細胞の付 着を可能とした。

２、細胞の極性の基準 細胞をを横切るｐＨの勾配を、上皮層を横切るイオン勾配を維持する細胞の測度 として使用した。上部および下部のチャンバーからの培地を独立に集めた。各チ ャンバーの中の体積はわずかに０．５ｍｌであったので、３つのウェルからの試 料をｐＨの測定のためにプールした。全面成長以下の単一層をもつか、あるいは 細胞が付着していない膜を横切るｐＨの勾配を対照として測定した。

３、アルブミンの分泌 全面成長の培養は、細胞分割およびアルファフェトプロティン（ＡＦＰ）合成の 劇的な減少、およびアルブミン合成の鋭い増加により特徴づけられる。循環する タンパク質は細胞の洞様の面から分泌されると仮定されるので、ベクターのアル ブミンの分泌を基底外側の機能のマーカーとして使用した。タンパク質は、ウシ 血清アルブミンと交差反応しない、固相ラジオイムノアッセイにより測定した。

４、メチオニンの吸収 メチオニンの吸収を、また、基底外側の膜の活性のインジケーターとして使用し た［バルカロバースタンダ−（Ｂａｌｃａｒｏｖａ−３ｔａｎｄｅｒ）、Ｊ、ら 、ＥＭＢＯＪ、　、３　：　２６８７−２６９４　（１９８４）］。細胞をメチ オニン不含培地の中で１時間インキュベーションした。この期間の終わりにおい て、１００μＣｉ／ｍｌのトランＵＳ−ラベル（Ｔｒａｎ”Ｓ−１ａｂｅｌ”） を含有する培地をチャンバーノ１つに添加し、そして培養物を３７℃においてイ ンキュベーションした。

インサートを３．５および１０分に除去し、冷ＰＢＳ中で２回すすぎ、１０ｍ１ のユニバーゾル（Ｕｎｉｖｅｒｓｏｌ”）（Ｓｃｈｗａｒｔｚ／Ｍａｎｎ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈ、オハイオ州りレブランド）の中に入れ、そしてカウントした。

５、コール酸の吸収および分泌 これらの測定は懸濁培養について記載されているように実施した［タラオ（Ｔａ ｒａｏ）Ｋ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、２４３：２５３−２５８　（ １９８２）］。２５３−２５８　（１９８２）］。２μＣｉ／ｍｌの［２，４， ３Ｈ］−コール酸を含有する培地を上部または下部のチャンバーに添加し、そし て３７℃において３０分間インキュベーションしまた。この負荷期間後、インサ ートを水冷生理食塩水の中で２回洗浄し、そしてアッセイが準備されるまで氷上 に保持した。分泌は加温培地を両者のチャンバーに添加し、３７℃において５分 間インキュベーションし、そして各チャンバーの中の培地をカウントすることに よって測定した。パイロット実験は、標識の５％より小が５分の終わりにおいて 細胞に関連したままであることを示した。

６、電子顕微鏡検査をＪＥＯＬ　ＪＥＭｌｏｏＣＸを使用して実施した。インサ ートの全体を２％のグルタルアルデヒドの中に１０分間入れて固定した。次いで 、膜をインサートから除去し、そしてアラルダイトの中に埋め込んだ。−ＣＭイ ンサートのプラスチック膜は滴定すべき区画化することができないので、これら の膜上で成長した細胞は埋め込みの前に下に横たわるマトリゲル層とともに剥離 された。−ＨＡインサートの中で成長した細胞はそれらのニトロセルロース膜と ともに埋め込まれた。

Ｂ、結果 −ＣＭ膜は湿潤しているとき透明であるので、細胞を倒立顕微鏡下に見ることが できた。すべての場合において、全面成長はアルファフェトプロティン（ＡＦＰ ）分泌の減少およびアルブミン分泌の増加［ケリイ（Ｋｅ　１１　ｙ）　Ｊ、　 Ｈ，ら、１９８９．５ｕｐｒａ］およびｐＨ勾配の発生が伴った。それゆえ、こ れらの基準を使用して、−ＨＡ　にトロセルロース）膜上で成長した細胞の全面 成長を評価した。細胞を１０５／ｍｌの密度でプレイティングし、通常３日以内 に全面成長に到達した。

細胞の極性の基準は、細胞がマトリゲルまたはニトロセルロース上で成長したか どうかにかかわらず同様であった。したがって、特記しない限り、データをプー ルする。

２、ｐ）（勾配の細胞を横切るｐＨ ｐＨの測定のための十分な培地を得るために、３つのインサートのグループをプ ールした。ｐＨの勾配は細胞をもたないインサートにおいで、あるいは細胞が全 面成長に到達する前に発生しなかった。いったん全面成長に達成すると、上部の チャンバーの中のｐＨは持続的により高かった。表３は９つの観察の結果を示す （３つのウェルは各測定のためにプールした）。上部のチャンバーは０．０３８ 単位の層の平均であり、下部のチャンバーより約１７％高い水素イオン濃度を表 した。

全面成長の細胞はアルブミンを上および下の両者のチャンバーの中に分泌した。

しかしながら、上部のチャンバーは下部のチャンバーより約３０％高いヒトアル ブミンを絶えず含有した（表１、）。

４、メチオニンの吸収 放射線標識したメチオニンの吸収、すなわち、基底外側の因子の指示を第３図に 示す。上部のチャンバーからの吸収はすべての時点においてより高く、５分にお いて２９％より高くそして１０分において２６％より高かった。標識はマトリゲ ルまたは膜単独により取り上げられなかった。

５、コール酸の吸収および分泌 ３０分の負荷期間後、標識したコール酸の分泌を上部および下部のチャンバーに おいて測定した。予備的研究において、標識期間の間に取り上げられた標識の９ ５％以上は５分以内に分泌されたことが示された。したがって、細胞により取り 上げられた合計のカウントは上部および下部のチャンバーの中の合計により推定 された（表４）。コール酸の最高の吸収は下部チャンバーからであった（はぼ７ ２００ｃｐｍ対３２００ｃｐｍ）。しかしながら、標識の８８％は下部のチャン バーの中に分泌して戻り、最小の上皮を横切る輸送が起こっていることを示唆し た。これは上部に負荷した細胞と鋭い対照であり、ここで標識の６２％を細胞の 層を横切って輸送され、そして下部のチャンバーの中に分泌される。コール酸は マトリゲルまたはニトロセルロース膜単独により取り上げられなかった。分泌さ れた層は、薄層クロマトグラフィーにより評価して、変更しなかったコール酸で あった。

表３ 上および下のチャンバーの中のｐＨおよびアルブミン濃度上部のチャンバー　下 部のチヤトへ二　旦　且障ｐＨ７，６５０±０．００４　７．５８２±０．００ ７　９　０．００６本アルブミン　２４６３±０．０５　２．００±０．０３　 ９　０．００１本数は平均±ＳＥＭａｐ値は対となったスチューデント式テスト を使用して計算した。細胞を全面成長まで１２ｍｍのミリセル（Ｍｉｌｌｃｅｌ ｌ）インサートの中に成長させ、そして培地を上部および下部のチャンバーから 独立に集めた。ｐＨの測定は３ウエルからプールした試料について実施し、そし てアルブミン濃度は固相ＲＩＡにより測定した。

表４ ［２，４，’Ｈ］−コール酸の吸収および分泌分泌されたカウント 上部の負荷　３．２５１　１２３６±２３３　２０１５±１４６　６２零　７下 部の負荷　７．２４７　８６６±５７　６３８１±６８１　１２本　７２μＣｔ ／ｍｌの［２，４，５ＨＩ−コール酸を含有する培地を上部または下部のチャン バーに添加し、そして細胞を３７℃において３０分間インキュベーションした。

この負荷期間後、インサートを水冷生理的塩類溶液中で２回洗浄し、そしてアッ セイを実施するまで氷上に保持した。

分泌は加温培地を両者のチャンバーに添加し、３７℃で５分間インキュベーショ ンし、そして各チャンバーにおいて培地の放射能を評価することによって測定し た。カウントの５％より小が５分の終わりにおいて細胞の中に残留した。

６、超構造の研究 接合部複合体により取り囲まれそして正常の微小絨毛を示す毛細胆管が細胞の間 で明らかであった。微小絨毛の境界により特徴づけられる、不完全な小管がまた 見られ、そしてこれらの多数は下のチャンバーに向かって開いているように見え た。微小絨毛膜は、また、多数のコーティングされた小高および小嚢をもつ最も 活性なエンドサイト−シスの膜であった。細胞の間の胆管の発生は、細胞がマト リゲルまたはニトロセルロース上のいずれで成長したかにかかられらず同様であ った。しかしながら、不完全な毛細胆管の開口はニトロセルロース上で成長した 細胞において、細胞が膜の中に成長する傾向があったので、容易には見られなか った。

論考 ＨｅｐＧ２／Ｃ３細胞系を主要な肝細胞のための基質として検査した。

なぜなら、これらの細胞は、胎児タンパク質から大人表現型への発現の切り替え を伴う、強い接触阻害を実証からである。さらに、細胞は正常に近いレベルの肝 タンパク質を発現する。

細胞極性の非特異的マーカーは、上部および下部のチャンバーの間のｐＨの差、 およびメチオニンの吸収を包含した。下部のチャンバーにおけるＨ′″濃度は上 部のチャンバーにおけるより約１７％高かった（表３）。

メチオニンの吸収は上部のチャンバーから２５〜２９％高く（第３図）、基底外 側膜が上方に向いていることを示した［バルカロバースタングー（Ｂａｌｃａｒ ｏｖａ−３ｔａｎｄｅｒ）、Ｊ、ら、ＥＭＢＯＪ、、びコール酸輸送の特異的マ ーカーは、また、この向きを示した（アルブミン濃度は上のチャンバーにおいて ３０％高く、そしてコール酸輸送は上部→下部の方向に５倍高いかった；参照、 表３および４）。

最も極性化した細胞はそれらの基底膜を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に付着し て成長したが、ＨｅｐＧ２／Ｃ３細胞が反対の向きに成長する傾向はまりたく驚 （べきことではない。肝細胞は管状器官において見いだされるような通常帯な基 部膜上に位置せず、そしてそれらの基本的面は半接着班の存在により特徴づけら れられない。ある時期、肝ＥＣＭは他のマトリックスと定性的に異なると考えら れた［ロジキンド（Ｒｏｊｋｉｎｄ）、Ｍ、ら、ジャーナル・オブ・セル・バク テリオロジ−（Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｔｏｌ、）、８ユニ　２５５−２６３）］、　しかしながら、最近 の報告が示唆するように、差は定量的であり、そして肝ＥＣＭは他の組織におい て見いだされる同一構成成分のゆるい配置である［メイハ−（Ｍａｈｅｒ）　、 Ｊ、Ｊ、ら、ガストロエンテロジー（Ｇａｓｔｒ。

ｅｎｔｅｒｏｌｇｙ）　、９４　：１０５３−１０６２　（ｆ９８８）；ピッセ ル（Ｂｉｓｓｅｌｌ）、Ｄ、Ｍ、ら、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ拳ガ ストロエンテロジー（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．）、２３ 　（Ｓｕｐｐｌ、１５１）：１−７　（１９８８）］。

肝の表現型の維持はちょうどマトリックスの相互作用より多くを必要とする；細 胞−細胞の接触は主要な役割を演する。ＨｅｐＧ２／Ｃ３細胞はこれに関して興 味あるものである。それらは成長または機能について肝ＥＣＭに依存しないが、 それらは細胞−細胞の接触に高度に依存する。低い密度で接種した細胞は、プレ ートの上を広がらない、小さいコロニーを形成する。さらに、細胞を濃縮したマ トリゲル上で成長させたとき、コードの形成が観察された。こうして、ＥＣＭの 単一層はこれらの細胞の固有の極性を変更するために十分ではなく、そして基底 外側の面は上の緩衝液チャンバーの支持されない環境において優先的に形成した 。

下のチャンバーからのコール酸の高い吸収（先端の膜を横切る）は予期せざるこ とであった。３つの可能な説明は次の通りである：　（ａ）肝細胞は毛細胆管か ら胆汁酸を吸収する能力を有する；　（ｂ）これらの培養した細胞における先端 の膜は有意なレベルの基底膜タンパク質を含有する（不完全な極性）：または（ Ｃ）下の膜の微小絨毛は表面積を、コール酸の輸送が受動拡散単独でにより増加 する点まで、増加することがありうる。

要約すると、培養において極性化した細胞に日常的に適用された極性の基準の多 くはＨｅｐＧ２／Ｃ３細胞に等しい適用可能であると思われる。

代理肝細胞としてＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａを使用する可能性を評価するために、この ような細胞が実施することを必要とする、いくつかの代謝プロセスを測定した。

第４図は重要な実験の結果を示し、この結果が示すように、標準の培養の条件下 に、細胞は主要な嫌気的代謝を実行する。

この驚（べき発見は、まず、簡単な単一層におけるグルコースの利用の初期の測 定により示唆された。培地の中のグルコース濃度は２４時間以内に非常に低いレ ベルに低下し、これが示唆するように、グルコースの利用は非効率的であり、そ して糖生成は実行されなかった。論理的説明は、細胞は低酸素であり、したがっ て、クエン酸サイクルを利用することができなかったことであった。この仮説を ２つの方法で試験した。

第１に、グルコースの利用は標準の条件下にかつインキュベージコン前に酸素化 した培地の両者において検査した。第４図に示すように、酸素化した培地の中の 細胞は有意により少ないグルコースを使用した。

過剰のグルコースの利用は細胞がクエン酸サイクルを通してピルベートを転換で きないためであること決定するために、同様な実験をニトロプロピオン酸（ＮＯ Ｐ）の存在下に実施した。ＮＯＰはスクシネートのトランジション状態の類似体 であり、スクシネートデヒドロゲナーゼを不可逆的に不活性化し、クエン酸サイ クルの利用を防止する［アルストン（Ａｌ　ｓ　ｔｏｎ）　、Ｔ、　Ａ、ら、プ ロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａの阻害因子の添加は低酸素条件下に作用をもたず、ク エン酸サイクルは活性とならないであろう。他方において、ＮＯＰは酸素化され た培養物におけるグルコース利用曲線をシフトするので、それは低酸素曲線に似 る。この曲線は第４図に示されている。

これらの細胞における代謝活性を評価するとき重要な変数は、経路が酸素制限的 （したがって、エネルギー）制限的でないことを保証することである。培養して いる細胞が酸素制限的であることができる程度は広く理解されていない。乳酸塩 からのグルコースおよび尿素の合成は、添加した酸素の不存在下のＴ−フラスコ において無視できた。下に示す実験の残部は、気密容器の中で９５％の０２＋５ ％のＣｏ２中で、同−混合物で気体処理した培地を使用して実施した。

実施例Ｖ ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａの糖生成活性 乳酸塩およびアミノ酸からのグルコースの合成は主要な肝特異的代謝機能である 。第５図は、補助エネルギー源としてオレイン酸存在または不存在における乳酸 塩からのグルコースの合成速度を示す。期待するように、オレイン酸はグルコー スの産生を刺激する。なぜなら、この脂肪酸を使用してこのプロセスにおけるエ ネルギーを供給することができるが、乳酸塩は炭素を供給するからである。これ らの実験において測定したグルコースの合成速度（乳酸塩から１．１３モル／分 ／ｇ、乳酸塩十オレイン酸塩から２．４４モル／分／ｇ）は、潅流したラットの 肝臓または分離したラットの肝細胞を使用して見いだされた速度とよ（一致する ［クレブス（Ｋｒｅｂｓ）、Ｈ，Ａ、ら、ｐｐ、２６９−２９１　（１９７６） Ｌこれは全体の肝特異的経路を通る束の測定であり、単に単一の酵素のレベルで ないことを指摘すべきである。これがが示すように、重要な糖生成酵素、ビルベ ートカルボギシラーゼ、ホスフェノールピルベートカルボキシラーゼおよびフル クト−スジホスファターゼのすべては、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞において適当に 発現および調節される。

グルコースを断食したラットに投与するとき、それは期待されるように直接グリ コーゲンに再合成されず、まずビルベー　トに分解され、次いでグリコーゲンに 再合成されることが実証された［ニ二一ガード（Ｎｅｗｇａｒｄ）　、Ｃ，Ｂ、 ら、バイオロジカル・ケミストリー（Ｂ　ｉ　ｏ　Ｉ。

Ｃｈｅｍ、）　、２５旦：　８０４６−８０５２　（１９８３）］、これらの実 験は、まずグルコース分解経路通過した後、グリコーゲンとして堆積される、投 与したグルコースの百分率を定量する、二重標識技術を使用した。これらの実験 は全ラットにおいて実施したので、グルコース代謝の最初の部位に関して、連続 する問題が残った。グルコースはまず末梢組織、例えば、筋肉により利用され、 次いで乳酸塩として肝臓に送り戻されて、グルコース−６−ホスフェートおよび グリコーゲンに合成されることができるか、あるいはグルコースは肝臓内の異な る代謝ゾーンにより異なるように利用されることができるであろう。

ＨｅＤＧ２／Ｃ３Ａを使用して、同様な二重標識っけの研究を実施した（参照、 第６図）。これらの研究が実証するように、肝臓はこれらの代謝の相互転化のす べてを実施することができる。Ｉ４０−グルコースおよび３Ｈ−水を大量の非標 識糖と同時に投与したとき、グルコースの大部分はまずグルコース分解を通して 分解され、次いでグリコーゲンに再系された。これはグリコーゲンの中に見いだ される３Ｈの量により示される。グルコース分解通過し、次いで再合成されるグ ルコースは、直接使用するグルコースより非常に多くの組み込まれた３Ｈを有す るであろう。標識されたグルコースおよび３Ｈ−水を投与し、グルコースの初期 のポーラス後の時間を変化させたとき、減少する量の炭水化物はグルコース分解 を通過した後、グリコーゲンを堆積し、これは１４Ｃに関する！Ｈの量の減少に より示され、第６図に対するインセットに示されている。これらの結果が示すよ うに、グルコース分解および糖生成は同時に活性であることができるが、グルコ ースを添加すると、直接のグリコーゲン合成に徐々にスイッチされる。

実施例Ｖｌｌ ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａにおける窒素の代謝肝臓はアンモニアおよび他の窒素含有化 合物のクリアランスのための主要な器官であり、そして窒素の不釣合いは部層の ＦＨＦの患者が直面する、より重大な代謝の問題の１つである。したがって、Ｈ ｅｐＧ２／Ｃ３Ａがいくつかの影響の窒素に代謝する能力を測定した。第７図は 乳酸塩および塩化アンモニウムからの尿素の合成を示す。この実験から計算した 速度、２０ｇモル／分／ｇの細胞、は、ラットの潅流した肝臓および分離した肝 細胞において測定された速度（２〜８μモル／分／ｇの肝臓［クレブス（Ｋｒｅ ｂｓ）　、Ｈ，Ａ、ら、ｐｐ、２６９−２９１　（Ｉ９７６）］）によく匹敵す る。

Ｈｅ　ｐ　Ｇ　２　／　Ｃ３Ａ細胞が窒素を代謝する能力の他の試験において、 細胞をＦＨＦの患者からの血清の試料とインキュベーションした。予備処理した 血清はアンモニアおよびいくつかのアミノ酸、顕著にはフェニルアラニンおよび オルニチンの増加を示した。この血清を０．５ｇのＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞で３ 時間処理した後、尿素は増加し、そしてアミノ酸は減少した。フェニルアラニン は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの作用下にチロシンの分解の１つのみの ルートを有し、劇的に減少することに注意すべきである。フェニルアラニンヒド ロキシラーゼは、テトラヒドロビオプテリンリダクターゼに依存して、この反応 のための補酵素を供給する。再び、これは肝特異的経路を通る束の測度であり、 そしてこれらの細胞が正常の肝細胞の代謝を達成することを示す。このＦＨＦ血 清を同一質量のＨｅＬａ細胞またはＨｅｐａＳＫ細胞（肝臓の内皮細胞系）とイ ンキュベーションすると、測定したパラメーターのいずれの有意の変化も示され なかった。

害施例Ｖｌｌ！− 中空繊維のカートリッジの中で成長したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞培養のための中 空繊維の装置は、主としてモノクローナル抗体の産生においてハイブリドーマの 成長のために使用されてきている［ハイフェッツ（Ｈｅｉｆｅｔｚ）、Ａ、Ｈ， ら、バイオロジカル・テクニークス（Ｂｔｏ、Ｔｅｃｈｎ　１ｑｕｅｓ）　、７ ：１９２−１９９　（１９８９）］。これらの装置はインラインの酸素化系を装 備するので、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａは、静止培養におけるより中空繊維の装置で成 長させたとき、よりよく実行することが予測された。これらの装置は、また、正 常の肝臓の３次元の構築のあるものを提供するという利点を有する。第８図は、 アミコン・フロバス（Ａｍｉｃｏｎ　ＦｆｏＰａｔｈ）１４００カートリツジの 中で成長したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａによるアルブミンの産生速度を示す。このカー トリッジをほぼｌＸｌ０’細胞とインキュベーションした。グルコースの利用お よびアルブミンの産生をその後毎日モニターした。培養物を破壊せずに５週後、 アルブミンの産生が安定するとき、どれだけ多くの細胞がカートリッジの中に存 在するかを正確に評価する方法はない。しかしながら、細胞が成長した毛管外の 空間は、この装置において２０ｍ１である。この全体の空間が細胞で充填されて いると仮定すると、最大数は約２０Ｘ１０’または２０ｇの細胞である。

Ｔ−フラスコまたはマルチウェルの皿における通常の培養条件（これは前述した ように酸素制限的であることができる）下に、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａは全面成長の 培養において約６μｇのアルブミン／ｍｇの湿潤重量／２４時間を産生ずる。中 空繊維のカートリッジの中で成長したＨｅｐＧ　２／Ｃ３Ａ細胞は、この量を２ フアクターだけ越えた。アルブミン／細胞の収量のこの増加は、多分、中空繊維 の装置により提供された、より生理学的培養条件のためである。

実施例ＩＸ ＬＡＤにおいてＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を使用する肝疾患の動物の処置ＨｅｐＧ ２／Ｃ３Ａ細胞を、実施例ＶＩＥに記載するように、中空繊維のカートリッジの 中で高い密度に成長させた。この立体配置は、細胞を、体外肝臓補助装置（ＥＬ ＡＤ）として、潅流したヒトの肝臓と同様に機能させることができる。

前述の方法を使用して、このようにして調製したＥＬＡＤは、肝不全の動物を救 う。致死以下の投与量のアセトアミノフェンを注射したイヌを使用するモデルを 後述するように利用し、そして肝臓の壊死および機能のパラメーターを処置を通 してモニターする。

Ａ、外科的手順： 無菌の条件および全体的麻酔下に、イヌにおいて頚動脈と内部の頚静脈との間に シャントとつくる。胸鎖乳突の前の境界に沿って切開をつくり、そして頚動脈お よび内部の頚静脈を露出させる。両者の血管を下顎の角度のレベルで結合し、そ してシャントを２つの血管の間で仕上げる。

シラスチック透析カテーテルを所定位置に縫合し、切開を通して外に出し、そし て創傷を４１０のシルクで閉じた。動物が麻酔から回復するまで動物を観察し、 そして再び６時間に検査する。窮迫をモニターし、そしてアセトアミノフェン（ １００ｍｇ／ｋｇ）をｑ６時間ｐｒｎで投与する。縫合糸を１週に除去し、そし てシャントが成熟してしまうまで透析を開始しない。ＥＬＡＤの取り付けは、シ ャントの球心性および遠心性の四肢に透析カテーテルを経てカートリッジを取り 付けることによって実施する。創傷は外科用テープで常時カバーして、シャント 部位への損傷を回避する。

Ｂ１アセトアミノフェンの中毒 アセトアミノフェンの注射（第１投与について７５０ｍｇ／に、第２の２回の投 与について２００ｍｇ／ｋ）と同時に、１％のキシロカイを皮下注射して痛みの ある局所的反応を回避する。致死以下の投与量を受けるグループにおける肝臓の 障害は、重大な症候を引き起こさない。致死投与量を受け取るグループは、昏睡 状態の前に、無食欲、嘔吐および下痢を経験する。追加の薬物は、フラン力ビラ （Ｆｒａｎｃａｖｉ　Ｉ　ｌａ）　、Ａ、らのモード（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ ｏｌｏｇｙ、９６：４７０−４７８　（１９８９）］に従い、動物に投与しない 。これは対照動物においてのみ重要である；肝臓透析を受ける動物は無症候性で ある。

次いでＬＡＤを使用してトキシン、接合ビリルビンを除去し、正常のアミノ酸の プロフィルを回復し、そして血清タンパク質および凝固因子を置換する。

ＥＬＡＤをまた使用して、致死投与量のアセトアミノフェンを与えた無肝臓のイ ヌの肝機能を支持する。イヌは間欠的体外肝臓透析により生き続けている。本発 明の細胞系は、肝臓補助装置において使用する他の細胞の問題を克服する。本発 明の細胞は永久的であり、肝臓のきわめて重大な生物学的機能を複製することが でき、そしてきわめてよく分化する。肝臓補助装置において使用するとき、細胞 は肝欠損または不全の被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的生物学的 活性を発現するすることができる。こうして、本発明は肝機能を支持する方法を 提供する。これは肝臓の再生起こるために十分な時間を提供し、ならびに循環す るトキシンを除去することによって肝臓の再生のためのよりすぐれた環境を提供 する。さらに、肝臓を再生することができない患者において、患者は移植を待つ 間生き続けることができる。

この方法は、また、第１の肝臓の移植前に、肝不全後に患者が回復することがで きる手段を提供する。また、緊急の第２の移植を必要とする患者において、肝臓 補助装置の入手可能性は、第２ラウンドの主要な外科を実施する前に、患者を回 収させることができるであろう。

この明細書の中に述べたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当 業者の技量のレベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物 または特許出願が詳しくかつ個々に示す場合と同程度にここに引用によって加え る。

本発明を理解を明瞭にするために例示および実施例により記載してきたが、ある 種の変化および変更は添付する請求の範囲内で行うことができることは明らかで あろう。

比産生 （グルコース）　ｍｇ／ｄｌ １４Ｇ−グリコーゲン（ｃｐｍ／分／９分間９Ｈ−グリコーゲ［ｃｐｍ／分／９ 分間９素（μモル／ｇ） アルブミン（ｍｇ／２４時間） 要　約　書 肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルの肝特異的生物学 的活性を有する永久的細胞系が提供される。細胞は種々の肝疾患の処置において 使用される。また、肝臓補助装置において細胞を使用する方法および肝臓補助装 置を製造する方法が提供される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的生 物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前記 細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長において 、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時間 のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファフ ェトプロテインの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルファ フェトプロテインを産生する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系。 ２、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タン パク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテインの 比は少なくとも約２５である、請求の範囲第１項記載の細胞系。 ３、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅ ｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第１項記載の細胞系。 ４、肝欠損または不全に悩む被検体を支持する肝臓補助装置であって、前記肝臓 補助装置は肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特 異的生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系の細胞か らなり、前記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面 成長において、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク 質／２４時間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン ／アルファフェトプロテインの比が少なくとも１５であるように、アルブミンお よびアルファフェトプロテインを産生する、肝臓補助装置。 ５、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タン パク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテインの 比は少なくとも約２５である、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。 ６、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨｅ ｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。 ７、さらに反対第１および第２の表面を有する半透膜を含み、前記細胞系は前記 第１面と接触している、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。 ８、前記膜は管からなり、そして前記第１表面は前記管の外部の表面である、請 求の範囲第７項記載の肝臓補助装置。 ９、前記肝臓補助装置は複数の前記管からなる、請求の範囲第８項記載の肝臓補 助装置。 １０、前記被検体はヒトである、請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置。 １１、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロテインの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロテインを産生する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系の細胞を、反 対の第１および第２の表面を有する半透膜に準備し、そして（ｂ）前記第１表面 上の前記細胞を、細胞が全面成長に到達するまで、培養し、前記培養工程は、 （ｉ）前記第１表面に前記細胞を接種し、そして（ｉｉ）前記細胞を成長を支持 する培地を、細胞が全面成長に到達するまで、連続的に循環させる、 からなる、 からなる、肝欠損または不全に悩む被検体を支持する肝臓補助装置を調製する方 法。 １２、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテイン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨ ｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を請求の範囲第４項記載の肝臓補助装置と 接触させ、前記接触は血液中の分子を前記細胞と接触させて前記血液に含まれる 分子の吸収および代謝的プロセスを達成し、そして前記接触はさらに前記細胞中 で産生されたタンパク質および低分子量の分子を血液の中に入れさせ、そして （ｂ）分泌された代謝廃棄物を肝臓補助装置から除去する、からなる、肝欠損ま たは不全に悩む被検体を支持する方法。 １５、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテイン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、前記肝臓補助装置はさらに反対の第１および第２の表面を有する半透膜を 含み、前記細胞は前記第１表面と接触し、そして工程（ａ）において血液は前記 第２表面と接触する、請求の範囲第１４項記載の方法。 １７、前記工程（ｂ）は浸漬溶液を前記細胞と接触させ、これにより前記分泌し た代謝廃棄物を除去することによって実施する、請求の範囲第１４項記載の方法 。 １８、前記方法は体外で実施する、請求の範囲第１４、１５、１６または１７項 記載の方法。 １９、前記方法は体内で実施する、請求の範囲第１４、１５、１６または１７項 記載の方法。 ２０、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨ ｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第１４、１５、１６または１７項記載の方 法。 ２１、前記被検体はヒトである、請求の範囲第１４項記載の方法。 ２２、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロテインの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロテインを産生する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系を培地中で維 持し、（ｂ）上澄み液を前記培養物から回収し、（ｃ）血漿タンパク質を前記上 澄み液を分離し、そして（ｄ）前記血漿タンパク質を精製する、からなる、肝欠 損または不全に悩む被検体を支持する方法。 ２３、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテイン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨ ｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロテインの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロテインを産生する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系を培地中で維 持し、（ｂ）前記細胞系を試験すべき薬物に暴露し、そして（ｃ）前記培養物を 前記薬物の代謝物の存在下に分析する、からなる、薬物および薬理学的化合物の 代謝的活性を評価する方法。 ２６、さらに、工程： （ｄ）前記代謝物を他の細胞培養物の中に導入して、それらの突然変異誘発また は有害作用を決定する、 を含む、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテイン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨ ｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２９、工程： （ａ）肝欠損または不全に悩む被検体を支持するために有効なレベルで肝特異的 生物学的活性を構成的に有する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系であって、前 記細胞系はグルコース不含培地中で成長することができ、そして全面成長におい て、前記細胞系は少なくとも約２０μｇ／ｍｇの合計の細胞タンパク質／２４時 間のアルブミンの発現速度を示し、そして前記細胞系は、アルブミン／アルファ フェトプロテインの比が少なくとも１５であるように、アルブミンおよびアルフ ァフェトプロテインを産生する、非腫瘍形成性永久肝細胞の細胞系を培地中で維 持し、（ｂ）前記細胞系を肝炎の菌株で感染させ、そして（ｃ）前記菌株により 引き起こされた前記細胞系への作用を観察する、からなる、ウイルスの肝炎を研 究する方法。 ３０、前記アルブミンの発現速度は少なくとも約２５μｇ／ｍｇの合計の細胞タ ンパク質／２４時間であり、そして前記アルブミン／アルファフェトプロテイン の比は少なくとも約２５である、請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１、前記細胞系はＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１０７４１の同定特性を有するＨ ｅｐＧ２／Ｃ３Ａである、請求の範囲第２９項記載の方法。