JPH05508421A - 液性アネルギーを誘導するための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛　アネルギーを　るための １斂光！ 本発明は免疫学の分野に属し、抗体に媒介される病態を治療することを目的とし て液性アネルギーを誘導する組成物および方法に関する。より詳細には、本発明 は非免疫原性の安定なポリマーおよびＴ細胞エピトープを欠いた免疫源のアナロ グの複合体に関する。

ｌ匪旦胃１ 病原性または病原性となり得る微生物の世界で生き延びるために、高等生物は実 質的にあらゆる外来物質を、その特徴的分子を介して特異的に認識する免疫系を 進化させた。この認識の結果、その合成を誘導された外来物質にのみ結合する、 抗体と呼ばれる特異的タンパク質の産生を高頻度で生じ、これは侵入した微生物 の排除を引き起こす。時として、動物の免疫系は自己の分子の内のあるものを認 識する抗体を作り、その動物の健康に不利に作用する自己免疫状態を生じる。

免疫原に対する応答としての特定の抗体の誘導には、胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞 ）、マクロファージ、および骨髄由来リンパ球（Ｂ細胞）を含む、多数の細胞種 の相互作用が関与する。

Ｂ細胞は、その表面に、活性化およびクローン拡大の最初の段階である免疫原と の結合を可能にする、免疫グロブリンを有している。この免疫グロブリンが結合 する、免疫原上の部位（単数または複数）、領域（単数または複数）またはドメ イン（単数または複数）は、「Ｂ細胞エピトープ」と呼ばれる。Ｂ細胞の活性化 および増大の第二の段階で、Ｔ細胞が、Ｂ細胞に結合する免疫原と、「Ｔ細胞エ ピトープ」と呼ばれる免疫原の部位、領域またはドメインで相互作用することに より、活性化される。活性化されるとＴ細胞は、免疫原によって結合したＢ細胞 に正のシグナル（単数または複数）を与え、モしてＢ細胞は分化して抗体を産生 じ分泌し始める。Ｔ細胞からの正のシグナルには、リンホカインの分泌および／ またはＢ細胞とＴ細胞との直接的な接触が含まれる。Ｔ細胞エピトープはＢ細胞 エピトープとは異なり得、あるいはより範囲が限定され得る。上述のように、免 疫原はＴ細胞依存性抗体を生じるためには、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方に認識さ れるエピトープを持っていなければならない。

抗体媒介性の病態を治療しようとする以前の試みは、免疫応答の一般的および特 異的な抑制を含んでいた。一般的な抑制には、典型的には例えばシクロホスファ ミドまたはステロイドのような、広いスペクトラムの非特異的免疫抑制剤が使用 された。これらの非特異的薬物は、免疫系の多くの局面を抑制するので、所望の 有利な機能を除去すると同様に、治療されるべき状態を生じる機能不全も起こす 。従って、これらはもしも用いるとしても非常に注意して用いられ、患者は二次 的な感染または他の望ましくない副作用の危険に曝される。

一般的な免疫抑制は不利益であるので、免疫系の正常な機能に影響することなく 、ある免疫原に対する免疫応答を特異的に抑制する方法は、抗体媒介性の病態の 治療にとって非常に好ましい。本発明は、免疫原に対する液性応答を、特異的に 抑制する組成物および方法に関している。

従来の特異的な免疫抑制を誘導しようとする試みは、ハブテンおよび免疫原を非 免疫原性のポリマー性キャリアーに複合させることに集中していた。Ｂｅｎａｃ ｅｒｒａｆ、　Ｋａｔｚおよびその仲間は、ハブテンおよび抗原およびｐ−リジ ンとり一グルタミン酸とのコポリマー（Ｑ−ＥＩ［）の複合体を使用した。彼ら の初期の研究には、モルモットおよびマウスにおける合成ハプテン２．４−ジニ トロフェニル（ＤＮＰ）の複合体が含まれ、この複合体が液性の不応答性を誘導 可能であることが示された。これらの初期の研究は、その後、他のハブテンの複 合体および免疫原の複合体に広げられた。ハブテンを泪いた結果は繰り返すこと ができたが、彼らの特許（米国特許第４．１９１．６６８号および第４，２２０ ．５６５号）はこのアプローチが免疫原に対するトレランスを誘導するのに有効 であると主張するけれども、続く研究は、叶ＥＫおよび免疫原の複合体が免疫原 に対する液性の不応答を誘導する手段を提供しないことを示した。例えばＬｉｕ ら、」旺ｎ、（１９７９）　１：劃：２４５６−２４６４は、これらの複合体に 対する続（研究が、その複合体が「タンパク質特異的Ｂ細胞のレベルでは不応答 を誘導しない」ことを示したと報告している。同様に、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ら、Ｊ、Ａ１１ｅｒ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎ、（１９８１）　６７：２７２−２ ７８は、ブタフサ（ｒａｇＷｅｅｄ）免疫原とＱ−ＩＪとの複合体が実際に、そ の免疫原に対するＩｇＥおよびＩｇＧの両方の応答を刺激したと報告している。

この引き続き行われた研究および非免疫原性ポリマーと免疫原との複合体を用い た他のデータ（Ｓａｓｋｉら、　５ｃａｎｄ、Ｊ、　１ｍ５ｕｎ、　（Ｌ９８２ ）　ｌｊ；：１９１−２００；　５ｅｈｏｎ、　Ｐｒｏ　、　Ａ１１ｅ　（１９ ８２）　３２：１６１−２０２：　Ｗｔｌｋｉｎｓｏｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、（９Ｂ？）　ｌｊｉ：３２６−３３ｔ、およびＢｏｒｅｌら、Ｊ　ｕ　ｏ　、 　ｔ　ｄｓ（１９９Ｇ）　ｕｉ＋１５９−１６１１）は、このような複合体で得 られたアネルギーは、あるとしても、Ｔ細胞活性の抑制によるものであり、Ｂ細 胞不応答性によるものではないことを示していると思われる。

他の参考文献の幾つかは、非免疫原性ポリマーとＤＮＡとの複合体を使用してい る。米国特許第４．１９１．６６１１号：米国特許第４．６５０，６２５；　Ｊ 、　Ｃ’ｎ、ｖ　ｓｔ、　（１９８８）　Ｌｌ：１９０１−１９０７；および同 一出願人による米国特許出願第０７／４９４．１１８号を参照のこと。

全体として、これらの引例はこれらＤＮＡ複合体が、このループス自己免疫原に 対して抗体の産生を抑制し得ることを示している。この点に関して、ＤＮＡはハ ブテンのように、Ｔ細胞エピトープを有さないことに注目すべきである。。

結局、従来技術は、非免疫原性の安定なポリマーおよび７％ブテンまたはＤＮＡ 、これらはいずれもＴ細胞エピトープを有さないものであるが、それらの複合体 に対する、抗体の産生は、Ｂ細胞不応答性を提供し得ることを示している、と出 願人は考える。出願人はまた、免疫原の複合体はＢ細胞不応答を提供しないが、 直接に免疫応答を抑制するようにＴ細胞を活性化すると考える。

及匪立皿丞 本発明は、従来の非免疫原性の安定なポリマーと免疫原との複合体がＢ細胞アネ ルギー（不応答）を誘導し得なかったのは、これらの免疫原がＢ細胞とＴ細胞の 両方のエピトープを有していたこと、および、もしも後者が除かれたならば、複 合体はＢ細胞アネルギーの誘導に有効であろうという発見に基づくものである。

従って、本発明の一つの局面は、（ａ）免疫原が結合するＢ細胞に特異的に結合 し、かつ（ｂ）免疫原のＴ細胞エピトープ（単数または複数）を欠く免疫原のア ナログと、非免疫原性の生物学的に安定なキャリアーポリマーとの複合体からな る、免疫原に対する特異的Ｂ細胞アネルギーを誘導するための組成物である。

上記複合体および、製薬的に許容し得るキャリアーまたはビークルの、製薬的組 成物が本発明のもう一つの局面である。

さらに本発明の局面は、上記複合体の有効量を個体に投与することを包含する、 該個体において免疫原に対する特異的Ｂ細胞アネルギーを誘導する方法である。

本発明のさらに他の局面は、上記複合体の治療的な有効量を個体に投与すること を包含する、免疫原に応答して望ましくない抗体を産生ずる抗体媒介性病態につ いて、個体を治療する方法である。

区皿二里崖ユ且■ 図１は、実施例１に記載されている、免疫したＣＡＦ　１マウスにおけるＢ細胞 エピトープの検出を、グラフで示している。

図２は、実施例１に記載されているＴ細胞エピトープの検出を、同様にグラフで 示している。

図３は、実施例１に記載されている、ペプチド”Ｌ−５３”に対する抗体の抑制 を示す。

図４および５は、実施例４に記載の結果を示すグラフである。

日を　るための≦ ここで用いられている用語「Ｂ細胞アネルギー」は、Ｔ細胞の介助のもとに抗体 を産生および分泌するこれらＢ細胞の不応答性を意味し、未成熟および／または 成熟Ｂ細胞のクローン欠失および／またはＢ細胞に産生能力が無いことを含むが これらに限定されない。「不応答」は免疫原に対する液性応答の、治療上有効な 低下を意味する。量的な低下（抗体産生の減少により測定される）は、少なくと も５０％、好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは１００％である 。

「抗体」はＴ細胞依存性のそれらの抗体を意味する。

ここで用いられている用語「免疫原」は、動物に注射された場合、液性免疫応答 を誘起する化学物質を意味する。免疫源はＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープ の両方を有する。

ここで用いられている用語「個体」は、哺乳類のメンバーを示し、ヒト、サル、 ウシおよびヒツジのような家畜、ウマのような競技用動物、およびイヌまたはネ コのようなベットを含む。

免疫原の「アナログ」という用語は、（ａ）該免疫原が特異的に結合する抗体に 特異的に結合し、かつ（ｂ）　Ｔ細胞エピトープを欠く分子を意味する。アナロ グは通常、免疫原の断片または誘導体であるので免疫源と同じ化学上の分類に入 るのであるが（例えば免疫原がポリペプチドで、アナログがポリペプチドである ）、化学上の類似性は必須ではない。従って、アナログは上述の（ａ）および（ ｂ）の機能的特徴を有する限り、免疫原と興なる化学上の分類に入り得る（例え ば免疫原が炭水化物で、アナログがポリペプチド、というように）。アナログは タンパク質、炭水化物、脂質、リポタンパク質、糖タンパク質、リポポリサッカ ライドまたは他の生物学的物質であり得る。また、免疫原またはアナログの化学 構造はいずれも、本発明の目的のために定義する必要はない。

用語「非免疫原性」は、キャリアーのポリマーを説明するのに用いられ、キャリ アーのポリマーそれ自身が個体に投与された場合に実質的に免疫応答を実質的に 誘起しないことを意味する。

抗体媒介性の病態に関与する免疫原は、生物学的薬剤、アレルゲン、独特の造影 剤のような外来（個体に対して異物）の免疫原、または甲状腺炎（サイログロブ リン）、発作（カルシオリビン）、男性不妊症（α−精子）、重症筋無力症（ア セチルコリン受容体）、リウマチ熱（炭水化物複合体）、およびＲｈ溶血性疾患 （Ｄ免疫原）に関連するもののような自己の免疫原（自己免疫原）であり得る。

このような免疫原に対するアナログは、候補となる分子をスクリーニングして、 それらが（ａ）該免疫原に対する血清抗体と特異的に結合し、かつ（ｂ）Ｔ細胞 エピトープを欠くことを決定することにより同定し得る。血清抗体に対する特異 的結合は従来の免疫アッセイを用いて決定し得、Ｔ細胞エピトープの有無は従来 のＴ細胞活性化アッセイにより決定し得る。これに関して、免疫原に対する血清 抗体に「特異的に結合する」アナログは、該免疫原に対して妥当なアフィニティ ーを示す。

Ｔ細胞エピトープの有無は、実施例に記載されているトリチウム標識チミジン取 り込みアッセイを用いて決定し得る。バックグラウンドよりも統計的に有意に高 いチミジン取り込みを誘導し得なかったアナログは、Ｔ細胞エピトープを欠くも のとみなす。チミジン取り込みの量は免疫原によって変化することが認職されよ う。典型的には刺激指数が約２〜３、より一般的には約１〜２が、Ｔ細胞エピト ープを欠くことを示すものである。

有用なアナログを同定する、従来の第一工程は、スクリーニングすべき候補のパ ネルまたはライブラリーを準備することである。例えば、タンパク質またペプチ ドのアナログの場合、ライブラリーは合成または組換え技術、例えばＧｅｙｓｅ ｎら、Ｓ　ｔ　ａｔ　ｅ　Ｐｅ　ｔ’ｄｅｓ　ａｓ　：　Ｃ１ｂａ　Ｓｙｍｐｏ ｓｉｕｍ（１９８６）１１ｊ：１３１−１４９：　Ｄｅｖｌｉｎら、　紅シ乱劇 （１９９０）　２ｉＸ＝４０４−４０６Ｈ５ｃｏｔｔら、　鉦シ瓜組（１９９Ｇ ）　３ｊ、ｌ：３８６−３９０；およびＣｖｉｒｌａら、出しぷ４　（１９９Ｇ 　）虹：６３７ｇ−６３８２に記載の技術により製造され得る。

合成技術では、約５から３０個のアミノ酸からなるペプチドが、各々のペプチド がその次のものにオーバーラツプし、線状エピトープがすべて表されるような様 式で合成される。これはカルボ牛シル末端およびアミノ末端の両方で、Ｂ細胞エ ピトープで期待されるよりも１残基分少なくオーバーラツプさせることにより達 成される。例えば、Ｂ細胞エピトープについての推定される最小必要量がアミノ 酸６個であるならば、各ペプチドは隣のペプチドとアミノ酸５個分、オーバーラ ツプしなければならない。この実施態様においては、Ｂ細胞エピトープの有無を 確認するために、各ペプチドは次に、免疫した動物または患者から得られる天然 の免疫原に対して産生された、抗血清に対してスクリーニングされる。抗体結合 活性を有するそれらの分子は、次に、実施例に記載のようにＴ細胞エピトープの 存在についてスクリーニングされる。Ｔ細胞エピトープを欠（それらの分子は本 発明のアナログとして有用である。

免疫原のＴ細胞エピトープ（単数または複数）が既知または同定可能である場合 には、候補アナログのランダムなスクリーニングは必要でない。このような場合 にはＴ細胞エピトープ（単数または複数）は、機能しないように変化させる（例 えば化学的に誘導体化し、またはエピトープの１つ以上の構成成分を除去するこ とにより）、または、例えばペプチドのような場合には合成または組換え法によ り、完全に除去し得る。

アナログは、本発明の複合体を調製するために、非免疫原性のポリマーのキャリ アーにカップリングされる。好ましいポリマーのキャリアーは生物学的に安定で あり、即ちインビボの排泄半減期が数日から数月であり、また、好ましくは、組 成の定まった合成一本鎖から構成されているものである。

これらは通常約ｓ、　ｏｏｏから約Ｚｏｏ、　０００、好ましくはｓ、　ｏｏｏ から３ｏ、ｏｏｏの範囲の分子量を有する。このようなポリマーの例には、ポリ エチレングリコール、ポリ■−リジン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ リドン、免疫グロブリン、および田−グルタミン酸とＱ〜リジンとのコポリマー である°Ｑ−ＥＸ“がある。

特に好ましいキャリアーポリマーは、前述の米国特許出願第０７／４９４．１１ ８号に記載の、約ｓ、　ｏｏｏから約３０．０００の分子量を有し、Ｅ：１１： （Ｑ−グリタミン酸：ｐ−リジン）のモル比がおよそ６０：４０のＤ−ＥＸであ る。

アナログのキャリアーポリマーへの複合体化は、任意の種々のやり方で行い得、 典型的には１つ以上の架橋剤およびアナログ上の官能基およびキャリアーを含む 。

ポリペプチドアナログは、アナログをキャリアーにカップリングさせる部位とし て働く、アミノ、カルボニル、またはスルフヒドリルのようなアミノ酸側鎖の基 を含む。もしもアナログが官能基を有していない場合には、これらを有する残基 をアナログに追加し得る。このような残基は固相合成法または組換え法で組み入 れられ得、この両者はペプチド合成の分野でよく知られている。炭水化物または 脂質アナログの場合には、官能性のアミ７基およびスルフヒドリル基が従来の化 学によってその中に組み入れられ得る。例えば、第一級アミノ基はソディウム　 シアノボロヒドリドの存在下にエチレンジアミンを用いる反応により組み入れ得 、スルフヒドリルはシステアミン　ジヒドａクロソドの後に標準的なジスルフィ ド還元試薬を用いて還元させることにより組み入れ得る。同様のやり方でキャリ アーもまた、適当な官能基をまだ持っていない場合には、官能基を含むように誘 導体化され得る。ペプチドアナログと叶ＥＩ［または他のタンパク質性キャリア ーとを複合することに特に関連して、カップリングは好ましくは、Ｄ−ＥＸのｐ −リジン残基のεアミノ基を、カップリングしようとするペプチドのアミノ末端 システィン残基にあるスルフヒドリル側鎖にリンクする、スルホスクシンイミジ ル（４−イオドアセチル）アミノベンゾエートのような、ヘテロ三官能性架橋剤 を用いて行われる。この方法は、好ましくは、各ｐ−Ｅｌ［分子に平均３から５ 個のアナログ分子がカップルし、カップリング前のＤ−ＥＸの平均分子量がｓ、 　ｏｏｏから３０．０００ダルトンである様に行われる。

複合体は通常、注射による投与（例えば腹腔内、筋肉内、等）用に製剤化される 。従って、これらは典型的には、生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース溶 液、等のような製薬的に許容し得るキャリアーと組合わされる。この複合体は通 常、製剤の０．０１重量駕から１０重量％を占める。この複合体は個体に、「治 療的な有効量」、即ち、関与する免疫原に対するＢ細胞のアネルギーを生じて、 処置すべき抗体媒介性の状態の予防、改善、または除去を行うに充分な量で、投 与する。特定の投与スケジュール、即ち投与量、時間および回数は、特定の個体 およびその個体の医学的経歴に依存する。通常、約１０μｇからＩＢ／ｋｇ体重 の複合体を、毎日、３日間連続して与える。他の適当な投与スケジュールは、１ 週間当り３回または１週間当り１回である。通常Ｂ細胞のターンオーバー速度に 合わせて、反復投与が、液性アネルギー状態を達成および／または維持するため に必要であり得る。このような反復投与は、典型的には、抗体力価の増加が観察 されたら、３０から６０日毎に、あるいはもっと早く、１■ｇ／ｋｇ体重までの 投与することを含む。あるいは、複合体の連続的徐放製剤が、いくつかの病態で は必要であり得る。徐放を達成するための様々な製剤および装置が当該分野で知 られている。

抗Ｔヘルパー細胞処置がこの複合体投与と一緒に行われ得る。このような処置は 、通常、ステロイドまたはシクロ７ボリンのようなＴ細胞を抑制する薬剤を使用 するものである。

以下の実施例は本発明およびその特徴をさらに説明することを意図する。これら の実施例は、いかなる様にも本発明の範囲を制限することを意図しない。

皇ｍ アセチルコ１ン　７　に　Ｂ　アネルギーベブチドとＱ−ＥＫ／ペプチドとの複 合体の調製：Ｔｏｒ　ｅｄｏ　ｅａ　ｉ　ｏ　ｎ’ｃｕｓのアセチルコリン受容 体のαサブユニットは、５ｔｒｏｕｄ、　Ｒ，Ｍ、およびＦｉｎｅｒ−Ｍｏｏｒ ｓ、　Ｊ、、　友」Ｌ−」しｙ１−Ｃ」Ｌｌ」一旦ｊ１９」１（１９８５）　ｌ ：３１７＋３５１およびＳｕｍｉｋａｗａ、Ｋ、ら、囮２酎１■Ｌｌ長工（１９ ８２）　ｌｊ；ｊ：５８０９−２２に記載されている。このαサブユニットの残 基４７位−１２７位として定義されるペプチドは、主要免疫原領域（ＭＩＲ）と 呼ばれる。

αサブユニットの残基６１−７７および１１２−１２７に相当する２つのペプチ ド、Ｌ−４２およびＬ−５３を、従来の固相法を用いて合成し、ＨＰＬＣで均一 にまで精製した。このペプチドをチオエーテル結合を介してトＥＫに結合するた めに、各々の配列のアミノ末端にシスティンを付加した。

各ペプチド（４０ｍｇ）をｐＨ９，０の０．１Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液溶解 した。溶液を室温で無水シトラコン酸（４００μＬ）と反応させ；ｐＨはＬＭ　 ＮａＯＨを加えることにより７．０より上に維持した。

溶液を次に、ジチオスレイトール中２０ｄにし、３７℃で２０分間加熱してペプ チドを還元した。この混合物をｐＨ７，０の０．１Ｍホウ酸ナトリウムで平衡化 したＧ−１０５ｅｐｈａｄｅｘカラムに通して迅速に脱塩した。

Ｑ−ＥＸ　（２００ｍｇ、重量平均ＭＷ＝約１０．０００−約３０，０００）を ２．ｈＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウムに溶解した。スルホスクシンイミジル（４ −イオドアセチル）アミノベンゼン（ＳＳＩＡＢ、　１０＋ａｇ、　Ｐｉｅｒｃ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を混合物に添加し、この混合物を暗所に室温下で、９０ 分間反応させた。次に、混合物を、ｐｎ’ｙ、　Ｏの０．１Ｍホウ酸ナトリウム で平衡化した１０ｍＬのＧ−２５カラムに通して脱塩した。

脱塩したＳＳ　ＩＡＢ−Ｑ−Ｅｌを還元し脱塩したペプチドに混合し、−晩反応 させた。得られた複合体を、１４にｄで除去する透析チューブに入れ、これを５ ％酢酸で透析してシトラコン基を除去した。透析用緩衝液をリン酸緩衝生理食塩 水に換え、透析を続けた。

Ｂ細胞エピトープの検出： ＣＡＦ　１マウスを、ミョウバンおよび、６　ｔｕｓｓ’ｓワクチン（！ｖｅｒ ｓｏｎ、　Ｇ、Ｍ、（１９８６）　ｎｄｂｏｏｋ　ｅ　’　ｔａｌ　Ｉ　。

、　ｖｏｌ、２．　ｐ、６７、　Ｄ、Ｍ、　ｆａｉｒ編、　Ｂｌａｃｋｖａｌｌ 　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、 　ＣＡ）に吸着させた組換えデンキナマズＭＩＲの５０μｇを腹腔内投与（ｉ、 ｐ、）により免疫した（０日目）。２１日目に、マウスに生理食塩水中の同じタ ンパク質を用いてＩＰでブースター注射を行い、２８日目に尾静脈から採血した 。これらのマウスの血清（抗ＭＩＲ血清）を、以下のようにしてＢ細胞エピトー プについてペプチドし−４２およびＬ−５３をスクリーニングするのに用いた。

指定のペプチド複合体の１０μｇ／ｍｌでコートされたマイクロタイターウェル に、血清を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、３回洗浄し 、１００μｍのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体を添加し、３７℃ で１時間インキュベートし、３回洗浄し、そして１００μｍの顕色剤（基質）を 各々のウェルに添加した。プレートを３０分間室温でインキュベートし、そして 各ウェルの色素量をＴｉｔｅｒｔｅρＭｕｌｔｉｓｋａｎで測定した。結果を図 １にグラフで示す。°Ｌ４２またはＬ５３．　ＮＭＳ”と表示されたカーブは、 抗ＭＩＲ血清の代わりに正常マウス血清（ＮＭＳ）を用いて、Ｌ４２またはＬ５ ３でコートしたプレートで得られた値を示している。図１に示すように、両方の ペプチドは免疫マウスから得た抗体と特異的に反応し、このことは、両方のペプ チドにＢ細胞エピトープが存在することを示している。

Ｔ細胞エピトープの検出二 Ｔ細胞活性化は、Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｍ、Ｌ、、　（１９８０）のＭｉ　ｓｈｅ 　ｌ　ｌおよびＳｈｉｇｉ　ｉ編、　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　’ｎ 　Ｃｅｌ　ｕｌａ　ｍ＋ａｕ　ｏ　ｏ　（Ｗ。

Ｈ，Ｆｒｓｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｆｓｃｏ、　ＣＡ ）、ｐ、　１６４に記載の一般的方法によりアッセイした。ＣＡＦＩマウスを完 全フロイントアジ−パント（ＣＦＡ）中の５０μｇ　ＭＩＲで、足踵に免疫した （０日目）。７日目に、膝窩リンパ腺を取り出し、マイクロタイタープレート中 に、ウェル当り５×１０５細胞で培養した。ペプチドまたはペプチド−ＤＥに複 合体を培養物に加えて、４日目にＴ細胞の増殖を測定するために１μＣｉのトリ チウムチミジンを各ウェルに加えた。５日目に５ｋａｔｒｏｎ＠細胞回収器で培 養物を回収した。

取り込まれた３トチミジン量はＢｅｃｋｍａｎ　Ｌ６８００＠液体シンチレーシ ｌンカウンターで測定した。刺激指数は、ペプチドを用いて取り込まれたＣＰＭ を、ペプチド無しの培養物に取り込まれたＣＰＭで割って算出した。刺激指数〉 １は、ウェルに添加したペプチドにＴ細胞エピトープが存在することを示す。図 ２に示すように、このアッセイでＬ−４２はＴ細胞エピトープを有するがＬ−５ ３は有さない。

Ｌ−５３７Ｑ−ＥＫ複合体による、Ｌ−５３におけるＢ細胞アネルギーの誘導： ＣＡＦＩマウスを０日目に、ミョウバンおよび、ｅ　ｔｕｓｓ’ｓワクチンに吸 着させた５０μｇのＭＩＲで、ｉ、ｐ、免疫した。２１．２２、および２３日目 にマウス（各群６匹）に、Ｌ−４２−Ｑ−Ｅに複合体またはし−５３−１ｊ−Ｅ Ｋ複合体のいずれかを１０または１００μｇ投与した。１群には生理食塩水のみ を投与した。２８日目に全てのマウスに生理食塩水中のＭｉｌｌをブースター注 射し、３５日目に全てのマウスから採血して、図１に関して前述したＥＬＩＳＡ アッセイを行って、これらの血清中のし−４２およびＬ−５３に対する抗体の存 在をアッセイした。Ｌ４２に対する抗体についての結果を図３Ａに、Ｌ５３に対 する抗体は図３Ｂに示す。Ｌ−５３複合体はＬ−５３に対する抗体の形成を抑制 したが、Ｌ−４２に対しては抑制しなかった。Ｌ−４２複合体はＬ−４２または Ｌ−５３のいずれに対する抗体応答も抑制せず、むしろし−４２に対する抗体産 生を増加し得た。抗体力価は標準血清に対するパーセントとして示される。Ｐ値 は各投与量を生理食塩水コントロールと比較して、標準を検定で決定した。

爽１」」 アルブミンー−ム　による　アルブミンに・　るＢ　アネルギーの　＼ この実施例は、免疫原とＱ−ＥＸとの複合体がＢ細胞アネルギーを誘導しないこ との証拠を、さらに示す。

卵白アルブミン−Ｄ−ＥＸ複合体の合成：ニワトリ卵の卵白アルブミン（５０ｍ ｇ）を１ｈＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ９，０の ５諷りに溶解した。３．０■ｇの２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬）を 添加した後、混合物を室温で２．５時間反応させた。０．５Ｍホウ酸ナトリウム 、　ｐＨ１９，０に１００１ｇ／ｍＬの濃度で溶解したＱ−ＥＸ　（５４ｍｇ） をＳＳＩＡＢ（１８ｍｇ：　Ｐｆｅｒｃｅ　Ｃ！＋６ｇａｆｃａりと暗所、室温 で２．５時間反応させた。上記２つの反応混合物をＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ；　１０ｍＬカラム容積、０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９，０によ り平衡化）で別々に脱塩し、排除された画分を合わせて暗所、４℃で１６時間、 反応させた。反応生成物を、０．２Ｍ炭酸水素アンモニウムで平衡化した５ｅｐ ｈａｅｒｙｌ　Ｓ−２００（４９０亀り、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムによる ゲル濾過で分画した。ドデシル硫酸ナトリウムの存在下にポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べて複合体を含むとされた画分を、プール して真空下に乾燥させた。複合体化卵白アルブミンを未反応のタンパク質から効 果的に分離するために、乾燥物を０゜８ｍＬのシトラコン酸無水物と、ＬＭ　Ｎ ａＯＨの添加によりｐＨを７と９の間に維持しながら、反応させた。このシトラ コン酸複合体はＳ−２００で再度クロマトグラフィを行い、５ＤＳ−ＰＡＧＥで 調べて高分子量の物質（＞８０．０００ダルトン）を含む画分を生物学的研究に 使用した。

ニワトリ卵白アルブミンは、ｒ：ｌ−Ｅにとの複合体にした場合、ニワトリ卵白 アルブミンで免疫したマウスにＢ細胞アネルギーを誘導しない： 雌ＣＡＦ＋マウスを、Ｂ、　ト」且５Ｓ（Ｓワクチンにアジュバントとして添加 したミｌウバンに沈降したニワトリ卵白アルブミン（ｏｖａ；　１０Ｇμｇ／マ ウス、　ｉ、ｐ、）でプライムした。１６週後、マウスを各６匹の２群に分けた 。第一の群（コントロール）は生理食塩水で処置し、第二の群にはＯＶａとＱ− Ｅにとの複合体（ｏｖａ−Ｑ−ＥＫ；２００μｇ／マウス／日、　ｉ、ｐ、）を 注射した。マウスには続く３日間連続して投与した。１＠目の投与の１週間後、 両群のマウスを生理食塩水溶解のｏｖａ（１００μｇ／マウス）でｉ、ｐ、でブ ースター投与した。その１週間後、マウスを尾静脈から採血した。血漿を回収し 、ＥＬＩＳＡアッセイで抗ＯＶａ抗体についてアッセイした。

表１に示すように、ｏｖａ４−ＥＸ複合体は抗ｏｖａ抗体応答を抑制しなかった 。

表ユ 群　処置　標準血清１に対する 抗ｏｖａ％±Ｓ、Ｄ。

１　生食　７０．７±３６ ２　ｏｖａ−Ｑ−ＥＸ　１６Ｇ、　２±１６７１抗ＯＶａ抗体量は、ｏｖａで免 疫しブースター投与したＣＡＰ、から得た血清の標準プールに対して測定するＥ ＬＩＳＡで決定した。示した値は、各群６匹の平均および標準偏差である。

尖１」」 Ｍ　＋＋　Ａ　によるＭＲに・　る Ｂ　アネルギーの　＼ この実施例は、免疫原とり−Ｅにとの複合体がＢ細胞アネルギーを誘導しないこ との証拠をさらに示すものである。

Ｍ［−Ｑ−Ｅに複合体の合成： ＭＩＨのカルボキシル末端に、８アミノ酸（Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ− Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号Ｎｏ、　：１））を含ませる改変を 行った。

アミン末端には１個のアミノ酸、プロリンを伸長した。精製した改変ＭＩＲ（２ ５０ｍｇ）を１０ｈ＋Ｍジチオスレイトールで還元し、１０ｍＭ　ＥＤＴ’Ａを 含有するＯ、　ＬＭホウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ９，０で平衡化した５ｅｐｈ ａｄｅｘ　Ｇ−２５（Ｐｈａｒ＋ｅａｃｉａ）を通して、脱塩した。ＩＪ−Ｅに （４００１ｇ）を前述の実施例のように５ＳＩＡＢ　（２９ｍｇ）と反応させた 。

生成物はＧ−２５で脱塩した。改変ＭＩＲおよびＱ−ＥＫをＧ−２５カラムに通 して排除された画分を合わせて、４℃で１６時間、暗所で反応させた。過剰の５ ＳＩＡＢ部分を２−メルカプトエタノールでクエンチし、反応混合物をＰＭ−１ ０膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＞で２０ｍＬに濃縮した。混合物 を１．ｏｍＬの無水シトラコン酸で処理し、５％水酸化アンモニウムで平衡化し たＳ−３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；　１．８Ｌ＞でクロマトグラフィした。５ ＤＳ−ＰＡＧＥで調べて、Ｑ−ＩＪ当り２つ以上の改変ＭＩＲ部分を含む画分を プールし、生物学的研究に使用した。

［Ｊｉ−ＩＱ−ＥＫ複合体は、同じ種由来のＭＩＲで免疫されたラットにおいて 、Ｔ細胞エピトープを含有しない：Ｔ細胞の活性化は前述のＢｒａｄｌｅｙの一 般的方法でアッセイした。雌ＬｅｗｆｓラットをＯ日間に、フロイント完全アジ ュバント（ＣＦＡ）中のＭＩＲ（５０膜ｇ）を用いて足諺に免疫した。７８目に 膝窩リンパ節を取り出し、ウェル当り５ｘ１０５細胞でマイクロタイタープレー トに入れて培養した。ＭＩＩ？７Ｑ−ＩＪを添加し、４日培養した後、ウェルに トリチウムチミジン（１−μＣｉ）をパルスしてＴ細胞の増殖を測定した。５日 培養の後、培養物を５ｋａｔｒｏｎ”細胞回収器で集めた。取り込まれた３トチ ミジンの量をシンテレ−９１２分析器で測定した。刺激指数は、複合体の非存在 下に取り込まれたカウントで割って算出した。１よりも大きい刺激指数は、添加 した複合体上にＴ細胞エピトープが存在することを示すものと考えられる。刺激 指数は、試験したＭＩＲ−夏−ＥＫの全濃度（１０膜ｇ／＋Ｌから４００ｍｇ／ ＋＊Ｌ）で４以上であった。このことは、このアッセイにおいて、　ＭＩＲで免 疫したラットが、ＭＩＲ−Ｄ−ＥＸ複合体上のＴ細胞エピトープを認識すること を証明している。

ＭＩＲ−ｐ−ＥＫはＭＩＲで免疫したラットにＢ細胞アネルギーを誘導しない： 雌ＬｅｖｉｓラットをＣＦＡ中のＭＩＲ（１００μｇ／ラット）でプライムした 。６か月後、ラットを各３匹ずつ、３群に分けた。１つの群は生理食塩水（コン トロール）で、他の２つの群はＭＩＲ−Ｑ−ＥＸ　（１００μｇ／ラット、１− ｐ−）で３日間連続して処置した。１週間後、コントロール群のラット、および ＭＩＨ４−ＩＪで処置したうちの１群に、生食中の組換えＭＩＲ（１０００μｇ ／ラフト、ｉ、ｐ、）をブースター投与した。１週間後に３群の全てについて、 ラットを尾静脈から採血した。血漿を集めてＥＬＩＳＡアッセイで抗ＭＩＲ抗体 の量をアッセイした。以下の表２はこれらのアッセイの結果を示す。

（以下余白） 表−ユ 群　処置　ＭＩＲフ゛−スター投与　μ／ｍｌ抗ＭＩＲ２群１に（平均±Ｓ、　 Ｄ、　’）　対するＰ ｌ　生食　あり　１ｆｆ（Ｌ５±７４．７２　ＭＩＲ−Ｑ−Ｅに　あり　８５． ５±３１．１　０．１９５３　ＭＩＲ−Ｑ−ＥＩ　なし　２３０．６±３１　０ ．０４９２抗ＭＡＲ抗体の濃度は、ラット抗ＭＩＲ血清の標準プールに対して測 定するＥＬＩＳＡで決定した。示した値は、各群３匹の平均および標準偏差であ る。Ｐ値は標準を検定で決定した。群２は群１に対して有意差は無い。群３（ブ ースター非投与群）は群１よりも有意に高い。

表２に示すように、群１の動物（生食フントロール）のデータは、ＭＩＲそれ自 身が免疫原であることを示す。群２および３の動物のデータは、ＭＩＲ−Ｑ−Ｅ に複合体が抗ＭＩＲ応答に影響しなかったことを示している。実際、ＭＩＲＥ− Ｅｌは群３において、抗ＭＡＲ応答をブーストした。

支り匠Ｌ −４２Ｋ　の　Ａ　いた これらの試験は、実施例１の結果と組み合わせると、Ｄ−ＥＸに複合された成分 は、もしもその部分がＴ細胞エピトープを含まないか、またはＴ細胞に認識され ない場合には、その部分を認識するＢ細胞においてアネルギーを引き起こすこと を示している。

Ｌ４２ペプチド〜ＫＬ■複合体の合成二還元したＬ−４２（実施例１参照）を、 前述のり−ＥＸに関する記載と同様のチオエーテル化学を用いて、スカシガイの ヘモシアニン（ＸＬＨ）に複合させた。

Ｌ−４２はＬ−４２−ＫＬＨで免疫されたマウスにおいてＴ細胞エピトープ（単 数または複数）を欠く： ペプチドによるＴ細胞の活性化は、上述のＢｒａｄｌｅｙの一般的方法で測定し た。雌ＣＡｈマウスを、０日間にＣＦＡ中のＫＬＨ（Ｌ−４２−３［Ｌｌｌ、　 ５０μｇ）と結合させたＬ−４２ペプチドで、足置に免疫した。

７８目に、膝窩リンパ節を取り出し、５Ｘ１０５細胞／ウエルの細胞密度でマイ クロタイタープレートに細胞培養した。ペプチドを添加し、そして４日培養した 後、ウェルに１μＣｆのトリチウムチミジンをパルスして、Ｔ細胞の増殖を測定 した。５日培養した後に、培養物を５ｋａｔｒｂ まれた３■−チミジン量は、シンチレーシ璽ン分析器で測定した。

刺激指数は、ペプチド非存在下に取り込まれたカウントで割って算出した。１よ り大きい指数は、添加したペプチドにＴ細胞エピトープのあることを示している 。

図４のデータはＬ−４２が、　Ｌ−４２−ＫＬＨ−免疫マウスから採取したＴ細 胞の増殖を刺激せず、従って、Ｌ−４２−ＫＬＨによる免疫で誘導せれたＴ細胞 が認識するエピトープを、含まなかったことを示している。

Ｌ−４２−ｆｌ−ＥＫ複合体はＬ−４２−ＫＬＨで免疫したマウスにＢ細胞アネ ルギーを誘導する： ＣＡＦ　＋マウスを、Ｂ、ｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンにアジ１バントとしてミツ ウバンを加えたものと沈降するＬ−４２−ＫＬＨの１ｏｏμｇ／マウスで、プラ イムした。３週間後、マウスを各６匹ずつの群に分けた。１つの群は生理食塩水 を３日間連続ｉ、ｐ、注射により処置しくコントロール）、他の群は同様にして Ｌ−４２−ＫＬＨ（５０μｇ／マウス、ｉ、ｐ、）で処置した。１週間たった後 、尾静脈から採血した。

血漿を集めて、ＥＬＩＳＡアブセイで抗し一４２抗体および抗ＫＬＨ抗体の量を アッセイした。データは標準血清に対するパーセントとして表した。星印は標準 を検定で調べた結果、データ点がコントロールに比べて有意に相違していたこと を示す。

図５のデータは、Ｌ−４２−Ｑ−Ｅに複合体によるこのアッセイにおいて、Ｌ− ４２応答は抑制されたが、抗ＫＬＨ応答は抑制されなかったことを示す。従って 、実施例１に要約された研究およびこれらのデータにより、マウスがＬ−４２ペ プチドを認識するＴ細胞クローンの増殖を誘導しないようなやり方で免疫された 場合には、Ｌ−４２−ｒｌ−ＥＸはＢ細胞アネルギーを誘導することが示される 。一方、Ｌ−４２ペプチドを認識するＴ細胞を誘導する免疫原（ＭＩＲ）で免疫 された動物では、Ｌ−４２−Ｑ−ＥＩ［はＢ細胞アネルギーを誘導しなかった。

免疫学、化学、医学および関連技術の当業者に自明な、本発明を実施するための 上記形態の改変は、以下の請求の範囲内にあっても構わない。

り知九Ｍ７・／ｌ　ｏｒ＞ｙｚＲ 刺うし行数 Ｏｐｇ　ｔｏｏｐｇ　１０ｐｇ　１００μｇ　１０ｇｇ（工’ｆｋ　）　Ｌ４２ −ＤＥＫ　Ｌ５３−ＤＥＫＦＩＧ、３Ａ （を匁）　、　Ｌ４２−　ＤＥＫ　Ｌ５３−　Ｄεにトレ吋−ン−？９１ｔ　ω 、ｇ／　？ウリーＦＩＧ、３Ｂ ｔ’ｉ；ＩＬハｐｒ＋ド　？＆Ｉ２９シｔ％”７’ｆｉ、　ｔ　（μｇ／ｍ１） ＦＩＧ、　４ −　Ｎ　ω　Ａ　い 。　８　８　８　呂　８ 要約書 安定な非免疫原性ポリマーと、免疫原の特異的Ｂ細胞結合能力は有するがＴ細胞 エピトープを欠いている免疫原のアナログとの複合体であって、導入された場合 に、免疫原に対する液性アネルギーを誘導する複合体が開示されている。従って 、これらの複合体は、外来性または自己免疫原によって引き起こされる抗体媒介 性病態を治療するために有用である。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫原に対して特異的Ｂ細胞のアネルギーを誘導する組成物であって、非免 疫原性の生物学的に安定なポリマーと、（ａ）該免疫原が特異的に結合するＢ細 胞に特異的に結合し、および（ｂ）Ｔ細胞エピトープを欠く該免疫原のアナログ 、との複合体を含有する、組成物。
2. ２．前記免疫原が外来性の免疫原である、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記外来性の免疫原が、生物学的薬剤、アレルゲン、または独特な造影剤で ある、請求項２に記載の組成物。
4. ４．前記免疫原が自己免疫原である、請求項１に記載の組成物。
5. ５．前記自己免疫原が、甲状腺炎、糖尿病、発作、男性不妊症、重症筋無力症、 リウマチ熱、またはＲｈ溶血性疾患に関連するものである、請求項４に記載の組 成物。
6. ６．前記免疫原およびアナログが、同一の化学的分類に属する、請求項１に記載 の組成物。
7. ７．前記免疫原およびアナログがポリペプチドである、請求項６に記載の組成物 。
8. ８．前記免疫原およびアナログが、異なる化学上の分類に属する、請求項１に記 載の組成物。
9. ９．前記ポリマーが、Ｄ−リジンとＤ−グルタミン酸とのコポリマーである、請 求項１に記載の組成物。
10. １０．個体において免疫原に対する特異的なＢ細胞アネルギーを誘導する方法で あって、該個体に請求項１，２，３，４，５，６，７，８または９に記載の組成 物の有効量を投与することを包含する、方法。
11. １１．免疫原に応答して望ましくない抗体が産生される、抗体媒介性病態につい て、個体を治療する方法であって、請求項１，２，３，４，５，６，７，８また は９に記載の組成物の治療的な有効量を該個体に投与することを包含する、方法 。
12. １２．抗体媒介性の病態を治療するための、製薬的組成物であって、請求項１， ２，３，４，５，６，７，８または９に記載の複合体の治療的な有効量を、製薬 的に許容され得るキャリアーと組合わせて含有する、組成物。