JPH05508924A

JPH05508924A - エプスタイン―バーウイルス膜抗原に対する哺乳類の抗体応答の検出および／または定量用アッセー

Info

Publication number: JPH05508924A
Application number: JP91512605A
Authority: JP
Inventors: ダーダ，ポール・ジヨン; キーエフ，エリオツト・ダン; ピアソン，ゲアリー・リチヤード; レイビン，ハーベイ; サリバン，マーシア・デレイニー
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1990-06-29
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1993-12-09
Also published as: CN1059601A; WO1992000525A1; EP0536319A1; EP0536319B1; DE69128622D1; US5672471A; ATE161966T1; DE69128622T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エプスタイン−バーウィルス膜抗原に対する哺乳類の抗体応答の検出および／または定量用アッセー発明の分野本発明は、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）抗原に対する哺乳類の抗体応答を検出および／または定量する診断用アッセー、特にＥＢＶ膜抗原（ＭＡ）に対するヒトＩｇＡ抗体応答を検出および／または定量するアッセーに関する。

発明の背景ＥＢＶ（ヒトヘルペスウィルス）は、もっばらヒトに存在する。該ウィルスのポリペプチドに対する抗体は、米国のヒト血清サンプルの８０％を越えるものに存在し、アジアおよびアフリカの住民ではそれより多い割合で存在する。それは世界中に広がっているが、ＥＢＶ感染の結果はそれぞれの集団２間で異なっている。このウィルスは、西洋の国々の伝染性単核球症の原因であり、さらにアフリカのバーキッート（Ｂｕｒｋｉｔｔ’　ｓ）リンパ腫、アジアの上咽腔癌（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ、　ＮＰＣ）に関係する。ＮＰＣは中国南部における癌の主たるもので、年間の罹患率は１００／　１０００００もの高さである。

ＮＰＣにおけるＩｇＡレベルの上昇は、ＥＢＶ特異抗体によるものであるという可能性がＨｅｎ１ｅらにより報告された（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　１７　：　１−７　（１９７６）　）。特に、間接免疫蛍光アッセー（ＩＦＡ）を用いて、ＮＰＣ患者におけるＥＢＶウィルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）およびＥＢＶ誘発初期抗原（ＥＡ）に対する血清ＩｇＡ抗体力価の上昇が報告された。このＩＦＡは、ＥＢＶ抗原に対するＩｇＡ抗体を検出するための標準的手法である。

Ｚｅｎｇら（ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、２．付録１、ｐｐＳ７−８１５（１９８６））　ｉｔ、ＥＢＶ　ＩｇＡ初期抗原（ＥＡ）抗体およびＩｇＡ　ＭＡ抗体は、ＩｇＡ　ＶＣＡ抗体よりもＮＰＣにはより特異的であることを報告した。ＥＢＶ　ＭＡに対するＩｇＡおよびＩｇＧ抗体が、ＮＰＣ患者血清でＩＦＡを用いて検出された。また、このグループは、ｖＣＡに対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体検出用に開発した酵素免疫アッセーについても報告したが、これはＮＰＣについての個々人のリスクを知るために、一般住民をスクリーニングするために中国で広く用いられてきた。

典型的には、ＥＢＶ抗原を検出するために用いられてきたＩＦＡおよび酵素結合免疫吸着アッセー（ＥＬＩＳＡ）は、未変成抗原、すなわ・ちＥＢＶ感染全固定細胞としてウィルス感染細胞融解物またはウィルス感染細胞からのアフィニティー精製抗原のいずれかを用いる。Ｈａｌｐｒｉｎら（Ａｎｎａｌｓｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０４：３３１−３３７　（１９８６））は、細菌で合成したＥＢＶ核抗原および初期抗原に対する、伝染性単核球症およびＮＰＣの患者のＩｇＧ抗体の力価を測定するためのＥＬＩＳＡの抗体を報告した。

Ｌｕｋａら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、６７　：　１４５−１５６（１９８４））は、主なＥＢＶ関連抗原のために開発した、ＶＣＡ。

ＥＡ、　ＭＡおよび膜抗原（ＥＢＮＡ）の精製蛋白成分を基にしたＥＬＩＳＡを報告した。ＥＢＮＡを除いて、これらの抗原は、単クローン性（モノクローナル）抗体を含むイムノアフィニティーカラムで精製された。

Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｈｕｍａｎ　Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｌｏｐｅｚ　＆Ｒｏｉｚｍａｎ編、ｐｐ２１１−２２０（１９８６））は、新しいＥＢＶ診断用アッセーの開発におけるモノクローナル抗体の価値を記載している。

Ｕｅｎら（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、４１　：　４７９−４８２（１９８ｇ））は、精製ＥＢＶポリペプチドに対するＩｇＡ抗体検出用３段階ＥＬＩＳＡを報告している。これは、主なりＣ＾（ｇｐ１２５）およびＭＡ複合体（ｇｐ２５０／　２００）に対する抗体を測定するために用いられた。

米国特許第４７０７３５８号（１９８７年１１月１７日、Ｋｉｅｆｆらに交付）および欧州特許出願公告公報第１５１０７９号（１９８５年８月７日公告）は、免疫原性防御蛋白ｇｐ３５０およびｇｐ２２０をコードするＥＢＶ　ＯＮ＾の同定を開示している。

Ｊａｍｅｓら（ＣＩｉｎ、１ｌｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、３　：　１３２−１５２（１９９０年４月））は、ＥＢＶ抗原に対する全抗体、ＩｇＧまたはｒｇＭ抗体を検出するための市販のいくつかのアッセーをいろいろ報告している。

Ｈｕｍｍｅｌら（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　、４９　：　４１３−４１７（１９８４））は、二ツノ主すＥＢｖ膜糖蛋白（ｇｐ３５０／３００）をコードする遺伝子を、ウィルスゲノムの５キロベースフラグメント（ＢａｍｔｌＩ−Ｌ）についてマツピングした。Ｂｅ１ｓｅｌら（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、５４　：　６６５−６７４（１９８７））は、二つの主な外側エンベロープ糖蛋白は、この同じ遺伝子によってコードされることをつきとめた。Ｔｈａｎｇら（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６１（６）　：　１７９６−１８０７（１９８７年６月））は、誓歯類および霊長類細胞におけるＥＢＶ　ｇｐ３５０／　２２０遺伝子の発現について記載している。

ラットの下垂体細胞（ＧＨ３株細胞）にｇｐ３５０／２２０遺伝子をトランスフェクションし、端が切り取られたｇｐ３５０／　２２０（トランスメンブレンアンカー領域を欠いている）を培養上清に大量に分泌するクローンを樹立したことが記載されている。

発明の概要本発明は、ＥＢＶ　ＭＡに対する哺乳類の抗体応答の検出および／または定量用アッセーに関するものであって、以下の段階を含む：（ａ）固定ＥＢＶ−ＭＡとＥＢＶ−Ｍ＾抗体を含むであろうと思われるサンプルをインキュベートする；（ｂ）段階（ａ）の生成物を、ＥＢＶ−ＭＡに特異的な哺乳類抗体と結合することができる検出試薬と反応させることによって、段階（ａ）の生成物を検出および／または定量する。

図面の簡単な説明図１は、患者血清の抗ＥＢＶ−ＭＡ力価のＥＬＩＳＡとＩＦＡとの比較を示すグラフである。

図２は、ＩＦＡで陰性とされ、本発明のアッセーでは１：４０の力価で弱い陽性と判明したサンプルについてのブロック実験を示すグラフである。

図３は、ＩＦＡで陰性とされ、本発明のアッセーでは１：４０の力価で弱い陽性と判明したサンプルについてのブロック実験を示すグラフである。

図４は、ＩＦＡで陰性とされ、本発明のアッセーでは１：４０の力価で弱い陽性と判明したサンプルについてのブロック実験を示すグラフである。

図５は、ＩＦＡで陰性とされ、本発明のアッセーでは１：４０の力価で弱い陽性と判明したサンプルについてのブロック実験を示すグラフである。

図６は、ＩＦＡで陰性とされ、本発明のアッセーでは１：４０の力価で弱い陽性と判明したサンプルについてのブロック実験を示すグラフである。

図７は、ＩＦＡで陰性とされ、本発明のアッセーでは１：４０の力価で弱い陽性と判明したサンプルについてのブロック実験を示すグラフである。

、発明の詳述ＥＢＶは脂質および４つの主なウィルス特異的蛋白（ｇｐ３５０／３００．　ｇｐ２２０／２００．　ｐ１４０およびｇｐ８５）から成る膜によって覆われている。本発明のアッセーに用いることができ！　、ｍ　（７）ＥＢＶ膜抗原は、ｇｐ３５０／３００．　ｇｐ３５０／２２０．　ｇｐ２２０／２００．　ｇｐ２５０／２００．　ｇｐ３５０／２２０．　ｇｐ３５０．　ｇｐ３４０．　ｇｐ３２０またはｇｐ２２０のように様々に呼称されてきた。これらの用語は本明細書中では互いに取り替えて用いられる。

鎖ＤＮＡフラグメントが、ｇｐ３５０／３００およびｇｐ２２０／２００に翻訳されるメツセージをコードすることを示した。ｇｐ２２０／　２００の場合は、このメツセージの一部はスプライシングにより除去される。これらの蛋白は、ウィルス感染に対する哺乳類の免疫能、特にウィルス感染に対するヒトの免疫能のアッセーのために重要なウィルス抗原である。本発明のアッセーは、ｇｐ３５０／　３００に対する哺乳類の抗体応答の検出および／または定量に用いることができる。このアッセーは、ＥＢＶ感染の検出または上咽腔癌発症の可能性が疑われる個々人のスクリーニングに用いることができる。同様なアッセーを他のＥＢＶ−１１Ａ、例えばｐ１４０およびｇｐ８５に対する哺乳類抗体応答の検出にも用いることができると考えられる。本発明のアッセーは以下の段階から成る：（ａ　）　Ｅ　Ｂ　Ｖ　／　Ｍ　Ａ抗体を含むと思われるサンプルを、固定ＥＢＶ−ＭＡトインキュベートす６　；　（ｂ）ＥＢＶ−ＭＡニ特特約的哺乳類の抗体と結合することができる検出試薬で、段階（ａ）の生成物を検出および／または定量する。

いずれの免疫グロブリン（例えばＩｇＡ、　ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ）も、ここに開示するアッセーを用いて検出または定量できる。好ましい具体例では、検出および／または定量されるのは、ヒ）ＩｇＡ応答である。

未変成抗原である、いずれのＥＢＶ−ＭＡも、ＥＢＶ感染固定全細胞、ウィルス感染細胞ライセード、ウィルス感染細胞ライセードからアフィニティー精製した抗原、合成抗原、遺伝子組み換えによる抗原またはＥＢＶ−ＭＡのポリペプチドのようないずれも、当業者にとって良く知られた手技で、適切な支持体の表面に固定化することができる。

本発明を実施するための好ましいＥＢＶ−ＭＡは、哺乳類細胞の発現系を含むＧＨ３Δ１９細胞によって分泌される遺伝子組み換え蛋白（ｇｐ３５０／　２２０、末端欠如形）である。この組み換え蛋白の合成は、Ｗｈａｎｇら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１（６）　：１７９６−１８０７（１９８７年６月））により記載され、その内容は本明細書に文献として含まれている。

支持体はいろいろな種類の支持体のうちいずれでも良い。挙げられるものは、合成ポリマー支持体、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン（例えばアミン化またはカルボキシル化ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ポリアミド、塩化ポリビニルなど；ガラスピーズ、アガロースなどである。支持体は、ＥＢＶ−。

ＭＡを該支持体に直接結合させるために反応基を含んでいても良い。　・好ましい具体例では、支持体はポリスチレンの微量滴定プレートの穴から成る。

検出試薬は、ＥＢＶ−ＭＡに特異的な哺乳類の抗体と結合することができるものでなければならない。好ましくは、この検出試薬は、酵素、放射性同位元素、蛍光性、化学発光性または電気化学的物質でラベルされた抗−抗体である。より好ましくは、この抗−抗体は、抗−ヒト免疫グロブリンクラスの試薬である。さらにこの検出試薬は哺乳類の他の免疫グロブリンクラスと交差反応を起こすものであってはならない。

本発明のアッセーで標識として用いることができる酵素には、セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリゾチームであるが、これに限られるものではない。酵素標識は、特異的結合対の成分で抗体を標識するために下記に記載したように、ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、同種２官能基性架橋剤および異種２官能基性架橋剤を用いることによって促進される。選択される標識方法は、酵素上の利用できる官能基および標識される物質に依存する。いずれの慣用的な方法も抗体標識のために用いることができる。これには、ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅａｒｌｍａｎｎ　（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８．　８７１（１９７１））　、ＡＶｒａｌｌｅａＳおよびＴｅｒｎｙｎｃｋ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅａ＋１ｓ−ｔｒｙ　８．　１１７５（１９７１））　、Ｉｓｈｉｋａｗａら（Ｊ。

ＩｓｍｕｎｏａｓｓａＹ　４（３）　：　２０９−２３７（１９８３））およびＪａｂｌｏｎｓｋｉ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４８：　１９９（１９８５））により記載された方法が含まれる。標識は、間接法、例えばスペーサーまたは他の特異的結合対の成分を用いて行うことができる。

セイヨウワサビペルオキシダーゼが好ましい酵素標識である。

抗体は、免疫型または非免疫型の特異的結合対の成分で標識することもできる。

免疫型特異的結合対の例は、抗原−抗体系またはハプテン−抗ハブテン系である。蛍光物質／抗蛍光物質、ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、ビオチン／抗ビオチン、ペプチド／抗ペプチドなども挙げられる。特異的結合対の抗体成分は、当業者にとって既知の慣用的な方法で作ることができる。そのような方法には、特異的結合対の抗原成分で動物を免疫することが含まれる。特異的結合対の抗原成分に免疫原性がない場合、すなわちハプテンの場合は、免疫原性を付与するためにキャリアー蛋白を共有結合させることができる。

非免疫型結合対には、２つの成分が互いに本質的な親和性を有するが、抗体ではない系が含まれる。非免疫対の例はビオチンーストレプタビジン、内因子−ビタミンＢ１□、葉酸−葉酸塩結合蛋白などである。

いろいろの方法を、特異的結合対の成分と抗体を共有結合で標識するために利用することができる。特異的結合対の成分の性質、所望の結合タイプおよび種々の結合化学反応に対する抗体の抵抗性に基づいて、方法を選択する。ビオチンは、市販の活性誘導体を用いることにより、抗体に共有結合させても良い。これらのうちのい（つかは、蛋白のアミン団と結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイニミド；カルボジイミドカップリングを介して炭水化物部分、アルデヒドおよびカルボキシル基と結合するビオチンヒドラジド；並びにスルフヒドリル基と結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである。フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネートを用いて、蛋白のアミン団に結合させることができる。ジニトロフェニル基は、２．４−ジニトロベンゼンスルホネートまたは２，４−ジニトロフルオロベンゼンを用いて、蛋白のアミン団と結合させることができる。特異的結合対の成分と抗体結合させるために、ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、同種官能基架橋および異種２官能基架橋を含む、他の標準的な結合方法を用いることもできる。カルボジイミドカップリングは、一つの物質のカルボキシル基を他の物質のアミン団と結合させる効果的な方法である。カルボジイミドカップリングは、市販試薬１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いて促進させることができる。

２官能基性イミドエステルおよび２官能基性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、同種２官能基性架橋剤は市販さ・れており、一つの物質のアミン団を他の物質のアミン団とカップリングさせるために用いられる。

異種２官能基性架橋剤は、異なる官能基をもつ試薬である。もっとも普遍的な市販異種２官能基性架橋剤は、第一の官能基としてアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、第二の官能基としてスルフヒドリル反応基を有する。

最も普遍的なスルフヒドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジスルフィドおよび活性水素である。官能基の一つは、照射により種々の基と反応する、光活性化アリールニトレンでも良い。

シグナル検出を促進するために、抗体または特異的結合対の成分のいずれかを標識することができる。

本明細書中で用いられる抗体という用語は、多クローン性、単クローン性抗体、それらの免疫反応性フラグメントまたは抗体混合物を指す。免疫反応性フラグメントという用語は、抗体の結合領域を含む１つまたは複数のフラグメントを指す。そのようなフラグメントは、Ｆｃ部分を欠いたフラグメントとして定義されるＦａｂ型フラグメント（例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’　）　！フラグメント）でも良（、また、無傷の抗体のＨ鎖成分を連結しているＳ−Ｓ結合の還元的クリーベツジにより得られる、いわゆる“半分子”じｈａｌｈ−ａ＋ｏｌｅｃｕｌｅ”）フラグメントであって調製することができる。

本発明は、ＥＢＶ−ＭＡに対する哺乳類の抗体応答に対してより高い感度および特異性を有し、さらに従来用いられてきたＥＢＶ−ＭＡ　ＩＦＡよりもより客観的な別の方法を提供する。

以下は本発明の実施を詳述するものである。

実施例ＩＡ、遺伝子組ミ換えＥＢＶ−ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０の製造と精製トランスフェクションしたラット下垂体株細胞（ＧＨ３Δ１９）　（Ｅ、　Ｋｉｅｆｆ　（Ｂｒｉｇｈａｏ＋　ａｎｄ　Ｗｏｍｅｎ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ。

Ｈｏ５ｔｏｎ、ＭＡ）より分与、その作成についてはｆｈａｎｇらにより記載（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６１（６）　：　１７９６−１８０７（１９８７年６月）、この内容は上記のように本明細書に参考文献として含まれる）またはこの細胞株のクローンを、１５０ｃ■２の組織培養フラスコまたはローラーボトルで、ダルベツコ−改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｌｌｅｄｉｕｍ）、高濃度グルコース、１０％ＮｕＳｅｒｕｍ　（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）およびグルタミン中で維持しながら３７℃で７日間増殖させた。

Ｇ■３Δ１９細胞は大量の遺伝子組み換え蛋白ｇｐ３５０／２２０（ｒｋｌＡ）を、可溶性で末端が切り取られた形で分泌した。

これを以下に述べるように２段階精製法で培養上清から集めた。高水準の分泌細胞子孫クローンを同定しながら、この細胞株を周期的にクローニングおよび再クローニングすることが、この組み換え細胞上清に高収量のｒＭ＾を保証するために必要であった。なぜなら分泌蛋白量は継代数が増えるに・したがい減少するからである。細胞外ｒＭＡの産生はウェスタンブロッティングおよびハイブリドーマ細胞株（２Ｌ１０および８ＭＡ１７．３）　（Ｇ、　Ｐｅａｒｓｏｎ（Ｇｅｏｒｇｅ−ｔｏｗｎ　Ｕｎｉｖ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，）より分与）から得られたモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによってモニターした。

これらのモノクローナル抗体は当業者に良く知られた手技を用いて産生された。

下記のように改変したＫｅｎｎｅｔｔらのプロトコールを用いた（Ｑｕａｌｔｉｅｒｅら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７９　：　６１６−６２０（１９８２年１月）により記載されたように、Ｋｅｎｎｅｔｔら（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、１ｌｉｃｒｏｂｉｏｌ。

ｌｍ５ｕｎｏ１．　８１　：　７７−９１（１９７８））により記載。コノ内容は本明細書中に参考文献として含まれる。）。

バイブＩＪＦ−７細ｌｆｉ株２Ｌ１０ハ、ＥＢＶ−１１Ａ複合体（Ｄ　ｇｐ３５０／３００に対するようにしたものである。これは上記の方法にしたがって作成した。

この方法は、２匹のマウスをＰ３ＨＲ−１細胞株のウィルス陽性細胞で腹腔内免疫することを必要とする。第一回免疫は、フロイントの完全アジュバントで行い、第二回免疫は、３週間後にフロイントの不完全アジュバントで行った。最後の免疫は、２週間後に細胞だけで行った。

ハイブリドーマは、Ｋｅｎｎｅｔｔらのプロトコール（Ｃｕｒｒ。

Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｇ＋ｕｎｏ１．８１：　７７−９１（１９７８）　（上記の通りＱｕａｌｔｉｅｒｅらにより記載））にしたがって樹立した。

最後の免疫から３日後、肺臓を取り出した。肺細胞（１０”）細胞／菖ｌ）、を１０７のＭＳ−１ミエローマ細胞と混合し、この混合物を９００Ｘｇで５分間遠心沈殿させた。上清を捨て、細胞をＳ−〇メジウム（１リツトルにつき４．５ｇのグルコースおよび２００１菖のグルタミンを１０■１添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液）で１回洗浄した。その後全溶液を試験管から取り除き、ペレットを穏やかに０．２■１の３０％ポリエチレングリコール１５ＱＱ　（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ。

ＮＪ）に再浮遊させた。この細胞をポリエチレングリコールに８分曝し、この８分間中に９００Ｘｇで３分遠心沈殿した。この後、５１１１のＳ−Ｏメジウムを加え、細胞を９００Ｘｇで５分間再遠心沈殿した。それからベレットを３０ｍ１の５−２０メジウム（Ｓ−〇メジウムと２０％ウシ胎児血清および１０％ＮＣＴＣ１３５）中のＨＡＴ培地（０，１１麗ヒボキサンチン１０．４μＭチミジン）に、１−２　Ｘ　１０’細胞／ｍｌの濃度で再浮遊した。９６穴の微量滴定プレートの各穴に細胞を分注し、３日毎に■ＡＴ培地を供給した。目で見えるクローンを有する穴に印を付け、そのような穴の上清液をＥＢＶ誘発夏＾に対する抗体について調べた。

抗体の膜特異性を確めるために、Ｐ３ＨＲ−１およびＢ−９５−８株細胞のアセトン固定塗抹標本および生細胞を蛍光抗体法でスクリーニングした。未変成ｇｐ３５０との反応性は、イムノブロッティング、免疫沈降反応およびＬｕｋａらの記載したＥＬＩＳＡプロトコール（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｌｅｔｈｏｄｓ、　６７　：　１４５−１５６（１９８４））を用いて、精製ｇｐａ５ｏに対するＥＬＩＳＡにより確かめた。このモノクローナル抗体は糖除去ｇｐ３５０・とは反応せず、この抗体が当該糖蛋白の炭水化物部分に対応するものであるということが確かめられた。

８ＭＡ１７．３ハイブリド一マ細胞株は、Ｗｈａｎｇら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

６１（６）　：　１７９６−１８０７）が記載したようにＥ、ｃｏｌｉで発現されるｇｐ３５０ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株である。８ＭＡ１７．３は、ｇｐ３５０の一部分（ｇｐ３５０の蛋白部分のアミノ酸の３８−７９６番目までをコードする開放型読み枠をクローニング）をコードするＥＢＶ開放型読み枠を含むＥ、ｃｏｌｔから得られたβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白で２匹のマウス免疫することによって作成された。免疫方法は上記で述べた通りである。マウスは３度免疫された。第１回目の腹腔内（ｉｐ）注射はフロイントの完全アジュバントを用い、第２回目は３週間後にフロイントの不完全アジュバントを用いて実施した。第３回目の免疫は抗原単独から成り、第２回目の注射の２週間後に行った。最終免疫の３日後に肺臓を取り出し、ＭＳ−１マウスミ工ローマ細胞株で、上記のように融合させた。β−ガラクトシダーゼ融合蛋白と反応する抗体について、上記のようにＥＬＩＳＡでクローンをスクリーニングした。その後、ウィルス産生Ｐ３ＨＲ１およびＢ−９５−８細胞株のアセトン固定および生細胞で蛍光抗体法によって、陽性味をスクリーニングしてその抗体の膜特異性を確認した。未変成ｇｐ３５０との反応性は、イムノブロッティングおよび免疫沈降反応によって確かめた。

プールしたＧｆ１３Δ１９の上清のｒｌｌＡを精製するために２段階精製プロトコールを用いた。プールした上清を室温（ＲＴ）でレクチンアフィニティーカラム（ＲＣＡ−ＩＩ、リチンＡ鎖をアガロースビーズに固定、Ｅ−Ｙ　ｌａｂ、ＳａｎＭａｔｅｏ、ＣＡ）にロードし、続いてリン酸塩緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。抗原（ｒｋｌＡ）をＰＢＳ中の０．１Ｍラクトースで溶出した。ｒＭ＾の存在は、分画を９６穴のポリスチレン微量滴定プレート（ＮＵＮＣ，Ｄｅｒｖａｒｋ）をＰＢＳ中で被覆し、非特異的部位をアッセー緩衝液（ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で保護し、アッセー緩衝液中でＢＭ＾１７．３とインキュベートし、続いてアッセー緩衝液中でセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＧＡＭ　ＩｇＧ−ＨＲＰ、　ＴＡＧＯ，Ｂｕｒｌｉｎｇａ＋ｗｅ、　ＣＡ）とインキュベートして調べた。この酵素反応は、基質緩衝液（０，１５％ｔｌａｏｚを含む、０．００９Ｍクエン酸および０．０３Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４）中の０．２％０〜フエニレンジアミン（ＯＰＤ）で行った。顕著なｒＭＡ活性を含む分画をプールし、４℃で５０ｍ１ｌ　Ｔｒｉｓ−ＢＣＩ（ｐＨ８，０）に対して透析した。透析後、プールした分画を、室温でＴｒｉｓ−ＢＣＩ　（ｐＨ８，０）で平衡化した蛋白用高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）モノ〜Ｑイオン交換樹脂（ファルマシア、スエーデン）にロードした。抗原を溶出させるために、ＮａＣ１の濃度勾配（０，０−０，５Ｍ）を用いた。

この抗原は〜０．２Ｍで溶出する。ｒＭ＾濃度について上記のようにＥＬＩＳＡで分画を分析した。Ｂｌｌ＾１７．３のＥＬＩＳＡの他に、ピークの分画をＢｉ［Ａ１７．３を用いてウェスターンブロッティングでも調べた。ピーク分画について、ＥＢＶ抗体陽性血清および陰性コントロール血清をＥＬＩＳＡおよびウェスターンブロッティングで調べ、どの分画が抗原プールを含むかを決定した。

Ｂ、ＥＢＶ−ＭＡ７ツセーＥＢ　ＶＭ＾に対する血清ＩｇＡ抗体価を調べるために間接ＥＬＩＳ＾を用いた。上記に記載したように作成した精製ｒＭ＾で９６穴ポリスチレン微量滴定プレート（ＮＵＮＣ）を、１穴当たり５０μｌの容量でＰＢＳ中で４℃、１晩被覆した。各調製物の抗原濃度は様々であったので、プレート被覆のための至適濃度を、ＥＢＶ抗体陽性血清および陰性のコントロール血清を用いて、　ｒｌｌＡ力価によって予めめた。この被覆プレートをＰＢＳで３度洗浄し、非特異的結合部位をブロック用緩衝液（ＰＢＳ中に１０％β−ラクトースおよび２％ＢＳ＾）で２時間室温でブロックした。このブロック用緩衝液を除去し、プレートを乾燥させ４℃で保存またはアッセーに使用するためにはＰＢＳで１度洗浄した。

血清サンプルをポリプロピレン試験管でサンプル緩衝液（ＰＢＳ中に１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、１％ＢＳＡ、　０．０２％アジ化ナトリウム）で１：２０に希釈した。この１：２０に希釈したサンプルを、ｒＭＡ被覆プレートで１穴につき５０μｍの容量で、１：２０から１　：　１２８０まで２倍段階希釈し、サンプル緩衝液中で３７℃、１時間インキュベーションした。その後プレートを６回、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に０．０５％トゥイージー２０．０．１％クロロアセトアミド）で洗浄した。ｒＭＡ被覆プレートに結合する血清ＩｇＡを検出するために、セイヨウワサビ結合抗ヒトＩｇＡヤギ抗体（ＧＡＩＩ　ＩｇＡ−ｆ［ＲＰ、　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、　ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、　ＰＡ）をコンジュゲート希釈液（ＰＢＳ中に１０％ＮＧＳ、　１％ＢＳＡ、　０．０５％トゥイージー２０．０．１％クロロアセトアミド）でｌ：ａｏｏｏｏに希釈し、１穴につきＳｈｌづつ加え、さらにプレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄緩衝液で洗浄した。基質緩衝液中のＯＰＤ　（５０μｍ／穴）を用い、３７℃で１０分暗所で酵素反応を行い、さらに該反応を４．ＯＮの［１！５Ｏ４（５ｈｌ／穴）で停止させた。６５０ｎｍリファレンスフィルターを用いた４９０ｎｗ吸収を自動プレートリーダー（ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ）で測定した。各サンプルの抗体の力価を、０．３０．　Ｄ、吸収を示す最終希釈でめた。本アッセーの各プレートでの陰性コントロール血清（ＤｕＰｏｎｔ　ＥＢＶ　ＶＣＡ　ＥＬＩＳＡｓのＥＢＶ　ＶＣＡ陰性健常人ボランティア血清）の試験では、吸収は、１：２０希釈で＜　０．０４０．　Ｄ、であった。

本発明のアッセーを用いて、５２サンプル（Ｇ、　Ｐｅａｒｓｏｎより分与）についてＩｇＡ抗体価を測定した。これらの結果をＩＦＡで得られた結果と比較した（図１および表１）。

ＩＦＡで陰性とされた２５サンプルのうち１４サンプルが本発明のアッセーで弱い陽性であることが分かり、当該１４サンプルのうち８サンプルの力価は１：２０で、６サンプルの力価は１：４０であった。これは、ｒＭＡ　ＥＬＩＳＡの感度増強によるものである。これらサンプルはすべてＥＢＶ−Ｍ＾に対して高水準のＩｇＧ抗体を有していた。抗ヒトＩｇＡ　−１１ＲＰがＩｇＧ抗体と交差反応を起こさないことを確かめるために、一連のブロック実験を行った。図２から７は、ＥＬＩＳＡ力価が１：４０のＩＦＡ陰性サンプルにおけるブロック実験を示している。すべてのサンプルにおいて、高水準のＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧヤギ抗体で十分にブロックされた。ＩｇＡ抗体のタイトレージコンカーブは、ＩｇＧがブロックされた場合も顕著には変化しなかった。

２７のＩｇＡ／　ＩＦＡ陽性サンプルのうちただ１サンプルだけがｒＭＡ　ＥＬＩＳＡで陰性となった。このサンプルは、ＩｇＧ力価がＩＦＡで＞２５６０で、ＩｇＡ力価は３２０であった。非常に高いＩｇＧ抗体価により、ＩＦＡで用いた抗ヒトｒｇ＾試薬がＩｇＧ抗体と交差反応を起こしたとも考えられる。このサンプルをＶＣＡ　ＥＬＩＳＡプレート（ＤｕＰｏｎｔ）でテストしたとき、高ＩｇＧ力価（＞　１２８０）を示したが、同じプレートで上記の抗ヒトＩｇＡ試薬では力価は検出されなかった。他のＩｇクラス、特にＩｇＧとの顕著な交差反応性がないことを確認するために、ｒＭＡ　ＥＬＩＳＡで用いたＧＡＨＩｇＡ−ＨＲＰのタイトレージョンを行い、さらに広範囲なテストを実施した。

これらのデータは、本発明のアッセーで測定されるＩｇ＾特異反応は、ＥＢＶ感染および／または上咽腔癌検出に有効であることが示されたＩＦＡにより測定されるＩｇ＾特異反応と相関性があることを示している。したがって、本発明のアッセーは、ＥＢＶ感染の検出および／または上咽腔癌発症の危険性があると疑われる個々人のスクリーニングにもまた用いることができる。

表　１サンプル　ＩＧＡ／ＩＦＡ　ＩＧＡ／ＥＬＩＳＡ　サンプル　ＩＧ＾／ＩＦＡ　ＩＧ＾／ＥＬＩＳＡ１７　４０　＞１２８０　４３　−　−２３　６４０　＞１２８０　４９　３２０　１２８０２４　４０　１６０　ＧＰ−２２０２５４０１２８０ＩｇＡ陰性４／９０　−　２０２６　１６０　４０　ＩｇＡ陽性４／９０　１６０　１６０図ＩＩＦＡでの力価０１口、　４・ＯＨＭ　Ｏ，口、４ｕＮＩＪＯ，０，４＠０ＮＩＪＯ，０，４９ＯＮＩＪ０．０．４１０８Ｍ要　約　書本開示はＥＢＶ−１１＾に対する哺乳類の抗体応答の検出おおよび／または定量用アッセーに関するものである。

国際調査報告国際調査報告ＬＩＳ　９１０４１３７Ｓ＾　４９７４６

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＥＢＶ−ＭＡに対する哺乳類の抗体応答の検出および／または定量用アッセーであって：ａ）ＥＢＶ−ＭＡ抗体を含むと思われるサンプルを固定ＥＢＡ−ＭＡとインキュベートし、ｂ）工程ａ）の生成物を、ＥＢＶ−ＭＡに特異的な哺乳類の抗体と結合することができる検出試薬と反応させることによって、工程ａ）の生成物を検出および／または定量することから成る、検出および／または定量用アッセー。
２．固定ＥＢＶ−ＭＡが遺伝子和み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｆｏｒｍ）ＥＢＶ−ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０である、請求項１に記載のアッセー。
３．遺伝子組み換えＥＢＶ−ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０が哺乳類細胞発現系により分泌される、請求項２に記載のアッセー。
４．抗体がＩｇＡである、請求項１に記載のアッセー。
５．該哺乳類抗体応答がヒトの抗体応答である、請求項１に記載のアッセー。
６．検出試薬が標識抗−抗体である、請求項１に記載のアッセー。
７．検出試薬が酵素標識されている、請求項６に記載のアッセー。
８．酵素がセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼである、請求項７に記載のアッセー。
９．アッセーがＥＢＶ感染の検出、または上咽腔癌発症の危険性があると疑われる個々人のスクリーニングに用いられる、請求項１に記載のアッセー。
１０．ＥＢＶ−ＭＡに対する哺乳類の抗体応答の検出および／または定量用アッセーであって：ａ）ＥＢＶ−ＭＡ抗体を含むと思われるサンプルを固定遺伝子組み換えＥＢＶ− ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０とインキュベートし、ｂ）工程ａ）の生成物を、ＥＢＶ−ＭＡに特異的な哺乳類の抗体と結合することができる検出試薬と反応させることによって、工程ａ）の生成物を検出および／または定量することから成る、検出および／または定量用アッセー。
１１．遺伝子組み換えＥＢＶ−ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０が哺乳類細胞発現系により分泌される、請求項１０に記載のアッセー。
１２．抗体がＩｇＡである、請求項１０に記載のアッセー。
１３．哺乳類抗体応答がヒトの抗体応答である、請求項１０に記載のアッセー。
１４．検出試薬が標識抗−抗体である、請求項１０に記載のアッセー。
１５．検出試薬が酵素標識されている、請求項１４に記載のアッセー。
１６．酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項１５に記載のアッセー。
１７．アッセーがＥＢＶ感染の検出、または上咽腔癌発症の危険性があると疑われる個々人のスクリーニングに用いられる、請求項１０に記載のアッセー。
１８．ＥＢＶ−ＭＡに対するヒトＩｇＡ抗体応答の検出および／または定量用アッセーであって：ａ）ＥＢＶ−ＭＡ抗体を含むと思われるサンプルを固定遺伝子組み換えＥＢＶ− ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０とインキュベートし、ｂ）工程ａ）の生成物を、ＥＢＶ−ＭＡに特異的なヒト抗体と結合することができる検出試薬と反応させることによって、工程ａ）の生成物を検出および／または定量することから成る、検出および／または定量用アッセー。
１９．検出試薬が標識抗−抗体である、請求項１８に記載のアッセー。
２０．検出試薬が酵素標識されている、請求項１９に記載のアッセー。
２１．酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項２０に記載のアッセー。
２２．遺伝子組み換えＥＢＶ−ＭＡ　ｇｐ３５０／２２０が哺乳類細胞発現系により分泌される、請求項１８に記載のアッセー。
２３．アッセーがＥＢＶ感染の検出、または上咽腔癌発症の危険性があると疑われる個々人のスクリーニングに用いられる、請求項１８に記載のアッセー。