JPH05508995A - 異種蛋白産生読ストレプトミセス・ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、請求項請求載の核酸配列でトランスフェクションされたストレプトミセス 細胞。

２１、請求項求肥７記載ＮＡベクターでトランスフェクションされたストレプト ミセス細胞。

２２　請求項１０記載のＤＮＡベクターでトランスフェクションされたストレプ トミセス細胞。

明細書 異種蛋白産生用ストレプトミセス・ベクター発明の分野 本発明は微生物における異種蛋白の産生に関する。さらに詳しくは、本発明は、 異種蛋白、特に、可溶性ＣＤ−４蛋白のストレプトミセスにおける発現用の核酸 配列および発現ベクターに関する。

発明の背景 ＨＩＶウィルス感染の主要な経路は該ウィルスのＣＤ４蛋白への付着を介して伝 達される。ＣＤ４　（Ｔ４とも称される）は主組織適合性複合体クラスＩＩ分子 と会合したＴ細胞表面糖蛋白である。しかし、ＣＤ４もＨＩＶ−１工ンベロープ 糖蛋白ｇｐ１２０の標的である。標的細胞上のＣＤ４にＨＩＶ−１ウイルスが一 旦結合すると、ウィルスＲＮＡは並置したウィルスと原形質膜の直接融合により 標的細胞に導入される［Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．５４：８６ ５−８７４（１９８８）］。

ＣＤ４のＤＮＡ配列は？−７ドンら［Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ 、　４２：９３−１０４（１９８５）］により開示されている。これより、成熟 ＣＤ４蛋白が４個に免疫グロブリン様ドメイン（Ｖｌ−Ｖ４）を含む細胞外領域 、トランスメンブラン・ドメインおよび約４０個のアミノ酸の帯電した細胞内領 域からなることが推論された（上記Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、参照）。

ｓＴ４のような、ＣＤ４の組換え体可溶性誘導体は、トランスメンプランおよび 細胞質ドメインが欠失されてもｇｐ１２０に結合する能力を保持する蛋白からな る。ｓＴ４はまたウィルス感染力およびＨＩＶ伝達融合細胞形成の両方を阻害す ることも示されている［Ｄｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８２ ８２−８４（１９８コ。この阻害がｓＴ４蛋白とＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ 蛋白の会合によって生じ、それゆえ、天然のＣＤ４蛋白と細胞表面で競合する。

ＣＤ４と可溶性ＣＤ４がウィルス感染力および細胞融合形成を阻害する機構は完 全には解明されていない。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、可溶性ＣＤ４のＨＩＶ−１ま たはＨＩＶ−２感染細胞への付加は他のウィルス蛋白の付随的増加なしにｇｐ１ ２０の放出を誘導すると見られる。これはＣＤ４がＨＩＶ−１の受動インヒビタ ーよりも能動インヒビターであることを意味している。

しかしながら、ｉｎ　ｖｉｖｏでは、ｓＴ４蛋白および同様な可溶性ＣＤ４蛋白 は血清から速やかに除去される。この速やかな除去は可溶性ＣＤ４のＨＩＶ作用 のインヒビターとしての臨床適用を著しく制限する。

血清クリアランス時間を延長するため、数種の可溶性ＣＤ４キメラが構築された 。トララネツカ−ら［Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ 　３３１：８４−８６（１９８８）］は、蛋白のカルボキシ末端部分がネズミ免 疫グロブリン軽鎮定常部からなるＣＤ４キメラ（ＶＩＶ２およびＶＩＶ２Ｖ３Ｖ ４）を開示している。トララネツカ−らは、さらにこれらの構築がミエローマ細 胞で発現されたことを開示している。

その後、トララネツカ−ら［Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３９：６８−７０（１９８９）］はネズミＩｇＭまたはＩ　ｇＧ２重鎖 定常部に融合したＣＤ４キメラ（ＶＩＶ２）を開示している。これらの構築がま た５量体を形成したことが開示されている。

シード（Ｓｅｅｄ、　１９８９年７月２６日発行のＥＰ−八−３２５，２６２） およびカポンら（Ｃａｐｏｎ　ｅｔａｌ、、１９８９年４月６日発行のＷＯ３９ １０２９２２）はヒトＩｇＧの重鎮および軽鎮定常部に融合したＣＤ４キメラを 開示している。シードおよびカポンらにより開示された蛋白はいずれも哺乳動物 系、すなわち、ＣＯＳ、ＢＨＫ　（仔／１ムスター腎臓）およびＣＨＯ細胞中で 発現された。その結果、開示されたＣＤ４キメラは他の発現系に比べて産生に軽 質がかかり、総合産生能力が制限されている。

本発明の１つの目的は産生コストを低減するためにＣＤ４キメラを細菌宿主系で 産生ずること、ならびに可溶性ＣＤ４に比べて血清半減期および／またはＨＩ■ 感染に対する効力の増加したＣＤ４を産生ずることである。

組換え体ＤＮＡ技術による蛋白産生において、宿主細胞により産生された蛋白の 一部または他の蛋白と融合させることは常套のことである。これらの余分な部分 は典型的には所望の蛋白の作用に加わらないが、その存在は所望の蛋白の折り畳 みまたはプロセッシングを妨害することがある。したがって、これらの影響を回 避または減するために天然の蛋白にできるだけ近い蛋白を産生できることが望ま しい。したがって、本発明のもう１つの目的は、ＣＤ４誘導体、キメラおよび他 の蛋白を、宿主系の蛋白から由来するアミノ酸を含まないか、純品の蛋白配列に 加えられている僅かのアミノ酸しか含まない細菌宿主系で産生ずることである。

本発明のさらにもう１つの目的はＣＤ４キメラおよび蛋白およびキメラを生じる 他の蛋白を産生ずるための、宿主系の蛋白から由来するアミノ酸を含まないか、 純品の蛋白配列に加えられている僅かのアミノ酸しか含まないベクターを提供す ることである。

発明の概要 本発明は、ストレプトミセス（ｓｔｒｅｍｐｔｏ＋ｗｙｃｅｓ）において、ＣＤ ４キメラ蛋白および他の異種蛋白の産生に有用な核酸配列およびＤＮＡベクター を提供するものである。本発明の核酸配列は、実質的に１〜約６個のアミノ酸を コードするアミノ酸配列からなるプロペプチド配列に作動的に結合したストレプ トミセス・ロンギスポルス（Ｓｔｒｅｍｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｌｏｎｇｉｓｐｏ ｒｕｓ）チロシン・インヒビター（ＬＴＩ）遺伝子のシグナルペプチドをコード する配列からなり、該アミノ酸の配列は、蛋白生成物の合成の間に該蛋白生成物 上に形成されたシグナルペプチドを除去するプロセッシング後、ストレプトミセ スにおける均質なアミノ末端を有する蛋白生成物が形成されるように選択されい る。本発明のもう１つ別の具体例においては、該プロペプチドが省略され、ＬＴ Ｉシグナルペプチドが、その３°末端にて１ｙｓ−ａｌａ−配列コードするよう に修飾された異種蛋白コード用の核酸配列に作動的に結他の態様において、本発 明は、本発明の核酸配列またはベクターで形質転換されたストレプトミセス細胞 および本発明の核酸配列を用いてストレプトミセスにおいて異種蛋白を産生させ る方法を提供するものである。

本発明は添付した請求の範囲にさらに詳しく指摘してあり、また、好ましい態様 を以下に記載する。

発明の詳細な記載 本発明は、ＣＤ４キメラ蛋白およびその他の異種蛋白をストレプトミセスにおい て産生ずるに有用な核酸配列およびＤＮＡベクターを提供するものである。本発 明の核酸配列は、実質的に１〜約６個のアミノ酸をコードするアミノ酸配列から なるプロペプチド配列に作動的に結合したストレプトミセス・ロンギスポルスチ ロシン・インヒビター（ＬＴＩ）遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列か らなり、該アミノ酸の配列は、蛋白生成物の合成の間に該蛋白生成物上に形成さ れたシグナルペプチドを除去するプロセッシング後、ストレプトミセスにおいて 均質なアミノ末端を有する蛋白生成物が形成されるように選択されいる。好まし くは、プロペプチドのアミノ酸配列はシグナルペプチドをコードする該核酸配列 の末端と該プロペプチド配列の始めの間の位置で蛋白生成物のプロセッシングを 起こすように選択されている。本発明の好ましい具体例においては、プロペプチ ドのアミノ酸配列はｔｈｒ−１ｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａ−ａｌａ−（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ：　１）またはｔｈｒ＝ｐｒｏ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−（ＳＥＱ　 Ｎｏ：　２）である。ただ１つのアミノ酸であり、蛋白生成物の良好な収率を与 えるので、プロペプチドｔｈｒ−がより好ましい。本発明のこれらの具体例にお いて、プロペプチドの核酸配列は、好ましくは、配列ＡＣＣ（ｔｈｒをコードす る）　、ＡＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３）　（ｔｈ ｒ−ｐｒｏ−ａｌａ−ａｌａ、　５ＥＱＩＤＮＯ＋１をコードする）またはＡＣ ＣＣＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＧＣＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４）　（ｔｈｒ− ｐｒｏ−ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ−１ＳＥＱ　ＩＩＩ　Ｎｏ：　２をコードする ）である。本発明の核酸配列は好ましくは、作動的に他のＤＮＡ配列と結合して 発現ベクターを形成し、これはついで異種蛋白の産生のため、ストレプトミセス に挿入できる。かくして形成された異種蛋白は該プロペプチドの配列からなる均 質なＮ−末端を有する。

本発明のもう１つの具体例においては、プロペプチドが省略され、ＬＴＩシグナ ルペプチドが、３゛末端において配列１ｙａ−ａｌａ−をコードするように修飾 された、異種蛋白をコードする核酸配列と作動的に結合している。該核酸配列は 好ましくは、作動的に池のＤＮＡ配列と結合して発現ベクターを形成し、これは ついで異種蛋白の産生のため、ストレプトミセスに挿入できる。本発明のこの具 体例においては、シグナル配列がシグナル配列の末端において異種蛋白から切断 されて、Ｎ−末端が１ｙａ−ａｌａ−Ｘ　（Ｘは異種蛋白の残余の部分である） を有する異種蛋白を形成する。本発明のこの具体例はＣＤ４誘導体およびキメラ 蛋白の産生に極めて有利である。

本出願人は、驚くべきことに、また、意外にも、ＣＤ４のＮ−末端に近い２位（ Ｖｌ領域中）で、ただ１つのアミノ酸を変えることにより、効率よく分泌され、 正しくプロセッシングされて全ＬＴＩシグナル配列が除去でき、しかも実質的に ｇｐ１２０結合能力を保持している異種蛋白が形成できることを見いだした。Ｃ Ｄ４誘導体またはキメラをコードする核酸配列を、そのアミノ末端で１ｙａ−ａ ｌａ−をコードするように変えることにより、ヒツジＬ３Ｔ４　（ＣＤ類似体） 受容体に類似するＮ−末端アミノ酸配列を含み、１ｙａ−ａｌａ−のＮ−末端を 有する生成物がコードされる。

この本発明の具体例をＣＤ４誘導体またはキメラ以外の異種蛋白の調製に使用し たい場合は、該異種蛋白をコードする核酸配列を、そのＮ−末端における２つの アミノ酸のコードする塩基を欠失させ、欠失した塩基の代わりに１ｙａ−ａｌａ −をコードする配列で置換するか、ＬＴＩシグナルペプチドをフードする配列の ３°末端に単に１ｙａ−ａｌａ−をコードする配列を付加することにより、その アミノ末端で１ｙａ−ａｌａ−をコードするように修飾できる。か（して、アミ ノ酸配列１ｙａ−ａｌａ−を有する修飾Ｎ−末端を有する異種蛋白をストレプト ミセス中で形成できる。

付加したアミノ酸の異種蛋白の機能に対する有害な影響の故に、本出願人は、異 種蛋白を融合蛋白として形成するときに問題とならないように、宿主系蛋白から 由来するアミノ酸が殆ど、あるいは全（ない天然蛋白（またはその一部）の配列 を有する異種蛋白を産生ずることを望んだ。本出願人は驚くべきことに、ＬＴＩ のプロペプチド遺伝子を欠失または修飾させることができ、はぼ純品（ａｕｔｈ ｅｎｔｉｃ）のＮ−末端を有する異種蛋白が形成でき、また、ストレプトミセス 宿主細胞から効率よく分泌されることを見いだした。

該シグナルペプチド切断部位周辺のアミノ酸配列がシグナルペプチドのプロセッ シングに劇的な影響を及ぼすことが明らかになった。プロセッシングおよび、そ の結果としての分泌および産生レベルに影響する少なくとも２つのパラメータが ある。切断部位周辺領域のアミノ酸の物理化学的性状および実効電荷である。

真核および原核種シグナルペプチドの統計的分析は、シグナルペプチド切断分析 周辺領域中の特定の残基における特定の群のアミノ酸に対する明確な選択性を示 しティる［ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４４：４３９ −４４６（１９８９）］。例えば、−３および一１位のアミノ酸残基は一般に小 さく、帯電していない。アラニンがこれらの位！における最も一般的なアミノ酸 である。また、−３および一１位はある種のアミノ酸群に対する明確な偏りを示 す。例えば、芳香族帯電疎水性残基およびプロリンは７８個の真核シグナルペプ チドにおける一１位には見いだされなかった。

成熟蛋白のアミン末端においては、＋１位にプロリンおよびグリシンは殆ど見ら れない。実験データおよび統計的分析共に、細菌シグナルペプチドの切断部位周 辺の領域には実効中性また負電荷が選択されることを明確に示している［Ｌｉ、 　ｅｔａｌ、）はイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のアルカリホスファターゼのア ミノ末端を実効電荷がＯから＋２に増加するように突然変異誘発すると、該アル カリホスファターゼの総産生が５０倍低下したことを示している。さらに、前駆 体を成熟生成物にプロセッシングするに要する時間が、野性型蛋白について予想 できなかったのに対し、実効電荷＋２の変異体では３０分に変化した。実効電荷 を＋１に減じると、この欠陥の厳しさは幾分減少された。上記、スマースら（Ｓ ｕｍｍｅｒｓｅ、　ｅｔ　ａｌ、　）はＢ−ラクタマーゼ・シグナルペプチドと ニワトリ筋肉トリオースホスフェート・イソメラーゼの間の種々のハイブリッド 蛋白について記載している。天然のトリオースホスフェート・イソメラーゼはイ ー・コリのペリプラズム中には分泌されない。しかし、このトリオースホスフェ ート・イソメラーゼの３位におけるアルギニン残基をプロリンまたはセリン残基 に変えると、この蛋白はべりプラズムに輸出できた。これらの観察は、切断部位 周辺における実効負電荷の明確な選択性を示しフォノ・ヘイエン（Ｗｏｎ　ｌ１ ｅｉｊｎｅ）の統計的分析に信頼性を与えている。

ＣＤ４　（Ｖ１領域中）の最初の２個のアミノ酸残基１ｙｓ−１ｙｓ−がｇｐ１ ２０結合活性に絶対に必要であることが判明した。純品のＮ−末端を有するＣＤ ４誘導体およびキメラ（例えば、ＫＫ−ＶＩＶ２）を提供する試みにおいて、Ｃ Ｄ４誘導体およびキメラが産生できなかったことが判明した。

ＣＤ４　ＶＩＶ２領域をＬＴＩシグナル配列と融合させる場合、得られる生成物 は少なくとも２つの形にプロセッシングされる。本出願人は驚くべきことに、ま た、意外にも、５つまでのアミノ酸を挿入することにより、陽性に帯電している リジン残基をシグナルペプチド切断部位から遠くに移動させると、均一なＮ−末 端を有するＣＤ４異種蛋白が培地に効率よく輸送され、しかもなおｇｐ１２０結 合能力を保持することを見いだした。さらに驚（べきことには、本出願人は、Ｃ Ｄ４分子の２位のリジンをアラニンに変えると、Ｎ−末端にリジンが存在するに もかかわらず、純品に近いＮ−末端を有する均一なＣＤ４蛋白が産生できること を見いだした。さらに、この異種蛋白も効率よく培地に分泌され、ｇｐ１２０結 合能を保持する。本発明の核酸配列およびベクターを用いて産生させた異種蛋白 は、均質なＮ−末端を有する。すなわち、生成物のＮ−末端が同じアミノ酸配列 を有し、幾つかの形の混合物として産生される異種蛋白よりも幾つかの利点を与 える。

所望の生成物を精製された形で得るために必要な分離工程が少ないので生産コス トが低い。異種蛋白の混合物よりも単一の生成物の方が統制認可にとって好まし い。加えて、蛋白生成物の天然の折り畳みおよび機能は宿主系蛋白から由来する アミノ酸がないことにより促進される。

他の具体例において、本発明は、プロモータおよび、実質的に１〜約６個のアミ ノ酸をコードするオリゴヌクレオチドからなるプロペプチド配列に作動的に結合 した、ストレプトミセス・ロンギスポルスのチロシン・インヒビター遺伝子のシ グナル配列をコードする核酸配列に作動的に結合した異種蛋白コード用配列から なるストレプトミセスにおける異種蛋白の発現用ＤＮＡベクターに向けられてい る。該アミノ酸の配列は、異種蛋白の合成の間、異種蛋白上に形成したシグナル ペプチドを除去するプロセッシング後、ストレプトミセスにおいて均質なアミノ 末端を有する異種蛋白が形成されるように選択されている。好ましくは、異種蛋 白をコードする配列はＨＩＶ　ｇｐ１２０結合領域である。

他の具体例において、本発明は、プロモータおよびストレプトミセス・ロンギス ポルスのトリプシン・インヒビター遺伝子シグナル配列に作動的に結合した異種 蛋白コード用配列からなるストレプトミセスにおける異種蛋白発現用ＤＮＡベク ターに向けられいる。該異種蛋白コード用の配列はその５′末端おいて１ｙｓ− ａｌａのアミノ酸配列をコードする塩基の付加、または５′末端における２つの アミノ酸をコードする塩基の欠失および欠失配列の１ｙｓ−ａｌａアミノ酸配列 配列コード用配列置換により修飾されている。好ましくは、異種蛋白のコード用 配列はＨＩＶｇｐ１２０結合領域をコードする配列である。

本発明のさらなる具体例は本発明のＤＮＡベクターの使用方法に向けられており 、本発明のベクターをストレプトミセス宿主細胞に導入し、適当な培地中で宿主 細胞を増殖させることからなる。

本発明のさらなる具体例は本発明の核酸配列またはＤＮＡ配列でトランスフェク ションしたストレプトミセス細胞に向けられている。

本明細書でｒＣＤ４Ｊと称するＣＤ４　Ｔリンパ球受容体蛋白はＨＩＶエンベロ ープ蛋白ｇｐ１２０と相互反応する表面糖蛋白である。この高い親和性相互反応 はｇｐ１２０とＣＤ４の細胞外ドメインの間で起こる。ＣＤ４の細胞外ドメイン は免疫グロブリンの可変部（Ｖ）領域を有する制限された相同性の４領域からな る。

ＣＤ４可変様領域（Ｖｌ−Ｖ４）の概略境界ドメインは、各々、アミノ酸１００ −１０９、アミノ酸１７５−１８４、アミノ酸２８９−２９８およびアミノ酸３ ６０−３６９である。かくして、本明細書で用いるｖｌはアミノ酸１−１８３　 （おおよそ）を称する。その他も同様。

ＣＤ４のトランスメンプランおよび原形質ドメインの除去は可溶性受容体蛋白を 生ずる。そのようなＣＤ４蛋白はヒトＣＤ４受容体の外部領域の全体または一部 からなり、ＨＩＶ−１感染およびウィルス誘発細胞融合を阻害することが示され ている［例えば、Ｄｅｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８２−８ ４（１９８８）参照］。本明細書で用いる「ＨＩＶ　ｇｐ１２０結合ドメイン」 なる語は、ＨＩｖｇｐ１２ｏと結合し、完全長のＣＤ４受容体蛋白と同等もしく は大きい親和性を有するいずれもの可溶性ヒトＣＤ４分子（すなわち、トランス メンブランおよび原形質ドメイン欠損）をいう。ＣＤ４のｇｐ１２０に対する結 合親和性はアルトスら［Ａｒｔｈｏｓ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｃｅ１ｌ　５７：４６９−４８１（１９８９）］の記載に従って分析できる。

本発明のＣＤ４分子はドメインｖ１に見られる最小ＨＩＶｇｐ１２０結合領域（ アミノ酸４ｌ−４５）からなる。好ましくは、ＣＤ４のＶ１■２ドメインまたは それと実賞的に同等の配列（すなわち、１５個以上のアミノ酸が異ならない）を 包含する。したがって、本発明の好ましくい具体例はヒト免疫グロブリンの定常 部と一緒になったＶＩＶ２である。

ＣＤ４のＤＮＡコーディング配列は？−／トンら［Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｃｅ１ｌ　４２：９３−１０４（１９８５）］に開示されており、本明細書 でも参照するが、ただし、ヒトＣＤ４の成熟アミノ末端はＬｙｓ−Ｌｙｓであり 、マツトンらが報告しているＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓではなイ［Ｌｉｔ ｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５５：５４１（１９８８）参照］、ＣＤ ４をコードするＤＮＡは種々の源から入手でき、例えば、プラスミドｐＴ４Ｂ　 （上記マツトンら）が挙げられる。別法として、ＣＤ４をコードするｃＤＮＡ分 子を公知の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて、ＣＤ４を発現する Ｔリンパ球のｍＲＮＡから誘導でき、あるいは標準的ＤＮＡ合成法で合成できる 。

以下に例示する蛋白に加えて、当業者は、さらなるＣＤ４誘導体をコードするＤ ＮＡ分子を容易に構築できる。例えば、アミノ酸付加、置換、欠失、転位（例、 ＶＩＶ３、ＶＩＶ４）およびこれらの化学的修飾を行うことは当業者に自明のこ とである。しかし、そのような誘導体はＨＩＶｇｐ１２０結合能を保持していな ければならない。

本発明のＣＤ４−１ｇキメラの固有の利点は可溶性ＣＤ４と比較してＨＩＶ感染 の抑制／不活性化の効果を増強させることである。これは、以下にさらに詳しく 記載するＦｃエフェクター機能の獲得を通じて達成することができる。

免疫グロブリンのＦｃ部に元来存在するエフェクター機能には、血清クリアラン ス時間の延長［Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　１０ ０：３７６−３８３（２９６ｇ）］　、蛋白Ａ結合［Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２０：２３６１−２３７０（１９８１）］　 、Ｆ　ｃ受容体結合［および抗原依存性細胞細胞毒性（ＡＤＣＣ）　、細胞毒性 Ｔ−細胞のＦｃ受容体への抗体結合によって伝達される］、補体結合（例、Ｃ１ ４結合）、二量体化［Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、＾ｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ　１：８７（１９８３）コおよび胎盤性移行［Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｌ 、　。

＾ｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４０：６ｌ−１３４（１９８７）コが包含される。

しかしながら、免疫グロブリン重鎮の部分を発現させる場合、エフェクター機能 の幾らかが減少し、あるいは除かれる。したがって、本発明の利点は、所望のエ フェクター機能が、それらの機能を伴うアミノ酸の付加により本発明の分子に与 え、戻すことができることである。例えば、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントの結 晶学的研究はヒンジ部とＣＨ３ドメインに二１体化が起こることを示している［ 例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ　ｅｔａｌ、、　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２０＋ ２３８１−２３７０（１９Ｕ）参照コ。したがって、該ヒンジ部またはＣＨ３ド メインからのアミノ酸を付加することにより、二量体化する能力のあるＩｇＧフ ラグメントを産生ずることができる。

さらに、上記したＦｃエフェクター機能はいずれもの適当な免疫グロブリン定常 部または同位体からも誘導できる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２．１ｇＧ３、Ｉ 　ｇＧ４、ＩｇＧＭ、ＩｇＧＡまたはＩｇＧＥ、好ましくはＩｇＧ１゜ヒトＩｇ Ｇ１は、補体およびＡＤＣＣによる殺伝達細胞に最も効率よいことが示されたの で好ましい［Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１６ ６：１３５１−１３６１（１９８７）］。ＩｇＧ１定常部は幾つかのドメイン、 ＣＨＩ、ヒンジ（ｈ）　、ＣＨ２およびＣＨ２からなる［Ｅｌｌｉｓｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｒ　１０：４０７１−７９（１９８１）］。

本発明の免疫グロブリン定常部は、可変部が欠失し、ＣＤ４またはそのＨＩＶｇ ｐ１２０結合フラグメントで置換されたヒト免疫グロブリン重鎮の全体または一 部を包含することができる。さらに、そのｇｐ１２０結合フラグメント。さらに 、ｇｐ１２０結合ドメインは直接的（すなわち、シグナルポリペプチドとして合 成または発現）あるいは間接的（すなわち、合成後に結合）に免疫グロブリンの 定常部に一緒にできる。

１つの具体例はＣＨ３ドメインの大部分（すなわち、少なくとも５１％）または 全てを欠くヒト免疫グロブリンＩｇＧ定常部である。好ましくは、免疫グロブリ ン定常部はＣＨ２ドメインの大部分または全てからなる。すなわち、ＣＨ２ドメ イン＋または一ヒンジ（ｈ）ｆＢである。好ましい具体例には−ＣＨ１ｈＣＨ２ 、−ｈＣＨ２または−ＣＨ２が包含される。しかし、本発明は単一の定常部ドメ インに限定するものではない。

本発明のもう１つの異体例は、少なくとも１つのドメインからなるアグリコシル 化されたヒト免疫グロブリン定常部である。好ましい具体例は、特に限定するも ノテハナイカ、−ＣＨ２ＣＨ３（ｊ（３、−ｈＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、 −ｈｃＨ２、−ＣＨ２および−ＣＨ３が包含される。最も好ましい具体例には、 特に限定するものではないが、−ｈＣＨ２および−ＣＨ２が包含される。好まし くは、この具体例の蛋白は細菌宿主中で産生される。より好ましくは、宿主細菌 はストレプトミセス属からのものである。

免疫グロブリンの重鎮または軽鎖定常部をコードするＤＮＡの調製方法は、例え ば、ロビンソンら（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７年５月７日公 開ＰＣ出願公開１０８７１０２６７１）によって教示されている。さらに、当業 者は、公知に方法（例、ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて、いずれかのＩｇＧ１ 発現細胞系、例えば、ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣより）からヒトＩｇＧ１配列をコ ードするＤＮＡ分子を調製できる。

別法として、該ＤＮＡ分子は標準的なりＮＡ合成法で合成できる。

本明細書に具体的に例示した蛋白に加え、当業者は、さらにＩｇ誘導体をコード するＤＮＡ分子を容易に構築できる。例えば、アミノ酸付加、置換、欠失、転位 およびそれらの化学的修飾である。他の例には、システィン残基の欠失の置換、 Ｆｃ受容体結合および／またはＣＩＱ結合を増加する突然変異誘発または他の免 疫グロブリン分子からのＦｃ領域の導入が包含される。そのような誘導体は以下 に記載するＦｃエフェクター機能の幾らかまたは全てを有する。

ＩｇＧのどの領域が発現されるかによって、生じたキメラ蛋白は、ヒトＩｇＧ。

プロティンＡ１補体（特に、ＣＩ　Ｑ）　、および免疫系の適当な細胞、例えば 、マクロファージのＦｃ受容体に対する抗体に結合できる。さらに、補体（およ び他のエフェクター機能）の結合は重鎮定常部上に単純に存在する該当配列より も他の因子に依存するようにみられる。というのも補体結合配列を含むヒトＩｇ Ｇの異なるサブクラスのものがそれらの補体結合能に差があるからである。

本発明の組換え体ＤＮＡ分子および核酸配列は、さらにＤＮＡ配列を含んでいて もよく、例えば、調節要素、１つ以上の選択マーカーおよび複製および維持機能 をコードする配列からなるベクターである。調節領域は典型的には本発明のコー ド配列から上流に見られるプロモータを含み、ＲＮＡポリメラーゼの結合および 転写開始において機能する。換言すれば、調節要素または領域は本発明の組換え 体ＤＮＡ分子に作動的に結合している。調節領域の選択は用いる宿主細胞によて 当業者が適宜行える。

選択マーカー系は、形質転換細胞に選択できる新しい表現型を与えるマーカー遺 伝子のような多くの公知のマーカー系のいずれでもよい。例えば、チオストレプ トン耐性リポソーム・メチラーゼ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ ｅ　２０：５１（１９ｇ２）およびネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼ （上記Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）のようなストレプトミセス薬剤耐性 遺伝子が包含される。

複製および維持機能をコードするＤＮＡ配列には、例えば、ストレプトミセスか らの誘導体、ｐｌＪ１０１誘導体［例えば、Ｋｅｉｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ ｏｌ　Ｇｅｎ　ｇｅｎｅｔν＋５：２３３（１９１１１２）参照コまたはストレ プトミセス５ＬＰＩ誘導ベクター［例えば、Ｂｉｂｂ　ｅｔａｌ、、　Ｍｏｌ　 Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１８４：２３０（１９８１）参照］が包含される。本発明 のベクターは遺伝子増幅を可能にするマーカーを含んでもよい。ストレプトミセ スにおける遺伝子コピー数を増幅するに用いるマーカーにはスペクチノマイシン 耐性用れる。

本発明はまた、本発明の組換え体ＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞にも関する 。そのような宿主細胞は適当な培地中で増殖でき、本発明の組換え体ＤＮＡ分子 によりコードされた蛋白を発現する。そのような宿主細胞は本発明の方法、すな わち所望の宿主細胞を本発明のプラスミドで形質転換することにより調製できる 。そのような形質転換は通常の形質転換法を利用することにより行える。好まし い宿主細胞なストレプトミセス属に属する。例えば、宿主には、限定しるもので はないが、ニス・リビダンス（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ）　、ニス・コエリカラ ー（Ｓ。

ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　、ニス・アルプス（８，３１ｂｕｓ）およびニスーｏ ンギスポルス（Ｓ。

１ｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）が包含される。好ましい具体例には、ニス・リビダン スおよびニス・ロンギスボルスが包含される。他の適当な宿生細胞には、限定す るものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母および他の細菌細胞（例、イ ー・コリ、サルモネラ、バチルス）が包含される。かくして、本発明およびその 生成物はいずれかの特定の宿主細胞に限定されるものではない。

ストレプトミセスにおける異種蛋白の発現には、種々のプロモータが利用できる 。例えば、ストレプトミセス・ガラクトース・オペロン−誘導プロモータ［Ｆｏ ｒｎｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８４：２１３０（１９８７）］、ニス・リビダンス・β−ガラクトン ダーゼ遺伝子構築プロモータ［Ｅｃｋｈａｒｄｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ　Ｂａ ｃｔｅｒｉ。

１１６９：４２４９（１９８７）；　Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＵＳＰ　４ ．７１７．６６６］、ｘス−ｏンギスポルス・トリプシン・インヒビター遺伝子 （１９８８年４月２０日公開ＥＰ−＾−２６４，１７５参照）またはエム・エチ ノスボルサ（Ｍ、　ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒｓａ）において報告されているような 一時的調節フプロモータ［Ｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 　１７０ニア１（１９８８）］が包含される。ストレプトミセスにおける転写終 了の領域は幾つかのストレプトミセス遺伝子の３′末端から誘導され、例えば、 ストレプトミセス・ガラクトース・オペロンの末端における終了シグナルまたは ニス・フラディアエ（Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ）ネオマイシン・ホスフォトランス フェラーゼ遺伝子の末端に見られるそれ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：５１９０（１９８３）コ が挙げられる。ストレプトミセスにおける蛋白輸出用の配列には、ニス・リビダ ンスＬＥＰ−１０遺伝子およびニス・ロンギスボルス・トリプシン・インヒビタ ー（ＬＴＩ）遺伝子から単離されたものが包含される（１９８８年４月２０日公 開ＥＰ−＾−２６４，１７５参照）。好ましくは、限定するものではないが、該 輸出またはシグナル配列はＬＴＩ遺伝子から由来するものである。

さらに好ましくは、シグナル配列は実施例に記載するごとく、修飾される（例、 付加、置換、欠失および／または転位）。

初期発現研究のため、実施例でさらに詳細に記載するＣＤ４−１ｇキメラＬＴＩ プレプロ配列に融合させた。この発現ベクターに対するストレプトミセスの複製 機能はＰＩＪＩＯＩの誘導体であるプラスミドｐ　Ｉ　Ｊ　３５１　［Ｋｅｉｓ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　。

本発明はまた、本発明の形質転換された宿主を適当な培地で培養し、蛋白を単離 することからなる本発明の組換体ＤＮＡ分子によりコードされた蛋白の産生方法 にも関する。「適当な培地」とは、該宿主が本発明のコーディング配列を回収可 能な量発現できる培地を意味する。用いる培地が宿生細胞に依存することは当業 者に自明である。かく産生された蛋白の単離は、好守しくは、宿主の培地から行 う。すなわち、本発明の蛋白は好ましくは培地中に輸出される。

本発明の蛋白（類）は標準的な方法で単離され、精製される。例えば、抽出、選 択沈澱、カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは 電気泳動が挙げられる。例えば、ＩｇＧキメラ蛋白は該キメラ蛋白を含有する溶 液を、融合蛋白のＦｃ部分に選択的に結合する固定化プロティンＡまたはＢを含 有するカラムに通すことにより精製できる。例えば、Ｒｅ１ｓ　ｅｔ　ａｌ、　 、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ１１３２：３０９８−３１０２（１９８４）参照。ついで 、キメラ蛋白はカオトロピック塩での処理またはｐＨ変化（例、０．３Ｍ酢酸） により溶出できる。別法として、本発明の蛋白は抗ＣＤ４抗体カラムまたは抗免 疫グロブリン抗体カラム上で精製できる。

本発明の蛋白および蛋白生成物はＨＩ　Ｖウィルス感染の処置に使用できる。予 防として、ＣＤ４−１ｇキメラが、エイズの危険性の高い固体またはＨＩＶに対 する抗体の存在によりＨＩＶに暴露されたのが示された固体に投与される。疾患 の初期またはその発病の前の有効量のキメラ蛋白の投与はＣＤ４°リンパ球の感 染を阻止するように作用する。治療として、ＣＤ４−１ｇキメラのＨＩＶ感染固 体への投与はウィルスの細胞外への蔓延を阻止する。

本発明のキメラ蛋白の投与量範囲はＨＩＶまたはＨＩＶ感染の症状を軽減する所 望の効果を生ずる範囲である。この投与量は、抗ＨＩＶ抗体の存在、培養可能な ウィルスの存在および患者血清における一２４抗体の存在によるようなＨＩＶ感 染が証明されている期間にわたって、融合細胞形成またはウィルスの流布による 二次感染の抑制または阻止する量を維持するように選択される。抗ＨＩＶ抗体の 存在は標準的なＥＬＩＳＡまたはウェスタン・アッセイ、例えば、抗ｇｐ−１２ ０、抗ｇＭ１、抗ｔａｔ、抗ｐ５５、抗ｐ１７抗体の使用によって測定できる。

投与量は、一般に、年令、感染の程度、反対表示（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａ ｔｉｏｎ）、もしあれば、例えば、免疫耐性によって変化する。投与量は０．０ １■ｇ／ｋｇ／日〜５０ａ＋ｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．０１〜１．　Ｑ　 ｍｇ／ｋｇ／日で変化できる。該キメラ分子は静脈内、腹腔内、筋肉内または皮 下に投与できる。非経口投与する場合、単回注射（例、ポーラス）または所定期 間にわたる段階潅流（ｇｒａｄｕａｌ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）によることができ る。

本発明の蛋白は他の薬剤と組み合わせて、例えば、リバース・トランスフェラ− ゼ、プロテアーゼまたはｔａｔのような他のＨＩＶ蛋白に対する薬剤と共同して 使用できる。ＨＩＶに対する有効な治療薬はウィルスの伝達と共に、感染の細胞 から細胞への伝達も防止しなければならない。該蛋白はまた他の抗ウィルス剤、 例えば、アジトチミド（ＡＺＴ）と組み合わせても使用できる。

本発明の蛋白はまたＣＤ４＋細胞相互反応の治療薬またはインヒビターとして作 用する天然、合成または組換体分子の同定用薬剤としても使用できる。例えば、 該蛋白は、ＣＤ４受容体表面ドメインの競合剤分析用のＥＬＩＳＡに基づく方法 により測定される蛋白相互反応のようなスクリーニング分析に使用できる。

可溶性ＣＤ４蛋白がＨＩ　Ｖ　ｅｎｖ　蛋白を発現する細胞と結合することを示 すｉｎ　ｖｉｔｒｏのデータに基づき、本発明の蛋白はまた、ｉｎ　ｖｉｖｏに おけるＨＩＶ感染細胞用の選択的標的決定分子（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｔａｒｇ ｅｔｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）としても使用できる。標的特異性担体蛋白とし て、ＣＤ４−Ｉｇ蛋白は、例えば、リポソーム処方のデリバリ−を含め、感染細 胞に対する細胞毒性剤のデリバリ−用担体蛋白として使用できる。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定 されるものではない。

実施例 遺伝子操作で用いる酵素は商業的入手源から手に入れ、実質的に販売者の指示に 従い使用した。特に断りのない限り、実質的にマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ）ら［モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９］によって記載されているごと くに行った。

実施例Ｉ　ＣＤ４−ＩｇＧキメラの調製組換えＤＮＡ操作を用い、種々のプラス ミドにおいて、ＣＤ４のｖ１ｖ２ドメインについての暗号配列にヒトのＨｉｎｇ ｅ−ＣＨ２またはＨｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を続け、これは種々の宿主細 胞で機能する。

ＶＩＶ２領域はアミノ酸１〜１８３を含有する［マツトン（Ｍａｄｄｏｎ）ら、 セルｉ　ｎ　ｇ　ｅ−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、各々、ＩｇＧ１アミノ酸９７〜２ ２８および９７−３３０よりなる［エリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）ら、エヌ・エイ ・アール（ＮＡＲ）。

（１９８９年９月６日に公開された）ＥＰ−Ａ−３３１，３５６に開示されてい る発現ベクター５Ｔ４１８４．ＤＨＦＲを修飾して、プラスミドＶＩＶ２１８３ ＤＨＦＲを得た　プラスミド５Ｔ４１８４．ＤＨＦＲをＥｃｏＲＩおよびＮｈｅ Ｉで切断し、ＣＤ４　ＤＮＡのヌクレオチド１〜６８２を含有する６８２塩基対 断片を単離した。この断片を、ＴＡＡ終始コドンが続＜ＣＤ４アミノ酸１７７〜 １８３をコードする合成リンカ−に結んだ。加えて、ＣＤ４配列のヌクレオチド ６９３（ＧからＡ）および６９６（ＣからＴ）を変化させることによって、合成 リンカ−はＨｉｎｄｌｌ［部位を生成した。これらのヌクレオチド変化はアミノ 酸配列を変更しない。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩに挟まれた得られた断片をもう １つの５Ｔ４１８４．ＤＨＦＲプラスミドのＥｃｏＲＩおよびＸｂａ１部位に結 んだ。

合成リンカ−の配列は実質的に以下の通りである。

得られたプラスミドＶＩＶ２１８３ＤＨＦＲは、マウスβ−グロビン・プロモー ター、ＤＨＦＲ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ領域およびアミノ酸１〜１８３について のＣＤ４暗号配列を含有する。ＶＩＶ２暗号領域の後で切断するＨｉｎｄｍでＶ ＩＶ２１８３ＤＨＦＲを実質的に直線化した。

次いで、Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２領域をコードするＢａｎ１Ｉ−Ａｖａ！断片（ヌク レオチド２９９〜６７７、エリソン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）ら、前掲）をヒトＩｇＧ １　ｃＤＮＡから単離した。（該Ｈｉｎｄ］Ｉ［部位はＰＣＲ突然変異誘発によ って導入した。）各断片を以下の合成リンカ−と共に異なるＶＩＶ２１８３ＤＨ ＰＲプラスミドのＨｉｎｄｎ［部位に結んだ。

１）ＨｉｎｄＩ［ｌ−Ｂａｎ１Ｉリンカ−＋ＶＩＶ２遺伝子の３′末端をＨｉｎ ｇｅＣＨ２またはＨｉｎｇｅ−ＣＨ２ＣＨ３の５°末端と結ぶためのもの。

５’　ＡＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＴにＧＡＧＣＣ］’コ１　八ＧＧＴＴＣＣＡＣＣ ５’ １ｉ）ＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩ［［リンカ−；停止コドンをＣＨ２暗号配列の後に 導入して、Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２断片の３°末端をＶＩＶ２配列の５゛末端を結合 するのに使用。

５’　ＣＣＧＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡ　）’コ’　ＣＴＣＡＴＣ入 ＣＴＧＡＣＧＴＣＴＴＣＧＡ　５’これらの構築体は、Ｈｉｎｄｍ結合における 非−ＣＤ４または非−１ｇＧ１アミノ酸残基の付加なくして、正しい解読枠を維 持するものであり、本明細書中では、各々、ＶＩＶ２−ｈｃＨ２ＤＨＦＲおよび １ｌ−ｈｃＨ２ｃＨ３ｃＯｓベクターＶＩＶ２−ｈｃＨ２ＤＨＦＩＪ：びＶＩＶ ２−ｈＣＨ２ＣＨ３ＤＨＦＲをＮｈｅＩで消化した。１８１７および２１４７ｂ ｐの断片を各々単離し、それはｖ２のカルボキシ末端、完全なＨｉｎｇｅ−ＣＨ ２またはＨｉｎｇｅ−ＣＨ２ＣＨ３暗号領域、ウシ・ポリＡ領域、マウスβ−グ ロビン・プロモーター、およびマウスＤＨＦＲ暗号領域の一部よりなる。

（後記する）ベクターＶＩＶ２１８３ＣＯＳ２はＲｏｕｓｅ肉腫ウィルスつＴＲ 。

ＳＶ４０初期プロモーター、ＶＩＶ２、ＳＶ４０ポリＡ初期領域、およびマウス ＤＨＦＲ暗号領域に作動可能に連結したマウスβ−グロビン・プロモーターを含 有する。ＶＩＶ２１８３ＣＯ８２をＮｈｅＩで消化すると、マウスＤＨＦＲ暗号 領域に対する■２のカルボキシ末端を含有する１７２３ｂｐ断片が取り出される 。

次イテ、ＶＩＶ２−ｈｃＨ２ＤＨＦＲおよびＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３ＤＨＦＲ からのＮｈｅｌ断片を、各々、ｖ２のカルボキシ末端およびＤＨＦＲ遺伝子を正 しい解読枠に保有するベクターＶＩＶ２１８３ＣＯ３２のＮｈｅＩ部位に結んだ 。

得られたベクターをＶＩＶ２−ｈｃＨ２ｃＯ３および１Ｖ２−ｈＣＨ２ＣＨ３Ｃ Ｏ８といい、これをＣＯ８細胞をトランスフェクトするのに使用した。

ＶＩＶ２１８３ＣＯ８の構築ニブ５スミＦＶＩＶ２１８３ＣＯ８２を得ルタメに 、プラスミドＶＩＶ２１８３ＤＨＦＲをＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌで消化した。

ＥｃｏＲＩ部位を満たし、ＶＩＶ２暗号領域よりなる７０７ｂｐ断片を単離した 。

この断片を、ＳｍａＩおよびＸｂａｌですでに切断してｓＴ４暗号領域を欠失し であるプラスミドＲｓｔ４ＣＯＳ２　（後記）に結んだ。得られたプラスミドは Ｖ１ｖ２１８３ｖｏＳ２であった。

Ｒｓ　ｔ４ＣＯＳ２の構築ニブラスミドＲｓｔ４ＣＯＳ２を得るために、プラス ミドｓ　ｔ４ＤＨＦＲ［マツトン（Ｍａｄｄｏｎ）ら、ＰＣＴ／ＷＯ３８１０１ ３０４，１９８８年２月２５日公開コをＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。

ＥｃｏＲ■部位を満たし、ＳＶ４０初期プロモーターを含有する３３８ｂｐ断片 を単離した。この断片を、ＢａｍＨＩですでに切断し、粘着末端を満たしである Ｒｓｔ４ＤＨＦＲ（後記参照）に結んだ。得られたプラスミドを向きについてス クリーニングし、ＳＶ４０初期プロモーターがＲＳＶ　ＬＴＲに対して反対の向 きであるものをプラスミドＲｓ　ｔ４ｃＯｓ２として選択した。

Ｒ３Ｔ４ＤＨＦＲの構築ニブラスミドＴＮＤ　［：ｌノルズ（Ｃｏｎｎｏｒｓ） ら、ディ・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、７　：　６５１〜６６１　（１９８８）］を ＢｇｌｌＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化した。Ｒｏｕｓｅ肉腫ウィルス（ＲＳＶ ）ＬＴＲを含有する６００ｂｐ断片を単離した。Ｈｉｎｄｍｒ粘看末端Ｊ、Ｓｍ ａＩ部位、ＥｃｏＲＩｒｑ着末端」よりなる商業的に入手可能なリンカ−［二ニ ー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ） 、ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、？サチューセツツ州コを用い、ＢｇｌｌＩおよ びＥｃｏＲＩで消化してＳＶ４０初期プロモーターを欠失しであるプラスミド５ Ｔ４ＤＨＦＲ（マツトン（Ｍａｄｄｏｎ）ら、前掲）にＲＨＶ　ＬＴＲ断片ベア ターＶＩＶ２−ｈｃＨ２ＤＨＦＲおよびＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３ＤＨＦＲをＡ ｆ　ＩＩ［［およびＸｂａｌで消化した。各々、■１の一部（はぼ７３アミノ酸 ）および完全なＨｉｎｇｅ−ＣＨ２またはＨｉｎｇｅ−ＣＨ２ＣＨ３暗号領域を 含有する７４６および１０４１ｂｐの断片を単離した。これらのＡｆｌＩＩ−Ｘ ｂａ■断片は、ＥＰ−Ｅ−３３１３５６（１９８９年９月６日公開）に開示され ているプラスミドＯｍｐＡＶＩＶ２のＡｆｌＩＩ−ＸｂａＩ断片を置き換えて、 ｖ１ｖ２−ｈＣＨ２また１ｔＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３Ｌ’ｆｔ’ＬかｉＪｉ合 した５ムダＰｔプロモーターおよびＯｍｐＡシグナル配列を含有するベクターが 得られた。イー・コリで機能する該ベクターをＯｍｐＡＶＩＶ２−ｈＣＨ２およ びＯｍｐＡＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３という。

ベク９−ＶＩＶ２−ｈｃＨＬ２ＤＨＦＲお、ｌ：びＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３Ｄ ＨＦＲをＡｆｌｌＩ［およびＸｂａｌで消化した。各々、Ｖｌの一部および完全 なＨｉｎｇｅ−ＣＨ２またはＨｉｎｇｅ−ＣＨ２ＣＨ３暗号領域を含有する７４ ６および１０４１ｂｐの断片を単離した。これらのＡｆｌＩ［［およびＸｂａｌ 断片はプラスミド１２Ｂ１のＡｆｌＩ［−ＸｂａＩ断片を！き換えた。プラスミ ド１２Ｂ１は、ストレブスミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ ｉｖｉｄａｎｓ）ロンギスポラス（ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）　トリプンン阻害 剤（ＬＴＩ）プロモーターおよびシグナル配列（１９８８年４月２０日に公開さ れたＥＰ−Ａ−２６４１７５参照）に作動可能に連結したＶＩＶ２、ならびにプ ラスミドｐＩＪ３５１　［ケイセルト（Ｋｅｉｓｅｒｔ）ら、モレキュラー・ア ンド・ジェネラル・ジェルティックス（］！ｏｎ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　 ）　１８５２２３（１９８２）］に見い出されるストレブスミセス複製機能を含 有する。得られたベクターをＶＩＶｌ−ｈＣＨ２ｓｔｒｅｐｔおよびＶＩＶ２− ｈＣＨ２ＣＨ３ｓｔｒｅｐｔといい、ＶＩＶ２−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２またはＶＩ Ｖ２−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２ＣＨ３に融合したまたは連結したＬＴＩシグナル配列 よりなる。これらのベクターをストレブスミセステ機能し、ＶＩＶ２−ｈｃＨ２ ＊たはＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３を培地に輸送するように設計する。

しかしながら、天然に存在するＬＴＩ蛋白はプレプロ蛋白として発現される。

すなわち、シグナル配列は分泌に際し切断され、プロ配列は細胞外で切断される 。

その結果、単離したＬＴＩ蛋白は異種アミノ末端を有し得る。ｖ１ｖ２−ｈｃＨ ２ｓｔｒｅｐｔおよびＶ　Ｉ　Ｖ　２−　ｈ　ＣＨ２ＣＨ３５ｔｒｅｐｔからの ＶＩＶ２−ｈＣＨ２またはＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３の発現は、各々、この奇形 ：すなわち、異種アミノ末端を有する蛋白を生じる。成熟蛋白、すなわちすべて のシグナル配列アミノ酸残基を欠く成熟蛋白に対するプロ蛋白の比率は培養条件 、例えば、ｐＨ１溶解酸素等の変化によってシフトし得る。

別法として、野生型ＬＴＩプレプロ配列、すなわち、シグナル配列＋プロペプチ ドを修飾して異種アミノ末端を有する蛋白を得た。野生型プレプロ配列は以下の アミノ酸を有する。

Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ|＾１ａ− Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−＾１ａ− Ｌｅｕ−＾１ａ−ｉ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ａｌａ−＾Pａ−Ｐｒｏ− ＾１ａ−３ｅｒ　；ここに、↓はシグナル配列とプロ蛋白との切断部位を表す。

１の構築体において、プロ蛋白配列を欠失し、Ｔｈｒ（Ｔ）で置き換えた。（成 熟ＣＤ４蛋白のアミノ末端はＫＫである）。従って、このキメラＣＤ４−免疫グ ロブリン蛋白のアミノ末端はＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　（ＴＫＫ）である。もう １つの構築体において、プロペプチド配列および成熟キメラ蛋白の最初の２個の アミノ酸を欠失し、Ｌｙｓ−ＡＩ　ａ（ＫＡ）で置き換えた。ＶＩＶ２−ｈＣＨ ２をコードするベクターを各々ＶＩＶ２−ｈＣＨ２−ＴＫＫおよびＶＩＶ２−ｈ ＣＨ２−ＫＡという。これらのベクターは、各々、Ｔｈ　ｒ−Ｌｙ　５−Ｌｙ　 ｓまたはＬｙｓ−Ａｌａの異種アミノ末端を有するＶＩＶ２−ｈＣＨ２蛋白をコ ードする。

ベクターＶＩＶ２−ｈＣＨ２−ＫＡの完全なヌクレオチド配列およびキメラ蛋白 ＶＩＶ２−ｈＣＨ２−ＫＡの対応するアミノ酸配列を以下に開示する。

１■刀工詰スαｆｆｉコニロー■エエ■ズコ刀コに＝スコλＣに０１４２５　Ｃ ；’Ｌ　ＧＩｔＧ　ＧＩＧ　ＧＣＧ１℃にＩｃ　ＱＣ’ＧＡ　ＧＣＣｒ　ＧＧ　 ＣＣＡＺＧ　ＴＴＣＡ−１：　ｉＷ　’？−Ｃ２６０）ＶａｌＶａｌＶａｌＡｓ ｐＶａｌＳａｔ）ＩｉｉＧｌｕＡｓｐＰｒｏＧｌｕＶｉｌＬｙｓＰｈｓ＾５ｎＴ ａｐＴｙ＋１４７６　ＧＩＧ　ＧＣＣＨ−ＧｒＧ　ＧＧ　Ｃ１℃ＯＩＴ　ＭＩ’ 　（Ｄ：　ＮＧ、’ＣＡ　Ｍ：；αＩ；　ＣＧ−ＧＳ　ＧＳ　０Ｓ２７７）Ｖｉ ｌ　＾ｓｐ　０１７　Ｖｉｌ　Ｇｌｕ　Ｖｉｌ　Ｈｉｓ　＾１ｎＡｌｌ　しｙｓ 　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　fｌｕ　Ｇ１ｎ Ｘ５７８　πコ０℃Ｎ四σｒ　Ａ！’Ｇ　ＧＧ　フＣＮＧπｚ　＜　Ｇ１℃πＩ ：　、”ｆ　ＡＩ’Ａα＝Ｃ℃αλ３１１）ＴａｐＬ＊ｕＡｓｎＧｌｙＬｙｓＧ ｌｕＴｙｒＬｙｉＣｙｓ’ＬｙｓＶｉｌＳｅｒＡｓｎＬｙｓ＾１ｘｕｕＰｒ。

３ｓ６ｏｃＷｒｌフ；Ｃにフーコ丁ａズズコ；りＣχＩｎＴＣＩ：にロエスズズ ココＡＣＧＴＩコ〔ゴー仄］：１ｐＣｒｒＣロＩフーコＸＩ■Q ｉｓ２０　αλ石【：工ＧＧ工匡フスｌ５ＣＸＳロαＣ刀＝コニωｚλ＝Ｔスχ ；ｃ＝ｃス６１８０■工χごに蔦Ｃλコ＝ゴーτすニアαコニ；町ｑ岸！お工σ ３ユＴ８６４０に式嘱にλ工Ｎへ＝Ｍロ＝ａｉ；Ｇα＝−Ｔロー＝コαロ＝にご ＝＝＝に＝αスｗｔｏｏ　ＮＣＡＭ入りＡαλ工圧フＣＯαコ＝Ｕπ釘ロπ仄２ 刀０ご）にλエコαスｆ１７ｍｍ丁（ン（７Ｂ；２（χコｒＧＡ：ロー＝ｃ℃に ＝α＝ｃｃｘズ３：為Ｃ【ズコ；、Ｗズｚｘｍ９４２ｏ　αｆｌ（Ａ ここに、シグナル配列はヌクレオチド６４８で始まり、ヌクレオチド７３１で終 わり：ｖ１はヌクレオチド７３２で始まり、ヌクレオチド１２８６で終わり、Ｈ ４ｎｇｅ領域はヌクレオチド１２８７で始まり、ヌクレオチド１３３１で終わり 、ＣＨ２は１３３２で始まり、暗号配列の端部まで続（。

ＶＩＶ２−ｈＣＨ２をエレクトロポレーションによってＣＨＯ細胞にトランスフ ェクトした。１５μｌのリン酸緩衝スクロース（ＰＢスクロース０２７２ｍＭス クロース、７ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，４，１ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　！、滅 菌濾過）に懸濁した１５μｇのＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＤＮＡを、１．　ＯＸ　１０ ’　ＣＨＯ細胞（０，８ｍ　ｌ　）と混合し、氷上、ジーン・パルサー・キュベ ツト（Ｇｅｎｅ　Ｐυ１ｓｅｒｃｕｖｅｔｔｅ）　（パイオーラッド（Ｂｉｏ− Ｒａｄ）　、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）　、カルフォルニア）中にて、 １５分間インキュベートした。次いで、このキュベツトをジーン・パルサー（バ イオ−ラッド（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ）　）の電極チャンバーに入れ、７００ボルト ／３μＦｄ（時定数＝０．７）のパルス１つを細胞に供給した。細胞を氷上に１ ０分間置き、次いで増殖培地（ＩＸＩＴＳ［インスリン、トランスフェリン、セ レニウム：コラボラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ）　、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）　、ＭＡコ、１×脂質［ギブ コ（Ｇｉｂｃｏ）　、グランド・アイランド（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）　、 ＮＹコを含む）で１０ｍ１に希釈した。次いで、細胞を９６穴マイクロタイター プレート上へ、３Ｘ１０ｓ細胞／ウエルで、合計５枚のプレートに撒いた。４８ 時間後、培地をＤＨＦＲ選択層選択択培地（すなわち、ヌクレオシド非含有増殖 培地）に変更した。

細胞を選択培地上で約４週間維持した。１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法 および抗ｓＴ４ポリクローナル抗体を用いてウェスタン・プロット分析を行った 。ＶＩＶ２−ｈＣＨ２遺伝子産物は、分子量約４０．　ＯＯＯダルトンにおける 単一の陽舞バンドによって同定された。陽性のウェルからの細胞を２４穴プレー トに移し、選択培地上でスケールアップが容易になるまで維持した。スケールア ップ用に、２つのクローン（３Ｆ８および２Ｆ６）を選択した。クローン３Ｆ８ は５０ｎＭのメトトレキセートを含む選択培地中で増幅させた。細胞を９６穴マ イクロタイタープレート上へ３Ｘ１０’細胞／ウエルで再び撒いた。増殖は、５ ０ｎＭのメトトレキセートレベルから開始し、標準的なプロトコルに従つて、増 殖が成功する毎に上昇させる必要があった。

同様に、ＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３ベクターをエレクトロポレーションによって ＣＨ○細胞にトランスフェクトした。細胞をヌクレオシド非含有培地上で増殖さ せ、抗ｓＴ４抗体を用いたウェスタン・プロット分析で異状のないウェルの上清 をスクリーニングすることによって、陽性のクローンを選択した。次いで、上清 の陽性クローンは、増加量のメトトレキセートを用いて増幅させた。

ＣＯ８細胞はＡＴＣＣ（ｏツクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）　、ＭＤ）から得て 、ＡＴＣＣの推奨プロトコルに従って増殖させた。次いで、細胞を、ＤＥＡＥ− デキストラン（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）　４００　ｇ／ｍ　１ およびクロロキン（シード（Ｓｅｅｄ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ ｃｉ）８４　：　３３６５−３３６９（１９８７））１００μＭを含むＤＭＥＭ 　（ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最小必須培地））ギブ：１（ＧＩＢＣＯ ）グランド・アイランド（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）　、ＮＹ中で、２．５％ Ｎｕ血清（コラポラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ）　、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）　、ＭＡ）中における１０ μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。３７℃で４時間インキュベー トした後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ　（リン酸緩衝食塩水）中の１０％ジメ チルスルホキシド２ｍｌで、２５゜にて３分間処理し、培地を除去し、ＤＭＥＭ で置換した。

ＶＩＶ２−ｈＣＨ２およびＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３（７）両方を発現させ、培 養培地中に移送させた。６ｍｍのディツシュ（約１０６細胞）中における標準的 なトランスフェクションでは、トランスフェクンヨン後７０時間で、２０μｇの ｖＩＶ２−ｈＣＨ２が培地に蓄積された。約０．４μｇの物質が核非含有の細胞 溶解産物中に存在した。比較として、数種類の哺乳類細胞中にて高レベルで発現 した溶解性ＣＤ４タンパク、すなわちｓＴ４の対応値は、上清中で２０μｇ１細 胞溶解産物中で１μｇであった。培地中のＶＩＶ２−ｈＣＨ２タンパクは、２つ の間隔の狭いフラグメントとして移動した。非還元条件下では、試料の約１０％ がダイマーとして移動するように見えたが、ＶＩＶ２−ｈＣＨ２は主として七ツ マ−として移動した。培地中のＶＩＶ２−ｈＣＨ２タンパクは、セファロース樹 脂に結合させたｇＰ１２０に結合した。

ＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３は、上記と同様にして分析した。このタンパクも同様 に、分泌産物として充分に発現され、培地中には２０〜２５μｇまで、細胞溶解 産物中には１〜２μｇまで蓄積された。培地中のタンパクは、還元条件下のＳＤ Ｓ／ＰＡＧＥによって、約５０ｋＤの単一フラグメントとして移動したが、細胞 溶解産物の試料は、約４０および５０ｋＤの２つの等価なバンドとして移動した 。非還元条件下では、ＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３は、主として、ダイマー形成に 相当する分子量を有する単一フラグメントとして移動した。このタンパクはセフ ァロースに結合させたｇｐ１２０に結合した。

０、２１６．７４７号、１９８７年４月１日付で公開）およびＡｒ１２０　（モ ット（Ｍｏｔｔ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ）８２　：　８ｇ −９２（１９８５））を、標準的す手順ヲ用いて、そｔＬぞれＯＰＭＡＶＩＶ２ −ｈｃＨ２およびＯｍｐＡＶ１ｖ２−ｈＣＨ２ＣＨ３でトランスフェクトした。

Ａ２５８株におけるｖ１ｖ２−ｈＣＨ２およびＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３の発現 は、培養培地の温度を３２℃〜４２℃に上昇させることによって行った（例えば 、ローゼンベルク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、メタボリッターエンザイモロジ− （Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ）工０１　：　１２３　（１９８３）を参照）。

ＡＲ１２０株におけるＶＩＶ２−ｈＣＨ２およびＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３の発 現は、ナリジクス酸（Ｎａｌ）を培養培地に添加することによって、以下のよう に行った（例えば、モット（Ｍｏｔｔ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ ｃｉ）　８２　：　８８−９２　（１９８５）を参照）。ＡＲ１２０の培養物を 、３７℃にて、０．４吸光度単位の光学密度（６５０ｎｍ）で増殖させたが、そ のとき、ナリジクス酸を最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように添加した。培養 物を、冥盪インキュベーター中、３７℃で約５時間維持し、その時点で、細胞を 遠心分離にかけ、続いて冷却して誘発を停止させた。

熱およびＮａｌの両方による誘発に対して、細胞ペレットおよび清澄化した培養 培地（すなわち、遠心分離にかけた培地）をＶＩＶ２−ｈＣＨ２およびｖ１ｖ２ −ｈＣＨ２ＣＨ３の発現について分析した。両方のキメラタンパクは充分に発現 されたが、はんのわずかな割合のＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３が培養培地中に検出 された（すなわち、移送された）。

ブチスミＦＶＩＶ２−ｈＣＨ２−ＴＫＫ、ＶＩＶ２−ｈＣ２ストレプトおよびＶ Ｉ　Ｖ　２−ｈ　Ｃ３ストレプトを、標準的な手順（ホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏ ｄ）ら、ジェネティック・マニュピレーション・オブ・ストレプトマイセス−ラ ボラトリ−・ノルビック（Ｎｏｒｖｉｃｈ）　、イングランド（１９８５））を 用いて、ニス・リビダに形質転換した。形質転換プレートに、チオストレプトン １００μｇ／ｍ＋を含む寒天（０，４％）を重ねることによって、形質転換体を 選択した。次いで、関心のあるタンパクを発現するコロニーを、チオストレプト ン５μｇ／ｍｌを補足したトリブチカーゼ・ソイ・ブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓ ｅ　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ）培地中で増殖させた。キメラタンパクはすべて培養培 地中に分泌されたが、ＶＩＶ２−ｈＣＨ２構築物はＶＩＶ２−ｂＣＨ２ＣＨ３構 築物より高レベルで発現された。ＶＩＶ２−ｈＣＨ２−ＫＡは約１４ｍｇ／Ｌで 発現された。

実施例３　ＣＤ４−１ｇＧキメラの特性決定Ａ）サブユニット構造。

天然分子形の分泌ＶＩＶ２−ｈＣＨ２−ＫＡおよびＶＩＶ２−ｈＣＨ２ＣＨ３は 、非還元条件下における１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動 によって分析した。タンパクのバンドは、ウェスタン・プロット分析によって同 定されたが、結果を表Ｉに示す。

Ｂ）抗体の認識： 本発明によって製造されたキメラタンパクはすべて、抗ＣＤ４抗体（ディーン（ Ｄ　ｅｅｎ　）ら、ネイチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）、３３１：８２−８４（１９８ ８））および抗ヒトＩｇＧＦｃレセプター抗体（カッペル（Ｃａｐｐｅｌ）　、 ？ルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）　、ＰＡ、）によって認識される。表Ｉを参照。

Ｃ）　ｇｐ１２０結合： ニス・リビダンス（Ｓ　、　１ｉｖｉｄａｎｓ）　、ＣＯＯＳおよびＣＨＯ細胞 中で製造されたキメラタンパクはすべて、アルドース（Ａｒｔｈｏｏｓ）ら（セ ル（Ｃｅｌｌ）　、５７　：　４６９　（１９８９））に記載の免疫沈降分析、 あるいは以下に述べるセファロースに固定されたｇｐ１２０への結合のいずれか によって、ｇｐ１２０結合を示した（表工を参照）： 試料を沈降（ｐｐｔ）緩衝液（０，５％乾燥乳および０．１％ＮＰ４０を含有す るリン酸緩衝食塩水）で全容量３００μＩに希釈する。ｇｐ１２０セファロース ビーズ（１００μｍ、上記）の５０％スラリーを希釈試料に添加し、４℃で６０ 分間インキュベートした。試料を微小遠心管中で回転させ（３０秒）、キメラタ ンパク／ｇｐ−１２０セファロース複合体を沈降させた。複合体を４００μｍの ｐｐｔ緩衝液で５回、水冷リン酸緩衝食塩水で１回洗浄した。複合体を再び回転 によって沈降させ、６０μｌの装填用緩衝液（ラミムリ（Ｌａｅｍｉｌｉ）　、 ネイチャ（Ｎａｒ巴荏）、λ旦ヱ：　６８０　（１９７０））中に再懸濁し、５ 分間沸騰させ、１５％ポリアクリルアミドゲル上に装填し、次いでウェスタン・ プロット分析を行った。イー・コリ（Ｅ、ｃｏ■）中で発現したキメラタンパク は、ｇｐ１２０結合について試験しなかった。

ｇｐ１２０は自家源から得た。それはまた、例えば、アメリカン・バイオテクノ ロジー、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）　、ＭＡから市販されている。セ ファロース・ビーズは以下のように調製した＝１．０リツトルのセファロースＣ １−６Ｂ　（７アーマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、ビスキャラタウエイ（ＰｉｓｃａｔａｗａＹ） 　、Ｎ　Ｊ　）を、Ｑ、５Ｎ　ＮａＯＨ／３０％テトラヒドロフランの塩基溶液 中のエビブロモヒドリン５２．５ｍｌと、４０℃で４時間反応させた。活性化セ ファ０−スを濾過によって焼結ガラス漏斗上に集め、３０％ＴＨＦで充分に洗浄 して、未反応のエビブロモヒドリンを除去した。洗浄液が中性になるまで、生成 物をさらに水で洗浄した。次いで、このゲルを、室温で、エチレンジアミン（５ ０ｍ　ｌ　）と−晩再懸濁した。ゲルを濾過し、０．１Ｍ酢酸、続いて水で洗浄 することによりて、未反応のエチレンジアミンを除去した。ゲルを１．０リツト ルの水に再懸濁し、次いでｐＨ６，０で無水コハク酸（２５ｇ）と反応させた。

洗浄液が中性であることがわかるまで、１．０リツトルの炭酸ナトリウム溶液（ ０，２Ｍ）　、続いて水でゲルをさらに洗浄した。最終的に、このゲルをイソプ ロピルアルコールで洗浄し、さらに含湿粉末として使用するために、４℃で保存 した。

Ｄ）　タンパクＡおよびタンパクＧの結合・ニス・リビダンス（Ｓ　、　１ｉｖ ｉｄａｎｓ）およびＣＱＳ細胞中で発現されたＶＩＶ２−ｈＣＨ２キメラタンパ クは、タンパクＡまたはタンパクＧに結合しない。対照的に、ニス・リビダンス （Ｓ　、　１ｉｖｉｄａｎｓ）およびＣＯ８細胞中で発現されたｖ１ｖ２−ｈＣ Ｈ２ＣＨ３キメラタンパクは、タンパクＡおよびＧの両方に対して、親和度は異 なるが、結合親和性を示す。ストレプトマイセス中で産生されたｖ１ｖ２−ｈｃ Ｈ２ｃＨ３は、ｃｏｓｍｍ中Ｔｌｌ生さｔしたＶＩＶ２−ｈｃＨ２ｃＨ３１：Ｊ ｔべて、タンパクＡおよびＧに対する親和性が低い。結果を表工にまとめて示す 。

表１．ＣＤ４／ＩｇＧキメラ蛋白賃の特性サブユニット　抗体　認識　ｇｐ１２ ０　蛋白質Ａ＆ＶＩＶ２−ｈｃ］１１２ｓ、　モノマー　＋＋十−リビダンス ｖＩＶ２−ｈＣＨ２Ｃｏｓ　（−／７−　＋　＋　＋　−およびダイマー １１１Ｖ２−Ｓ　リビダンス　モノマー　＋＋＋＋ｈＣＨ２Ｃ）＋３　（弱い） ＶＩＶ２−ＣＯＳ　ダイ７−　十　＋　＋　＋ｈｃ１１２ｃＥ１３ 実施例４−ｍ合プラスミＦＴＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡ−ＡＡ−ＶＩＶ２ＡＮＤ およびＫＡ−ＶＩＶ２（７）構築 融合プラスミドのＴＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡＡ−ＶＩＶ ２およびＫＡ−ＶＩＶ２を、プラスミド１２Ｂ１より以下のように構築した。

プラスミド１２Ｂ１の構築、プラスミド１２Ｂ１は、ストレプトミセス・ロンギ スポラス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）のトリプ シン抑制剤（ＬＴＩ）プロモーターおよびシグナル配列に機能的に連結したＶＩ Ｖ２　（１９８８年４月２０日付けのＥＰ−Ａ−２６４，１７５参照）、ならび にプラスミドｐｌＪ３５１に見られるようなストレプトミセス複製機能を有する （カイザー（Ｋｅｉｓｅｒ）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・シネティ ックス（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ）　１８５　：２２３　（１９８２）＞。

親プラスミド１２Ｂ１を以下のように構築した。（ＣＤ４　ＤＮＡ配列のヌクレ オチド１４８と１４９の間にある：マッドン（Ｍａｄｄｏｎ）ら、セル（Ｃｅｌ ｌ）凹円にあるＢｂｖＩ切断部位を、該ＢｂｖＩ切断部位をヌクレオチド１５０ と１５１の間に置くように、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ　ｄｉｒ＝ｃｔｅｄ 　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）　、プロシーディン ゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス−Ｌ−−ゲス・エイ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）により取り出した。この 変異（１４７８と称する）を、アミノ酸残基１−１２９のコード配列を含有する ５ＣＤ４ミニ遺伝子中に挿入した。この１４７８変異含有のＥｃ。

Ｒ１＋Ｈｉｎｄｌ　１１断片を、Ｍ１３ｍｐ１８からｐＵｃｌｇに移し、ｐＵｃ Ｖ１ｐＶ２　（１４７８）を生成した。ｐＵｃＶ１ｐＶ２　（１４７８）のＢｂ ｖＩ消化の後に、それをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｋｌｅｎｏｗ　 ｆｒａｇｍｅｎｔ）で処理し、５゛の一重鎖配列を満たし、ついでＨｉｎｄｌ　 Ｉ　Ｉで消化した。これらの操作により得られたＨｉｎｄＩＩＴ−平滑末端断片 を、ＡｃｃＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼｌクレノー断片で処理し、Ｈｉｎｄ Ｉ　Ｉ　Ｉで消化したｐＬＴ１４５０中にクローンした。得られたプラスミドの １２Ｂ１／１４７７は、発現ＶＩＶ２蛋白質がそのアミノ末端で６アミノ酸ＬＴ Ｉｐｒｏペプチドに加えて成熟ＬＴＩ蛋白質の残基１および２を含有するように 、ＬＴＩシグナル配列のコード配列に融合した５ＣＤ４ミニ遺伝子（アミノ酸残 基１−１２９）を含有する。ストレプトミセス・レプリコンおよび選択可能なマ ーカーを、ｐＩＪ３５１　（キーサー（Ｋ　１ｅｓｅｒ）ら、モレキュラー・ア ンド・ジェネラル・シネティックス（Ｍｏｌ　ｇｅｎ、　Ｇｅｂｅｔ、　）１８ ５　：　２２３−２３８　（１９８２））を両方のプラスミドにある独特のＰｓ ｔＩ部位を用いて挿入することにより１２Ｂ１／１４７７中にクローンした。１ ２Ｂ１／１４７７ブラスミドにて完全なり１ｖ２ミニ遺伝子（アミノ酸残基１− １８３）を得るに、実施例］のＤＨＦＲＶＩＶ２　１８３＃７からのＡｆｌＩ　 Ｉ　＋ＸｂａＩ断片を、ＡｆｌｌｌおよびＸｂａｌで消化した１２　Ｂ　１／１ ４７７中に挿入した。

得られたプラスミドは１２Ｂ１であった。

プラスミドＩ）ＬＴＩ４．）０の構築：ＬＴＩ遺伝子を含有する０、９２ｋｂ　 ５ａｃＩ−Ｋｐｎｌ断片を５ａｃｌおよびＫｐｎｌで消化したｐＵＣ１８中に挿 入した。このプラスミドであるｐＬＴＴ５２０を、ＥａｇＩで部分的に消化し、 ５ａｌＩで全体的に消化し、ついでＥａｇｌおよび５ａｌＩ末端を有する合成リ ンカ−（２ｘ鎖）に連結した： ５−ＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：５）ＣＧＧＣ ＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＴ−５’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６）この連 結により得られたプラスミドを、合成リンカ−を５ａｃＩ部位から約０゜５ｋｂ に位置するＥａｇＩ部位に挿入するのにスクリーンした。このＥａｇ１部位は、 ＬＴＩ遺伝子の５゛末端については塩基対８６に位置する。得られたプラスミド はＬＴＩプロモーターおよびシグナルペプチドについてのコード配列およびペプ チド切断部位を含有する。

融合プラスミドのＴＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡＡ−Ｖｌｖ ２およびＫＡ−ＶＩＶ２を得るに、オリゴヌクレオチド変異誘発を用いてＬＴＩ 　ｐｒｏペプチドコード配列を欠失し、シグナルペプチド切断部位の後に選択の アミノ酸コード配列を創作した。これらの変異誘発に用いたＭ１３−重鎮ＤＮＡ は、１２Ｂ１からの１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ断片をＥｃｏＲＩお よびＸｂａＩで消化されているＭ１３ｍｐ１８中に挿入することにより創作した ｍｐ１８ＶＩＶ２／１２Ｂ１であった。部位指向性変異誘発に用いたオリゴヌク レオチドを表３に要約する。

表３−ＶＩＶ２誘導体を創作するに用いたオリゴヌクレオチドτＫＫ−ＶＩＶ２ 　２２１４　５’ＧＣＣＣ八ＧＣＡＣＣＡＣＴＩＴＣＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＣ ＧＣにＧＣＴＣＣ−：ｌ　’τＰＡＡ−Ｖ１Ｖ２　２２５３　５’−Ｃ；ＣＣＣ ＡＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣにＧＣＧＴＧＧＣ−３’ＴＰ八八 Ａ−ＶＩＶ２　２２５４　５’−ＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣ八ＣＴＴＴＣＴＴＡへＣ ＡＧＣＧＧＣＣＣ，ＧＧＧ−３’に八−ＶＩＶ２　２２／１６　５’−ＧＣＣＣ ＡＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴｒＧにＣＣＡＧＣＧＣＧにＣＴＣＣ−］’表３にお いて、ヌクレオチド配列２２１４はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７であり；ヌクレオ チド配列２２５３はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８であり：ヌクレオチド配列２２５４ はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９であり：ヌクレオチド配列２２１６はＳＥＱ　ＩＤＮ ０：１０である。

ＲＦ形の変異誘発されたｍｐ１８ＶＩＶ２から単離された０、７ｋｂＥｃｏＲＩ −ＡｆＩＩＩ断片を、１２Ｂ１からの０．７５ｋｂＥｃｏＲＩ−Ａｆｌｌ　Ｉ断 片と交換し、プラスミドｐＶＩＶ２−２２１４　（またはｐＴＫＫ−ＶＩＶ２） 　、ｐＶＩＶ２−２２５３（またはｐＴＰＡＡ−ＶＩＶ２）　、ｐＶＩＶ２−２ ２５４　（まタハｐＴＰＡＡＡ−ＶＩＶ２）およびｐｖｌＶ２−２２１６　（ま たはｐＫＡ−ＶＩＶ２）　ヲ４７’：。別名ｐＴＫＫ−ＶＩＶ２とも称されるｐ ＶＩＶ２−２２１４を、表３に示されるような、修飾されたプロペプチド配列ト レオニンに連結したＬＴＩシグナル配列を含有し、該修飾されたプロペプチド配 列のトレオニンがＶＩＶ２に連結する、オリゴヌクレオチド２２１４を用いて創 作した。別名ｐＴＰＡＡ−ＶＩＶ２とも称されるＩ）ＶＩＶ２−２２５３を、表 ３に示されるような、修飾されたプロペプチド配列のｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａ− ａｌａに連結したＬＴＩシグナル配列を含有するオリゴヌクレオチド２２５３を 用いて構築した。別名ｐＴＰＡＡＡ−ＶＩＶ２とも称されるｐＶＩＶ２−２２５ ４を、表３に示されるような、修飾されたプロペプチド配列のｔｈｒ−ｐｒｏ− ａｌａ−ａｌａ−ａｌａと連結したＬＴＩシグナルペプチド配列を含有し、それ が順次、■ＩＶ２と連結する、オリゴヌクレオチド２２５４を用いて構築シタ。

別名ｐＫＡ−ＶＩＶ２とも称されるｐＶＩＶ２−２２１６を、表３に示されるよ うな、順次、ＶＩＶ２と連結するＬＴＩシグナルペプチド配列を含有するオリゴ ヌクレオチド２２１６を用いて構築した。

実施例５−βｇａ１　零ＫＫ−ｖＩＶ２融合プラスミドの構築βｇａ１　本ＫＫ −ＶＩＶ２を、プラスミドｐβｇａｌｓＴ４／７から変異誘発により構築した。

ｐβｇａｌｓＴ４／７は以下のように構築した。

ｐβｇａｌｓＴ４／７の構築　プラスミドル零ｇａｌｓＴ４／７をプラスミドｐ ＵＣｓｔ４、ｐｌＪ７０２およびｐ３ＳＳＸＭＣＰより構築した。ｐ３ＳＳＸＭ ＣＰは、β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびシグナル配列を含有するｐＵ Ｃ９（ビエラおよびメッシング（ＶｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ）　、ジン（ 撫）１旦：２５９（１９８２））誘導体である。シグナルペプチドの切断部位用 のコード配列の下流にある２６個の塩基対がＸｌＩｎ１部位である（エフハード （Ｅ　ｃｋｈａｒｄｔ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、）　１６９　二４２４９　（１９８７））。Ｂａ５ＨＩ認識配列 含有の合成リンカ−（マサチューセッツ州、ベバリー、ニュー・イングランド・ バイオラボラドリース（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）をこの部位 に挿入し、プラスミドｐ３ｓｓＸ１０を得た。このベクターをＢａｍＨＩおよび 逆トランスクリプターゼで処理し、つづいてＸｈｏＩ消化に付した。逆トランス クリプターゼで処理したＮｃｏｌ末端を有する断片をこのベクターで連結し、平 滑末端および５ａｌＩ末端を得た。満たされた（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ）　Ｂａｍ ＨＩ部位を満たされたＮｃｏＩ部位と連結し、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩ部位の両方 を再構築した。得られたプラスミドはり３ＳＳＸＭＣＰであった。ｐＵＣｓＴ４ をＸｂａＩおよび逆トランスクリブターゼで処理し、つづいてＮｃｏＩ消化に付 した。ついで、この１．１ｋｂのＮｃｏＩ−Ｘｂａｌ　（ＲＴ）断片を、５ａｃ ｌおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼＩで処理し、つづいてＮｃｏＩ消化に付した ｐ３ＳＳＸＭＣＰに挿入した。ストレプトミセス複製機能が、両プラスミドの独 特ＢｇｌＩＩ部位を介してｐ３ＳＳＸｓＴ４に挿入されたｐ　Ｉ　Ｊ　７０２に より得られた。得られたプラスミドはｐβｇａｌｓＴ４／７であった。

ｐβｇａｌ　ｓｔ４／７からの１．６ｋｂの旦ｃｏＲＩ−Δ工上ＩＩＩフラグメ ントを、ｍｐ１８ＶＩＶ２−２２１４からの０．７５ｋｂの旦ｃｏＲＩ−Δ工± ＩＩフラグメントと交換し、ｍｐ１８Ｂｇａｌ　ＩＶＩＶ２を得た。特定部位の 突然変異誘発を用いて、ＣＤ４シグナルペプチドのアミノ酸残基−９〜−１のコ ーディング配列を欠失させ、βｇａｌシグナルペプチドの−３および一４位のア ルギニン残基をそれぞれアスパークマートおよびグルタマートに変化させ、成熟 β−ガラクトシダーゼ蛋白質の１〜８残基についてのコーディング配列を欠失さ せた。

これらの突然変異は、配列が ５’　−ＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＧＴＣＣＴＣＴＡ ＣＧＧＣＧＣＣＴＧ−３゜（配列番号１１） であるオリゴヌクレオチド２２５６を用いて行った。

Ｉ−Δ工±１エフラグメントと交換した。得られたプラスミド、ｐＶＩＶ２βｇ ａ１−２２５６　（βｇａ　ｌ　＊ＫＫ−ＶＩＶ２）は以下の特徴を有する：（ １）ＶＩＶ２発現はβｇａｌプロモーターにより指令される、（２）βｇａｌシ グナルペプチドのコーディング配列は、アミノ酸残基−４がグルタマートおよび −３がアスパータマートとなるように改変されている、および（３）ＶＩＶ２の 予想されるＮ−末端アミノ酸配列がＬｙｓ−Ｌｙｓとなるように、ＶＩＶ２はβ ｇａｌシグナル配列に融合している。

実施例６　ニス・リビダンス（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ）におけるＶＩＶ２発現 標準的な方法（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら、ゲネティック・マニピユレ ーション・オブ・ストレプトミセス（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）−ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、エフ・クロウ・アンド・サンズ・リ ミティッド（Ｆ、　Ｃｒａｖｅ　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、　）　、ノーウィッチ （Ｎｏｒｗｉｃｈ）　、英国（１９８５））を用いて、実施例４からのプラスミ ドｐＶＩＶ２−２２１４、ｐＶＩＶ２−２２５３、ｐＶＩＶ２−２２５４、ｐＶ ＩＶ２−２２１６およびＩ）ｖ１ｖ２βｇａ　ｌ−２２５６をニス・リビダンス （Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ）　１３２６　（ビン（Ｂｉｂｂ）ら、Ｍｏ１．　Ｇ ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、よ８４　：　２３０−２４０　（１９８１））に形質転換 した。Ｒ２ＹＥ形質転換プレートに３ｍｌの０４％寒天＋１００μｇ／ｍ１チオ ストレプトンをオーバーレイすることにより、形質転換体を選択した。

関心のある蛋白質を発現する形質転換体を、トリブチカーゼ・ソイ・ブロスまた はＭＨＩ　＋５％ＨｙｃａｓｅＳＦ　（４０ｇ／リットルのグルコース、５０ｇ ／リットルのＨｙｃａｓｅＳＦ、５０ｇ／リットルのＨｙｓｏｙ、Ｉｇ／リット ルの酵母エキス、Ｉｇ／リットルのＣａＣＯ４、および０．００１　ｇ／リフド ルのＣｏＣｌ２　（５μｍ７ｍ１のチオストレプトンで補足））中で増殖させた 。ｇｐ１２０結合測定法およびｇｐ１２０アフィニティータロマドグラフィーに 用いた無細胞上清を、ＭＥ１＋５％Ｈｙｃａｓｅ中で増殖させた培養から収穫し た。

ニス・リビダンス（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ）中で発現させた場合のＶＩＶ２誘 導体を最初にイムノブロッティングにより特徴づけた。

イムノプロット法−無細胞上清を１５％ポリアクリルアミド（３０：０．８アク リルアミド：ビス）−ドデシル硫酸ナトリウムゲル（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）（１９７０）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７　：　６８０−６８５） 上で分離し、ついでニトロセルロースに移した（タウビン（Ｔｏｖｂｉｎ）ら、 （１９７９）プロシーデイングズ・オブ・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイ エンシーズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　 ＵＳＡ）　７６　：　４３５０　４３５４）　。二）ロセルロースフィルターを 加工し、変性５ＣＤ４蛋白質に対して調製したウサギ抗血清を用いてｖ１ｖ２を 検出（ブチウナー（Ｂｒａｖｎｅｒ）ら、（１９８５）ジーン（Ｇｅｎｅ）４０ 　：１９１−２０１）した。結合抗体を１２５Ｉ−蛋白質Ａで検出した。免疫反 応バンドをオートラジオグラフィーで可視化した。

ＴＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＲＡＡＡ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡＡ−ＶＩＶ２、ＫＡ−ＶＩ Ｖ２およびβｇａｌ＊ＫＫ誘導体は単一の免疫反応バンドとして現れた。ＫＫ− ＶＩＶ２誘導体からはダブレットが現れた。ＫＫ−ＶＩＶ２蛋白質の１つは、Ｃ ＨＯ細胞から得られたＶＩＶ２と共に共泳動した。ＶＩＶ２参照蛋白質より遅い 移動度で泳動する他のバンドは、ＬＴＩシグナルペプチドの不完全加工またはＬ ＴＩシグナルペプチド中の別の切断部位における加工の結果かもしれない。ＫＫ −ＶＩＶ２誘導体により発現された生成物のへテロ性のため、これ以上の研究は 行わなかった。

ついで、ｇｐ１２０結合により、これらＶＩＶ２誘導体の生物学的活性を測定し た。定量的ｇｐ１２０免疫沈降（アートス（Ａｒｔｈｏｓ）ら、セル（Ｃｅｌｌ ）　５ヱ・４６９−４８１　（１９８９）　）により評価したところ、ストレプ トミセス生産ＶＩＶ２蛋白質は完全に活性であった。免疫沈降検定の結果を表２ に示す。調べたＶＩＶ２１１！導体はすべて、９０％より大きなｇｐ１２０結合 を示した。

ＴＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡＡ−ＶＩＶ２おＪびβ−ｇａ ｌ＊ＫＫ誘導体のＶＩＶ２生産を、１００ｍｇ／ｍ１以上のレベル’ｔ’ＶＩＶ ２を生産するプラスミド１２Ｂ１から得られるものと比較した。ＴＰＡＡ−ＶＩ Ｖ２お、Ｊ−びＴＰＡＡＡ−ＶＩＶ２１！導体のｌＶ２発現レヘしベ、１２Ｂ１ から得られるものと匹敵するものであった。ＫＡ−ＶＩＶ２発現は、１２Ｂ１か ら得られるものの７０％であった。ＴＫＫ−ＶＩＶ２発現は、１２Ｂ１から得ら れるものの３０％であった。βｇａｌ＊ＫＫ発現は約１ｍｇ／ｍｌであった。

実施例７　プラスミド１）ＶＩＶ２−２２１４、ｐＶＩＶ２−２２５３、ｐＶＩ Ｖ２−２２５４、ｐＶＩＶ２−２２１６およびｐＶＩＶ２βｇａｌ−２２５６に より生産される異種蛋白質のＮ末端アミノ酸の分析Ａ、　Ｎ−末端配列決定のた めの、ＧＰ−１２０セフアロースアフイニテイーカラムを用いるストレプトミセ ス培地からのＶＩＶ２の精製１、ｇｐ１２０セファロースの調製 活性エステル化学を用いてアミノ基を介して、セファロースＣＬ−６Ｂ　（ファ ーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）上に、精製したｇｐ１２０を固定化した。

約０．２５ｍｇのｇｐ１２０を１ｍｌの樹脂に結合させ、ｓｔ４についての結合 能を２０μｇ／ｍ＋と測定した。

２、培地からのサンプルの調製 ＶＩＶ２構成体を含有する発酵培地を、カラム平衡緩衝液（下記参照）中で５倍 希釈し、２０．ＯＯＯＸｇで１５分間遠心分離し、０．２μアクロディスク低蛋 白質結合フィルター（ゲルメン（Ｇｅｌｍｅｎ）　）で濾過した。

３、Ｇｐ１２０アフィニティークロマトグラフィーＧｐ１２０セファロースカラ ム（１，６ｃｍＸ　６　ａｍ）を、５０ｍＭへベスｐＨ７，５，１５０ｍＭ　Ｎ ａＣ１で平衡化させた。調製した培地サンプルをカラムに載せ、吸光度が基線に 達するまで平衡緩衝液で洗浄し、５０ｍＭヘベスｐＨ７，５，１５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１で再び洗浄して、非特異的結合している不純物をすべて除去した。０，１Ｍ 酢酸でＶＩＶ２を溶出した。

４、逆相ＨＰＬＣを使用することによる、アフィニティー精製ｖ１ｖ２からのペ プチド不純物の除去 アフィニティーカラムから溶出したｖ１ｖ２を０．０５％ＴＦＡ溶液とし、０． ０５％ＴＦＡ中で平衡化させたＣ３　ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（デュポン・プロ（ ＤｕＰｏｎｔ　Ｐｒｏ）　１０　／　３００．４．６ｃｍＸ２５０ｃｍ）に載せ た。０．０５％ＴＦＡ中の０〜６０％アセトニトリルの直線グラジェントで１ｍ ｌ／分で６０分間、該カラムを溶出した。ＶＩＶ２生成物を５０分の単一のピー クとして溶出させた。集めた両分をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　３　 （アミコン（八ｍ１ｃｏｎ）　）濃縮し、Ｎ末端配列決定およびアミノ酸分析に 使用した。

Ｂ、　Ｎ末端配列決定 Ｎ末端アミノ酸配列を確認して、シグナルペプチド加工が予想された切断部位に 現れたかどうかを確かめた。ｇｐ１２０セファロースアフィニティークロマトグ ラフィーおよび逆相ＨＰＬＣを用いて、培養上清からｖ１ｖ２蛋白質を精製した 。部分的に精製したＶＩＶ２調製物を、ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動 でさらに精製し、ついで、Ｎ末端アミノ酸配列決定のために調製したポリビニリ デンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜中に電気溶出した（マツダリアＱｌａｔｓｕｄ ａｒｉａ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６２　：１００３５−１００３８　（ １９８７））　。気相蛋白質シークエネーターを用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を 決定した。この分析によれば、ＬＴＩシグナルペプチドのカルボキシ末端に融合 したＶＩＶ２蛋白質ＴＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡＫＫ−ＶＩＶ２、ＴＰＡＡＡＫ Ｋ−ＶＩＶ２およびＫＡ−Ｖｌｖ２は、ＬＴＩシグナルペプチド切断部位で正確 に加工される。Ｎ末端アミノ酸配列を表２に要約する。ｖ１ｖ２ペプチドのＮ末 端はＬＹＳ−ＬＹＳである。しかし、Ｂｇａ　ｌ＊ＫＫ−ＶＩＶ２誘導体は、天 然シグナル配列切断部位で加工されなかった。この誘導体では、ＬＹＳ−ＬＹＳ の前のアミノ酸は、β−ｇａｌ＊シグナルペプチドの３゛末端のコーディング配 列から誘導される。Ｒ（−４）Ｅ／Ｒ（−３）Ｄシグナルペプチド突然変異のシ グナル配列切断は、−８〜−７のβｇａｌシグナル配列内に現れる。

ＴＵ−Ｖ　Ｉ　Ｖ　２　Ｔｈｒ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−＞　９０％ＴＰＡＡＫＫ−Ｖ 　Ｉ　Ｖ　２　Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−−−＞　９ ０％ＴＰＡＡＡＨ−Ｖ　Ｉ　Ｖ　２　Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−＾１ａ−＾１ａ−Ａｌａ −ＬＹＳ−ＬＹＳ−−−＞　９０％ＴＰＡＡＡＫＫ−Ｖ　Ｉ　Ｖ　２　ＬＹＳ− ＬＹＳ　Ｎ　Ｄ　（１）ＫＡ−Ｖ　Ｉ　Ｖ　２　ＬＹＳ−Ａｌａ−−−＞　９０ ％Ｂｇａ１本■−ＶＩＶ２　＾１ａ−＾１ａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−＾１ａ −Ａｌａ−ＬＹＳ−ＬＹＳ　＞　９０％（１）測定せず 上の記載および実施例は、好ましい具体例を含む本発明を完全に開示する。しか し、本発明は上に特に記載した具体例に限定されるものではない。当業者に自明 である上記の方法の修飾は、以下の請求の範囲の範囲内である。

要約書 ストレプトミセスにおいてＣＤ４キメラ蛋白ならびに他の異種蛋白の産生に有用 な核酸配列およびＤＮＡベクターを開示している。本発明の核酸配列は、実質的 に１〜約６個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドからなるプロペプチド 配列に作動的に結合した、ストレプトミセス・ロンギスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）チロシン・インヒビター遺伝子（ＬＴＩ） のシグナル配列をコードする配列からなり、該アミノ酸の配列が、異種蛋白の合 成の間に該異種蛋白上に形成したシグナルペプチドを除去するプロセッシング後 、ストレプトミセスにおいて均質なアミノ末端を有する異種蛋白の形成を生じる ように選択されている。

本発明のもう１つ別の具体例では、プロペプチドが省略され、ＬＴＩシグナルは 、３°末端で１ｙｓ−ａｌａ−配列をコードするように修飾された異種蛋白をコ ードする核酸配列に作動的に結合したＬＴＩシグナルペプチドである。また、本 発明は本発明の核酸配列またはベクターで形質転換された細胞および本発明の核 酸配列およびベクターを用いてストレプトミセスにおいて異種蛋白を産生させる 方法を提供する。

国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に１〜約６個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドからなるプ ロペプチド配列に作働的に結合した、ストレプトミセス・ロンギスポルス（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）チロシン・インヒビター遺伝 子のシグナル配列をコードする核酸配列からなり、該アミノ酸の配列が、異種蛋 白の合成の間に該異種蛋白上に形成したシグナルペプチドを除去するプロセッシ ング後、ストレプトミセスにおいて均質なアミノ末端を有する異種蛋白の形成を 生じるように選択されたことを特徴とする核酸配列。
2. ２．該プロペプチド配列が、該シグナル配列をコードする核酸配列の末端と該プ ロペプチド配列の始めの間の位置で該異種蛋白のプロセッシングを起こさせる請 求項１記載の核酸配列。
3. ３．該プロペプチドがアミノ酸、スレオニンをコードする請求項２記載の核酸配 列。
4. ４．該プロペプチドがアミノ酸配列、【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１）をコードする請求項２記載の核酸配列。
5. ５．該プロペプチドがアミノ酸配列、【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２）をコードする請求項２記載の核酸配列。
6. ６．該核酸配列が、配列 【配列があります】 またはストレプトミセスにおいてシグナルペプチドとして作用できるその誘導体 からなるストレプトミセス・ロンギスポルスのシグナル配列をコードする請求項 １記載の核酸配列。
7. ７．該プロペプチド配列が、配列ＡＣＣからなる請求項６記載の核酸配列。
8. ８．該プロペプチド配列が、配列【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ ）からなる請求項６記載の核酸配列。
9. ９．該プロペプチド配列が、配列【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ ）からなる請求項６記載の核酸配列。
10. １０．３′末端がＩｙｓ−ａＩａ−をコードするように修飾された、ポリペプチ ドをコードするための核酸配列に作働的に結合したストレプトミセス・ロンギス ポルスのチロシン・インヒビター遺伝子シグナル配列をコードする核酸配列を含 む核酸配列。
11. １１．プロモータおよび請求項１記載の核酸配列に作働的に結合した異種蛋白を コードする配列を含むストレプトミセスにおける該異種蛋白の発現用ＤＮＡベク ター。
12. １２．該異種蛋白のコード配列がＨＩＶｇｐ１２０結合領域をコードする配列で ある請求項１１記載のＤＮＡベクター。
13. １３．該異種蛋白のコード配列が、ＣＨ３ドメインの大部分あるいは全てを欠く ポリペプチドをコードするヒト免疫グロブリン定常部の一部に結合したＨＩＶｇ ｐ１２０結合領域をコードする配列である請求項１１記載のＤＮＡベクター。
14. １４．プロモータおよびストレプトミセス・ロンギスポルスのトリプシン・イン ヒビター遺伝子シグナル配列に作働的に結合した異種蛋白用のコード配列からな り、該異種蛋白コード配列が、その３′末端おいてアミノ酸配列Ｉｙｓ−ａＩａ をコードする塩基の付加、あるいはその３′末端の２個のアミノ酸をコードする 塩基を欠失させ、欠失した配列の代わりに、アミノ配列Ｉｙｓ−ａＩａをコード する配列で置換することにより修飾されているストレプトミセスにおける該異種 蛋白発現用ＤＮＡベクター。
15. １５．該異種蛋白のコード配列がＨＩＶｇｐ１２０結合領域をコードする配列で あり、３′末端の２個のアミノ酸をコードする塩基が欠失され、欠失した配列に 代えてアミノ酸配列Ｉｙｓ−ａＩａをコードする配列で置換されてる請求項１４ 記載のＤＮＡベクター。
16. １６．該異種蛋白のコード配列がＣＨ３ドメインの大部分あるいは全てを欠くポ リペプチドをコードするヒト免疫グロブリン定常部の一部に結合したＨＩＶｇｐ １２０結合領域をコードする配列であり、その３′末端における２個のアミノ酸 をコードする塩基が欠失され、欠失した配列に代えてアミノ酸配列Ｉｙｓ−ａＩ ａをコードする配列で置換されている請求項１４記載のＤＮＡベクター。
17. １７．請求項１２記載のベクターをストレプトミセスの宿主細胞に導入する工程 と、該宿主細胞を適当な培地で増殖させる工程とからなることを特徴とする請求 項１２記載のベクターの使用方法。
18. １８．請求項１４記載のベクターをストレプトミセスの宿主細胞に導入する工程 と、該宿主細胞を適当な培地で増殖させる工程とからなることを特徴とする請求 項１４記載のベクターの使用方法。
19. １９．請求項１記載の核酸配列でトランスフェクションされたストレプトミセス 細胞。
20. ２０．請求項６記載の核酸配列でトランスフェクションされたストレプトミセス 細胞。
21. ２１．請求項７記載のＤＮＡベクターでトランスフェクションされたストレプト ミセス細胞。
22. ２２．請求項１０記載のＤＮＡベクターでトランスフェクションされたストレプ トミセス細胞。