JPH0747545B2

JPH0747545B2 - 創傷治癒及び修復の修復段階を促進し、かつ感染した創傷及び糖尿病哺乳類の創傷の治癒を促進するためのｉｌ−４の用途

Info

Publication number: JPH0747545B2
Application number: JP4504436A
Authority: JP
Inventors: シュワルツ，マーティン・エイ; サリヴァン，リー・エム; ボバー，ロレッタ・エイ
Original assignee: Schering Plough Corp
Current assignee: Schering Plough Corp
Priority date: 1991-01-10
Filing date: 1992-01-07
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2010-05-24
Also published as: EP0502599A1; WO1992011861A1; EP0566661A1; CA2099263C; AU1198092A; AU660959B2; DK0566661T3; JPH05509333A; ES2085003T3; IE75707B1; DE69209051D1; CA2099263A1; EP0502599B1; IE920070A1; ATE135233T1; GR3019708T3; DE69209051T2; EP0566661B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景インターロイキン‐４［本明細書中では以後「IL-4」と
するが、Ｂ細胞刺激因子１（BSF-1）としても知られて
いる］は、M.Howard et al.により、J.Exp.Med.（198
2）,Vol.155,pp.914-23において初めて、IL-2とは区別
されるＴ細胞由来の増殖因子として記載されている。こ
の因子は、正常なマウスＢリンパ球類の長期組織培養を
可能にし、かつ、活性化されたＢリンパ球と相互作用し
て４か月もの長期間その増殖を維持する。混合したＢリ
ンパ球移植体は培養を開始するために利用されてきた
が、未成熟な表現型を有するＢリンパ球は、組織培養中
においてはIL-4により特異的に促進させられることが明
らかになった。例として、C.Peschel et al.,J.Immun
ol.（1989）,Vol.142,1558-1568を参照せよ。更に、G.T
renn et al.,J.Immunol.（1988）Vol.140,1101-1106
は、IL-4が、休止期のマウスＴリンパ球のLyt-2＋亜集
団からの細胞障害性Ｔ細胞の発生を刺激化することを開
示している。

マウスIL-4遺伝子がクローン化され、COS-7細胞中で発
現させられた［T.Otsuka et al.,Nuc.Acids Res.（1
987）,Vol.15,333-334を参照せよ］。クローン化した因
子は、Ｔ細胞培養上清から精製した因子について観察さ
れた、組織培養における活性を全て有していた。ヒトIL
-4遺伝子のクローニング及び発現は、N.Arai et al.,
J.Immunol.（1989）,Vol.142,274-282、及び、T.Yokota
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（1986）,Vol.83,5844-
5848に記載されており、COS-7中に産生される因子は、
組織培養中において研究された天然の分子に類似した活
性を有していた。IL-4をヒトとマウスの細胞系の両方に
おいて研究した場合には、以下に示すように、追加的な
インビトロ活性がこの分子により生じた。ｉ）IL-4は、
Ｂリンパ球亜集団が増殖へと誘導される際に生じる過程
であるIgE合成の誘導及び調節における重要な役割を担
っていた［Pene,J.,Proc.Natl.Acad.Sci.（1988）,Vol.
85,6880-6884を参照せよ］。ii）IL-4は、組織培養にお
ける正常ヒトＢリンパ球上に、低親和性のFcεレセプタ
ー（CD23）を誘導した［T.DeFrance et al.,J.Exp.Me
d.（1984）,Vol.165,1459-1457を参照せよ］。iii）IL-
4は、他のリンフォカイン類、インターフェロン‐γと
は特に著しく相互作用し［R.L.Coffman et al.,Immun
ol.Res.（1988）,Vol.102,5-27、及び、S.Romagnani e
t al.（上述）を参照せよ］、更に、Ｔ細胞類とも相互
作用して［R.L.Coffman et al.（上述）、S.Rogmagna
ni et al.（上述）、及び、M.D.Widmer et al.,Nat
ure,（1987）,Vol.326,795-98、を参照せよ］、Ｂ細胞
増殖及び改変を引き起こした。更に、iv）IL-4は、休止
期のＢ細胞上のMHCクラスII抗原の発現を増大させた
（Ｒ Noelle et al.,PNAS 81.6149-6153,1984）。

T.R.Mosmann et al.は、J.Immunol.,（1987）Vol.13
8.1813-1816において、アミノ酸配列1-90及び129-149に
おいて50％が相同であるヒトとマウスのIL-4は種特異的
であることを開示した。

創傷治癒及び修復の段階は、３つの重複する段階（これ
らは、創傷の原因となる損傷もしくは外科切開の後に起
こる）を含むとみなすことができる。段階Ｉは、Ａ）血
液凝固、及び、Ｂ）炎症反応段階を含み、段階IIは、肉
芽組織形成及び創傷収縮を含み、更に、段階IIIは、
「創傷治癒及び修復の修復段階」と呼ばれ、マトリック
ス形成と改造、及び、コラーゲン蓄積を含み、この段階
では、肉芽組織の細胞外マトリックスが形成されて、創
傷に対する抗張力が与えられる。R.S.Cotran,V.Kumar
and S.L.Robbins,W.B.Saunders Co.4th Ed 1989に
よるRobbins Pathologic Basis of Disease,pp71-8
6の「治癒及び修復」と題する節、及び、R.A.F.Clarkに
よる「創傷治癒の概説及び総体的考察」と題する第１
章,pp3-33、を参照せよ。

J.Bancherau et al.,Lymphokine Res.Vol.6.No.1:U1
35（1987）に記載されているように、IL-4は広い領域の
免疫細胞刺激を有する。Clinical Immunology and I
mmunopathology 49:292-298（1988）において、Monroe
及び共同研究者らは、Clinical Immunologh and Imm
unopathologh 49:292-298（1988）において、マウスIL
-4は、初代の及び不滅化させたマウスの皮膚線維芽細胞
のいずれにおいてもDNA合成を亢進することができると
いう証拠を提供した。Thornton,S.C.,et al.,J.Leukoc
yte Biology 47:312-320（1990）は、ヒトの肺及び滑
液の線維芽細胞に対する細胞増殖亢進活性について、一
群のサイトカイン類をテストした。検査したサイトカイ
ン類の内、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-アルファ）及び
血小板由来増殖因子（PDGF）のみが顕著に細胞増殖を刺
激化した。しかしながら、これらのインビトロにおける
実験に関連して、Thornton et al.は、インターロイ
キン類、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、及び、IL-6は不活性
である旨を開示している。

1989年７月28日に出願された、共同譲渡されている米国
特許出願第386,937号（1990年７月26日に出願された国
際特許出願No PCT/US90/04093）は、（１）IL-4を哺乳
類に投与することにより好中球の数を増大させ、感染に
対する宿主耐性を増大させるか、あるいは、非常に初期
の段階で感染を治療することができ、更に（２）IL-4
は、局所的に投与して、創傷部位における好中球及び単
球の活性化及び線維芽細胞増殖を刺激することにより、
開口している切り傷もしくは火傷等の創傷を治癒するた
めに有効である旨を開示している。

発明の要約我々は、驚くべきことに、IL-4が、ヒト皮膚線維芽細胞
株におけるDNA合成を刺激化しうることを発見した。我
々は、更に、PDGF及び表皮成長因子（EGF）等の既知の
増殖因子類とは異なり、IL-4は、インビトロにおいては
細胞数の顕著な増加を刺激化しないことも発見した。従
って、本明細書は、創傷治癒及び修復の修復段階の促進
を必要とする哺乳類においてこのような段階を促進させ
る方法を提供し、この方法は、このような促進に有効な
量のIL-4を、創傷治癒及び修復の修復段階中に投与する
ことを含む。

本明細書は更に、哺乳類、特にヒトの感染した創傷の治
癒及び修復を促進させる方法をも提供し、この方法は、
治癒に有効な量のIL-4を感染した創傷に対して投与する
ことを含む。

本明細書は更に、真性糖尿病に苦しむ哺乳類の創傷の治
癒及び修復を促進させる方法をも提供し、この方法は、
治療に有効な量のIL-4を、真性糖尿病を有する哺乳類の
創傷に対して投与することを含む。

本発明は、本明細書中に開示される技術のうち、インタ
ーロイキン−４を含有する創傷治癒及び修復促進剤に関
する。

図面の簡単な説明図１は、本明細書に記載される方法に従ってIL-4と共に
インキュベートしたヒト皮膚線維芽細胞中におけるDNA
合成の用量依存的増大についての、グラフによる説明で
ある。

図２は、本明細書に記載される方法に従ってIL-4と共に
インキュベートしたヒト皮膚線維芽細胞におけるコラー
ゲン合成の用量依存的増大を示す、グラフによる説明で
ある。

図３は、本明細書に記載される方法により、IL-4がPDGF
に対するヒト皮膚線維芽細胞の走化性を亢進させたこと
を示す、グラフによる説明である。

図４は、本明細書に記載される方法により、PDGF及びザ
イモサンに対するヒト皮膚線維芽細胞のIL-1刺激化遊走
における減少を引き起こすIL-4の能力を示す結果の、グ
ラフによる説明である。

図５は、ヒト皮膚線維芽細胞組織細胞CCD 19sk、CCD
27sk、及びヒト肺の組織細胞CCD 34luの増殖におけるI
L-4の効果の、グラフによる説明である。

図5bは、ヒト皮膚線維芽細胞及び肺細胞の増殖における
PDGFの効果の、グラフによる説明である。

図5cは、本発明により、ヒト皮膚（肺ではない）線維芽
細胞の増殖のPDGFによる刺激化を、rhIL-4が用量依存的
に促進することについての、グラフによる説明である。

図6aは、ヒト皮膚線維芽細胞及び肺組織細胞の増殖にお
けるEGFの効果の、グラフによる説明である。

図6bは、本発明により、ヒト皮膚（肺ではない）線維芽
細胞のEGFによる刺激化を、IL-4が用量依存的に促進す
ることについての、グラフによる説明である。

図７は、感染した及び感染していない創傷を示す急性創
傷治癒モデルにおける創傷閉鎖を促進させることに対す
るIL-4の効果の、グラフによる説明である。

図８は、創傷形成後７日目における、糖尿病でない動物
及び糖尿病の動物の創傷の破壊強度を増大させることに
ついてのIL-4の有効性を証明する、グラフによる説明で
ある。

図９は、創傷形成後14日目における、糖尿病でない動物
及び糖尿病の動物の創傷の破壊強度を増大させることに
ついてのIL-4の有効性を証明する、グラフによる説明で
ある。

発明の詳細な説明古典的には、創傷治癒は４つの段階に分けられている。
しかしながら、これらの段階は連続的に起こる傾向にあ
り、実際の生理学的事項は重複することがある。これら
の段階は創傷形成時から開始し、以下に示すようにな
る。

段階時間炎症／即時０から１時間炎症／創面切除／初期１から24時間修復／中間期１から７日成熟／後期７日を上回る日数修復期の特徴は、脈管形成、線維芽細胞の局在化、及
び、創傷収縮である。線維芽細胞はフィブリン束に沿っ
て創傷滲出物内へと遊走し（即ち、最初の24時間の間に
痂皮が定着する）、新生血管構造間で凝集し始める。こ
れらの線維芽細胞は、早くも２日目から、プロテオグリ
カン及び可溶性コラーゲンの分泌を開始する。これらの
物質はマトリックスを形成する。創傷の抗張力の増加は
コラーゲン産生に相関する。開口した創傷及び著しい組
織損傷を伴う創傷は、血管床を形成して創傷中の修復細
胞が必要とする酸素及び滋養物を供給する必要がある。
内皮細胞の増殖により毛細血管芽が生じ（脈管形成）、
それが伸長して肉芽組織床を形成し、更に、最終的に
は、上皮細胞に覆われて創傷を閉鎖する。創傷端の内方
向への遊走（収縮）は、収縮特性を有する一連の線維芽
細胞が創傷中に生じた際に開始する。

我々は、IL-4が、コラーゲン産生の２倍を上回る増大を
誘導することを発見した。創傷治癒及び修復の修復期に
おいては、新たに合成されたコラーゲンは細胞外マトリ
ックス中に取り込まれ、それにより、新しい細胞の成長
及び増殖の強力な足場もしくは支持体、及び、創傷の抗
張力の増大がもたらされる。我々は更に、IL-4が修復期
の創傷治癒及び修復の間に、創傷治癒及び修復の選択的
な促進及び調節を提供することをも発見した。本明細書
に記載される方法に従うIL-4の投与が創傷治癒及び修復
を亢進するばかりでなく、IL-4は、化学誘引剤であるPD
GFへの過剰な皮膚線維芽細胞の走化性により生じる瘢痕
組織形成及び／叉は繊維形成を最小限にし、かつ、IL-1
により誘導される皮膚線維芽細胞組織細胞の増殖及び化
学誘引剤PDGFへの走化性を制止させるように調節するこ
とにより、創傷部位の炎症を低減させる。本明細書に記
載される方法に従う、修復期中の、創傷部位もしくはそ
の近傍におけるIL-4の投与は、IL-4に適合性である哺乳
類で、その免疫反応が創傷治癒及び修復に効果を有する
ほど強力もしくは迅速でないものにとって有効である。
ヒトであることが好ましいこのような哺乳類には、癌治
療の放射線化学療法もしくは器官移植のために免疫反応
が低下している免疫緩和宿主、遺伝的免疫不全の宿主、
高齢者、創傷治癒及び修復不全の寝たきりの人、及び糖
尿病患者等がある。

本明細書中において使用する用語「創傷」は、外科手
術、外傷、火傷による潰瘍、もしくは床ずれにより生じ
る開口した創傷もしくは切り傷を含むが、これらに限定
されるものではない。用語「創傷治癒及び修復の修復期
の促進」は、（１）創傷治癒及び／叉は修復の修復期中
に、創傷部位に存在するPDGF等の化学誘引剤への、ヒト
皮膚線維芽細胞組織細胞の走化性を調節及び／叉は促進
し、（２）創傷治癒及び修復の修復期中に、創傷部位に
対して遊走している及び／叉は創傷部位に存在するヒト
皮膚線維芽細胞組織細胞中のコラーゲン合成を調節及び
／叉は促進し、（３）修復期中に、創傷部位に存在する
PDGF等の化学誘引剤への皮膚線維芽細胞組織細胞の遊走
のIL-1による誘導により生じる炎症反応を阻害もしくは
制動し、即ち、制止させるるように調節し、更に、
（４）創傷治癒及び修復の修復期中に、創傷部位に存在
するヒト皮膚（肺ではない）線維芽細胞組織細胞の増殖
の、化学誘引剤PDGF及び特にEGFによる刺激化を、調節
的方法で促進することを含む。

我々は、IL-4の存在下において増殖させたヒト皮膚線維
芽細胞が、改変したボイデンチェンバーアッセイにおい
て化学誘引剤PDGFへの走化性の促進化を示すことを発見
した。この走化性の促進化は、修復期前及び修復期中
の、創傷部位内への線維芽細胞の漸増において、重要な
シグナルを提供するものと思われる。我々は、IL-4が、
PDGFへのヒト皮膚線維芽細胞の遊走を刺激化するIL-1の
能力を制動し、即ち、制止させるように調節し、それに
より、瘢痕形成及び繊維形成を最低限にすることを発見
した。従って、我々は、創傷部位もしくはその近傍で
の、IL-4の投与、好ましくはIL-4の局所投与が、以下に
従って、創傷治癒及び修復の修復期中の創傷治癒及び修
復を亢進させることを発見した：（１）皮膚線維芽細胞
増殖を刺激化し、（２）コラーゲン合成を誘導し、
（３）IL-1により誘導されるPDGF及び他の化学誘引剤へ
のヒト皮膚線維芽細胞の走化性を阻害し、更に、（４）
創傷治癒及び修復の修復期中に、創傷部位に存在するヒ
ト皮膚線維芽細胞組織細胞の増殖の、化学誘引剤PDGF及
びEGFによる刺激化を調節的方法において促進する。

我々は更に、予期せぬことに、IL-4が、感染性創傷及び
真性糖尿病に苦しむ哺乳類の創傷の治癒を劇的に促進す
ることを発見した。

IL-4は種特異的蛋白質である。本明細書に記載される方
法に従って治療すべき哺乳類に適合性を示す任意の適切
なIL-4を、本発明において利用することができる。IL-4
に対して相補的なDNA類（cDNA類）が、近年、数々の研
究室により、クローン化されかつ配列決定されている
［例えば、Yokota et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
（1986）Vol.83:5894-5898（ヒト）;Lee et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.（1986）Vol.83:2061-2065（マウ
ス）;Noma et al.,Nature（1986）Vol.319:640-646
（マウス）；及び、Genzyme Corporation,Boston,Mass
achusetts（ヒト及びマウス）］。更に、非組換えIL-4
が、様々な培養上清から精製されている［例えば、Grab
stein et al.,J.Exp.Med.,（1985）Vol.163:1405-141
3（マウス）；及び、Ohara et al.,J.Immunol.,（198
5）Vol.135:2518-2523（マウスBSF-1）］。DNA及びアミ
ノ酸配列、及び本発明における用途のための適切なIL-4
物質の取得方法の教示について、上述の論文全ての開示
を本明細書の一部としてここに引用する。

好ましくは、治療すべき哺乳類はヒトであり、かつ、本
発明において使用されるIL-4はヒトのIL-4であり、更
に、大腸菌内内で発現されそこから単離された（1987年
７月29日に出願された米国特許出願第079,666号、及
び、1988年７月12日に出願された米国特許出願第194,79
9号）、Yokota et al.,Proc.Natl.Acad.sci.USA（198
6）,Vol.83:5894-5898、及び、1987年５月21に公開され
たPCT特許出願No.87/02990において記載されている配列
を有するヒト型のものであることが最も好ましい。CHO
細胞からのIL-4の産生は、1989年７月28日に出願され
た、共同所有されている米国特許出願第336,937号に記
載されている大腸菌からのIL-4の産生は、1989年10月31
日に出願された、共同所有されている米国特許出願第42
9,588号に記載されている。上述の論説、PCT出願、及
び、米国特許出願等の開示を、本明細書中の一部として
ここに引用する。

本明細書に記載される方法に従い、哺乳類に有効量のIL
-4を投与して、創傷治癒及び修復の修復期を促進させ、
化学誘引剤へのヒト皮膚線維芽細胞組織細胞の走化性を
調節及び／叉は促進させ、創傷部位に遊走しているかあ
るいはそこに存在するヒト皮膚線維芽細胞組織細胞内に
おけるコラーゲン合成を調節及び／叉は促進させ、か
つ、IL-4により誘導される化学誘引剤へのヒト皮膚線維
芽細胞組織細胞の遊走により生じる炎症反応を阻害もし
くは制止させるように調節し、更に、創傷治癒及び修復
の修復期中に、創傷部位に存在するヒト皮膚線維芽細胞
組織細胞の増殖の、化学誘引剤PDGF及びEGFによる刺激
化を、調節的方法において促進させる。

創傷に塗布するIL-4の量は創傷のサイズに依存する。創
傷１平方センチメートル当たり約0.25から約15マイクロ
グラムのIL-4を塗布する。ヒトの治療の場合には、組換
えヒトIL-4（「rhIL-4」）を塗布することが好ましい。
１日当たり、１平方センチメートル当たり約１から約10
マイクログラムのrhIL-4を、単一もしくは分割用量で、
創傷部位もしくはその近傍に塗布することが好ましい。

投与の量、頻度及び期間は、創傷の範囲及び重度、患者
の年令及び物理的条件等の因子により異なる。通常、IL
-4の投与は最初は一度であるが毎日であることもあり、
かつ、創傷治癒及び修復の修復期前もしくはその期間中
に定期的に継続することができる。用量及び頻度は、創
傷ならびに創傷治癒及び修復の修復期におけるIL-4の効
果の度合いの初期検査中に決定することができる。

その用量の投与は、創傷部位もしくはその近傍におい
て、非経口的、局所的、経皮的、皮下的、もしくは、筋
肉内的に行うことができる。IL-4は、数々の慣習的な用
量形態の任意のものとして投与することができる。非経
口的調製物には、無菌の溶液もしくは懸濁液が含まれ
る。体重１キログラム当たり約0.25から約15ミリグラム
のrhIL-4の用量が、ヒトに対する局所的な投与には好ま
しい。

上述の用量形態を考慮した薬剤学的組成物の処方は、慣
習的な技術を使用して、慣習的な薬剤学的に容認される
賦形剤及び添加物を添加して調製することができる。

IL-4は、１ミリリットル当たり100マイクログラムを越
えない最大濃度で、10ミリモルのクエン酸緩衝液及び防
腐剤を含まない滅菌水で再構成して、皮下注射、腹腔内
注射により、もしくは、継続的な静脈内注入により、あ
るいは、静脈注射により、全身的に投与することができ
る。継続的注入のためには、日用量を5mlの正常食塩水
に添加して、その溶液を機械的なポンプもしくは重力に
よって注入することができる。

現在のところ、コラーゲンゲル（Bausch ＆ Lomb Ph
armaceuticals社、Clearwatr,Flaから入手しうるもの
等）内で、コラーゲン保護膜の形で局所的にIL-4を投与
することが最も好ましい（I.Finkelstein et al.Curr
ent Eye Research（1990）Vol.9（７）653-659を参照
せよ）。好ましいコラーゲンゲル内の局所用量は、ゲル
1ml当たり約100ナノグラムから約１マイクログラムのIL
-4、好ましくはゲル1ml当たり約150ナノグラムから約１
マイクログラムのIL-4、より好ましくはゲル1ml当たり
約300ナノグラムから約１マイクログラムのIL-4の範囲
であり、この用量を、絆創膏もしくは包帯の一部として
創傷部位に、もしくは、別の貼剤として創傷の近傍に投
与することができる。

創傷治癒及び修復中の、IL-4によるヒト線維芽細胞組織
細胞の刺激化を更に補足するためには、例えば、IL-1、
インターフェロン（ガンマーインターフェロン等）等の
インターロイキン及び成長因子等の他のサイトカイン類
と組み合わせてIL-4を投与することも有効でありうる。
典型的な適切な成長因子としては、表皮成長因子（EG
F）、血小板由来成長因子（PDGF）及びトランスフォー
ミング成長因子アルファ及びベータ（それぞれ、TGF-
α、及び、TGF-β）があり、これらの成長因子は皮膚線
維芽細胞を刺激化し、このことによってコラーゲン類及
びおそらくグリコサミノグリカン類（GAG）の産生を増
大させることが示されている。本発明の創傷治癒及び修
復促進剤は、好ましくはIL-4をEGFもしくはPDGFと共に
投与することにより、ヒト皮膚線維芽細胞組織細胞類の
調節的刺激化を促進する。ガンマーインターフェロン
は、線維芽細胞における細胞内粘着性分子（ICAM-I）の
発現を増大させることが示されており、一方、IL-1はコ
ラーゲンの産生を刺激化することが示されている［D.N.
Sauder et al.,Lymphokine Reseach（1990）.Vol.9
（４）,465-473を参照せよ］。これらの成長因子類と組
み合わせた場合、IL-4はそれらの活性を増加及び／叉は
調節するように作用しうる。コラーゲン合成及びGAG合
成の調節は、顔面領域における皮膚創傷の修復において
頻繁に生じる問題である瘢痕形成を制限することを助長
しうる。更に、所定の期間にわたるIL-4の塗布は、修復
下の創傷領域内への線維芽細胞類及び他の細胞種の漸増
を促進することができる。IL-4は叉、因子レセプターの
発現を亢進するように、あるいは、抑制するように調節
することのいずれかにより、他の因子類、特にIL-1に対
する線維芽細胞の反応性を調節するように作用すること
もできる。

本明細書中において使用する用語「〜と組み合わせて」
もしくは「〜と共に」は、IL-4を、他のサイトカイン類
の投与の前、それと同時に、あるいはそのすぐ後に投与
しうることを意味する。

方法ヒト皮膚線維芽細胞細胞株 American Type Culture Collection（ATCC）から入
手したヒト皮膚線維芽細胞細胞株（CCD 27sk ATCC
＃CRL-1475,CCD 19sk ATCC ＃CRL-1471,及び、CCD
34lu ATCC ＃CRL 1491）を、ATCCにより推奨されて
いるように、10％のウシ胎児血清を補充したダルベコ改
変培地（DMEM）、あるいは、改変イーグル培地（MEM）
中で継代した。典型的には、線維芽細胞細胞株培養物を
20継代にいたるまで使用するが、この場合１継代は２か
ら３の細胞倍加率に等しい。CCD 27skは、明らかに正
常な個体から皮膚生検により取得した正常（対照）ヒト
胎児線維芽細胞である。

リンフォカイン類及び成長因子類 CHO由来の組換えヒトインターロイキン‐４（rhIL-4）
は、Schering-Plough Union社,NJ、から入手した（比
活性は、５×10⁷u/ml）。ヒトPDGF（BBホモダイマー）
は、Genzyme Corporation社,Boston,MA、から購入し
た。表皮成長因子（EGF）及び血小板由来成長因子（PDG
F）は、Collaborative Reseach社,New Bedford,MA、
から購入した。

抗体類組換えヒトIL-4（25D2）に対するモノクローナル抗体類
は、確立された方法により、Schering-Plough Researc
h社,Bloomfield.N.J.、において調製したが、これは、G
enzyme Corporation社からも入手することができる。
抗‐IL-5（TRFK）モノクローナル抗体類は、Shering-Pl
ough Research社,Bloomfield、から供給された。

本発明に従い、ヒト線維芽細胞を、IL-4の存在下で増殖
させる。実験の形式に依存して、以下に示す項目のうち
の１つもしくは複数を測定する。（１）DNA合成、
（２）コラーゲン合成、（３）PDGF及び他の化学誘引剤
類への走化性、（４）IL-1により刺激化される走化性の
阻害、及び、（５）ヒト皮膚線維芽細胞組織細胞類のPD
GF/EGFによる刺激化の促進。

実施例１ヒト皮膚線維芽細胞（CCD 27sk）におけるDNA合成に関
連した（³H）‐チミジン取り込みの測定は、Monroe et
al.,Clinical Immunology and Immunopathology
49:292-298（1988）、及び、Thornton,S.C.,et al.,J.
Leukocyte Biology 47:312-320（1990）の方法を使用
して行った。

20,000個のヒト線維芽細胞（CCD 27sk）を24穴の培養
皿内に撒いた。37℃において一晩インキュベーションし
た後、非粘着性細胞を除去し、細胞層を無血清培地で２
度洗浄した。その後、細胞培養物を、0.1％、１％、も
しくは、２％のウシ胎児血清（FCS）を含む培地中で48
時間維持した。次に、ヒト組換えインターロイキン‐４
（rhIL-4）（0.1から100単位／穴）を添加し、更に72時
間インキュベーションを継続した。New England Nucl
ear社より入手した１μCiの（³H）‐チミジンの取り込
みを、Monroe et al.（上述）の確立された方法によ
り測定した。

線維芽細胞培養物は1-2％のFCSを含む培地内では飢餓状
態にならないこともあるが、対照実験では一貫してアッ
セイ培地は10％のFCS及びrhIL-4を含んでいた。

本実験の結果を図１にグラフで示す。ヒト皮膚線維芽細
胞におけるDNA合成を刺激化するIL-4の能力を、（³H）
‐チミジンの取り込みにより測定した。IL-4によるDNA
合成の誘導は、アッセイ培地中のウシ胎児血清の濃度に
依存する。このような用量依存的な結果は、EGF及びTGF
-β等の他の一般的な成長因子類に共通である。従っ
て、我々は、hIL-4が、臨床モデルにおいてヒト皮膚線
維芽細胞内のDNA合成を刺激化することを予測してい
る。

他の細胞増殖実験を、rhIL-4（25D2）に対するモノクロ
ーナル抗体類を添加した以外は上述の方法に厳密に類似
する方法に従って行った。DNA合成は観察されなかっ
た。また、他の細胞増殖実験においては、抗IL-5（TRF
K）モノクローナル抗体類を添加したこと以外は上述の
方法に従ったが、IL-4によるDNA合成の制動は観察され
なかった。

実施例２コラーゲン合成の測定は、Monroe et al.,Clinical
Immunology and Immunpathology（1988）,Vol 49,22
9-298の方法に従って行い、CCD 27skヒト皮膚線維芽細
胞を24穴のプレート（Primaria社）に撒き、実施例１に
ついて記載したように、0.1から500単位/mLのCHO由来IL
-4と共にインキュベートした。細胞単層を10μCiの
（³H）‐プロリン（New England Nuclear Corp.社）
でパルスした。プレートを氷上に置き、細胞を掻き取っ
て200μＬの0.2N NaOH内に入れ、ポリプロピレン製試
験管に移した。2mLの50％トリクロロ酢酸（TCA）/5％タ
ンニン酸を添加し、氷上で１時間インキュベーションを
継続した。この試験管を、4000gで、４℃で30分間遠心
し、ペレットを、以前に使用したものと同様のTAC/タン
ニン酸溶液で３回、次にアセトンで３回洗浄した。ペレ
ットを、0.5N NaOH/0.5N 酢酸緩衝液に再懸濁させ
た。アリコートを、Boehringer Mannheim Biochemica
ls社、Indianapolis,IN、から入手したコラゲナーザを
含む、もしくは、含まないこの緩衝液中で、４℃で90分
間インキュベートした。500μＬのTCA/タンニン酸、及
び、100μＬの1mg/mL ウシ血清アルブミン（BSA）を添
加して、この試験管を４℃で30分間インキュベートし
た。次に、試験管を4000gで30分間遠心した。上清をシ
ンチレーション計測機で計測した。コラーゲン合成のパ
ーセントは、以下に示すように決定した。

図２にグラフで示した本実験のデータは、CHO由来のIL-
4を添加したヒト皮膚線維芽細胞（CCD 27sk）のインキ
ュベーションの結果、タイプＩ及び／叉はタイプIIIの
コラーゲン合成が２倍を上回って増大することを証明す
る。

実施例３ Adelman-Grill,B.C.,and Cully,Z.J.,Cell Physiolog
y 143:172-177（1990）、及び、Senior,R.M.,et al.,
J.Clin.Invest.70:614-618（1982）の方法を用いて、以
下に示すように改変して、以下に示す走化性実験を行っ
た。

A. CCD 25skヒト皮膚線維芽細胞の遊走に影響を与え
るrhIL-4の能力を、改変型ボイデン走化性チャンバーア
ッセイを使用して測定した。各穴は、８μＭの孔を有す
るポリカーボネート膜からなる２重フィルター（Nucleo
pore Corp.社,Pleasanton,CA）によって上部と下部に
分割されている。このフィルターを、Vitrogen（Collag
en Corporation社,Palo Alto,,CA）の溶液中に、室温
で４時間浸し、蒸留水で洗浄し、その後、空気乾燥させ
ることにより表面加工した。下部を、240μＬのPDGF含
有対照培地で満たし、膜を被せ、更に、350μＬの細胞
懸濁液を添加した（1.5-3×10⁵）。線維芽細胞の懸濁液
は、様々な濃度のrhIL-4（0.1-100μ/mL）と共にアッセ
イの前に予め３日間インキュベートした集密単層細胞を
トリプシン処理することにより調製した。組み立てた改
変型ボイデン走化性装置を、給湿化しているインキュベ
ータ内に、37℃で４時間放置し、その後、膜を除去し、
95％のエタノールで固定化し、裏返し、ヘモトキシリン
で染色した。細胞遊走は、高出力顕微鏡下において（×
400）、下部膜の細胞核を計数して決定した。通常、膜
１枚当たり3-4ケ所の視野を計測した。細胞遊走は、３
点決定した視野当たりの細胞数の平均として表した。

B. PDGF及びザイモサンへのヒト皮膚線維芽細胞の走化
性についてのIL-4の効果を、4ngのPDGF及びザイモサン
の存在下において実施例3Aの方法を使用して決定した。

図３において示した実験においては、rhIL-4の存在下に
おいて増殖したヒト皮膚線維芽細胞（CCD 27sk）につ
いて、血小板由来成長因子（PDGF;4ナノグラム）へ遊走
する能力を試験した。この結果は、IL-4により誘導され
るPDGFへの遊走の濃度依存的増大を示している。それと
は対照的に、ザイモサンで活性化させたヒト血清への走
化性は減少している。我々は、様々な化学誘引剤類への
走化性を調節するIL-4のこの新しい活性が、修復段階に
おける創傷の治療及び修復の臨床療法に有効であること
を期待している。

実施例４ IL-1で処理したCCD 27skヒト皮膚線維芽細胞のPDGFへ
の走化性についてのIL-4の効果を、実施例３の方法にに
従い、以下に示すように改変して測定した。

ヒト皮膚線維芽細胞（CCD 27sk）をrhIL-1（Genzyme
社）（10もしくは100単位/mL）で24時間予め処理し、そ
の後、rhIL-4の非存在下及び存在下で増殖させた。IL-4
に対するIL-1の比率は、以下に示す範囲にわたり変化さ
せた。1/0、1/10、1/100、10/0、10/10、及び、10/10
0。その後、この方法で処理した細胞について、血小板
由来増殖因子（PDGF:4ng）への遊走能力を試験した。図
４にグラフで示した結果は、IL-4により生じるPDGFへの
遊走の濃度依存的減少を証明している。図４の結果に表
されるように、IL-1により誘導される走化性の調節にお
けるIL-4のこの新しい活性は、修復期の創傷治癒及び修
復の臨床療法、並びに、IL-1により誘導される炎症の治
療において有効であると思われる。

実施例５ヒト皮膚線維芽細胞組織細胞の増殖の、PDGFによ刺激化
を促進するrhIL-4の可能性を、R.Margis et al.Analy
tical Biochemistry（1989）,Vol181,209-211の方法に
従って決定した。

A. ヒト皮膚線維芽細胞、CCD 19sk、CCD 27sk、及
び、CCD 34lu（穴当たり、3,000から5,000細胞）を、9
6穴プレート（Primaria-Falcon社）内に撒いた。rhIL-4
の一連の２倍希釈液（1000、500、250、125、62.5、31.
25、15.6、7.8、3.9）を、10％FCSを補充したDMEMに添
加した。72時間の培養後、用いた培地を除去し、以下に
示す分光高度測定アッセイを使用して細胞数を決定し
た。培地を除去した後、細胞層を、リン酸緩衝化生理食
塩水（PBS）（pH7.2）で洗浄した。この細胞を、PBS中4
0％フォルマリンで固定した。細胞を、Margis et al.
（上述）の方法に従って、10％酢酸及び40％メタノール
中の0.2％クマシー（BioRad社）の溶液で染色した（穴
当たり50μｌ）。60分後、染色液を除去した。次に、各
穴を蒸留水で洗浄し、50％メタノール中（50μｌ）の0.
1N NaOHを添加して染料を溶出させた。Dynatech Labs
社,Chantilly Va.から入手可能なTitertek Multiscan
MC上で、各穴の吸光度を595nmにおいて読み取った。
細胞数決定についての本アッセイの精度は、予め、血球
系計数により測定した既知の細胞数と、595nmにおける
吸光度との比較により評価した。ヒト線維芽細胞の刺激
化に対するIL-4の効果の結果を、図５にグラフで示す。

B. ヒトの皮膚及び肺の線維芽細胞組織細胞の増殖につ
いてのPDGFの効果を、PDGFを一連の２倍希釈法（２、
１、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.00
78ナノグラム／穴）により各穴に添加したことを除いて
は、実施例5aの方法に従って決定した。PDGFによるヒト
皮膚組織細胞の用量依存的刺激化を、図5bにグラフで示
す。

C. ヒトの、肺以外の皮膚組織細胞の刺激化におけるIL
-4による用量依存的促進化を、IL-4およびPDGFを各穴に
添加したことを除いては、実施例5Aの方法に従って決定
した。

ヒト皮膚線維芽細胞組織細胞株の増殖の、PDGFによる刺
激化に対するIL-4へ用量依存的促進化を、図5cにグラフ
で示す。

実施例６ヒト皮膚線維芽細胞組織細胞の刺激化に対する、rhIL-4
の用量依存的促進効果を、PDGFの代わりにEGFを使用し
たことを除いては、実施例5Aの方法に従って決定した。

ヒト線維芽細胞皮膚組織細胞の増殖に対するEGFの用量
依存的的効果を図6a中に示し、ヒト皮膚（肺ではない）
の線維芽細胞組織細胞増殖のEGFによる刺激化に対す
る、rhIL-4によるる用量依存的促進効果を図6bに示す。
図6bの結果から、創傷部位もしくはその近傍におけるIL
-4の投与は、創傷部位もしくはその近傍において既に存
在するもしくは放出されたEGFによるヒト皮膚線維芽細
胞の刺激化の促進により、創傷治癒及び修復を促進する
ことが予測される。ヒトの肺組織細胞の増殖における刺
激化は観察されなかった。

実施例７ IL-4を用いた創傷治癒のインビトロにおける促進化体重250-300グラムのSprague-Dawley種のオスのラット7
2匹を、35mg/kgのペントバルビツールを腹腔内注射する
ことにより麻酔した。４つの1.5cm²の穴を有するように
設計された銅の鋳型を各ラットの背中の湾曲部にあてが
った。この鋳型を使用して、各ラットの正中線上に、４
ケ所の、筋肉層を含む最大肥厚切除傷を作成した。

このラットを８つの群に分けた。最初の４つの群の創傷
は感染させず、後の４つの群には意図的に、５×10⁵の
大腸菌を混入させた。

対照群１は10匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷
に、一日一回５日間、0.1mlの食塩水賦形剤を注射し
た。

群２は10匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、
一日一回５日間、創傷の平方センチメートル面積当たり
0.1μｇのマウスIL-4を注射した。

群３は10匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、
一日一回５日間、創傷の平方センチメートル面積当たり
1.0μｇのマウスIL-4を注射した。

群４は９匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、
一日一回５日間、創傷の平方センチメートル面積当たり
10.0μｇのマウスIL-4を注射した。

群５の感染対照群は９匹のラットを含んでいた。各ラッ
トの創傷に５×10⁵の大腸菌を混入させ、かつ、0.1mlの
食塩水賦形剤を５日間毎日創傷内に注射した。

群６は、感染させた創傷を有する８匹のラットを含んで
いた。各ラットの創傷に５×10⁵の大腸菌を混入させ
た。各ラットの創傷に、一日一回５日間、創傷の平方セ
ンチメートル面積当たり0.1μｇのマウスIL-4を注射し
た。

群７は、感染させた創傷を有する７匹のラットを含んで
いた。各ラットの創傷に５×10⁵の大腸菌を混入させ
た。各ラットの創傷に、一日一回５日間、創傷の平方セ
ンチメートル面積当たり1.0μｇのマウスIL-4を注射し
た。

群８は、感染させた創傷を有する９匹のラットを含んで
いた。各ラットの創傷に５×10⁵の大腸菌を混入させ
た。各ラットの創傷に、一日一回５日間、創傷の平方セ
ンチメートル面積当たり10.0μCgのマウスIL-4を注射し
た。

この「混入させた」創傷には、新鮮な18時間のブイヨン
培養物から取得した５×10⁵の大腸菌ATCC＃25922を接種
した。これにより、急性の混入化創傷を作成した。手術
後、ラットをケージに戻し、食料と水とを随意に与え
た。

IL-4もしくは賦形剤を創傷端に注射した。創傷が完全に
閉鎖したとき、超過用量のペントバルビツールを腹腔内
注射することによりラットを屠殺した。各ラットの各創
傷から生じた瘢痕部分を、筋肉層を含む背面組織の8mm
の細長い切片の一部分として切除した。切片は、瘢痕部
分に対して垂直に採取した。その後、中心に瘢痕を有す
るこれらの切片を、INSTRON圧力機を使用して、5kgの負
荷圧力と１分当たり10mmのクロスヘッドスピードで破砕
した。得られた創傷の破壊強度を、瘢痕粉砕に必要なピ
ーク負荷として定義し、キログラムで表す。結果を、図
１、及び、以下の表１及び２に示す。

対照と比較して、ｐ＜0.05であった。

感染対照と比較して、ｐ＜0.005であった。

図７は、感染させた急性の創傷治癒モデルにおける、創
傷閉鎖の促進に対するIL-4治療の有効性を立証してい
る。全ての時点において、IL-4は、感染対照と比較し
て、開口したままの創傷の割合を低下させることができ
た。実際に、IL-4治療は、処置されていない非感染性創
傷に通常観察される比率での感染性創傷の治癒を可能に
した。表２のデータは、IL-4が、感染させた最大肥厚切
除創傷治癒の破壊強度を増大させることを示している。

実施例８本実験の主題は、糖尿病ラットにおける創傷治癒を誘導
するIL-4の能力の、インビボにおける研究を提示するこ
とである。

45mg/kgのストレプトゾトキシンを筋肉内注射すること
により、32匹のラットに真性糖尿病を誘導した。これら
のラットを個別の代謝ケージで飼育し、ラットの尿を、
標準的な尿検査用細片技術により毎日テストして、糖尿
とケトン尿とを決定した。３日間連続して糖尿病が確認
された後、動物をネンブタール全身麻酔法を使用して麻
酔した。上述の実施例７に記載した無菌技術を使用し
て、最大肥厚の皮膚及び筋肉層にわたる6cmの創傷を各
ラットの背中に作成した。その後、ラットを４つの群、
即ち、0.1μｇのIL-4を創傷端内に注射した群、1.0μｇ
のIL-4を創傷端内に注射した群、10.0μｇのIL-4を創傷
端内に注射した群、及び、食塩水賦形剤を創傷端内に注
射した群に分けた。損失を回避するために、動物が麻酔
から覚醒し、興奮し始めたときにIL-4を注射した。その
後、創傷を、5-0ナイロンの２本の単純縫合糸で閉鎖し
た。動物を麻酔から回復させ、それぞれのケージに戻し
た。半数のラットを７日目に屠殺し、残りの半数を創傷
形成後14日目に屠殺して、創傷の破壊強度によってコラ
ーゲン成熟の初期及び後期変異を調べた。

各創傷の破壊強度を決定するために、皮膚及び皮下組織
の１平方センチメートルの細片を創傷に対して垂直に採
取した。破壊強度は、INSTRON Tensiometer 4205を用
い、5kgの負荷及び10mm/分のクロスヘッドスピードで決
定した。破壊強度の増大は、創傷内のコラーゲンの沈着
及び成熟に良く相関することが示されている。この結果
を図８及び９に示す。

図８及び９は、創傷形成後それぞれ７日及び14日目にお
ける、非糖尿病及び糖尿病ラットの創傷の破壊強度の増
大に対するIL-4の有効性を証明している。左側の対照用
グラフに見られるように、糖尿病の動物は治癒不全を示
し、その結果創傷の破壊強度が低くなる。IL-4による治
療は、糖尿病の動物における破壊強度を、非感染性の最
高肥厚切除創傷治癒の破壊強度近くにまで増大させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ボバー，ロレッタ・エイアメリカ合衆国ニュージャージー州07036, リンデン，ラリタン・ロード 301

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン−４（IL−４）を含有す
る創傷治癒及び修復促進剤。
【請求項２】インターロイキン−４（IL−４）を含有す
る、真性糖尿病に病む哺乳類の創傷治癒及び修復促進
剤。
【請求項３】インターロイキン−４（IL−４）を含有す
る感染性創傷治癒及び修復促進剤。