JPH0552848A - 免疫測定法および装置 - Google Patents
免疫測定法および装置Info
- Publication number
- JPH0552848A JPH0552848A JP21185891A JP21185891A JPH0552848A JP H0552848 A JPH0552848 A JP H0552848A JP 21185891 A JP21185891 A JP 21185891A JP 21185891 A JP21185891 A JP 21185891A JP H0552848 A JPH0552848 A JP H0552848A
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- JP
- Japan
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- fine particles
- reaction
- sample
- antigen
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】
【目的】抗原抗体反応を利用した免疫測定において、凝
集ごとに蛍光強度を検知することにより、凝集状態を正
確に把握し、測定感度の向上を図る。 【構成】反応試薬に蛍光性微粒子を用い、反応後の反応
液をフローセルに導入し、それに光を照射する。試料中
の微粒子から凝集ごとに発生する強度の異なる蛍光を検
知することにより、凝集状態を測定する。 【効果】簡便な操作でかつ高感度な測定が出来る。従来
の試薬作製技術をそのまま利用出来る。
集ごとに蛍光強度を検知することにより、凝集状態を正
確に把握し、測定感度の向上を図る。 【構成】反応試薬に蛍光性微粒子を用い、反応後の反応
液をフローセルに導入し、それに光を照射する。試料中
の微粒子から凝集ごとに発生する強度の異なる蛍光を検
知することにより、凝集状態を測定する。 【効果】簡便な操作でかつ高感度な測定が出来る。従来
の試薬作製技術をそのまま利用出来る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体成分中の微量物質
の計測に係り、特に血液等の試料中の特定物質を簡便に
かつ高感度に測定する免疫測定に関する。
の計測に係り、特に血液等の試料中の特定物質を簡便に
かつ高感度に測定する免疫測定に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液等の試料中の微量成分を高感度に測
定するために、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が開
発されている。試料中の抗原と試薬として添加した抗体
の間に多次元の結合が生じ、凝集塊となる。これを光学
的に測定する。さらに測定感度を上げるために、ラテッ
クス凝集法が用いられている。抗原あるいは抗体を結合
させたラテックス粒子を試薬として用い、対応する試料
中の抗体あるいは抗原との凝集の度合いを散乱光強度測
定，濁度測定，電気抵抗検出，光音響検出などによって
感度を向上させたものである。それぞれの方法について
は、例えば臨床病理 臨時増刊５３号 ７１頁 １９７
５年、日本臨床検査自動化学会会誌 ９卷６７８頁 １
９８４年、アナリティカル ケミストリー ５９巻 ２
５１９頁１９８７年（Anal．Chem．５９，２５１９，
（１９８７））に論じられている。しかしながら、反応
した微粒子試薬と反応しなかった微粒子試薬が共存した
状態で計測するため、抗原濃度の低い領域では感度が悪
かった。これを改善するように、反応後の粒子試薬を凝
集ごとに計測する方法が開発されている。これについて
は例えば日本臨床検査自動化学会会誌 １２巻 ２９４
頁１９８７年に記載の粒度分布測定法がある。
定するために、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が開
発されている。試料中の抗原と試薬として添加した抗体
の間に多次元の結合が生じ、凝集塊となる。これを光学
的に測定する。さらに測定感度を上げるために、ラテッ
クス凝集法が用いられている。抗原あるいは抗体を結合
させたラテックス粒子を試薬として用い、対応する試料
中の抗体あるいは抗原との凝集の度合いを散乱光強度測
定，濁度測定，電気抵抗検出，光音響検出などによって
感度を向上させたものである。それぞれの方法について
は、例えば臨床病理 臨時増刊５３号 ７１頁 １９７
５年、日本臨床検査自動化学会会誌 ９卷６７８頁 １
９８４年、アナリティカル ケミストリー ５９巻 ２
５１９頁１９８７年（Anal．Chem．５９，２５１９，
（１９８７））に論じられている。しかしながら、反応
した微粒子試薬と反応しなかった微粒子試薬が共存した
状態で計測するため、抗原濃度の低い領域では感度が悪
かった。これを改善するように、反応後の粒子試薬を凝
集ごとに計測する方法が開発されている。これについて
は例えば日本臨床検査自動化学会会誌 １２巻 ２９４
頁１９８７年に記載の粒度分布測定法がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記抗原抗体反応に基
づく従来の測定方法に関しては、常に抗原過剰の反応条
件下での処理方法，共存物質による干渉を避ける方法な
どが不可避の問題となる。溶液内抗原抗体反応では、極
端な抗原過剰の場合に異常低値を示し、誤った測定値を
提出することになる。また血清中に通常存在するヘモグ
ロビン、あるいは乳びが増量した場合、高度希釈を行っ
ても光散乱や光吸収が起こるように、試料からの共存物
の影響が免れない。
づく従来の測定方法に関しては、常に抗原過剰の反応条
件下での処理方法，共存物質による干渉を避ける方法な
どが不可避の問題となる。溶液内抗原抗体反応では、極
端な抗原過剰の場合に異常低値を示し、誤った測定値を
提出することになる。また血清中に通常存在するヘモグ
ロビン、あるいは乳びが増量した場合、高度希釈を行っ
ても光散乱や光吸収が起こるように、試料からの共存物
の影響が免れない。
【０００４】さらにラテックス粒子を用い溶液内抗原抗
体反応させた後、そのまま濁度または散乱光強度測定す
る場合は、未反応微粒子試薬の影響を受け、高感度検出
不可という問題がある。
体反応させた後、そのまま濁度または散乱光強度測定す
る場合は、未反応微粒子試薬の影響を受け、高感度検出
不可という問題がある。
【０００５】凝集ごとに測定する方法の場合、光散乱法
による検知では、検出粒子の大きさに限界（波長のオー
ダ）がある一方、反応試薬に大きい粒子を用いると反応
効率が落ちる。
による検知では、検出粒子の大きさに限界（波長のオー
ダ）がある一方、反応試薬に大きい粒子を用いると反応
効率が落ちる。
【０００６】電気抵抗検出法では、検出粒子の大きさは
アパーチュアの大きさに制限される。アパーチュアを小
さくするとつまりやすく現実的でない。また光散乱法と
同様に外来のゴミ（粒子）の影響を受け、小さい粒子が
使えないという制約がある。光音響検出による方法で
は、粒径と励起光波長が一致する領域で感度は共鳴的に
増加するが、それ以下の領域では感度が非常に低いた
め、小さい粒子への適用は難しい。
アパーチュアの大きさに制限される。アパーチュアを小
さくするとつまりやすく現実的でない。また光散乱法と
同様に外来のゴミ（粒子）の影響を受け、小さい粒子が
使えないという制約がある。光音響検出による方法で
は、粒径と励起光波長が一致する領域で感度は共鳴的に
増加するが、それ以下の領域では感度が非常に低いた
め、小さい粒子への適用は難しい。
【０００７】また、上記測定方法は凝集に含まれる粒子
数に対し、測定信号がリニアでないため、正確な大きさ
が測定できない。
数に対し、測定信号がリニアでないため、正確な大きさ
が測定できない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は反応試薬に用いる微粒子として、キサンテ
ィン，ローダミンなどの蛍光色素を表面に結合させた、
もしくは内部に含有させたラテックス粒子を用いる。反
応後の反応液をフローセルに導入し、フローセルに光を
照射する。試料中の微粒子から凝集ごとに発生する強度
の異なる蛍光を検知することにより、凝集状態を測定す
る方法を用いる。
に、本発明は反応試薬に用いる微粒子として、キサンテ
ィン，ローダミンなどの蛍光色素を表面に結合させた、
もしくは内部に含有させたラテックス粒子を用いる。反
応後の反応液をフローセルに導入し、フローセルに光を
照射する。試料中の微粒子から凝集ごとに発生する強度
の異なる蛍光を検知することにより、凝集状態を測定す
る方法を用いる。
【０００９】
【作用】上記のように本発明方法では、粒子が蛍光性な
ので、微小な粒子の測定も容易に行える。したがって反
応に都合の良い小さい粒子を試薬として用いることがで
きる。
ので、微小な粒子の測定も容易に行える。したがって反
応に都合の良い小さい粒子を試薬として用いることがで
きる。
【００１０】本発明方法では、蛍光検出のため、血清成
分または外来ゴミ，粒子などの影響を受けにくい。
分または外来ゴミ，粒子などの影響を受けにくい。
【００１１】また本発明方法は凝集ごとに検出している
ので、未反応の粒子試薬の影響なく測定できる。
ので、未反応の粒子試薬の影響なく測定できる。
【００１２】さらに蛍光強度は粒子中の色素含有量に比
例するので、本発明方法に依れば、凝集の大きさ（微粒
子の数）に対しリニアな応答が得られ、正確な凝集状態
の把握が可能である。
例するので、本発明方法に依れば、凝集の大きさ（微粒
子の数）に対しリニアな応答が得られ、正確な凝集状態
の把握が可能である。
【００１３】
【実施例】本発明の実施例を図面を用いて説明する。
【００１４】ラテックス凝集反応の一例を図１により説
明する。
明する。
【００１５】蛍光色素を含有する非抗原性のラテックス
粒子が担体となって、その表面に特異抗体（あるいは抗
原）が結合されており、血清などの試料中の抗原（ある
いは抗体）の存在下で抗原抗体反応により、ラテックス
粒子が抗原を介して互いに結合し、反応条件に応じた大
きさ分布をもつ凝集体を形成する。
粒子が担体となって、その表面に特異抗体（あるいは抗
原）が結合されており、血清などの試料中の抗原（ある
いは抗体）の存在下で抗原抗体反応により、ラテックス
粒子が抗原を介して互いに結合し、反応条件に応じた大
きさ分布をもつ凝集体を形成する。
【００１６】次に吸光度法や濁度法で検出できなかった
濃度領域（例えば１０−11Ｍ）の抗原を上記のように、
免疫反応させて得た試料溶液をフローセルに導入し、本
法によって蛍光検出した。反応前と反応後の測定結果を
それぞれ図２に示した。図に示したように反応前、すな
わちブランクのヒストグラムには、蛍光微粒子試薬を反
映する一本のピークが現れたのに対して、反応後のヒス
トグラムには、前記のピーク以外に、凝集に対応した何
本のピークが得られた。この結果より、抗原の濃度が非
常に低い場合でも、ブランクとの違いがはっきり認めら
れたことから、本発明は従来法より感度が高く、定量範
囲が広いことが分かり、また未反応の微粒子試薬の影響
を受けないことが分かった。
濃度領域（例えば１０−11Ｍ）の抗原を上記のように、
免疫反応させて得た試料溶液をフローセルに導入し、本
法によって蛍光検出した。反応前と反応後の測定結果を
それぞれ図２に示した。図に示したように反応前、すな
わちブランクのヒストグラムには、蛍光微粒子試薬を反
映する一本のピークが現れたのに対して、反応後のヒス
トグラムには、前記のピーク以外に、凝集に対応した何
本のピークが得られた。この結果より、抗原の濃度が非
常に低い場合でも、ブランクとの違いがはっきり認めら
れたことから、本発明は従来法より感度が高く、定量範
囲が広いことが分かり、また未反応の微粒子試薬の影響
を受けないことが分かった。
【００１７】さらに、図２の測定データに基づいて、蛍
光強度を凝集の大きさに対してプロットした。その結
果、図３に示したように、凝集の大きさすなわち微粒子
の数に比例して蛍光強度が増大していることを判明し
た。したがって本法は外来ゴミ，粒子等の影響なく凝集
状態を正確に把握できることが分かった。
光強度を凝集の大きさに対してプロットした。その結
果、図３に示したように、凝集の大きさすなわち微粒子
の数に比例して蛍光強度が増大していることを判明し
た。したがって本法は外来ゴミ，粒子等の影響なく凝集
状態を正確に把握できることが分かった。
【００１８】次に本発明を実施する装置の一例を示す。
【００１９】図４は計数装置の概略を説明するものであ
る。凝集反応させた後の反応液は試料導入装置１より導
入され、ポンプ１７により、チューブ２を通って一定流
速でフローセル３に送られる。レーザ８から発振された
レーザ光をレンズ９により絞りフローセル３中を流れる
試料流に照射する。粒子がレーザビームを通過する際に
発せられるパルス状の蛍光をレンズ１０で集光し、フィ
ルタ１１を通過させて光電子増倍管１２で検出する。光
電子増倍管１２で電気信号に変換した出力はアンプ１３
で増幅し、波高分析器１５に入力する。波高分析器１５
ではあらかじめ設定しておいた上限および下限を与える
２種の閾値の間にあるパルスのみをカウントする。パル
スの数が粒子数になる。試料導入装置１にスイッチ４を
設け、試料導入と同時にトリガ信号５をディレイタイマ
６に送り、ディレイ時間をおいて、測定開始の指示信号
７を波高分析器１５に入力し測定操作を開始させる。波
高分析器１５にて１次処理結果１４をパーソナルコンピ
ュータ１６に送り、データ処理し結果を表示する。
る。凝集反応させた後の反応液は試料導入装置１より導
入され、ポンプ１７により、チューブ２を通って一定流
速でフローセル３に送られる。レーザ８から発振された
レーザ光をレンズ９により絞りフローセル３中を流れる
試料流に照射する。粒子がレーザビームを通過する際に
発せられるパルス状の蛍光をレンズ１０で集光し、フィ
ルタ１１を通過させて光電子増倍管１２で検出する。光
電子増倍管１２で電気信号に変換した出力はアンプ１３
で増幅し、波高分析器１５に入力する。波高分析器１５
ではあらかじめ設定しておいた上限および下限を与える
２種の閾値の間にあるパルスのみをカウントする。パル
スの数が粒子数になる。試料導入装置１にスイッチ４を
設け、試料導入と同時にトリガ信号５をディレイタイマ
６に送り、ディレイ時間をおいて、測定開始の指示信号
７を波高分析器１５に入力し測定操作を開始させる。波
高分析器１５にて１次処理結果１４をパーソナルコンピ
ュータ１６に送り、データ処理し結果を表示する。
【００２０】パーソナルコンピュータ１６では予め設定
しておいたプログラムに従って、指示信号１８をだし、
測定操作の進行を制御する。
しておいたプログラムに従って、指示信号１８をだし、
測定操作の進行を制御する。
【００２１】また励起光としてアルゴンガスレーザやヘ
リウムネオンレーザなどの気体レーザ、またはＹＡＧレ
ーザなどの固体レーザや半導体レーザ、またはこれらの
発振線を基本波とした第２または第３高調波を用いるこ
とができる。
リウムネオンレーザなどの気体レーザ、またはＹＡＧレ
ーザなどの固体レーザや半導体レーザ、またはこれらの
発振線を基本波とした第２または第３高調波を用いるこ
とができる。
【００２２】
【発明の効果】簡便な操作でかつ高感度な測定が出来
る。従来の試薬作製技術をそのまま利用出来る。
る。従来の試薬作製技術をそのまま利用出来る。
【図１】ラテックス凝集反応の一例を示す図である。
【図２】反応前と反応後試料のヒストグラムを示す図で
ある。
ある。
【図３】蛍光強度と凝集の大きさとの関係を示す図であ
る。
る。
【図４】測定装置の一例を示す構成図である。
１…インジェクタ、２…チューブ、３…フローセル、４
…トリガー、８…レーザ、９…レンズ、１０…レンズ、
１１…フィルタ、１２…光電子増倍管、１３…アンプ、
１５…波高分析器、１６…パソコン、１７…ポンプ。
…トリガー、８…レーザ、９…レンズ、１０…レンズ、
１１…フィルタ、１２…光電子増倍管、１３…アンプ、
１５…波高分析器、１６…パソコン、１７…ポンプ。
Claims (5)
- 【請求項１】微粒子の表面に抗体又は抗原を感作させた
試薬を準備し、該試薬と測定すべき試料を反応させて、
試料中に含まれる抗原又は抗体を介して生じる微粒子の
凝集状態を計測することにより、試料中の抗原濃度又は
抗体濃度を測定する免疫測定法において、微粒子が蛍光
性であり、反応後の微粒子の凝集状態の計測を１凝集塊
ごとに蛍光強度を検知することにより行なうことを特徴
とする免疫測定法。 - 【請求項２】請求項１記載の微粒子が球状であり、その
直径が０.５μｍ以下であることを特徴とする免疫測定
法。 - 【請求項３】請求項１記載の微粒子がポリスチレン，ポ
リメタクリル酸メチル，ポリヒドロキシエチルメタクリ
ルレート、のうちいずれかを主成分とし、蛍光色素を粒
子の表面に結合させるか、もしくは粒子の内部に含有さ
せることを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項４】請求項１記載の微粒子に蛍光性を与える成
分が、ローダミン，ニールブルー，ニールレッド，メチ
レンブルー，チオニンクロリド，フルオレセイン，テキ
サスレッド，アクリジンオレンジ，フィコビリタンパク
であることを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項５】試料を反応容器に分注する機構，微粒子を
含む試薬を反応容器に分注する機構，反応後の反応液を
フローセルに導入する機構，フローセルに光を照射し、
試料中の微粒子から発生する蛍光を検出する機構、およ
び得られた信号を処理する機構からなることを特徴とす
る免疫測定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21185891A JPH0552848A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 免疫測定法および装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21185891A JPH0552848A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 免疫測定法および装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0552848A true JPH0552848A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16612769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21185891A Pending JPH0552848A (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 免疫測定法および装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0552848A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001096868A3 (en) * | 2000-06-12 | 2003-01-30 | Sysmex Corp | Immunoassay and immunoassay apparatus |
| JP2009258034A (ja) * | 2008-04-21 | 2009-11-05 | Fujifilm Corp | 表面プラズモン放射光検出方法および装置、表面プラズモン放射光検出用試料セルおよびキット |
| JP2010190880A (ja) * | 2008-04-18 | 2010-09-02 | Fujifilm Corp | 光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キット |
| JP2010223802A (ja) * | 2009-03-24 | 2010-10-07 | Fujifilm Corp | 光信号検出方法 |
-
1991
- 1991-08-23 JP JP21185891A patent/JPH0552848A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001096868A3 (en) * | 2000-06-12 | 2003-01-30 | Sysmex Corp | Immunoassay and immunoassay apparatus |
| CN1317394C (zh) * | 2000-06-12 | 2007-05-23 | 希森美康株式会社 | 免疫测定方法和免疫测定装置 |
| JP4796265B2 (ja) * | 2000-06-12 | 2011-10-19 | シスメックス株式会社 | 免疫測定方法及び免疫測定装置 |
| JP2010190880A (ja) * | 2008-04-18 | 2010-09-02 | Fujifilm Corp | 光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キット |
| JP2009258034A (ja) * | 2008-04-21 | 2009-11-05 | Fujifilm Corp | 表面プラズモン放射光検出方法および装置、表面プラズモン放射光検出用試料セルおよびキット |
| JP2010223802A (ja) * | 2009-03-24 | 2010-10-07 | Fujifilm Corp | 光信号検出方法 |
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