JPH055307B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は検出可能なマーカーを含む小袋（sac）
およびこれを被分析体のアツセイに使用すること
に関する。さらに本発明はリガンドで感作された
検出可能なマーカーを含む小袋、およびこれを被
分析体のアツセイに使用することに関する。 （従来技術） 検出可能なマーカーを含む小袋、特に脂質の小
のう（嚢）（vesicle）がリガンド（被分析体）の
アツセイに用いられている。代表的なアツセイ法
においては、分析すべきリガンド（被分析体）、
およびトレーサー（被分析体またはその適宜な同
族体で感作された検出可能なマーカーを含む小袋
からなる）が被分析体に対する結合剤上の限られ
た数の結合部位に対して競合する。結合剤に結合
するトレーサーの量は試料中の被分析体の量に反
比例する。結合トレーサー成分と遊離トレーサー
成分を分離したのち、結合トレサーおよび／また
は遊離トレーサーの量は試料の結合トレーサー部
分および／または遊離トレーサー部分における検
出可能なマーカーを測定することによつて確認さ
れ、これが試料中の被分析体の尺度を与える。 しかし多くの場合、検出可能なマーカーを含む
小袋は、検出可能なマーカーがアツセイの前また
は途中で小袋から“漏出する”という点で十分な
安定性をもたず、これによりアツセイにおけるこ
の種の小袋の有効性が制限される。ここで用いる
“漏出する”という語は、材料が無傷の小袋から
散逸すること、または小袋が破損したため材料が
散逸することを意味する。 小袋内の吸光性色素を使用する試みにおいて
は、色素の漏出または小袋の破損により生じる問
題のほかに、吸光性色素は簡単な計測器で許容で
きる精度および正確度をもつて読み取るのに十分
な信号を与えない。 従つて検出可能なマーカーを含む改良された小
袋が求められている。 （発明の構成） 本発明の一観点によれば、水中で測定して少な
くとも100000である吸光係数をもつ吸光性色素を
含む小袋が提供される。さらにこの色素は水中に
少なくとも0.1Mの濃度で溶解しうる。 検出可能なマーカーとして小袋に含まれる色素
は、正味負電荷または正味正電荷である正味電
荷、好ましくは正味負電荷をもつ色素でもある。
色素の電荷は、電荷が等しいことにより小袋から
の漏出が防止されるという点で小袋を形成する材
料の電荷と等しいことが好ましい。さらに色素は
PH５〜９で完全にイオン化するものであることが
好ましい。 本発明者は、上記の特色により色素が小袋の内
側から漏出することはないという点で安定性を高
めることを見出した。さらに被分析体のアツセイ
に用いた場合、この種の色素を含む小袋はアツセ
イにおいて改善された感度を与える。 特に好ましい実施態様によれば、小袋の内側に
含まれる吸光性色素はスルホローダミンＢ染料、
特に遊離塩基または塩（たとえばナトリウルム
塩、リチウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩な
ど）としてのスルホローダミンである。 一般に色素は少なくとも．001M、好ましくは
少なくとも．05Mの濃度で小袋に含まれる。小袋
内の色素の濃度は水中におけるその色素の溶解度
を越えない。 本発明の他の観点においては、前記の種類の吸
光性色素を含む小袋をリガンド（抗原、ハプテン
または抗体である）で感作する。 本発明の他の観点によれば、前記の吸光性色素
を含む小袋を被分析体のアツセイに用いる。吸光
性色素を含む小袋は、個々のアツセイ法に応じて
リガンドで感作して、または感作せずに使用でき
る。 内側に吸光性色素を含む小袋は、当技術分野で
一般に知られている多種多様な小袋のいずれであ
つてもよく、これにはポリマーマイクロカプセル
（たとえばコアセルベーシヨンまたは界面重合に
より製造されるもの）、または多種多様な材料か
ら製造できる小のう、好ましくは脂質から製造さ
れるものが含まれる。小のうが脂質を含む場合、
これはしばしばリポソームと呼ばれるが、当技術
分野で知られているように、小のうは脂質でない
両親媒性成分から製造することもできる。当技術
分野で知らているように、リポソームは多種多様
な脂質から製造することができ、これにはリン脂
質、糖脂質、ステロイド、比較的長鎖のアルキル
エステル、たとえばリン酸アルキル、脂肪酸エス
テル、たとえばレシチン、脂肪アミンなどが含ま
れる。脂肪質の混合物、たとえば中性ステロイ
ド、帯電した両親媒性物質およびリン脂質も使用
できる。リン脂質の代表例としては、スフインゴ
ミエリン、ジパルミトイル、レシチンなどがあげ
られる。代表的なステロイドとしては、コレステ
ロール、コレスタノール、ラノステロールなどが
あげられる。帯電した両親媒性化合物（一般に12
〜30個の炭素原子を含む）の代表例としては、リ
ン酸モノーまたはジアルキルエステル、第四アン
モニウム塩、またはアルキルアミン；たとえばリ
ン酸ジセチル、ジステアリルアミン、ジヘキサデ
シルアミン、リン酸ジラウリル、スルホン酸ジオ
クタデシル、ジドデシルジオクチルアンモニウム
ホルミドなどがあげられる。 小のうは多種多様な方法のいずれによつても製
造できる。たとえばリポソームはたとえば米国特
許第4235871号明細書に記載の反転エマルジヨン
法により製造できる。この方法では小のうを形成
する物質（一般にリン脂質）および小のうに封入
すべき色素を含有する油中水型エマルジヨンを調
製し、次いで溶剤を蒸発させてゲル様混合物とな
し、このゲル様混合物を攪拌するかまたは水に添
加することによつて小のうに変える。 封入された物質を含む小袋を製造するための他
の方法が米国特許出願第650200号明細書（1984年
９月13日出願）に記載されており、この種の方法
も本発明による吸光性色素を含む小袋の製造に採
用できる。 封入されたマーカーを含む小袋を製造するため
の他の方法が米国特許第4343826号およびPCT国
際公開第WO80／01515号各明細書にも示されて
おり、これらの方法も本発明に応用できる。 ポリマーマイクロカプセルは当技術分野で知ら
れている方法により製造される。ただしマイクロ
カプセルがその中において形成される溶液は吸光
性色素をも含有し、これによりポリマーマイクロ
カプセル内に色素が含まれる。この種のマイクロ
カプセルの製造は、たとえば“マイクロカプセル
封入法および用途”（イー・フアンデガー編、プ
レナム・プレス、1947年）に示されている。 前記のように、吸光性色素を含む小袋をリガン
ドで感作できる。リガンドは一般に抗原、抗体ま
たはハプテンであり、感作した状態でこれらの小
袋を被分析体のアツセイに使用できる。たとえば
リガンドを各種の方法（共有結合、誘導体化、活
性化など）で小袋に結合させることによつて、小
袋をリガンドで感作できる。小袋を適宜なカツプ
リング化合物またはスペーサー化合物（リガンド
の免疫反応性を破壊しないもの）の使用によつて
リガンドに結合させることができる。当技術分野
で知られているように、カツプリング化合物は２
個の反応性官能基をもち、これらの官能基のうち
一方はトレーサーのリガンド部分の官能基と反応
または結合可能であり、他方は小袋の官能基と反
応または結合可能である。少なくとも２個の反応
性置換基を含むスペーサー化合物またはカツプリ
ング化合物はたとえばカルボキシル基、イソシア
ネート基、イソチオシアネート基、アミノ基、チ
オール基、水酸基、スルホニル基、カルボニル基
などの置換基を含有する。これらは明らかなよう
に相互に結合すべきリガンドおよび小袋に存在す
る官能基に依存する。 あるいは小袋をリガンドに直接に結合させるこ
ともできる。たとえばトレーサーのリガンド部分
がアミノ置換基をもち、トレーサーの小袋部分が
カルボニルまたはカルボキシル置換基をもつ場
合、リガンドと小袋を当技術分野で既知の方法、
たとえば活性エステル法により相互に直接に結合
させることができる。 リガンドを小袋の形成に用いられる物質のうち
の１種と結合させることにより、または小袋が形
成されたのちこれらにリガンドを結合させること
により小袋をリガンドで感作させることができ
る。この種の方法は当技術分野で一般に知られて
おり、本発明を完全に理解するためにこれに関す
る詳細は不必要であると考える。 前記のように、前記の種類の吸光性色素を含む
小袋は試料中の被分析体を測定するためのアツセ
イに使用できる。小袋はリガンドで誘導体化され
ていても、いなくてもよい。 小袋を試料中の被分析体の測定に用いるために
リガンドで誘導体化する場合、誘導体化された小
袋は一般に当技術分野で“トレーサー”と呼ばれ
る。小袋の誘導体化に用いられるリガンドは、測
定すべき被分析体に依存する。たとえばアツセイ
が抗原またはハプテンの測定のための競合アツセ
イである場合、トレーサーの製造に用いられるリ
ガンドは被分析体またはその適宜な同族体である
（“適宜な同族体”という語は、被分析体のその同
族体が被分析体に対する結合剤に結合することを
意味する）。 アツセイが“サンドイツチ”型のアツセイであ
る場合、トレーサーの製造に用いられるリガンド
はアツセイすべき被分析体に特異的なリガンド、
たとえばアツセイすべき抗体または抗原に応答し
て誘発された抗体である。 たとえば、明らかなようにトレーサーの製造に
用いられるリガンドは抗原、ハプテンまたは抗体
のいずれであつてもよい。 アツセイに用いられる結合剤も被分析体に依存
する。たとえば被分析体が抗原またはハプテンで
ある場合、結合剤は被分析体に特異的な抗体また
は天然物質である。被分析体が抗体である場合、
結合剤は被分析体に特異的な抗体、抗原または天
然物質である。 アツセイに用いられる結合剤は支持された形ま
たは支持されていない形で使用できる。支持され
ている場合、結合剤はアツセイにおいて結合剤に
対する支持体として適切であることが一般に知ら
れている多種多様な物質上に支持させることがで
きる。この種の物質の代表例として、ポリマー、
ガラス粒子、細菌細胞などがあげられる。固体支
持体はシート状、管状を含む多種多様な形状、あ
るいはカードまたは試験紙などであつてもよい。 従つて本発明の他の観点によれば、結合剤およ
びトレーサーを使用し、その際結合剤は少なくと
も被分析体に結合し、トレーサーには被分析体お
よび結合剤の一方が結合して、アツセイにおいて
遊離および結合トレーサー画分を与える、試料中
における被分析体のアツセイ法が提供される。こ
のアツセイ法において、前記の種類の吸光性色素
を含む小袋がアツセイにおける検出可能なマーカ
ー源である。 代表的アツセイ法においては、被分析体を含む
かまたは含む疑いのある試料をトレーサー（検出
可能なマーカーとして吸光性色素、特にスルホロ
ーダミンＢまたはその塩を含む小袋に結合した被
分析体またはその適宜な同族体）および結合剤
（被分析体およびトレーサーの双方に特異的；結
合剤は好ましくは固体支持体に支持されている）
と共にインキユベートする。このインキユベーシ
ヨンによつて、トレーサーと被分析体の間で結合
剤上の結合部位に対して競合が起こる。結合剤に
結合したトレーサーの量は試料中の被分析体の量
に反比例する。 インキユベーシヨンは小袋の早期破壊を防止す
る条件下で行われる。アツセイのこの部分は一般
に小袋の浸透圧と等張の適宜緩衝化された水性媒
質中で行われる。たとえば小袋の早期破壊を防ぐ
ために、温度、PHおよびイオン濃度などの条件を
制御する。たとえば小袋の浸透圧と等張の水性緩
衝媒質を供給する。一般に緩衝液は５〜９程度の
PHを備えている。 結合トレーサー画分と遊離トレーサー画分を分
離したのち、色素を結合画分および／また遊離画
分から、当技術分野で既知の方法（たとえば小の
うの溶解のための界面活性剤または酵素系溶解剤
の使用）で小袋を溶解することにより放出させる
ことができる。そこで試料中の被分析体の測定の
ために、放出された吸光性色素の量を測定する。
こうして、当技術分野で一般に行われているよう
に、アツセイに関して得られた値を、既知量の被
分析体（既知濃度の標準被分析体；これは試料中
の未知量の被分析体の測定のために使用できる標
準曲線の作成のために用いられる）を用いて等し
い方法により得た値と比較する。 前記の種類の吸光性色素（リガンドで感作され
る）を含む小袋から形成されるトレーサーも、色
素の放出のために小袋を溶解することなく試料中
の被分析体を測定するために使用できる。この種
のアツセイは米国特許出願第579667号明細書
（1984年２月14日出願）に記載されている。この
種の方法によれば、被分析体およびトレーサーの
少なくとも一方に対する結合剤が、固体支持体表
面に位置する試験領域上に支持される。その際結
合剤は、アツセイに用いられるトレーサーが結合
剤または結合剤に結合した被分析体に結合した際
それ以上処理することなくアツセイ条件下で支持
体上に見える濃度で、固体支持体の試験領域に支
持される。同明細書に記載されるように好ましい
固体支持体はセルロースエステルであり、ニトロ
セルロースがきわめて良好な結果を与える。 上記明細書に記載されるように、固体支持体上
に支持される結合剤は被分析体およびトレーサー
の双方に対する結合剤であるから、または被分析
体およびトレーサーの一方のみに対する結合剤で
あり、用いられる結合剤の種類は被分析体の測定
のために採用されるアツセイに依存する。 この種の方法の一つにおいては、固体支持体上
に適宜な濃度支持される結合剤をまず被分析体
（たとえば抗原）と接触させる。次いで固体支持
体上の結合剤に結合した抗原をトレーサーと接触
させる。このトレーサーは前記の型の吸光性色素
（特にスルホローダミンＢまたはその塩）を含む
小袋であり、小袋は被分析体に対する抗体で感作
されている。固体支持体上の結合剤に被分析体を
介して結合したトレーサーの量は試料中の被分析
体の量と正比例し、試料中に存在する被分析体の
存在および／または量は被分析体を介して支持体
に結合したトレーサーの存在および／または量か
ら測定できる。この方法によれば、トレーサーの
量および／またはトレーサーの存在は小袋を溶解
せずに視覚的に判定できる。 場合によつては、前記の種類の吸光性色素を含
む小袋は、小袋を誘導体化することなく被分析体
のアツセイに使用することができる。たとえばあ
る種のアツセイ法においては、試料中の被分析体
を固体支持体上に支持された、被分析体に対する
結合剤、およびトレーサー（被分析体、または酵
素系溶解剤で誘導体化されたその適宜な同族体）
と共にインキユベートする。トレーサーおよび被
分析体は結合剤上の結合部位に対して競合する。
その結合画分と遊離画分を分離したのち結合部分
および／または遊離部分を前記の種類の吸光性色
素を含む小のうと接触させる。小袋からのマーカ
ーの放出率および／または小袋から放出されるマ
ーカーの量は、結合画分および／または遊離画分
中のトレーサーの量に依存する。当技術分野で一
般に行われているように、既知量の被分析体を用
いてアツセイを反復することによつて標準曲線が
作成される。 従つて明らかなように前記の種類の吸光性色素
を含む小袋は各種のアツセイに使用でき、この種
の小袋をリガンドで誘導体化して、または誘導体
化せずにアツセイに使用できる。 アツセイは多種多様な試料中で行うことができ
る。大部分の場合、アツセイは体液、たとえば血
清、尿、痰などの試料中で行われる。 このアツセイ法は各種の被分析体の測定に採用
できる。被分析体の種類の代表例としては下記の
ものがあげられる。薬物（治療薬および誤用され
る薬物を含む）；ホルモン、ビタミン；蛋白質
（あらゆる種類の抗原を含む）；ペプチド；ステロ
イド；細菌；菌類；ウイルス；寄生虫；細菌；菌
類、ウイルスまたは寄生虫の成分または産生物；
あらゆる種類のアレルゲン；正常細胞または悪性
細胞の産生物または成分など。個々の例としては
T₄；T₃；ジゴキシン；HCG；インシユリン；テ
オフイリン；抗生物質、たとえばゲンタマイシン
およびトブラマイシン；抗痙攣薬、たとえばフエ
ノバルビタール、カルバメザピン、バルプロン酸
（valproic acid）；抗不整脈薬、たとえばリドカ
イン、キニジンなどがあげられる。 以上のように本発明によれば特異性をもつ吸光
性色素を含む小袋、特に小のうまたはリポソーム
が提供され、その際吸光性色素はスルホローダミ
ンＢまたはその塩であり、この種の小袋はリガン
ド、特に抗原、ハプテンまたは抗体で誘導体化さ
れていてもいなくてもよい。小袋はリガンドで誘
導体化されている場合特に試料中の被分析体のア
ツセイにおいてトレーサーとして有用である。 小袋中に用いられる色素は吸光性色素であるが
これらの色素は螢光性をも有する。従つて本発明
の範囲においてこの種の吸光性色素を吸光性によ
るよりもむしろ螢光によつて検出することもでき
る。 本発明を下記の例に関して詳述するが、これに
よつて本発明の範囲が限定させるものではない。 例 １ リポソームの製造 １ 100mlの回転蒸発器用丸底フラスコに下記の
ものを添加した。 ａ コレステロール48mg、シグマ＃CH−Ｓ。 ｂ ジステアロイルホスフアチジルコリン
（DSPC）104mg、アバンチ・ポーラー・リピ
ド＃850365（CHCl₃中 20mg／ml）。 ｃ 架橋剤（ジステアロイルホスフアチジルエ
タノールアミン−（ｐ−マレイミドフエニル）
ブチレート（DSPE−MPB）3.75mg、自家
製、CHCl₃中２mg／ml、（例1Aに記載）。 ｄ イソプロピルエーテル6.0ml、フイツシヤ
ー＃Ｅ−141。 ｅ メタノール1.0ml、アルドリツチ＃15、490
−３。 ２ 回転混合した。 ３ 0.1MスルホローダミンB5.0mlを添加した。
イーストマン＃14321、0.1M酢酸ナトリウム／
0.1M・NaCl、PH4.5の緩衝液中に調製。 ４ 回転混合した。 ５ 容器をN₂でフラツシした。 ６ 乳化するために室温の水浴型超音波発生装置
中で10分間、超音波処理した。 ７ 下記のとおり調整された回転蒸発器に乗せ
た。 水浴温度＝44℃ 回転速度＝４ ８ 発泡が止むまで徐々に真空度を高めた（約30
〜40分）。 ９ 圧力を低下させ、リポソームを44℃で30分間
アニールした。 10 加温された（50〜52℃）0.1Mスルホローダ
ミンB10mlを容器に添加し、混合した。 11 温リポソーム調製液を0.4ミクロン、次いで
0.2ミクロンのバイオーラド・ユニポア（Bio−
Rad Unipore）ポリカーボネート膜（それぞ
れバイオーラド＃313−0059および＃313−
5059）を通して押出した。 12 リポソームを90mlの超遠心管中で酢酸ナトリ
ウム／食塩緩衝液（PH4.5）により約80mlの総
容積に希釈した。 13 75000×ｇで30分間遠心分離した。 14 ペレツト化したリポソームを酢酸ナトリウ
ム／食塩緩衝液（PH4.5）で80mlに再懸濁した。 15 ＃13および＃14を繰返し、次いで＃13を再び
繰返した。 16 ペツト状リポソームをトリス緩衝液（PH8.0）
（50ｍＭトリス、100ｍＭ・NaCl、１ｍＭ・
EDTA、310ｍOs／Kg）に再懸濁した。 17 蛋白質反応まで４℃に保持した。 例1A 例１で用いたジステアロイルホスフアチジルエ
タノールアミン−マレイミドフエニル−ブチレ
ートの製造 ジステアロイルホスフアチジルエタノールアミ
ン（119.2mg、0.1593ミリモル）、アバンチ・ポー
ラー・リピド）をクロロホルム30mlに懸濁し、固
体がすべて溶解するまで窒素雰囲気下で加熱還流
した。溶液を室温にまで放冷したのちトリエチル
アミン（22.2μ、0.1593ミリモル、アルドリツ
チ）およびスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイ
ミドフエニル）ブチレート（79.45mg、0.2230ミ
リモル、ピアス）を添加した。反応混合物を室温
で窒素雰囲気下に一夜攪拌した。混合物を減圧下
で濃縮して淡黄色ろう状固体（270.7mg）を得た。
これはTLC分析（シリカ、65：25：4CH₂Cl₂：
CH₃OH：H₂O）に際し１個の主スポツトおよび
数個の副スポツトとして現われた。スポツトを紫
外線およびモリブデンブルースプレー試薬（シグ
マ）で可視化した。R0.5。 粗生成物を４枚のシリカゲル分取用厚型薄層板
（イー・メルク、2.0mm）上で65：25：4CH₂Cl₂：
CH₃OH：H₂Oで展開しながらクロマトグラフイ
ー処理した。２列のモリブデンブルー活性バンド
のうち上方のバンドを単離し、生成物を50％
CH₂Cl₂：C₂H₅OHで抽出した。溶剤を蒸発させ
ることにより生成物を白色固体（65.75mg）とし
て得た。 IR（ニート）：2910(s)、2845(s)、1734(s)、1715(s)、
1510(m)、1460(m)、1390(m)、1370（mw）、1242
(m)、1230(m)、1100(m)、1060(m)、905(m)、820(m)、
685cm^-1(m) こうして得られたリポソームはローダミン染料
を含み、当技術分野で既知の方法によりリガンド
で感作して本発明に用いるトレーサーを製造する
ことができる。 リポソーム（例１）で抗体で感作することによ
るトレーサーの製造 例 ２ １ 蛋白質Ａ精製抗体８mgに酢酸ナトリウム／食
塩緩衝液（PH4.5）中の1M・ジチオスレイトー
ル0.4mlを添加した。 ２ 室温、暗所で磁気攪拌し、30分間反応させ
た。 ３ 反応混合物を、トリスPH8.0緩衝液（50ｍＭ
トリス、100ｍＭ食塩液、１ｍＭ・EDTA、
310ｍOs／Kg）で平衡化したセフアデツクスＧ
−25を媒体とするカラムを通過させることによ
りジチオスレイトールを除去した。 ４ O.D.280を監視し、各画分をプールした。 ５ この溶液を新たに調製したリポソーム10mlと
混合した。 ６ N₂でフラツシし、密封した。 ７ 室温で一夜反応させた。 ８ これらの蛋白質標識リポソームを標準トリス
緩衝液を用いて遠心分離により２回洗浄した。 ９ 最後の洗浄ののち、ペレツトをトリス40ml中
に再懸濁した。 10 ４℃に保存した。 HCGに関するニトロセルロースデイスクイム
ノアツセイ（妊娠試験） 試 薬 １ 吸着緩衝液５（AB₅）：BD、カタログ
＃614335。 ２ HCGのα鎖に対するHCG抗体。 ３ ニトロセルロース紙：シユリーヘル・アン
ド・シユイル、ME25、細孔0.45μｍ。 ４ ウシ血清アルブミン：シグマ、カタログ＃Ａ
−7906。 ５ 尿対照：BDI、カタログ＃255815。 ６ トレーサー：例１の方法により製造され、例
２の方法によりHCG鎖に対する抗体で感作さ
れたリポソーム。 方 法 １ ニトロセルロース紙の１cmのデイスクを切取
つた。 ２ HCG抗体の１：50希釈液（AB5中に希釈を
行つた）3μをデイスクの中央にピペツトで
移した。 ３ 室温で15分間乾燥させた。 ４ AB5中の５％BSA（使用前に0.45ミクロンの
フイルターで過した）300μを各デイスク
にピペツトで移した。 ５ デイスクを37℃で１時間インキユベートし
た。 ６ 液体をデカントした。 ７ 尿対照または尿200μをピペツトで移した。 ８ 室温で１時間インキユベートした。 ９ 対照または尿をデカントした。 10 デイスクを1.5mlのAB5で２回洗浄した。 11 トレーサーの１：12希釈液（希釈はAB5中
で行われた）300μを各デイスクにピペツト
で移した（貯蔵リポソームは脂質約１マイクロ
モル／mlを含有していた）。 12 室温で１時間インキユベートした。 13 トレーサーをデカントした。 14 1.5mlのAB5で２回洗浄した。 15 可視スポツトは妊娠に関して陽性である。

【表】

【表】 RIAはBD HCG¹²⁵Iキツトにより行われた。 例 ４ ジステアロイルホスフアチジルエタノールアミ
ン−ジゴキシゲニンの製造 ジステアロイルホスフアチジルエタノールアミ
ン（400.0mg、0.5346ミリモル、アバンチ・ポー
ラー・リピド）をCHCl₃：CH₃OH（９：１）50
mlに懸濁し、固体がすべて溶解するまで窒素雰囲
気下で加熱還流した。溶液を冷却したのち３−ケ
トジゴキシゲニン（207.7mg、0.5346ミリモル）
および4Aシーブ（シグマ）2.0ｇを添加した。反
応混合物を窒素雰囲気下に60℃で３時間攪拌し、
この時点でナトリウムシアノボロヒドリド
（36.95mg、0.5881ミリモル、シグマ）を添加し
た。混合物を室温で一夜攪拌した。反応混合物を
過し、減圧下で濃縮して白色泡状物（579.6mg）
を得た。これはTLC分析（シリカ、20％
CH₃OH：CH₂Cl₂）下で１個の主スポツトおよび
数個の副スポツトとして現れた。このスポツトを
ホスホモリブデン酸スプレー試薬（シグマ）によ
り可視化した。R0.3。 粗生成物を低圧カラムクロマトグラフイー（シ
リカゲル、10％CH₃OH−CH₂Cl₂）により精製し
て生成物を白色固体（185.3mg）として得た。生
成物を可変波長UV検出器セツトにより230nｍで
検出した。 例 ５ ジゴキシゲニンで感作されたスルホローダミン
Ｂ含有リポソーム（トレーサー）の製法 ジパルミトイルホスフアチジルコリン
（dppc）、コレステロール（chol）、ホスフアチジ
ルエタノールアミン、ジステアロイル−ジゴキシ
ゲニン（dspe−dig）（例４）およびジパルミトイ
ルホスフアチジルグリセロール（dppG）をクロ
ロホルム／メタノール（20：１）にchol50モル
％、dppc40モル％、dppg10モル％の比率で溶解
し、痕跡量（たとえば200μｇ）のdspe−digを添
加した。これらの脂質を丸底フラスコ内で減圧下
に回転蒸発器により乾燥させたのち、凍結乾燥器
に一夜入れて痕跡量の残存溶剤をすべて除去し
た。水中の0.1MスルホローダミンＢの溶液をフ
ラスコに添加し（10ml）、フラスコを激しく振と
うし、または所望により短時間超音波処理した。
この操作を60℃で行つた。当技術分野で知られて
いるように、リポソームはこの条件下で自然に生
成し、約0.1Mのローダミン染料を封入含有した。
検出可能なジゴキシゲニンをリポソームの表面に
施した。リポソームを封入された色素と同じ浸透
圧（約310ｍOsm／Kg）の緩衝液中で数回洗浄し
て浸透圧溶解を防止した。この調製液を0.4また
は0.2μのフイルターで過して比較的大きなリポ
ソームを除去した。このリポソームを緩衝液中に
希釈して、リン脂質１マイクロモル／ml（緩衝
液）を含有させた。 例 ４ ジゴキシン法 ペーパースポツト法 １ ニトロセルロース紙（ME−25）小片に、0.1
％BSA含有トリス緩衝液（トリス塩基6.005ｇ、
EDTAトリナトリウム0.358ｇ、NaCl6.83ｇ、
NaN₃0.2ｇ、BSA1ｇ、適量のHPLC水を加え
て１となし、HCでPHを8.0にする）中のウ
サギ抗ジゴキシン抗体5μをスポツトした。
抑制を示す種々の濃度で4M・NaCl溶液を用い
て310ｍOs／Kgに調整した。30分間風乾した。 ２ 上記ニトロセルロース紙小片をトリス緩衝液
中の３％BSA（トリス塩基6.055ｇ、EDTAト
リナトリウム0.358ｇ、NaCl6.83ｇ、NaN₃0.2
ｇ、BSA30ｇ、適量のHPLC水を加えて１
となし、HClでPHを8.0にする）で被覆した。
4M・NaCl溶液を用いて310ｍOs／Kgに調整し
た。小片をBSA中に30分ないし１時間、また
は小片が完全に飽和されるまで浸漬した。飽和
後にデカントまたは吸引によりBSAを除去し
た。 アツセイ法 １ 前処理を小片したジゴキシン標準品（0n
ｇ／ml；0.57ｇ／ml；1.0nｇ／ml；2.5nｇ／ml）
および／または患者血清で複覆した。小片を標
準液および／または血清に10分間浸漬した。標
準液および／または患者血清をデカントまたは
吸引により除去した。標準液および／または患
者血清を除去したのち、小片をトリス緩衝液
（トリス塩基6.005ｇ、EDTAトリナトリウム
0.358ｇ、NaCl6.83ｇNaN₃0.2ｇ、適量の
HPLC水を加えて１となし、HClでPHを8.0
にする）で２回洗浄した。NaCl溶液を用いて
310ｍOs／Kgに調整した。 ２ 小片を感作されたリポソーム500μ（例４
のPE−ジゴキシゲニン100〜400μｇを含有）で
被覆した。リポソームはトリス緩衝液（トリス
塩基6.055mg、EDTAトリナトリウム0.358ｇ、
NaCl6.83ｇ、NaN₃0.2ｇ、適量のHPLC水を
用いて１となし、HClでPHを8.0にする）中
に希釈されていた。4M・NaCl溶液を用いて、
抑制を示す希釈率で310ｍOs／Kgに調整した。
小片をリポソームに15分間浸漬した。リポソー
ムをデカンテーシヨンまたは吸引により除去し
た。リポソーム除去後に小片をトリス緩衝液
（トリス塩基6.055ｇ、EDTAトリナトリウム
0.358ｇ、NaCl6.83ｇ、NaN₃0.2ｇ、適量の
HPLC水を加えて１となし、HClでPHを8.0
にする）で２回洗浄した。4M・NaCl溶液を用
いて310ｍOs／Kgに調整した。 アツセイ法の説明： １ この試験のために採用した抗体希釈度は１：
200、１：1200および１：2200であつた。 これらの希釈度は変更できる。結果は下記の
とおりであつた。 １：200の希釈度ではすべての標準濃度にお
いてピンク色の小片が得られた。この希釈度は
参考としてのみ用いた。 １：1200の希釈度では、0nｇ／ml、0.5nｇ／
mlおよび1.0nｇ／mlの標準濃度においてピンク
色の小片が得られた。2.5nｇ／mlの標準濃度に
おいてはピンク色の小片は得られなかつた。こ
れは2.5nｇ／mlまたはこれ以上のジゴキシンが
存在する場合は色の変化が見えないことを示
す。 １：2200の希釈度では、0nｇ／ml、0.5nｇ／
mlの標準濃度においてピンク色の小片が得られ
た。1.0nｇ／mlおよび2.5nｇ／mlの標準濃度に
おいてはピンク色の小片は得られなかつた。こ
れは1.0nｇ／ml以上のジゴキシンが存在する場
合は色の変化が見えないことを示す。 患者血清の測定について： 患者血清10種を前記のように処理し、結果を下
記の表に従つて比較した。

【表】 この形式によれば患者血清値の範囲（すなわち
2.5nｇ／ml以上；1.0〜2.5nｇ／mlまたは1.0nｇ／
ml以下）10種のうち９種が正確に判定された。 例 ７ コレステロール132マイクロモル、ジステアロ
イルホスフアチジルコリン113マイクロモル、ジ
ステアロイルホスフアチジルグリセロール13.2マ
イクロモル、およびジステアロイルホスフアチジ
ルエタノールアミン−ジゴキシゲニン結合体
200μｇをクロロホルム−メタノール（９：1v／
ｖ）20mlに溶解した。この混合物を回転蒸発器に
より37℃で250ml容の丸底フラスコ中で乾燥させ
た。乾燥した脂質フイルムをさらに真空中で25℃
において16時間乾燥させ、１ｍＭ・EDTAおよ
び0.02％NaN₃を含有する2.7％（ｗ／ｖ）グリセ
リン溶液（PH6.7）中で膨潤させた。膨潤は60℃
で３分間緩徐に回転させることにより行われた。
混濁したリポソーム懸濁液を2000rpmで10分間回
転させて大型の多層小のうを沈降させ、上清を採
取して30000rpmで30分間回転させ、大型の単層
小のうを沈降させた。小のうへの装填は、空のリ
ポソームペレツトをスルホローダミンＢの0.1M
溶液（PH6.7）20mlに再懸濁し、この懸濁液を細
孔寸法1.0μ、0.4μおよび0.2μのポリカーボネート
膜から順に押出すことによつて行われた。トリス
20ｍＭ、EDTA20ｍＭ、グリセリン２％（ｗ／
ｖ）、DMSO0.05％、およびNaN₃0.02％を含有す
る緩衝液30mlを添加し、リポソームを30000rpm
で30分間回転させた。ペレツトを同じ緩衝液に２
回再懸濁して洗浄し、封入されていない色素を除
去し、洗浄された装填済リポソームを同じ緩衝液
にリン脂質リン１マイクロモル／mlに希釈した。 ジゴキシンのイムノアツセイにおける非等張ト
レーサーとしての上記リポソームの有効性を下記
により試験した。12×75mmのポリプロピレン製試
験管をヒツジ抗ジゴキシン抗血清１：2000希釈液
で被覆した。試験管に上記リポソーム50μ、臨
床試料として既知量のジゴキシンを含有する血清
100μ、ならびにウシ血清アルブミン0.1％、
EDTA1ｍＭ、アジ化ナトリウム0.02％をも含有
するトリスー食塩緩衝液（PH8.0）850μを充填
した。37℃で30分間インキユベートしたのち吸引
により試験管を空にし、トリヌー食塩緩衝液で洗
浄し、５％トライトン（Triton）Ｘ−100を１ml
添加して試験管壁に結合したリポソームを溶解
し、分光計で565nｍにより吸光を測定した。ジ
ゴキシン0nｇにおける吸光は0.080O.D.であり、
ジゴキシンに対して得られた標準曲線は対数−対
数プロツト上で直線状であり、ジゴキシン2nｇ
（血清）の用量においてリポソーム結合が50％置
換された。臨床試料のアツセイはラジオイムノア
ツセイにより測定された水準と良好な相関を示す
水準を与えた。 本発明は、吸光性色素を含有する小袋が提供さ
れ、これによりアツセイが簡単な装置、たとえば
比色計または安価な分光計を用いて行われるとい
う点で特に有利である。本発明者は意外にも、必
要な安定性を得るためには吸光性色素が一定の特
性をもつべきであることを見出した。特に本発明
者は他の色素、たとえばフルオレセインおよびそ
の誘導体につき試験し、この種の色素は小袋内に
含まれた場合必要な安定性を与えないこと、すな
わちこれらの色素は貯蔵中に小袋から著しく漏出
し、簡単な計測器を用いて測定するために十分な
感度をもたないことを見出した。 本発明の小のうの安定性は優れており、色素の
漏出は室温で６か月の保存期間にわたつて低いこ
とが認められた。 本発明により製造されたトレーサー（リガンド
で増感されたスルホローダミンＢ含有小のう）を
用いて得られる増幅は各トレーサー分子に付着し
た１個のマーカー残基により達成されるものより
も1000〜10000倍の範囲にある。アツセイは簡単
な分光計による比色測定によつて効果的に読取る
ことができる。アツセイの精度および正確度はラ
ジオイムノアツセイの場合に劣らず、手動式酵素
イムノアツセイにより得られる結果よりも優れて
いる。 これらおよひ他の利点は本明細書の教示から当
業者には自明であろう。 上記の教示を考慮して本発明を種々に補正およ
び変更することができる。従つて本発明は特許請
求の範囲に記載される範囲内において、前記に詳
述されたもの意外の形で実施することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも100000の吸光係数をもつ吸光性色
   素を含む小袋（sac）からなり、該色素が水に少
   なくとも0.1Mの濃度に溶解する組成物であつて、
   小袋材料がコレステロール、ジステアロイルホス
   フアチジルコリン（DSPC）、ジステアロイルホ
   スフアチジルエタノールアミン、ジパルミトイル
   ホスフアチジルコリン（DPPC）、ホスフアチジ
   ルエタノールアミン、ジパルミトイルホスフアチ
   ジルグリセロール及びジステアロイルホスフアチ
   ジルグリセロールからなる群から選択されるもの
   であり、色素がスルホローダミン系色素であるこ
   とを特徴とする上記組成物。 ２ 色素が正味電荷をもつ特許請求の範囲第１項
   に記載の組成物。 ３ 色素が水中で５〜９のPHにおいて完全にイオ
   ン化する特許請求の範囲第２項に記載の組成物。 ４ 小袋が色素を少なくとも0.01Mの濃度で含む
   特許請求の範囲第２項に記載の組成物。 ５ 小袋が色素を少なくとも0.05Mの濃度で含む
   特許請求の範囲第４項に記載の組成物。 ６ 小袋が色素を少なくとも0.01Mの濃度で含
   み、小袋が小嚢（vesicle）である特許請求の範
   囲第７項に記載の組成物。 ７ 小袋が色素を少なくとも0.05Mの濃度で含む
   特許請求の範囲第６項に記載の組成物。 ８ 小袋が、抗原、抗体及びハプテンよりなる群
   から選ばれるリガンドで感作されている特許請求
   の範囲第１項に記載の組成物。 ９ 色素が正味電荷をもち、小袋が小嚢である特
   許請求の範囲第８項に記載の組成物。 １０ 色素が水中で５〜９のPHにおいて完全にイ
   オン化する特許請求の範囲第９項に記載の組成
   物。 １１ 小袋が色素を少なくとも0.05Mの濃度で含
   む特許請求の範囲第１０項に記載の組成物。 １２ 被分析体の尺度として小袋中に存在する色
   素を検出し、該吸光性色素が少なくとも100000の
   吸光係数をもち、該吸光性色素が水に少なくとも
   0.1Mの濃度に溶解することを特徴とする、被分
   析体の尺度として検出可能なマーカーを含む小袋
   を使用する試料中の被分析体のアツセイ法であつ
   て、小袋材料がコレステロール、ジステアロイル
   ホスフアチジルコリン（DSPC）、ジステアロイ
   ルホスフアチジルエタノールアミン、ジパルミト
   イルホスフアチジルコリン（DPPC）、ホスフア
   チジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスフ
   アチジルグリセロール及びジステアロイルホスフ
   アチジルグリセロールからなる群から選択される
   ものであり、色素がスルホローダミン系色素であ
   ることを特徴とする上記方法。 １３ 小袋中に存在する吸光性色素が小袋から放
   出された後に検出される特許請求の範囲第１２項
   に記載の方法。 １４ 小袋が、抗原、抗体及びハプテンよりなる
   群から選ばれるリガンドで感作されている特許請
   求の範囲第１２項に記載の方法。 １５ 小袋が小嚢である特許請求の範囲第１２項
   に記載の方法。