JPH0556359B2 - - Google Patents
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- JPH0556359B2 JPH0556359B2 JP60201877A JP20187785A JPH0556359B2 JP H0556359 B2 JPH0556359 B2 JP H0556359B2 JP 60201877 A JP60201877 A JP 60201877A JP 20187785 A JP20187785 A JP 20187785A JP H0556359 B2 JPH0556359 B2 JP H0556359B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oligonucleotides
- carrier
- adsorbed
- eluted
- protecting group
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、現在非常に複雑である合成オリゴヌ
クレオチド類の精製を著しく短縮化する合成オリ
ゴヌクレオチド類の精製方法及び装置に関する。
クレオチド類の精製を著しく短縮化する合成オリ
ゴヌクレオチド類の精製方法及び装置に関する。
（従来の技術）
公知の固相法によつて多数の異なるオリゴヌク
レオチド類を比較的迅速に生産することが可能で
ある。
レオチド類を比較的迅速に生産することが可能で
ある。
化学的オリゴヌクレオチド合成法の通常法（例
えばポリマーキヤリアー上第１図参照）では、
5′−トリチル化ヌクレオチド要素が、互いに所望
の順序で順々に連結させられる。このような合成
の終りには、種類の違つたフラグメント（断続シ
ーケンス）が、目的の完全保護オリゴヌクレオチ
ド類から離れて得られる。これらのフラグメント
は遊離ヒドロキシル基又はアセチル基のいずれか
（鎖伸長段階の間におけるブロツク反応によつて
導入される）を有し、さらにその上、非常に制限
された量で5′−末端にトリチル基を有する。
えばポリマーキヤリアー上第１図参照）では、
5′−トリチル化ヌクレオチド要素が、互いに所望
の順序で順々に連結させられる。このような合成
の終りには、種類の違つたフラグメント（断続シ
ーケンス）が、目的の完全保護オリゴヌクレオチ
ド類から離れて得られる。これらのフラグメント
は遊離ヒドロキシル基又はアセチル基のいずれか
（鎖伸長段階の間におけるブロツク反応によつて
導入される）を有し、さらにその上、非常に制限
された量で5′−末端にトリチル基を有する。
適用する合成法（ホスホトリエステル、ホスフ
アイトトリエステル）によつて異なる変性オリゴ
ヌクレオチド類とフラグメントが副生物として得
られる。
アイトトリエステル）によつて異なる変性オリゴ
ヌクレオチド類とフラグメントが副生物として得
られる。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、これらの生成物は一連の脱保護
基及び精製段階に付されなければならない。この
精製には合成時間よりもはるかに超える時間が要
求される。
基及び精製段階に付されなければならない。この
精製には合成時間よりもはるかに超える時間が要
求される。
下記のスキームは、現今のたいていのDNA合
成実験室で行われている精製方法の順序を示して
いる。〔H.G.ガザー及びアンネ ラング「遺伝子
フラグメントの化学的及び酵素的合成、実験室マ
ニユアル」、フエルラーグヘミ、バインハイム
（1982）（H.G.Gasser and Anne Lang，
“Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene
Fragmenta，ａ Laboratory Manual”、
Verlag Chemle，Weinheim，1982）参照〕 １ 部分的脱保護基とキヤリアーからの分離 ２ 溶液の濃縮 ３ トリチル化オリゴヌクレオチドのクロマトグ
ラフイー精製 ４ 溶液の濃縮 ５ 酸触媒による脱トリチル化 ６ 溶液の濃縮 ７ 高性能液体クロマトグラフイー（HPLC）又
はポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE） ８ 脱塩又は溶離及び脱塩 ９ 溶液の濃縮 これらの精製段階のうち、段階２及び４、つま
り、それぞれの溶液の濃縮は特に時間を費やすも
のである。
成実験室で行われている精製方法の順序を示して
いる。〔H.G.ガザー及びアンネ ラング「遺伝子
フラグメントの化学的及び酵素的合成、実験室マ
ニユアル」、フエルラーグヘミ、バインハイム
（1982）（H.G.Gasser and Anne Lang，
“Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene
Fragmenta，ａ Laboratory Manual”、
Verlag Chemle，Weinheim，1982）参照〕 １ 部分的脱保護基とキヤリアーからの分離 ２ 溶液の濃縮 ３ トリチル化オリゴヌクレオチドのクロマトグ
ラフイー精製 ４ 溶液の濃縮 ５ 酸触媒による脱トリチル化 ６ 溶液の濃縮 ７ 高性能液体クロマトグラフイー（HPLC）又
はポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE） ８ 脱塩又は溶離及び脱塩 ９ 溶液の濃縮 これらの精製段階のうち、段階２及び４、つま
り、それぞれの溶液の濃縮は特に時間を費やすも
のである。
脱保護基の段階１の間、親油性のトリチル基以
外の全ての保護基は開裂する。トリチル基のみが
目的のオリゴヌクレオチドの5′−末端に見出され
る。
外の全ての保護基は開裂する。トリチル基のみが
目的のオリゴヌクレオチドの5′−末端に見出され
る。
（問題点を解決するための手段）
本発明によれば、このトリチル基の疎水性が、
前述の副生物と開裂した保護基からの分離を、逆
相物質との相関作用によつ可能にさせることが驚
くべきことに見い出された。
前述の副生物と開裂した保護基からの分離を、逆
相物質との相関作用によつ可能にさせることが驚
くべきことに見い出された。
すなわち本発明は、
合成オリゴヌクレオチド類の精製方法であつ
て、 −親油性保護基を有するオリゴヌクレオチド類を
含む溶液を前もつて濃縮しないで加えてオリゴ
ヌクレオチド類を逆相性及び任意のイオン交換
性を有するキヤリアー上に吸着させ、 −該逆相性及び任意のイオン交換性を有するキヤ
リアー上から親油性保護基を有さないオリゴヌ
クレオチド類を除去し、 −キヤリアーに吸着されたオリゴヌクレオチド類
から保護基を開裂させ、 −キヤリアーに吸着されたオリゴヌクレオチド類
を再び洗浄し、 −吸着されたオリゴヌクレオチド類をキヤリアー
から溶離させ、 そして −溶離されたオリゴヌクレオチド類を次いで、そ
れ自体公知の方法によつてさらに精製する ことを特徴とする方法を提供するものである。
て、 −親油性保護基を有するオリゴヌクレオチド類を
含む溶液を前もつて濃縮しないで加えてオリゴ
ヌクレオチド類を逆相性及び任意のイオン交換
性を有するキヤリアー上に吸着させ、 −該逆相性及び任意のイオン交換性を有するキヤ
リアー上から親油性保護基を有さないオリゴヌ
クレオチド類を除去し、 −キヤリアーに吸着されたオリゴヌクレオチド類
から保護基を開裂させ、 −キヤリアーに吸着されたオリゴヌクレオチド類
を再び洗浄し、 −吸着されたオリゴヌクレオチド類をキヤリアー
から溶離させ、 そして −溶離されたオリゴヌクレオチド類を次いで、そ
れ自体公知の方法によつてさらに精製する ことを特徴とする方法を提供するものである。
第１に、逆相性を有する疎水性吸着物質とイオ
ン交換剤との組合せは、本発明によれば、クロマ
トグラフイー型操作として次の段階が組合わせて
行われるのを可能にする。
ン交換剤との組合せは、本発明によれば、クロマ
トグラフイー型操作として次の段階が組合わせて
行われるのを可能にする。
−親油性保護基によつて保護されており、それ以
外の保護基が選択的に脱保護されたオリゴヌク
レオチド類を含む溶液からキヤリアー上へのオ
リゴヌクレオチド類の直接的吸着 −親油性保護オリゴヌクレオチド類の精製 −吸着されたオリゴヌクレオチド類からの親油性
保護基の開裂 本発明の方法によれば上述のスキームの段階２
〜５がクロマトグラフイ操作において組合わせる
ことができる。
外の保護基が選択的に脱保護されたオリゴヌク
レオチド類を含む溶液からキヤリアー上へのオ
リゴヌクレオチド類の直接的吸着 −親油性保護オリゴヌクレオチド類の精製 −吸着されたオリゴヌクレオチド類からの親油性
保護基の開裂 本発明の方法によれば上述のスキームの段階２
〜５がクロマトグラフイ操作において組合わせる
ことができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、上述のス
キームの段階１において、アンモニア脱保護基溶
液により選択的に脱保護されたオリゴヌクレオチ
ド類を含む溶液が、アンモニアを蒸発させた後、
カラム上に注入される。この場合カラムにはポリ
テトラフルオロエチレン（PTFE、レムプス ヘ
ミー−レキシコン（Ro¨mpps Chemie−
Lexikon）第７版、第3478ページ（1977）参照）
とジエチルアミノエチル−セルロース（DEAE−
セルロース、レンプスヘミー−レキシコン
（Ro¨mpps Chemie−Lexikon）第８版、第629と
874ページ（1981）参照）からなり、ポリテトラ
フルオロエチレンとDEAE−セルロースを十分に
混合したものが充填されている。
キームの段階１において、アンモニア脱保護基溶
液により選択的に脱保護されたオリゴヌクレオチ
ド類を含む溶液が、アンモニアを蒸発させた後、
カラム上に注入される。この場合カラムにはポリ
テトラフルオロエチレン（PTFE、レムプス ヘ
ミー−レキシコン（Ro¨mpps Chemie−
Lexikon）第７版、第3478ページ（1977）参照）
とジエチルアミノエチル−セルロース（DEAE−
セルロース、レンプスヘミー−レキシコン
（Ro¨mpps Chemie−Lexikon）第８版、第629と
874ページ（1981）参照）からなり、ポリテトラ
フルオロエチレンとDEAE−セルロースを十分に
混合したものが充填されている。
前記溶液中に存在し、5′−末端でトリチル化し
たオリゴヌクレオチドは固相上に吸着させられ
る。保護基の大部分と、さらにこれに加えて存在
する、トリチル基を持たないオリゴヌクレオチド
類が最初の洗浄、好ましくは炭酸水素トリエチル
アンモニウムによる洗浄段階で除去される（上述
のスキームの段階３）。次いで、酸で、好ましく
はジクロロ酢酸のジクロロメタン液で処理され
て、トリチル基が開裂される（スキームの段階
５）。さらに洗浄段階を行うことによつて完全に
脱保護基が行われたオリゴヌクレオチドが、吸着
物質から今や溶離される。今日において、前精製
されたオリゴヌクレオチドは他の精製法（例え
ば、イオン交換、電気泳動；スキームの段階７）
によつても均質な形により簡単に単離される。
たオリゴヌクレオチドは固相上に吸着させられ
る。保護基の大部分と、さらにこれに加えて存在
する、トリチル基を持たないオリゴヌクレオチド
類が最初の洗浄、好ましくは炭酸水素トリエチル
アンモニウムによる洗浄段階で除去される（上述
のスキームの段階３）。次いで、酸で、好ましく
はジクロロ酢酸のジクロロメタン液で処理され
て、トリチル基が開裂される（スキームの段階
５）。さらに洗浄段階を行うことによつて完全に
脱保護基が行われたオリゴヌクレオチドが、吸着
物質から今や溶離される。今日において、前精製
されたオリゴヌクレオチドは他の精製法（例え
ば、イオン交換、電気泳動；スキームの段階７）
によつても均質な形により簡単に単離される。
本発明の方法において、合成オリゴヌクレオチ
ド類の精製は、逆相性及び任意のイオン交換性を
有する吸着剤上を前記選択的に開裂されたオリゴ
ヌクレオチド類を含む溶液、緩衝溶液、酸、及び
有機性でかつ水と相溶性である溶剤などの種類の
異なる溶液を前記で説明した順序で通すことによ
り行われる。それ故本発明の方法は、手動操作の
他に自動操作によつても行うことができる。この
ような精製装置は逆相性及び任意のイオン交換性
を有するキヤリアーを充填したカラムと、該キヤ
リアー上に前記種類の異なる溶液を任意の順序で
流す手段を具備してなり、適宜DNA合成装置と
オンラインで連結することができるものである。
ド類の精製は、逆相性及び任意のイオン交換性を
有する吸着剤上を前記選択的に開裂されたオリゴ
ヌクレオチド類を含む溶液、緩衝溶液、酸、及び
有機性でかつ水と相溶性である溶剤などの種類の
異なる溶液を前記で説明した順序で通すことによ
り行われる。それ故本発明の方法は、手動操作の
他に自動操作によつても行うことができる。この
ような精製装置は逆相性及び任意のイオン交換性
を有するキヤリアーを充填したカラムと、該キヤ
リアー上に前記種類の異なる溶液を任意の順序で
流す手段を具備してなり、適宜DNA合成装置と
オンラインで連結することができるものである。
本発明の精製方法は、5′−ヒドロキシオクタヌ
クレオチド（）と精製5′−トリチル化オクタヌ
クレオチド（）の混合試料（）の例によつて
実証される。
クレオチド（）と精製5′−トリチル化オクタヌ
クレオチド（）の混合試料（）の例によつて
実証される。
第２図はそれぞれのHPLC図を示す。
定量的な脱トリチル化は例として5′−トリチル
化オクタヌクレオチドを用いて実証される。
化オクタヌクレオチドを用いて実証される。
第３図は混合物（）、5′−トリチル化オクタ
ヌクレオチド（）及びヒドロキシオクタヌクレ
オチド（）のHPLC図を示す。
ヌクレオチド（）及びヒドロキシオクタヌクレ
オチド（）のHPLC図を示す。
（試験例及び実施例）
次の実験により本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
補助剤及び薬剤
−デイスポーザブルのフイルターカラム（２枚の
20μｍフリツト６ml、品番71216（ベーカー） −６mlフイルターカラム用アダプター品番71220
（ベーカー） − 圧縮空気用のコネクター −フイルターカラム充填物：ポリテトラフルオロ
エチレン＝PTFE（ICI） −DEAE−セルロースDE52予め膨潤させた。カ
タログNo.4057−050（ワツトマン） −溶剤：2M炭酸水素トリエチルアンモニウム
（PH7.5）＝2M TEAB（2mol／1TEAB） 無水エタノール ジクロロメタン＝CH2Cl2 ジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸＝DCA フイルターカラムの充填物 1200mgPTFE 200mgDEAE−セルロース −乾燥状態で混合。
20μｍフリツト６ml、品番71216（ベーカー） −６mlフイルターカラム用アダプター品番71220
（ベーカー） − 圧縮空気用のコネクター −フイルターカラム充填物：ポリテトラフルオロ
エチレン＝PTFE（ICI） −DEAE−セルロースDE52予め膨潤させた。カ
タログNo.4057−050（ワツトマン） −溶剤：2M炭酸水素トリエチルアンモニウム
（PH7.5）＝2M TEAB（2mol／1TEAB） 無水エタノール ジクロロメタン＝CH2Cl2 ジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸＝DCA フイルターカラムの充填物 1200mgPTFE 200mgDEAE−セルロース −乾燥状態で混合。
−フイルターカラムの２枚のフリツトの間に充
填。
填。
−上側のフリツトを押圧してその材料を圧縮す
る。
る。
−全溶液を圧縮空気で、カラム材料中を強制的に
通す。
通す。
カラムの洗浄と平衡化
２mlのエタノール
２mlの100mM（100mmol／１）TEAB
２mlの2M TEAB／エタノール（４：１）
２mlの50mM TEAB
カラムへの供給
0.5μmolのオリゴヌクレオチド合成仕込物（ホ
スホトリエステル法）を有する充填したキヤリア
ー物質は、４mlのNH3（33％）／ピリジン（９：
１）に加えられ、室温で２日間、次いで、50℃で
12時間閉鎖容器中で放置された。この容器を開
け、サンドバス中、50℃でアンモニアを蒸発させ
た（約２時間）。残留溶液をピペツトで移し、キ
ヤリアー物質を50mMのTEAB2mlで、次いで
50mM TEAB／エタノール（１：１）２mlで洗
浄した。３つの溶液を一緒にし、カラム上に供給
した。
スホトリエステル法）を有する充填したキヤリア
ー物質は、４mlのNH3（33％）／ピリジン（９：
１）に加えられ、室温で２日間、次いで、50℃で
12時間閉鎖容器中で放置された。この容器を開
け、サンドバス中、50℃でアンモニアを蒸発させ
た（約２時間）。残留溶液をピペツトで移し、キ
ヤリアー物質を50mMのTEAB2mlで、次いで
50mM TEAB／エタノール（１：１）２mlで洗
浄した。３つの溶液を一緒にし、カラム上に供給
した。
第１回洗浄段階
３×２ml 50mM TEAB
２ml100mM TEAB
分離（非トリチル化成分の分離）
２×２ml 2M TEAB／エタノール（95：５）
第２回洗浄段階
２ml50mM TEAB
２mlエタノール
２mlCH2Cl2
酸処理
ジクロロメタン中、３％ジクロロ酢酸が、３分
間で強制的に通された。次いで、以下液ですすい
だ。
間で強制的に通された。次いで、以下液ですすい
だ。
２mlCH2Cl2
２mlエタノール
２ml50mM TEAB
溶 離
２×２ml2M TEAB／エタノール（４：１）
濃 縮
溶離液（４ml）を減圧下で濃縮乾固させた。次
いで残留物を上述のスキームの段階７によつてさ
らに精製した。
いで残留物を上述のスキームの段階７によつてさ
らに精製した。
HPL Ｃ図の説明
本発明による分離は純粋な5′−トリチル化オク
タヌクレオチド5′−ヒドロキシオクタヌクレオチ
ドとの混合物の例によつて実証される。HPL Ｃ
図，及び。
タヌクレオチド5′−ヒドロキシオクタヌクレオチ
ドとの混合物の例によつて実証される。HPL Ｃ
図，及び。
物質の分離
C18−シリカゲルカラム（ヌクレオシルRPC18
カラム）0.4×25cm（マシエリーナゲル）上で行
う。
カラム）0.4×25cm（マシエリーナゲル）上で行
う。
− 流速：２ml／分
−0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート
（PH6.3）中、５％〜50％のアセトニトリルの
傾斜で 定量的脱トリチル基化 5′−トリチル化オクタヌクレオチドによつて例
示される。HPL Ｃ図，及び RPC18カラム（上記参照）上の物質の分離 実施例 オリゴヌクレオチドGTT GTT TAA TGG
GTA AACがホスホトリエステル法によつてセ
ルロースフイルター上で合成された。それらの構
成分子はジメトキシ−トリチル化塩基保護のホス
ホジエステルである（R.フランス、W.ハイケン
ズ、G.ハイステルベルグ−モウチス及びH.ブレ
ツカー、「ヌクレオチド酸リサーチ」Vol11、第
4365ページ（1983）参照） 0.5μmolの18−merを仕込んだセルロースフイ
ルターを４mlNH3（33％）／ピリジン（９：１）
中に加え室温で２日間、50℃で12時間、閉じた容
器中で放置した。容器を開け、サンドバス上で50
℃で（約２時間）アンモニアを蒸発させた。残留
溶液をピペツトで移し、セルロースフイルターを
２mlの50mM TEABと２mlの50mM TEAB／エ
タノール（１：１）で洗浄した。
（PH6.3）中、５％〜50％のアセトニトリルの
傾斜で 定量的脱トリチル基化 5′−トリチル化オクタヌクレオチドによつて例
示される。HPL Ｃ図，及び RPC18カラム（上記参照）上の物質の分離 実施例 オリゴヌクレオチドGTT GTT TAA TGG
GTA AACがホスホトリエステル法によつてセ
ルロースフイルター上で合成された。それらの構
成分子はジメトキシ−トリチル化塩基保護のホス
ホジエステルである（R.フランス、W.ハイケン
ズ、G.ハイステルベルグ−モウチス及びH.ブレ
ツカー、「ヌクレオチド酸リサーチ」Vol11、第
4365ページ（1983）参照） 0.5μmolの18−merを仕込んだセルロースフイ
ルターを４mlNH3（33％）／ピリジン（９：１）
中に加え室温で２日間、50℃で12時間、閉じた容
器中で放置した。容器を開け、サンドバス上で50
℃で（約２時間）アンモニアを蒸発させた。残留
溶液をピペツトで移し、セルロースフイルターを
２mlの50mM TEABと２mlの50mM TEAB／エ
タノール（１：１）で洗浄した。
３種の溶液を集め、カラムの上から入れた。カ
ラムを２mlの50mM TEABで３回、２mlの
100mM TEABで１回洗浄した。２mlの2M
TEAB／エタノール（95：５）で２回カラムを
すすぎ、非トリチル化成分を分離した。さらにカ
ラムを２mlの50mM TEAB、２mlのエタノール
及び２mlのジクロロメタンですすいだ。ジクロロ
メタン中３％ジクロロ酢酸をカラム中を３分間で
強制的に通し、次いでカラムを２mlのジクロロメ
タン、２mlのエタノール及び２mlの50mM
TEABですすいだ。カラムを２mlの2M
TEAB／エタノール（４：１）で２回すすぎ、
18−merを溶離させた。溶離液（４ml）を減圧下
で濃縮乾固した。残留物をさらにイオン交換性
HPL Ｃクロマトグラフイー及び脱塩（上述のス
キームの段階７）によつて精製した。最終生成物
精製18−merは160nmで光学濃度1.1を有してい
た。
ラムを２mlの50mM TEABで３回、２mlの
100mM TEABで１回洗浄した。２mlの2M
TEAB／エタノール（95：５）で２回カラムを
すすぎ、非トリチル化成分を分離した。さらにカ
ラムを２mlの50mM TEAB、２mlのエタノール
及び２mlのジクロロメタンですすいだ。ジクロロ
メタン中３％ジクロロ酢酸をカラム中を３分間で
強制的に通し、次いでカラムを２mlのジクロロメ
タン、２mlのエタノール及び２mlの50mM
TEABですすいだ。カラムを２mlの2M
TEAB／エタノール（４：１）で２回すすぎ、
18−merを溶離させた。溶離液（４ml）を減圧下
で濃縮乾固した。残留物をさらにイオン交換性
HPL Ｃクロマトグラフイー及び脱塩（上述のス
キームの段階７）によつて精製した。最終生成物
精製18−merは160nmで光学濃度1.1を有してい
た。
第１図はポリマー・キヤリアー上での化学的
DNA合成のスキームを示し、第２図は分離にお
けるHPL Ｃ図を示し、第３図は定量的脱トリチ
ル化のHPL Ｃ図を示す。
DNA合成のスキームを示し、第２図は分離にお
けるHPL Ｃ図を示し、第３図は定量的脱トリチ
ル化のHPL Ｃ図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 合成オリゴヌクレオチド類の精製方法であつ
て、 −親油性保護基を有するオリゴヌクレオチド類を
含む溶液を前もつて濃縮しないで加えてオリゴ
ヌクレオチド類を逆相性及び任意のイオン交換
性を有するキヤリアー上に吸着させ、 −該逆相性及び任意のイオン交換性を有するキヤ
リアー上から親油性保護基を有さないオリゴヌ
クレオチド類を除去し、 −キヤリアーに吸着されたオリゴヌクレオチド類
から保護基を開裂させ、 −キヤリアーに吸着されたオリゴヌクレオチド類
を再び洗浄し、 −吸着されたオリゴヌクレオチド類をキヤリアー
から溶離させ、 そして −溶離されたオリゴヌクレオチド類を次いで、そ
れ自体公知の方法によつてさらに精製する ことを特徴とする方法。 ２ 逆相性を有する前記キヤリアーとしてポリテ
トラフルオロエチレンを用いる特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ イオン交換性を有する前記キヤリアーとして
ジエチルアミノエチル−セルロースを用いる特許
請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ４ キヤリアー上で合成されたオリゴヌクレオチ
ド類を該キヤリアーから選択的に開裂させ、かつ
親油性保護基を有するオリゴヌクレオチド類を含
む溶液を前もつて濃縮せずに加えて、逆相性及び
任意のイオン交換性を有するキヤリアー上にオリ
ゴヌクレオチド類を吸着させる特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ５ 親油性保護基を有するオリゴヌクレオチド類
を含む水溶液からアンモニアを蒸発後、逆相性及
び任意のイオン交換性を有するキヤリアー上にオ
リゴヌクレオチド類を吸着させる特許請求の範囲
第１、２、３又は４項記載の方法。 ６ 親油性保護基を有するオリゴヌクレオチド類
を含む溶液を逆相性及び任意のイオン交換性を有
するキヤリアーを満たしたカラム上に加え、次い
で該キヤリアーを緩衝液で洗浄し、酸で処理し、
緩衝溶液と、有機性でかつ水との相溶性を有する
溶剤で洗浄し、そして吸着されたオリゴヌクレオ
チド類を該キヤリアーから溶離させる特許請求の
範囲第１、２、３、４又は５項記載の方法。 ７ 緩衝溶液として、炭酸水素トリエチルアンモ
ニウムを用いる特許請求の範囲第７項記載の方
法。 ８ 酸として、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸
を用いる特許請求の範囲第６又は７項記載の方
法。 ９ 有機性でかつ水との相溶性を有する溶媒とし
てエタノール及び／又はジクロロメタンが用いら
れる特許請求の範囲第６、７又は８項記載の方
法。 １０ オリゴヌクレオチド類のカラムからの溶離
を炭酸水素トリエチルアンモニウム及びエタノー
ルの４：１液で行う特許請求の範囲第１、２、
３、４、５、６、７、８又は９項記載の方法。
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