JPH0556947B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼお
よびその製法に関するものである。さらに詳しく
は、本発明はラクトパチルス属の微生物が生産す
る熱安定性に優れた新規なピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼおよびその製法に関するものである。 本発明の新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ
は、ピルビン酸、リン酸、電子受容体からアセチ
ルリン酸、二酸化炭素および還元型電子受容体を
生じる酵素であり、血清、尿中のピルビン酸の定
量、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナー
ゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナ
ーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸
キナーゼ等の酵素活性測定用に用いられる。 （従来の技術） 従来から知られているピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼとしてはいわゆるPyruvate Dehydrogenase
somplexを形成しているPyruvate：Lipoamide
oxidoreductase（EC1、２、４、１）、
Pyruvate：Ferricytochrom b₁ oxidoreductase
（EC1、２、２、２）、Pyruvate：Ferredoxin
oxidoreductase（EC1、２、７、１）が知られて
いる（酵素ハンドブツク、丸尾文治、田宮信雄監
修、発行所：朝倉書店）。これら酵素と本発明の
新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼとは反応様式
が異なつている。また本発明の新規なピルビン酸
デヒドロゲナーゼと同様の反応様式を示す酵素と
してピルビン酸オキシダーゼ（EC1、２、３、
３）があるが（酵素ハンドブツク、丸尾文治、田
宮信雄監修、発行所：朝倉書店）、ピルビン酸オ
キシダーゼは電子伝達系として酸素に最も良く作
用することが知られている。〔Fed.Proc.13巻734
〜738頁（1954）〕。 （発明が解決しようとする問題点） 従来、血清や尿中のピルビン酸の比色定量はピ
ルビン酸オキシターゼを用いて行なわれてきた
が、ピルビン酸オキシダーゼは耐熱性が充分では
なく、また溶存酸素等の問題からドライケミスト
リーには不適であつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは上記の背景を踏まえて微生物が生
産する、従来のピルビン酸オキシダーゼよりも熱
安定性に優れ、さらに溶存酸素の影響を受けない
ピルビン酸デヒドロゲナーゼを見い出そうと鋭意
研究を重ねた結果、ラクトバチルス属に属する微
生物から、熱安定性に優れた新規なピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼを見い出した。 すなわち本発明は下記性質〜を有すること
を特徴とする新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ
である。 下記反応を触媒する。 ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体−−−→ア
セチルリン酸 ＋CO₂＋還元型電子受容体 ピルビン酸に特異的に作用する。 電子伝達体として、酸素よりも１−メトキシ
フエナジンメトサルフエート（PMS）、メチレ
ンブルー、フエリシアナイドおよび２，６−ジ
クロロフエノールインドフエノール（DCPIP）
に作用しやすい。 安定PHが５〜８付近である。 至適温度が約55℃である。 PH6.3、15分間処理で50℃まで安定である。 また本発明は上記性質〜を有する新規なピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼを生産するラクトバチ
ルス属に属する菌株を培養し、該培養物から該新
規なピルビン酸デヒドロゲナーゼを採取すること
を特徴とする新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ
の製法である。 本発明に使用する微生物としては、熱安定性に
優れた新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ生成能
を有する微生物であればいずれの菌株でも使用で
きる。 本発明に用いる微生物の好適な例としては、ラ
クトバチルス・デルブリツチイ・サブスピーシ
ズ・ラクテス JCM 1063、JCM 1248、ラクト
バチルス・デルブリツチイ IFO 3202、IFO
3534、ラクトバチルス・サリバリウム・サブスピ
ーシズ・サリバリウム JCM1231が挙げられる。 本発明の酵素を製造するに当つては、熱安定性
に優れた新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ生産
菌を通常の方法で培養する。使用する培地組成と
しては使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無
機物、その他必要な栄養素を適量含有するもので
あれば、合成培地、天然培地いずれも使用でき
る。例えば炭素源としてはグルコース、シユクロ
ース、デキストリン、ピルビン酸、糖蜜などが使
用される。窒素源としては、例えばペプトン、肉
エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などの
窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、クエン酸アンモニウム、グルタミン酸
などのアミノ酸など、無機あるいは有機の窒素化
合物が使用される。 培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行
なう。培養温度は20℃〜50℃の範囲、好ましくは
37℃付近、培養PHは５〜８の範囲、好ましくはPH
６〜７に制御するのが良い。これら以外の条件下
でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養
期間は通常１〜４日間で生育し、菌体内に新規な
ピルビン酸デヒドロゲナーゼが生成蓄積される。 本発明の酵素の精製法は一般に使用される精製
法を用いればよい。例えば抽出法には超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレン
チプレス、界面活性剤など、いずれを用いてもよ
い。さらに抽出液については公知の硫安や芒硝な
どの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウム
などの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイ
ミンなどの凝集法さらにはDEAE（ジエチルアミ
ノエチル）セフアロース、CM（カルボキシメチ
ル）セフアロースなどのイオン交換体クロマト法
などにより精製することができる。 次に本発明の新規なピルビン酸デヒドロゲナー
ゼの一例であるクラトバチルス・デルブリチイ
IFO3202が産生するピルビン酸デヒドロゲナーゼ
の理化学的性質について述べる。 (1) 作用 ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体−−−→ア
セチルリン酸 ＋CO₂＋還元型受容体 基質特異性 オキザロ酢酸、DL−乳酸、酢酸またはα
−ケトグルタール酸には反応せず、ピルビン
酸に特異的である。 電子伝達系に酸素のみを用いた場合及び各
種の電子受容体を加えた場合の酵素活性を示
した。表示は酸素のみの場合の活性を100と
して相対活性で示した。また同様の反応式を
示す公知のピルビン酸オキシダーゼ〔Fed.
Proc。13巻734〜738頁（1954）〕と比較し
た。

【表】 略号は以下のものを示す。 １−メトキシPMS：１−メトキシフエナジ
ンメトサルフエート DCPIP：２，６−ジクロロフエノールイン
ドフエノール この結果より、本発明の酵素は電子伝達系と
して酸素よりも他の電子受容体に作用しやす
い。 (3) 至適PH 新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼの反応PH
の影響を求めた。緩衝液は50ｍMK−リン酸緩
衝液を用いて行なつた。各PHでの新規なピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定結果は第１図
に示す通りで至適PHは6.2〜6.3付近であつた。 (4) 安定PH 緩衝液には50ｍＭ酢酸緩衝液（PH３〜６）、
50ｍMK−リン酸緩衝液（PH5.5〜８）、50ｍＭ
Tris−HCl緩衝液を（PH８〜９）を用い、25
℃、20時間保温して、その残存活性を測定し
た。その結果第２図に示す通り、安定PHは５〜
８付近であつた。 (5) 至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結
果第３図に示す通り、至適温度は55℃付近であ
つた。 (6) 熱安定性 新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼを50ｍＭ
Ｋ−リン酸緩衝液、PH6.3で40〜60℃で15分
間加熱した後、残存活性を測定した。その結果
第４図に示す通り50℃まで安定であつた。 (7) 物質的影響 酵素活性測定法にて示す反応系より、下記
の物質を除去した場合の酵素活性を次表に相
対活性として示した。なお、リン酸除去の場
合は緩衝液として50ｍＭ酢酸緩衝液PH6.3を
用いた。

【表】 略号は以下のものを示す。 TPP：チアミンピロフオスフエート FAD：フラビンアデニンジヌクレオチド 以上のことより、本酵素はコフアクターと
してTPP、FAD、Mg²⁺が必要であり、基質
としてリン酸が必要なことが判明した。 酵素活性測定法にて示す反応系の硫酸マグ
ネシウムの代りに、次に示す種々の金属を用
いて酵素活性を測定した。各種金属の反応液
中での濃度は10ｍＭであり、さらに表示は硫
酸マグネシウムのときの活性を100として相
対活性で示した。

【表】 その結果、Mg²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺およ
びNi²⁺により酵素活性が発現した。 以上の結果より、本酵素は明らかに熱安定性
に優れた新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼで
ある。 次に本発明の新規なピルビン酸デヒドロゲナー
ゼの活性測定法を示す。 0.15M Ｋ−リン酸緩衝液、PH6.3 10ml ３ｍＭ TPP ２ml 0.15ｍＭ FAD・Na₂ ２ml 15ｍＭ EDTA・Na₂ ２ml 0.15M MgSO₄ ２ml １ｍM1−メトキシPMS−10ｍＭ NTB ３ml 10％ Triton Ｘ−100 1.5ml 蒸留水 2.5ml 上記反応液を調製した後、2.5mlを試験管に分
取し、0.3Mピルビン酸カリウム水溶液を0.5ml加
えて37℃で５分間予備加温する。酵素溶液0.05ml
を添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に37℃に
制御された分光光度計で570nｍにおける１分間
当りの吸光度変化を求める（ΔODTest）。盲検
は、酵素溶液の代りに酵素希釈液50ｍＭ Ｋ−リ
ン酸緩衝液、PH6.3を0.05ml加え、上記同様に操
作を行なつて１分間当りの吸光度変化を求める
（ΔOD blank）。 新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の表示
は、上記条件下で１分間あたり1/2マイクロモル
のジホルマザンを生成する酵素単位を１単位(U)と
した。 （実施例） 以下実施例を挙げて本発明を具体的に示す。 実施例 １ 肉エキス0.5％、ポリペプトン２％、酵母エキ
ス１％、K₂HPO₄・3H₂O1％、MgSO₄・
7H₂O0.02％、MnSO₄・7H₂O0.02％を含む培地
（PH6.8）90mlを500ml容坂口フラスコに移し、121
℃、15分間オートクレーブを行なつた。放冷した
後、別殺菌した20％ピルビン酸ナトリウム水溶液
（PH5.0）を無菌的に10ml添加した。種菌としてラ
クトバチルス・デルブリツチイIFO3202を同培地
に一白金耳接種し、37℃で24時間振盪培養し、種
培養液とした。次に同培地5.4を10・ジヤー
フアメンターに移し、121℃で15分間オートクレ
ーブを行ない、放冷後、別殺菌した20％ピルビン
酸ナトリウム水溶液を無菌的に600ml添加した。
これに種培養液100mlを移し、300rpm、通気量２
／分、37℃で24時間培養した。培養終了時のピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は0.35U／mlであ
つた。 培養液６を遠心分離にて集菌し、50ｍＭ Ｋ
−リン酸緩衝液PH7.0 100mlにて懸濁した。超音
波破砕機（海上電気製、19KHz）にて15分間処理
し、遠心分離してその上清液を得た。上清液を50
ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液PH7.0にて平衡化した
DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア製）
カラムクロマトグラフイーに供し、０〜0.5M
NaCl溶出画分にピルビン酸デヒドロゲナーゼ活
性を得た。溶出液を限外濾過機にて濾縮した後、
50ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液、PH7.0にて平衡化し
たセフアデツクスＧ−200（フアルマシア製）にて
ゲル濾過を行なつた。その結果840Uのピルビン
酸デヒドロゲナーゼが得られた。 （発明の効果） 本発明では熱安定性に優れ、溶存酸素の影響を
受けない新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼが得
られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の新規なピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼの至適PHを示す。第２図は本発明の新規な
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの安定PHを示す。図
中○−○は50ｍＭ酢酸緩衝液、●−●は50ｍＭ Ｋ
−リン酸緩衝液、△−△は50ｍＭ Tris−HCl緩
衝液を示す。第３図は本発明の新規なピルビン酸
デヒドロナーゼの至適温度を示す。第４図は本発
明の新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼの熱安定
性を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記性質〜を有することを特徴とする新
   規なピルビン酸デヒドロゲナゲーゼ。 下記反応を触媒する。 ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体−−−→ア
   セチルリン酸 ＋CO₂＋還元型電子受容体 ピルビン酸に特異的に作用する。 電子伝達体として、酸素よりも１−メトキシ
   フエナジンメトサルフエート（PMS）、メチレ
   ンブルー、フエリシアナイドおよび２，６−ジ
   クロロフエノールインドフエノール（DCPIP）
   に作用しやすい。 安定PHが５〜８付近である。 至適温度が約55℃である。 PH6.3、15分間処理で50℃まで安定である。 ２ 下記性質〜を有する新規なピルビン酸デ
   ヒドロゲナーゼを生産するラクトバチルス属に属
   する菌株を培養し、該培養物から該新規なピルビ
   ン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
   る新規なピルビン酸デヒドロゲナーゼの製法。 下記反応を触媒する。 ピルビン酸＋リン酸＋電子受容体−−−→ア
   セチルリン酸 ＋CO₂＋還元型電子受容体 ピルビン酸に特異的に作用する。 電子伝達体として、酸素よりも１−メトキシ
   フエナジンメトサルフエート（PMS）、メチレ
   ンブルー、フエリシアナイドおよび２，６−ジ
   クロロフエノールインドフエノール（DCPIP）
   に作用しやすい。 安定PHが５〜８付近である。 至適温度が約55℃である。 PH6.3、15分間処理で50℃まで安定である。