JPH055740A - レーザ磁気免疫測定用検体調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 実際に患者血清の各種抗体（抗原）検査に適
用する検体の、コントロール値の低減と、安定化を図る
ために、非特異反応の少なく、かつ汎用性の高いレーザ
磁気免疫測定用検体の調製方法を提供する。 【構成】 検出すべき抗原に対する第一の特異抗体を予
め結合したマイクロビーズ浮遊液と、検体とを反応さ
せ、このマイクロビーズ表面に検体を捕捉し、捕捉され
た検体と、この検体に対する第二の特異抗体とを反応さ
せて、検体を第一と第二の特異抗体とでサンドイッチす
る。さらに上記第二の特異抗体に対する抗抗体に予めビ
オチンを結合させた第三の特異抗体を加えて、第二の特
異抗体と第三の特異抗体とを反応させ、さらにこの反応
相に、アビジン結合磁性微粒子標識材料の分散浮遊液を
加えて上記第三の特異抗体中のビオチンと、アビジン結
合磁性微粒子標識材料中のアビジンとを反応させてマイ
クロビーズに捕捉した検体のみを磁気標識し、反応しな
かった上記磁性微粒子標識材料は、分離・除去する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応を利用し
た免疫検査法に関するものである。更に詳しくは、先に
本発明者らが発明したレーザ磁気免疫測定法に用いられ
るレーザ磁気免疫測定用検体調製方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血
病等のような新型ウイルス性疾病、あるいは各種ガンの
早期検査法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法
の開発が、現在、世界的規模で推進されている。

【０００３】従来から知られる微量免疫測定法として
は、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡ法と記す）、
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ
（ＦＩＡ）法等が既に実用化されている。これらの方法
は、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識とし
て付加した抗原または抗体を用い、これと特異的に反応
する抗体または抗原の有無を検出する方法である。

【０００４】本発明者らは先に特願昭６１−２２４５６
７号，６１−２５２４２７号，６１−２５４１６４号，
６２−２２０６２号，６２−２２０６３号，６２−１５
２７９１号，６２−１５２７９２号，６２−１８４９０
２号としてレーザ磁気免疫測定法及び測定装置について
の発明を特許出願している。これらの新しい免疫測定法
は標識材料として磁性微粒子を用いて、例えば磁気標識
された検体の有無を干渉縞から検出する点に特徴があ
り、アイソトープを用いないでピコグラム以下の超微量
検出が可能である。本発明者らは上述の特許に基づき、
磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、初めて、ウイ
ルスの検出等を行なった。

【０００５】さて、本発明者らは先に、Ｍｏｌｄａｙあ
るいは本発明者らの方法で作製したデキストラン被覆マ
グネタイト粒子に、Ｍｏｌｄａｙの開示した方法でプロ
テインＡを結合し、該プロテインＡに更にエイズウイル
ス（ＨＩＶ）抗原、例えばＰ２４に対するモノクローナ
ル抗体を結合して、微量なＨＩＶ抗原の検出実験を実施
し、その成果を第３７回日本ウイルス学会（１９８９年
１１月）で発表している。この結果、精製したＨＩＶ抗
原の場合は、０.１ピコグラム／ｍｌの微量ウイルス抗
原の検出に成功した。しかし、Ｍｏｌｄａｙの開示した
方法で人血清中からＨＩＶ抗原を検出する場合、プロテ
インＡに結合した抗体が解離しやすく、デキストラン被
覆マグネタイト粒子が直接マイクロビーズに結合するこ
とが生じるため、コントロール値が異常に高くなる現象
が生じた。なお、コントロール値とは検体を加えない場
合に検出される信号値で、いわゆる雑音である。

【０００６】本発明に関わる、アビジン−ビオチン反応
は公知であり、従来は核酸の非放射性標識に用いられて
いた。また、酵素免疫法（ＥＩＡ）、蛍光標識免疫法
（ＦＩＡ）でも用いられていたが、本発明者らが開発し
てきた、磁性微粒子を標識に用いる新しい免疫測定方法
では新規である。即ち、ＥＩＡ法等では、ＡＢＣ法とし
て知られているように、予めビオチン化した酵素とアビ
ジンを、酵素標識時に同時に加えることが行なわれてい
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、実際に患者
血清に適用する際に問題となる、コントロール値の低減
と、安定化を図るために、非特異反応の少なく、かつ汎
用性の高いレーザ磁気免疫測定用検体調製方法を提供す
ることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従来のＥＬＩＳＡ法で一
般的に行われている方法は９６穴のマイクロプレート底
面に抗原あるいは抗体を固定して、その表面に患者血清
中の目的とする抗体あるいは抗原を捕捉するものである
から、抗原抗体反応の場は２次元的であった。これに対
して、本発明のレーザ磁気免疫測定法の場合検出感度を
向上する方法として、マイクロプレートの代わりに非磁
性体からなるマイクロビーズを用いている（特願昭６３
−１０２９１２号「レーザ磁気免疫測定方法を実施する
ための検体調製法」）。この理由は、抗原抗体反応の場
を３次元にすることによって微量の抗原または抗体を効
率よく抗原抗体反応させるためと、未反応の磁性微粒子
標識材料をＢ／Ｆ分離（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ、すなわ
ち検体と結合した磁性微粒子と結合していない磁性微粒
子とに分離）するためである。すなわちマイクロビーズ
及び磁性微粒子標識材料として、例えば、直径２μｍの
マイクロビーズ、直径０.０３μｍの磁性微粒子標識材
料というように、それぞれの大きさ、質量が大きく相違
するものを用いれば、両者は遠心力あるいはフィルター
によって分離できる。

【０００９】本発明の方法に従えば、汎用性の高い検体
調製方法として、検出すべき抗原に対する第一の特異抗
体が予め結合されたマイクロビーズ浮遊液と、検体とを
反応させ該マイクロビーズ表面に検体を捕捉する第一工
程と、捕捉された該検体と、該検体に対する第二の特異
抗体とを更に反応させ、該検体を第一と第二の特異抗体
とでサンドイッチする第二工程と、前記第二工程後に、
該第二の特異抗体に対する抗抗体に予めビオチンを結合
させた第三の特異抗体を加えて、該第二の特異抗体と該
第三の特異抗体とを反応させる第三工程と、前記第三工
程後に、アビジン結合磁性微粒子標識材料の分散浮遊液
を加えて上記第三の特異抗体中のビオチンと、該アビジ
ン結合磁性微粒子標識材料中のアビジンとを反応させ該
マイクロビーズに捕捉された該検体のみを磁気標識する
第四工程と、前記工程において反応しなかった該磁性微
粒子標識材料を分離・除去する第五工程とを少なくとも
含むことを特徴とするレーザ磁気免疫測定用検体調製方
法が提供されている。

【００１０】上記本発明のレーザ磁気免疫測定用検体調
製方法は、あらゆるウイルスの抗原診断に適用できる汎
用性に優れた検体調製方法である。即ち、第二の特異抗
体に、例えば、検査対象ごとに異なるマウスモノクロー
ナル抗体を用いて第三の特異抗体（第二の抗体に対する
抗抗体、即ち２次抗体）にビオチン化した抗マウス抗体
を用いる方法を取れば、一種類のビオチン化した第三の
特異抗体であらゆるウイルスの診断に用いることができ
るからである。なお、この方法は２次抗体法といわれて
いる。

【００１１】以上、検体としてウイルス等の抗原を検査
する場合の方法を説明したが、本発明のレーザ磁気免疫
測定用検体調製方法は、抗体検査にも適用できる。な
お、本法を抗体検査に適用する場合に用いられる抗体捕
捉用のマイクロビーズとしては、目的とする抗体と特異
的に反応する抗原を、予めその表面に結合させたマイク
ロビーズが用いられる。上記抗体検査を行うには、ま
ず、このマイクロビーズに抗体を捕捉後、この捕捉した
抗体に対する抗抗体を反応させ、更に抗抗体に対するビ
オチン化２次抗体を反応させた後に、磁性微粒子標識材
料を加え、検体を磁気標識すればよい。

【００１２】なお、上述した抗原や抗体の他、ホルモン
や生理活性物質等の微量の蛋白を検出する場合にも本発
明のレーザ磁気免疫測定用検体調製方法は適用可能であ
る。

【００１３】

【実施例】以下、本発明のレーザ磁気免疫測定用検体調
製方法を、エイズウイルス（ＨＩＶ）の検出に適用した
一実施例に基づき詳しく説明する。

【００１４】（１）アビジン結合磁性微粒子標識材料の
作製 本実施例に用いたデキストラン被覆マグネタイト微粒子
を以下のようにして作製した。まず、デキストラン１２
５ｇ，尿素５０ｇを１リットルの純水に溶解し、ＦｅＣ
ｌ₃６Ｈ₂Ｏを０.５ｇ、ＦｅＣｌ₂４Ｈ₂Ｏを０.７３ｇ添
加（Ｆｅ³⁺：Ｆｅ²⁺＝１：２（モル比）に相当する）し
て、出発溶液とし、これを密閉が可能な容器（例えば、
テフロン製容器）に入れ、この容器をオイルバスに漬け
て１００−１１０℃で約２時間加熱した。加熱により、
尿素が分解して、アンモニアを発生し、溶液中にデキス
トランで被覆されたマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）が、作製
された。後の操作に適するように、この溶液を、限外濾
過（フィルター：１０万分子量分画用）を適用して、約
８−１０倍濃縮し、デキストラン被覆微粒子を含有する
水溶液を得ることができた。Ｘ線によるマグネタイト微
粒子の粒径測定により、これら微粒子は、１００オング
ストロームになっていることが確認された。

【００１５】次に、これら微粒子に、アビジンを結合さ
せるため、その前段階として、以下の操作を行った。上
記濃縮水溶液に１００ｍｌにｐＨ６.５に調整した酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液を、１００ｍｌ添加し、その
後、４℃まで冷却して、超音波振動を加えながら、酸化
剤（ＮａｌＯ₄）２ｇを添加し、１紙時間反応させた。
この操作により、デキストランは、結合が一部開裂す
る。以下、この溶液を、酸化デキストラン被覆マグネタ
イト微粒子含有溶液と呼ぶ。

【００１６】このようにして作製した酸化デキストラン
被覆マグネタイト微粒子１ｍｌに、ほう酸−ほう砂緩衝
液（ｐＨ７.５−８.５の間の値を選択してよい。）１ｍ
ｌを添加後、アビジン数ｍｇを加えて１−２時間振とう
させながら付加反応を進行させた。これを１晩４℃で保
存し、その後数ｍｇのＮａＢＨ₄を添加して還元処理を
行った（４℃）。次に、ＨＥＰＥＳ緩衝液で、さらに１
晩透析をおこなって余分な還元試薬を除去した。さら
に、付加反応に関与しなかったアビジン（フリーのアビ
ジンと呼ぶ）は、この後遠心またはゲル濾過によって除
いた。以上の操作によりアビジン結合デキストラン被覆
マグネタイト微粒子を得た。

【００１７】（２）検体調製方法（実施例） ＨＩＶ抗原：ＭＯＬＴ４／ＨＴＬＶ−IIIＢのＨＩＶ
培養上清を最終濃度２％のパラフォルムアルデヒドで処
理し、これを蔗糖密度勾配遠心法により精製し、さらに
１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０で可溶化したＨＩＶ抗原を
正常人血清で希釈してウイルス濃度０.１ｐｇ／ｍｌに
調製した。粒径２μｍのアクリル樹脂製マイクロビー
ズ（トレスフェア、東レ株式会社）を活性化した後、抗
ＨＩＶウサギ血清から高速液体クロマトグラフィー法で
ＩｇＧ精製した抗ＨＩＶウサギＩｇＧと３５℃で３０分
反応させ、ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ（牛アルブミ
ン）−ＰＢＳの０.２％マイクロビーズ浮遊液を調製し
た。この調製により、マイクロビーズ表面にはＨＩＶ抗
体（第一の特異抗体）が固定化される。前記ＨＩＶ抗
原浮遊液２５μｌと、前記マイクロビーズ浮遊液２５μ
ｌを３５℃で１時間反応させ、ＨＩＶをマイクロビーズ
表面に捕捉させた。抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗
体（第二の特異抗体）０.１ｍｇ／ｍｌを１０μｌ加
え、３５℃で３０分間反応させた。予めビオチンを結
合した、抗マウスビオチン化抗体（第三の特異抗体）
０.１ｍｇ／ｍｌを１０μｌ加え、３５℃で３０分間反
応させた。この後、未反応の第三の特異抗体を遠心分離
法でＢ／Ｆ分離した。更に、上述したアビジン結合磁
性微粒子標識材料０.１ｍｇ／ｍｌを１０μｌ加え、３
５℃で１５分間反応させた。反応後、未反応の該磁性微
粒子標識材料を遠心法でＢ／Ｆ分離した。沈殿したマイ
クロビーズを２５μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で再浮遊した
後、測定に用いた。以上の操作によりマイクロビーズに
捕捉したＨＩＶ抗原を磁気標識した。

【００１８】（３）陰性コントロール 上述した検体調製方法のの工程において、ＨＩＶ抗原
を２５μｌ加える代わりに正常人血清を２５μｌ加え、
以下以降の操作は、上述した検体調製操作と同様の操
作を行い、これを陰性コントロールとした。

【００１９】（４）比較対照となる検体調製方法（比較
例） 上述した検体調製方法の以下の工程の代わりに、本発
明者らが以前に実施し、第３７回日本ウイルス学会総会
（１９８９年１１月大阪、講演番号４７５「レーザ磁気
免疫測定法（ＭＩＡ）によるＨＩＶ抗原検出の試み」）
で発表した方法によった。まず、ＨＩＶ抗体-プロテイ
ンＡ結合デキストラン被覆マグネタイト微粒子は、遠心
によってＢ／Ｆ分離した。また、先に述べた陰性コント
ロールの調製法と同様に、ＨＩＶ抗原を２５μｌ加える
代わりに正常人血清を２５μｌ加え、以下以降の操作
は、本法（比較対照となる検体調製方法）と同様の操作
を行い、これを比較例の陰性コントロールとした。な
お、本法において用いているプロテインＡ結合デキスト
ラン被覆マグネタイト微粒子は、上記（１）アビジン結
合磁性微粒子標識材料の作製で説明したアビジンに代
え、プロテインＡを用いて作製した。これにＨＩＶ患者
血清を反応させ、遠心法により未反応抗体を除去し、Ｈ
ＩＶ抗体-プロテインＡ結合デキストラン被覆マグネタ
イト微粒子を得た。

【００２０】（５）検体測定法 以下に述べる干渉法により測定した。純水３５０μｌ
が注入された検査容器のウエルに、検体調製の終わった
検体２５μｌ全量を入れた。傾斜磁界発生装置の中に
上記検査容器を挿入し、約８ｋガウスの磁界をかけ、ウ
エル水面の一点に検体を磁気濃縮した。この濃縮点に
５ｍＷのＨｅ-Ｎｅレーザを入射角３０度で斜めから照
射し、反射光束中の干渉縞を白色スクリーンで受け、Ｃ
ＣＤカメラ、画像処理装置により干渉縞の中心光強度を
測定した。以下、表１にその結果を示す。

【表１】

【００２１】上記表１に示す結果からも明らかなよう
に、本実施例のレーザ磁気免疫測定用検体調製方法によ
り調製された検体は、従来の方法で調製された検体に比
べ、レーザ磁気免疫測定における感度が極めて高感度で
あった。

【００２２】

【発明の効果】従来のデキストラン被覆マグネタイトに
直接抗体を結合する方法は、検査対象毎に磁性標識試薬
を用意する必要があった。本発明の磁気免疫測定用検体
調製方法は、磁気標識にアビジン-ビオチン反応をはじ
めて利用したものであって、以下に述べるような種々の
効果および有効性が顕著に認められた。

【００２３】まず、第１に本発明のレーザ磁気免疫測定
用検体調製方法は、対象とする検体が代わっても同一の
磁性標識試薬が使用できることはもちろんのこと、ビオ
チン化抗体（第三の特異抗体）をウイルス毎に用意する
必要がなく一種類のビオチン化抗体のみでよい。これは
診断薬キットとして実用化する際に極めて有利であり、
汎用性並びに安定性の高い優れた試薬キットの提供が可
能となる。なぜならば、抗体をビオチン化する場合、抗
体価の低下は不可避であり、このため従来の方法のよう
に、検体毎に異なるビオチン化抗体を作製する必要があ
る場合、最適なビオチン化条件を個別に検討する必要が
あった。しかし、本発明のレーザ磁気免疫測定用検体調
製方法の場合、第二の特異抗体は特別な処理なしで使用
するから抗体価の低下が生じない。このためマイクロビ
ーズに捕捉した抗原を効率よく、高感度でサンドイッチ
することができる。そのため、検出感度が高い。この目
的には第二の特異抗体として検査対象毎に異なるマウス
モノクローナル抗体が最適である。更に第三の特異抗体
としては、一種類の抗マウス抗体をビオチン化して用い
ればよい。また、磁気標識は従来の抗原抗体反応利用す
る方法に代えて、反応速度の高いアビジン-ビオチン反
応を利用しているから、反応時間の短縮に有利である。

【００２４】本発明のレーザ磁気免疫測定用検体調製方
法により、調製した検体は従来の方法で調製した検体に
比べ、レーザ磁気免疫測定を行う際の目的抗体（抗原）
の検出感度が約１００倍程度向上し、かつ検体の調製時
間は４時間程度であるのに対し、例えば、市販のＨＩＶ
抗原検査キット（ダイナボット社製ＨＩＶ抗原検査キッ
ト）では、検出感度が３０ｐｇ／ｍｌ程度で、検体調製
時間には約２日間必要である。

【００２５】本発明のレーザ磁気免疫測定用検体調製方
法は実施例で述べたＨＩＶ抗原検出に限られるものでは
なく、他のウイルス抗原は勿論のこと、現在広く実施さ
れている抗体検査にも適用できる。また、抗体検査に適
用した場合、検出感度が高い特徴を活かして、例えば血
液中で抗体量の少ないＩｇＥ抗体の検出が短時間で可能
になるのでアレルギー診断にも好適である。

【００２６】さらに、本発明によれば、抗原抗体反応の
みに止まらず、従来ＲＩＡ法が適用されていたペプチド
ホルモン等の種々のホルモンあるいは種々の酵素、ビタ
ミン、薬剤などの測定にも応用することが可能である。
従って、従来は限定された施設でＲＩＡ法によらなけれ
ば実施できなかった精密な測定を、一般的な環境で広く
迅速に実施することが可能となる。例えば、集団検診等
のような一般的な状況で、各種のウイルス、癌等のスク
リーニング検査等において、本発明のレーザ磁気免疫測
定用検体調製方法を応用して精密な測定が広く実施でき
れば、癌あるいはウイルス性疾患等の早期診断が可能と
なり、有効な早期治療を的確に実施することが可能とな
る。このように、本発明が医学・医療の分野で果たす効
果は計り知れない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 星野 光利 東京都千代田区内幸町一丁目１番６号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 水谷 弘子 東京都渋谷区宇田川町６番11号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 検出すべき抗原に対する第一の特異抗体
   が予め結合された非磁性体からなるマイクロビーズ浮遊
   液と、検体とを反応させ、該マイクロビーズ表面に検体
   を捕捉する第一工程と、捕捉された該検体と、該検体に
   対する第二の特異抗体とを更に反応させ、該検体を第一
   と第二の特異抗体とでサンドイッチする第二工程と、前
   記第二工程後の反応相に、該第二の特異抗体に対する抗
   抗体に予めビオチンを結合させた第三の特異抗体を加え
   て該第二の特異抗体と該第三の特異抗体とを反応させる
   第三の工程と、前記第三の工程後の反応相に、アビジン
   結合磁性微粒子標識材料の分散浮遊液を加えて上記第三
   の特異抗体中のビオチンと、該アビジン結合磁性微粒子
   標識材料中のアビジンとを反応させ該マイクロビーズに
   捕捉された該検体のみを磁気標識する第四工程と、前記
   工程において反応しなかった該磁性微粒子標識材料を分
   離・除去する第五工程とを少なくとも含むことを特徴と
   するレーザ磁気免疫測定用検体調製方法。