JPH03225277A - 多項目の免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウィルス抗体あるいはホルモンの同時多項目
免疫化学的測定法に関する。

〔従来の技術〕

従来の方法として各項目をそれぞれに測定し結果を得る
方法が一般的である。一方、免疫測定法において同時に
多項目の抗体あるいは抗原の有無を調べる方法として固
相に結合させる抗原あるいは抗体を予め混合させ、その
後に固相にそれらを結合させ、それを測定に用いる方法
や、１〜１０ｍｍのポリスチレンボールに別々に抗体や
抗原を結合させた固相を用いる免疫測定法が知られてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、前述の各項目に応じて測定する方法は多
くの検体量を必要とし、新生児などの検体量の限られた
患者には適していない。また、それに関るコストは項目
数分だけ係るため多額の費用を必要としていた。

また、上述の同時多項目法は、固相の結合容量が低く同
時に多項目の成分を検出することが困難であり、また反
応時間を長くすれば検体中の測定対象項目の濃度が異な
るために２つ以上の項目での検出シグナルを同程度にす
ることが困難であった。一方、１〜１０ｍｍのポリスチ
レンボールに抗体や抗原を別々に結合させた固相を用い
る免疫測定法では固相それ自体の容積が大きくなり、大
量の検体を必要とするなどの問題があった。

〔課題を解決するための手段〕 本発明者らはこれらの問題を解決するため、鋭意努力し
、各々の測定抗体あるいは抗原に対する抗体を粒径が０
．１〜１．０μｍの粒子に結合させ、同じシグナル／ノ
イズ　（Ｓ／Ｎ）　　となるように混合し、これを固相
とすることおよびより高感度な検出系を採用することに
より同時多項目の免疫化学的測定法を開発することがで
き、本発明を完成するに至ったものである。本発明にお
ける測定対象は、検体に含まれるウィルス抗体あるいは
ホルモンである。検体の種類は限定されないが、例えば
血漿、血清、血球抽出液深、全血液抽出液などである。

抗体の作製 本発明に使用するためのポリクローナル抗体は、抗原を
ウサギ、山羊、馬、モルモット、ニワトリなどの温血動
物に体重１ｋｇあたり０．３〜２ｍｇを１〜数回背中皮
下、フントバット、大腿筋などにアジュバントとともに
注射し、その血清より得ることができる。また、モノク
ローナル抗体は、抗原をマウス１匹あたり０．０１〜０
．５ｍｇフロインドアジュバントとともに注射し、抗体
価が高くなった状態で肺臓を摘出し、その肺細胞をポリ
エチレングリコールによりマウスミエローマ細胞と融合
させ、その細胞より当該抗体を産生ずる細胞を選択し、
モノクローン細胞として増殖させ、これをマウス腹腔中
あるいは培養液中で大量細胞培養することにより製造す
ることができる（モノクローナル抗体とがん、■サイエ
ンスフォーラム、１９８５年）。

本発明における免疫化学的測定法として、放射免疫測定
法、酵素免疫測定法、これらのいづれの方法を採用して
も同時多項目が定性的あるいは定量的に行うことができ
る。本発明における酵素免疫測定法では例えばウィルス
検出用では各種ウィルス抗原を上述の粒子に結合させ、
粒子の混合比率を決めるため、予めそれぞれの測定対象
ごとに抗原を測定する。次に同じＳ／Ｈになるように粒
子を希釈し混合する。この粒子に一定量の検体を加え、
１分〜３０時間反応させ粒子を洗浄する。

これに一定量の酵素標識抗ヒｌ−１ｇＧ抗体を加え１分
〜３０時間反応さ＋！′％粒子を洗浄する。それぞれの
反応温度は４℃〜４０℃であり、好ましくは２５℃〜３
８℃である。洗浄後、粒子に結合した抗体結合酵素の量
を酵素基質を加え活性測定することにより検体中の抗体
量を定性あるいは定量することができる。本方法におい
て用いることのできる酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼなどである。この際基質は、用いる酵素に
適したものを用いることは言うまでもない。例えば、Ａ
ＢＴＳ、ルミノール−Ｈ２０□（パーオキシダーゼ用）
、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウンベリフ
ェリルホスフェート、ＡＭＰＰＤ（アルカリホスファタ
ーゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−０−ガラクトース
、メチリウンベリフェリル−β−０−ガラクトース、Ａ
ＭＧＰＤ　（β−ガラクトシダーゼ用）などを挙げるこ
とができる。酵素反応させ、測定は４℃から４０℃で加
温しながらレート法あるいは１分〜１８時間反応させ、
生じた発色、蛍光あるいは、発光の測定により行うもの
である。

また本発明の免疫化学的測定法の放射免疫測定法は上記
酵素標識のかわりに１２５１などの放射同位元素を標識
し、行うものである。本方法の実施の際の測定操作は前
記酵素免疫測定法の場合と全く同じである。

粒子の抗体あるいは抗原の結合法は物理吸着法や化学的
結合法を使用する。例えばカルボキシメチル化された粒
子の場合、０．１〜ＩＩＩＩｇの抗体溶液（ｐＨ５〜７
）に水溶性カルボジイミドを加え１〜５時間反応させる
ことにより調製される。免疫反応を行うにあたっては先
に述べた抗原固定粒子にサンプルを加え、４℃〜４０℃
好ましくは２０℃〜３８℃で１〜１８時間反応させるも
のである。

この後、生理食塩水あるいは蒸留水で洗浄を行い、放射
標識抗体をこの粒子に加え、４℃〜４０℃好ましくは２
０℃〜３８℃で１〜１８時間反応させ、生理食塩水ある
いは蒸留水で洗浄を行い、その放射能活性を計測するも
のである。測定にはシンチレーションカウンターを使用
するものである。

また本発明は、イソルミノールやアクリジンエステルな
どをラベルした化学発光測定法、フルオッセインやロー
ダミンをラベルした蛍光免疫測定法で行うこともできる
。この際、ラベル体の標識は活性化エステル法やインチ
アネート法を採用することにより容易に行うことができ
る（「酵素免疫測定法」（医学書院、１９８７年）参照
）。

〔作　　用〕

本発明は、ヒト血清あるいは尿に含まれるいくつかの抗
体や抗原を同時に測定される。

〔実　施　例〕

参考例１　パーオキシダーゼ活性測定用試薬の調製 （ア）　　１．０ｍＭフェノチアジン−１０イル−プロ
ピルスルホネートおよび０．１ｍＭのフェノールインド
フェノールを含むようにトリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ＝　８．４．５０　ｍＭ）に加える。

（イ）　ルミノールＤＭＳＯ溶液を調製時初期濃度が７
５０μＭとなるように１ｍＭの過酸化水素水溶液に加え
調整した。

実施例　１ １−ｉ　　抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合磁性粒子の作製 ５％フェライト被覆粒子（０，３μｍ）分散水溶液（２
０ｍＭ酸緩衝液、ｐＨ３，５）４ｍｌに抗ＴＳ）［ｖウ
スＩｇＧ　（５ｍｇ／ｍｊ’）　１ｔｎｌを加え、エン
ドオーバーエンドミキサーで室温で一夜攪拌シタ。

この粒子分散液を表面が３０００ガウスの磁石で上清と
粒子に分離した後、上清を除去し、２％ＢＳＡ溶液（０
，１Ｍ）リス−塩酸、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１
ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ７，５）で５回洗浄し、同様のＢＳ
Ａ溶液５ｍｌ１に分散し、磁性粒子とした。

１−ｉ　抗１７−ヒトロキシブロケステロンウサギＩｇ
Ｇ結合磁性粒子の作製（抗１７１７−０ＨＰＩ結合） ５％フェライト被覆粒子（０，３μｍ）分散水溶液（２
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３，５）４ｍｆに抗１７−ヒ
トロキシブロケステロンウサギＩｇＧ（５ｍｇ／ｍｉ’
）　ｌｌｌ１ｔを加え、エンドオーバーエンドミキサー
で室温で一夜攪拌した。この粒子分散液を表面が３００
０ガウスの磁石で上清と粒子に分離した後、上清を除去
し、２％ＢＳＡ溶液（０，１Ｍトリス−塩酸、１ｍＭ塩
化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ７，５）で
５回洗浄し、同様のＢＳＡ溶液溶液５仁ｌ散し、磁性粒
子とした。

これらの二種類の磁性粒子を抗ＴＳＨマウスＩｇＧ粒子
が０．０２％、抗１７−０ＨＰウサギＩｇＧ粒子がｏ、
ｏｏｓ％になるように混合し、ＴＳＨ，１７−０ＨＰ検
出用粒子とした。

実施例１で作製したホルモン検出用フェライト粒子溶液
２００μｌに検体２０μ！パ一オキシダーゼ結合ＴＳＨ
及びパーオキシダーゼ結合１７−〇〇Ｐの混合液（０，
５μｇ／ｍ１）、を２０μｌ加え、室温で３０分間放置
した。

このチューブを表面磁場が３０００ガウスの磁石に接し
て、フェライト粒子を集磁させ、上清をデカンテーショ
ンにより排液した。この後０．０４％生理食塩水ｌｌ１
１を加え攪拌した。このチューブを前述の磁石により上
清をデカンテーションにより排液した。この操作を３回
繰り返した。この粒子を含むチューブに参考例１で調製
しておいたパーオキシダーゼ活性測定試薬を２００μｌ
加えた。次に参考例１で調整した溶液（イ）を１３５μ
！加え３７℃で３００分間反応せた。その後フォトンカ
ウンターに入れパーオキシダーゼの活性を測定した。１
０秒間の測定の内４秒間に於ける発光を積算した。

各検体及びスタンダード抗原を用いて測定した結果を表
１に示す。

ＴＳＨＯμＵ／ａ＋１ ＴＳＨ５μＵ／ｍ１ ＴＳＨ２０μＵ／ｍｆ ＴＳＨ４０μＵ／ｍｉ’ １７−０ＨＰ　　Ｏμｇ／ｍ　１ １７−ＯＨＰ　　３　ａ　ｇ／ｍ　１ １７−ＯＨＰ　１０μｇ／ｌ１１ １７−ＯＨＰ　４０ｕｇ／ｍｌ！ （検体） 表１ カウント（５秒間） ８００００ ０００００ ｓｏｏｏ。

００００ ３ｇ２０００ ２５０００ ５０００ １０００ ６５０００ ８００００ （判定） 正常 正常 ２２００００　　　再検査 １０００００　　　　確定検査 １５００００１／ ３７５０００　　　正常 実施例　２ ２−ｉ　　　ＨＩＶ　、ＡＴＬＡ　、ＨＢＶ結合フェラ
イト粒子の調製 ５％フェライト被覆粒子分散水溶液（２０ｍＭリン酸緩
衝液、ｐＨ３，５）４ｍｉに各抗原（５ｍｇ／ａ１）１
＋ａｌを加え、エンドオーバーエンドミキサーで室温で
一夜攪拌した。この粒子分散液を表面が３０００ガウス
の磁石で上清と粒子に分離した後、上清を除去し、２％
ＢＳＡ溶液（０，１Ｍトリス−塩酸、１ｍＭ塩化マグネ
シウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ７，５）で５回洗浄
し、同様のＢＳＡ溶液溶液５セｌ散し、磁性粒子とした
。

ＨＩＶ、ＡＴＬＡ　、ＨＢＶ各々ノ抗原を感作した上記
粒子を終濃度でＨＩＶで、０．０１％、ＡＴＬＡではｏ
、ｏｏｓ％、ＨＢ■では０．００２％となるように　２
％ＢＳＡ　溶液で希釈し、スクリーニング用のフェライ
ト粒子とした。

−ｉｔ 人血清を２０μ！とり、これに５％ウサギ血清を含む２
％ＢＳＡ溶液（０，１Ｍトリス−塩酸、１＋ｏＭＭｇ（
Ｊ２．０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、ｐＨ７，５）で希釈し
この２０μｌをチューブに採った。これに実施例２−ｉ
で調製したスクリーニング用フェライト粒子を３５０μ
ｌ加え、室温で３００分間反応せた。

このチューブを表面磁場が３０００ガウスの磁石に接し
て、フェライト粒子を集磁させ、上清をデカンテーショ
ンにより排液した。この後０．０４％生理食塩水１ｍｉ
’を加え攪拌した。このチューブを前述の磁石により上
清をデカンテーションにより排液した。この操作を３回
繰り返した。このチューブに抗ヒトＩｇ−マウスＩｇＧ
アルカリホスファターゼコンジ二ゲート　２００μｌ（
コンジニゲート濃度０．５μｇ／ｍｌ！、　　０．１Ｍ
　ｌ−リス−塩酸、２％ＢＳＡ、１ａＭ　ＭｇＣ１’２
．０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、ｐＨ７，５）を混合し、室
温で２００分間反応せた。

次に、このチューブを表面磁場が３０００ガウスの磁石
に接して、フェライト粒子を集磁させ、上清をデカンテ
ーションにより排液した。この後０．０４％生理食塩水
１ｍｆを加え攪拌した。このチューブを前述の磁石によ
り上清をデカンテーション゛により排液した。この操作
を３回繰り返した。この粒子を含むチューブに３−（２
’−ピローハダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’
−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン
ニナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）１００　μｇ／ｍｌを含
む基質液（０，１ｍＭ　　ＺｎＣ１，、ｐＨ９，８）２
００μｊ’　　を加え室温で反応させた。５分間反応を
行った後ルミノメータ−（ベルトールド社製）で測定し
た。その結果を表２に示す。

表２ ウサギ血清 人正常血清　Ａ カウント（ｘｌＯ’１５５ｅｃｏｎｄｓ）０．５ ０．８ ０．９ １．１ 検 体 ０．８ ２５．０ ５．２ １．８ ９．５ １０．６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）免疫測定法において、粒径が０．１〜１．０μｍ
   の粒子を用い、一つの反応層に測定対象の各抗原あるい
   は抗体を別々に結合した該粒子をとり、これに検体を反
   応させることを特徴とする同時多項目免疫化学的測定法
   。 （２）抗原量、抗体量あるいはそれらが結合した粒子量
   を調節し、Ｓ／Ｎを一定にして行うことからなる請求項
   （１）の測定法。 （３）抗原がＢ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス
   、ヒト成人Ｔ細胞リンパ球ウィルス、トレポネーマパリ
   ーダムの中から少なくとも２以上よりなる請求項（１）
   の測定法。（４）抗体が抗サイロイド刺激ホルモン抗体
   、抗１７−ヒドロキシプロゲステロン抗体、Ｔ４の中か
   ら少なくとも２以上よりなる請求項（１）の測定法。 （５）粒子が磁性粒子、ラテックスである請求項（１）
   の測定法。 （６）抗体がマウスモノクローナル抗体である請求項（
   ４）の測定法。 （７）免疫化学的測定法が酵素免疫測定法である請求項
   （１）の測定法。 （８）免疫化学的測定法が放射免疫測定法である請求項
   （１）の測定法。