JPH0558715B2 - - Google Patents
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- JPH0558715B2 JPH0558715B2 JP63311047A JP31104788A JPH0558715B2 JP H0558715 B2 JPH0558715 B2 JP H0558715B2 JP 63311047 A JP63311047 A JP 63311047A JP 31104788 A JP31104788 A JP 31104788A JP H0558715 B2 JPH0558715 B2 JP H0558715B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/22—Klebsiella
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/852—Klebsiella
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- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、クレブシエラ属の新規微生物
klebsiella sp.またはその変異株の培養物を用い
て、高いラムノース含有量を有する単糖類混合物
を生産する方法に関する。
klebsiella sp.またはその変異株の培養物を用い
て、高いラムノース含有量を有する単糖類混合物
を生産する方法に関する。
クレブシエラ（klebsiella）属の微生物の中に
は、ある生育条件下で、多糖類、特にエキソポリ
サツカリド（exopolysaccharides）を、生育培
地１リツトルあたり十分の数グラムのオーダーで
生産しうるものがあることが知られている。この
場合、ラムノースは、これらエキソポリサツカリ
ドの66％にまで達しうる。このことについては、
B.A.Bryan、R.J.LinhardtおよびL.Danielsの論
文（“Applied and Environmental
Microbiology”、vol.51、No.６、第1304〜1308頁
［（1986年６月））を参照されたい。しかし、産生
されるラムノースの収率は低く、工業的な応用に
は結びつかない。
は、ある生育条件下で、多糖類、特にエキソポリ
サツカリド（exopolysaccharides）を、生育培
地１リツトルあたり十分の数グラムのオーダーで
生産しうるものがあることが知られている。この
場合、ラムノースは、これらエキソポリサツカリ
ドの66％にまで達しうる。このことについては、
B.A.Bryan、R.J.LinhardtおよびL.Danielsの論
文（“Applied and Environmental
Microbiology”、vol.51、No.６、第1304〜1308頁
［（1986年６月））を参照されたい。しかし、産生
されるラムノースの収率は低く、工業的な応用に
は結びつかない。
出願人は、クレブシエラ属の新規微生物
Klebsiella sp.の培養物を使用することにより上
記論文に報告されているよりもずつと高収率で、
ラムノースを生産することが可能であることを、
あらたに見出した。
Klebsiella sp.の培養物を使用することにより上
記論文に報告されているよりもずつと高収率で、
ラムノースを生産することが可能であることを、
あらたに見出した。
本発明の目的は、クレブシエラ属の新規菌株を
用いてラムノース含有量の高い単糖類混合物を生
産する方法を提供することである。
用いてラムノース含有量の高い単糖類混合物を生
産する方法を提供することである。
より特定すれば、本発明は、番号Ｉ−714とし
て1987年11月10日付でパスツール研究所
（Institut Pasteur）の国立微生物培養物寄託所
（Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes（C.N.C.M）住所：パリ
75724、リユ・デユ・ドクトール・ルー25番地−
25、rue du Docteur Roux−75724 PARIS
CEDEX 15）に委託された菌株BEC 441とその
同一種内変異株を用いて、同化可能な、炭素源、
窒素源および無機物質源を含む栄養培地中での発
酵により、大部分エキソサツカリドのかたちで、
ラムノースを含む多糖類を産生する方法に関す
る。
て1987年11月10日付でパスツール研究所
（Institut Pasteur）の国立微生物培養物寄託所
（Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes（C.N.C.M）住所：パリ
75724、リユ・デユ・ドクトール・ルー25番地−
25、rue du Docteur Roux−75724 PARIS
CEDEX 15）に委託された菌株BEC 441とその
同一種内変異株を用いて、同化可能な、炭素源、
窒素源および無機物質源を含む栄養培地中での発
酵により、大部分エキソサツカリドのかたちで、
ラムノースを含む多糖類を産生する方法に関す
る。
この新規微生物は、下水処理場の汚泥から単離
されたもので、下記の特徴を有する： 基本的様態 −形態：均一な杆菌 直径において大 特定の配列をもたない −移動性− −グラム陰性 −３％KOHによる溶解：＋＋＋ −深い寒天中での可視培養：好気／嫌気性 −０％NaCl肉汁中での培養：＋＋＋ −２％NaCl肉汁中での培養：＋＋＋ −４％NaCl肉汁中での培養：＋＋＋ −６％NaCl肉汁中での培養：＋＋ −８％NaCl肉汁中での培養：＋ −10％NaCl肉汁中での培養：− 〔基本培地：PYG（ペプトン：10ｇ／；イース
ト抽出物：３ｇ／；グルコース：１ｇ／）〕 −10℃での培養：＋＋＋ −20℃での培養：＋＋＋ −41℃での培養：＋＋＋ −45℃での培養：− 〔基本培地：BHI（脳、心臓浸出液、診断用パ
スツール（Diagnostic Pasteur））〕 −普通寒天培地上での急速濃厚培養：白色で厚く
滑らかで広がつた直径８〜10mmのコロニー（コ
ロンビア寒天（COLUMBIA AGAR）、30℃、
空気中、４日間培養） −原栄養株培養 −グルコースからの酸産生：＋＋＋ −グルコースからのガス産生： 10℃で：＋＋＋ｄ 30℃で：＋＋＋ 41℃で：− −ヴオージエ・プロスカウアー（VOGES−
PROSKAUER）反応：＋＋＋ −硝酸塩還元酵素（nitrate reductase）：＋＋＋ −亜硝酸塩還元酵素（nitrite reductase）：＋ −チオ硫酸塩還元酵素（thiosulphate
reductase）：−テトラチオネート・レダクター
ゼ（tetrathionate reductase）：− −ウレアーゼ：＋＋＋ −インドール産生：− −フエニルアラニン・デアミナーゼ
（phenylalanine deaminase）：− −トリプトフアン・デアミナーゼ（tryptophan
deaminase）：− −［アルギニン・ジヒドロラーゼ」（“alginine
dihydrolase”）：− −「オルニチン・デカルボキシラーゼ」
（“ornithine decarboxylase”）：− −「リジン・デカルボキシラーゼ（“lysine
decarboxylase”）：− −γ−グルタミルトランスフエラーゼ（γ−
glutamyltransferase）：＋＋＋ −oNPb−ガラクトシド（oNP−galactoside）
の加水分解：＋＋＋ −pNPb−キシロシド（pNPb−xylosde）の可水
分解：− −pNPb−グルクロネート（pNPb−
glucuronate）の加水分解：− −不溶性デンプンの加水分解：＋ −TWEEN80の加水分解：− −卵黄寒天上のリパーゼ：− −細胞外DNAアーゼ（extracellular DNase）：
− −ゲラチナーゼ（gelatinase （Frazier））：− −カゼイナーゼ（caseinase）：− −API 50 CH（発売元：アー・ペー・イ・シス
テム・エス・アー（API System S.A.）、La
Balme−Les−Crrotes、38390 Montalieu−
Vercieu、France）での酸性化 懸濁培地：MTL（後記M63倍地＋ペプトン５
ｇ／＋イースト抽出物0.5ｇ／） 指示薬：フエノール・レツド 測定：１、５、９日 結果は第１図にまとめてある。
されたもので、下記の特徴を有する： 基本的様態 −形態：均一な杆菌 直径において大 特定の配列をもたない −移動性− −グラム陰性 −３％KOHによる溶解：＋＋＋ −深い寒天中での可視培養：好気／嫌気性 −０％NaCl肉汁中での培養：＋＋＋ −２％NaCl肉汁中での培養：＋＋＋ −４％NaCl肉汁中での培養：＋＋＋ −６％NaCl肉汁中での培養：＋＋ −８％NaCl肉汁中での培養：＋ −10％NaCl肉汁中での培養：− 〔基本培地：PYG（ペプトン：10ｇ／；イース
ト抽出物：３ｇ／；グルコース：１ｇ／）〕 −10℃での培養：＋＋＋ −20℃での培養：＋＋＋ −41℃での培養：＋＋＋ −45℃での培養：− 〔基本培地：BHI（脳、心臓浸出液、診断用パ
スツール（Diagnostic Pasteur））〕 −普通寒天培地上での急速濃厚培養：白色で厚く
滑らかで広がつた直径８〜10mmのコロニー（コ
ロンビア寒天（COLUMBIA AGAR）、30℃、
空気中、４日間培養） −原栄養株培養 −グルコースからの酸産生：＋＋＋ −グルコースからのガス産生： 10℃で：＋＋＋ｄ 30℃で：＋＋＋ 41℃で：− −ヴオージエ・プロスカウアー（VOGES−
PROSKAUER）反応：＋＋＋ −硝酸塩還元酵素（nitrate reductase）：＋＋＋ −亜硝酸塩還元酵素（nitrite reductase）：＋ −チオ硫酸塩還元酵素（thiosulphate
reductase）：−テトラチオネート・レダクター
ゼ（tetrathionate reductase）：− −ウレアーゼ：＋＋＋ −インドール産生：− −フエニルアラニン・デアミナーゼ
（phenylalanine deaminase）：− −トリプトフアン・デアミナーゼ（tryptophan
deaminase）：− −［アルギニン・ジヒドロラーゼ」（“alginine
dihydrolase”）：− −「オルニチン・デカルボキシラーゼ」
（“ornithine decarboxylase”）：− −「リジン・デカルボキシラーゼ（“lysine
decarboxylase”）：− −γ−グルタミルトランスフエラーゼ（γ−
glutamyltransferase）：＋＋＋ −oNPb−ガラクトシド（oNP−galactoside）
の加水分解：＋＋＋ −pNPb−キシロシド（pNPb−xylosde）の可水
分解：− −pNPb−グルクロネート（pNPb−
glucuronate）の加水分解：− −不溶性デンプンの加水分解：＋ −TWEEN80の加水分解：− −卵黄寒天上のリパーゼ：− −細胞外DNAアーゼ（extracellular DNase）：
− −ゲラチナーゼ（gelatinase （Frazier））：− −カゼイナーゼ（caseinase）：− −API 50 CH（発売元：アー・ペー・イ・シス
テム・エス・アー（API System S.A.）、La
Balme−Les−Crrotes、38390 Montalieu−
Vercieu、France）での酸性化 懸濁培地：MTL（後記M63倍地＋ペプトン５
ｇ／＋イースト抽出物0.5ｇ／） 指示薬：フエノール・レツド 測定：１、５、９日 結果は第１図にまとめてある。
−M63倍地（炭素源研究用の無機倍地。組成は次
のとおり）： KH2PO4：3.9ｇ／ K2HPO4：11.2ｇ／ （NH4）2SO4：２ｇ／ MgSO4・7H2O：0.2ｇ／ FeSO4・7H2O：0.05ｇ／ Ｄ−グルコース存在下：＋＋＋ 酢酸存在下：＋＋＋ マロン酸存在下：− クエン酸存在下：＋＋＋ ３−ヒドロキシ安息香酸存在下：− Ｌ−ヒドロキシプロリン存在下：− 空気中30℃での反応 記号の説明 −：反応または培養が陰性（進まない） ｗ：弱 ｄ：遅延 ＋：陽性 ＋＋：強陽性 ＋＋＋：陽性の度合いが特に強い 化学的分類様相 極性脂質に関する組成を下記の方法で調べた。
のとおり）： KH2PO4：3.9ｇ／ K2HPO4：11.2ｇ／ （NH4）2SO4：２ｇ／ MgSO4・7H2O：0.2ｇ／ FeSO4・7H2O：0.05ｇ／ Ｄ−グルコース存在下：＋＋＋ 酢酸存在下：＋＋＋ マロン酸存在下：− クエン酸存在下：＋＋＋ ３−ヒドロキシ安息香酸存在下：− Ｌ−ヒドロキシプロリン存在下：− 空気中30℃での反応 記号の説明 −：反応または培養が陰性（進まない） ｗ：弱 ｄ：遅延 ＋：陽性 ＋＋：強陽性 ＋＋＋：陽性の度合いが特に強い 化学的分類様相 極性脂質に関する組成を下記の方法で調べた。
シリカ上薄層クロマトグラフ法による比較分析抽
出に用いた溶媒：クロロホルム／メタノール
１：２ １次元クロマトグラフ法； 展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水／酢酸
65：25：４：0.8 リン脂質の可視化：モリブデン酸アンモニウム アミノ化脂肪質の可視化：ニンヒドリン 糖脂質の可視化：α−ナフトール 全脂質の可視化：バニリン／H2SO4 対照株： mfl 290：Klebsiella Terrigena CIP 80.07得
られたクロマトグラムを第２図に示す。
出に用いた溶媒：クロロホルム／メタノール
１：２ １次元クロマトグラフ法； 展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水／酢酸
65：25：４：0.8 リン脂質の可視化：モリブデン酸アンモニウム アミノ化脂肪質の可視化：ニンヒドリン 糖脂質の可視化：α−ナフトール 全脂質の可視化：バニリン／H2SO4 対照株： mfl 290：Klebsiella Terrigena CIP 80.07得
られたクロマトグラムを第２図に示す。
Klebsiella sp.I.714株は抗莢膜血清
（anticapsular sera）Ｋ 14およびＫ 44に対し
試験した場合、ノイフエルト反応（莢膜膨化）に
陽性反応を示す。他の抗莢膜血清、たとえば、
K1からK13、K15、K17からK43、K46、K47、
K50、K51、K54、K55、K59からK62、K64から
K67およびK70からK72に対しては反応陰性であ
り、K16、K45、K48、K49、K52、K53、K56か
らK58、K63、K68およびK69血清に対しては、
I.714株は、ノイフエルト反応に弱陽性を示す。
よつて、I.714株は血清型K14およびK44に関係す
る。
（anticapsular sera）Ｋ 14およびＫ 44に対し
試験した場合、ノイフエルト反応（莢膜膨化）に
陽性反応を示す。他の抗莢膜血清、たとえば、
K1からK13、K15、K17からK43、K46、K47、
K50、K51、K54、K55、K59からK62、K64から
K67およびK70からK72に対しては反応陰性であ
り、K16、K45、K48、K49、K52、K53、K56か
らK58、K63、K68およびK69血清に対しては、
I.714株は、ノイフエルト反応に弱陽性を示す。
よつて、I.714株は血清型K14およびK44に関係す
る。
本発明はまた、微生物Klebsiella sp.BEC 441
の変異株の使用に関する。有用な変異株は、発酵
器中であらかじめ培養したものから自然発生変異
株を単離し、これから単純に選び出すことによ
り、あるいは、Klebsiella sp.BEC 441の培養物
に高エネルギー放射線（たとえば紫外線、Ｘ線）
または化学試薬［たとえばオゾン、亜硝酸、
NTG（Ｎ−メチル−N′−ニトロソ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）もしくはEMS（エチルメタン・ス
ルホネート）］を作用させて微生物の大部分を殺
し、生き残つた微生物を培養し、より多くの多糖
類を産生するものを選択することにより得ること
ができる。
の変異株の使用に関する。有用な変異株は、発酵
器中であらかじめ培養したものから自然発生変異
株を単離し、これから単純に選び出すことによ
り、あるいは、Klebsiella sp.BEC 441の培養物
に高エネルギー放射線（たとえば紫外線、Ｘ線）
または化学試薬［たとえばオゾン、亜硝酸、
NTG（Ｎ−メチル−N′−ニトロソ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）もしくはEMS（エチルメタン・ス
ルホネート）］を作用させて微生物の大部分を殺
し、生き残つた微生物を培養し、より多くの多糖
類を産生するものを選択することにより得ること
ができる。
本発明の方法は、Klebsiella sp.BEC 441また
は選択されたその変異株の培養物を、炭素源、窒
素源および適当な無機塩からなる栄養培地中、約
６ないし８のPH、約30℃ないし35℃の温度で、空
気を吹き込み撹拌しながら、２ないし12日間発酵
させ、生じた多糖類を発酵媒体から単離し、つい
でこの多糖類を加水分解し、生じた加水分解のPH
を約５ないし９の範囲に調整することによる。
は選択されたその変異株の培養物を、炭素源、窒
素源および適当な無機塩からなる栄養培地中、約
６ないし８のPH、約30℃ないし35℃の温度で、空
気を吹き込み撹拌しながら、２ないし12日間発酵
させ、生じた多糖類を発酵媒体から単離し、つい
でこの多糖類を加水分解し、生じた加水分解のPH
を約５ないし９の範囲に調整することによる。
炭素源としては、ソルビトール、マンニトー
ル、グルコース、グリセロールおよびその混合物
のような物質を用いることができるが、これに限
定されるものではない。現時点では、ソリビトー
ルが好ましい。化学的に純粋な炭素源を用いるこ
とは必須ではない。たとえば、工業用品位のソル
ビトール、就中、マンニトールを不純物として含
むものの使用が可能である。
ル、グルコース、グリセロールおよびその混合物
のような物質を用いることができるが、これに限
定されるものではない。現時点では、ソリビトー
ルが好ましい。化学的に純粋な炭素源を用いるこ
とは必須ではない。たとえば、工業用品位のソル
ビトール、就中、マンニトールを不純物として含
むものの使用が可能である。
目安としては、栄養媒体１リツトルあたり、５
ないし100ｇの炭素源、好ましくは10ないし50
ｇ／の炭素源を用いることができる。
ないし100ｇの炭素源、好ましくは10ないし50
ｇ／の炭素源を用いることができる。
窒素源としては、カゼイン・ペプトン（カゼイ
ンの酸または酵素による加水分解で得られる）、
とうもろこし浸出液、イースト抽出物、大豆ペプ
トン、ジヤガイモ細粉、Ｌ−フエニルアラニン、
トレオニン、硫酸アンモニウムおよびこれらの混
合物のような物質を用いることができるが、これ
に限定されるものではない。現時点では、カゼイ
ン・ペプトン、とうもろこし浸出液およびジヤガ
イモ細粉が好ましい。Ｌ−フエニルアラニンも、
良い結果を与えるが、比較的高価であるという欠
点がある。
ンの酸または酵素による加水分解で得られる）、
とうもろこし浸出液、イースト抽出物、大豆ペプ
トン、ジヤガイモ細粉、Ｌ−フエニルアラニン、
トレオニン、硫酸アンモニウムおよびこれらの混
合物のような物質を用いることができるが、これ
に限定されるものではない。現時点では、カゼイ
ン・ペプトン、とうもろこし浸出液およびジヤガ
イモ細粉が好ましい。Ｌ−フエニルアラニンも、
良い結果を与えるが、比較的高価であるという欠
点がある。
目安としては、栄養培地１あたり窒素源0.5
ないし10ｇ、好ましくは１ないし５ｇ／を用い
ることができる。
ないし10ｇ、好ましくは１ないし５ｇ／を用い
ることができる。
栄養培地中の炭素／窒素重量比が重要な条件で
ある。少なくとも５の比で用いることが有利で、
100もしくはそれ以上にまで及んでよい。
ある。少なくとも５の比で用いることが有利で、
100もしくはそれ以上にまで及んでよい。
無機塩類としては、マグネシウム塩、たとえば
MgSO4および少なくとも１種のリン酸塩、たと
えばM2HPO4（ここでＭはアルカリ金属またはア
ンモニウムイオン）から選ばれるもの、を含むこ
とが必要である。マグネシウム塩は、たとえば、
0.1ないし0.3ｇ／の割合で、リン酸塩は、たと
えば、２ないし15ｇ／の割合で含むことができ
る。M2HPO4とMH2HPO4の混合物を用いると
有利である。こうした混合物は、栄養培地のPHの
調整を可能とし、さらに緩衝液として働く。
MgSO4および少なくとも１種のリン酸塩、たと
えばM2HPO4（ここでＭはアルカリ金属またはア
ンモニウムイオン）から選ばれるもの、を含むこ
とが必要である。マグネシウム塩は、たとえば、
0.1ないし0.3ｇ／の割合で、リン酸塩は、たと
えば、２ないし15ｇ／の割合で含むことができ
る。M2HPO4とMH2HPO4の混合物を用いると
有利である。こうした混合物は、栄養培地のPHの
調整を可能とし、さらに緩衝液として働く。
発酵培地の温度は30ないし35℃の範囲、好まし
くは32〜33℃とすることができる。培地のPHは６
と８の間でなければならず、中性（PH７）域が好
ましい。
くは32〜33℃とすることができる。培地のPHは６
と８の間でなければならず、中性（PH７）域が好
ましい。
通気条件は、発酵培地上の酸素分圧が維持され
るに充分なものでなければならない。おおむね、
0.3ないし3VVM（空気体積／培地体積／分）のオ
ーダーの通気で充分であろう。
るに充分なものでなければならない。おおむね、
0.3ないし3VVM（空気体積／培地体積／分）のオ
ーダーの通気で充分であろう。
発酵媒体を充分に撹拌し続けることも、培地の
角の増粘を防ぐため必要である、おおむね、300
ないし1500rpmの速度での撹拌が適当であろう。
角の増粘を防ぐため必要である、おおむね、300
ないし1500rpmの速度での撹拌が適当であろう。
また、必須ではないものの、栄養培地中に、微
生物にとつて無毒の界面活性剤を混合することが
有利である。これにより、発酵培地から多糖類を
分離するのが容易になる。有用な界面活性剤の一
例は、“Tween 80”の商標名で市販されている
非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン−ソ
ルビトール・モノオレエート）である。たとえ
ば、0.5ないし２ｇ／、好ましくは約１ｇ／
のこの薬剤が混合できる。
生物にとつて無毒の界面活性剤を混合することが
有利である。これにより、発酵培地から多糖類を
分離するのが容易になる。有用な界面活性剤の一
例は、“Tween 80”の商標名で市販されている
非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン−ソ
ルビトール・モノオレエート）である。たとえ
ば、0.5ないし２ｇ／、好ましくは約１ｇ／
のこの薬剤が混合できる。
ビタミン類を供給するため、栄養培地中に少量
のイースト抽出物（主要な窒素源としてこれが用
いられていない場合）を混合することも有利であ
る。
のイースト抽出物（主要な窒素源としてこれが用
いられていない場合）を混合することも有利であ
る。
発酵時間は、おおむね２ないし12日程度とす
る。実施条件および達成しようとする多糖類濃度
の目標値に応じて決まる。
る。実施条件および達成しようとする多糖類濃度
の目標値に応じて決まる。
産生された多糖類は、エクソポリサツカリドま
たは細胞に拘束された多糖類のかたちであるが、
たとえば、発酵培地を70〜120℃の熱で約10分な
いし約１時間熱処理し（細胞に拘束された多糖類
分画を抽出するため）、冷ました状態で遠心分離
して澄んだ上澄みを集めることにより単離する。
この層には、多糖類のほとんど全量が含まれてい
る。所望ならば、この後、集めた上澄み層にアセ
トンまたはエタノールもしくはプロパノールのよ
うな低級アルコールのような非溶媒性有機液体を
添加して多糖類を沈澱させ、その後、過または
遠心分離により沈澱を分離し、最後にこれを乾燥
することも可能である。変法として、上澄み層を
凍結乾燥させることもできる。
たは細胞に拘束された多糖類のかたちであるが、
たとえば、発酵培地を70〜120℃の熱で約10分な
いし約１時間熱処理し（細胞に拘束された多糖類
分画を抽出するため）、冷ました状態で遠心分離
して澄んだ上澄みを集めることにより単離する。
この層には、多糖類のほとんど全量が含まれてい
る。所望ならば、この後、集めた上澄み層にアセ
トンまたはエタノールもしくはプロパノールのよ
うな低級アルコールのような非溶媒性有機液体を
添加して多糖類を沈澱させ、その後、過または
遠心分離により沈澱を分離し、最後にこれを乾燥
することも可能である。変法として、上澄み層を
凍結乾燥させることもできる。
Klebsiella sp.BEC 441（I.714）によつて産生
される多糖類は、六炭糖の繰り返し単位からな
る。この六炭糖はラムノース、ガラクトースおよ
びグルクロン酸からなり、それぞれのモル比は
３：２：１である。これはガラクトースの３位で
分岐した側鎖を含み、該側鎖の分岐点には、側鎖
の一部であるウロン酸が直接に結び付いている側
鎖はラムノース残基で終わる。
される多糖類は、六炭糖の繰り返し単位からな
る。この六炭糖はラムノース、ガラクトースおよ
びグルクロン酸からなり、それぞれのモル比は
３：２：１である。これはガラクトースの３位で
分岐した側鎖を含み、該側鎖の分岐点には、側鎖
の一部であるウロン酸が直接に結び付いている側
鎖はラムノース残基で終わる。
多糖類の加水分解は、H2SO4やHClのような強
酸によつて加水分解し、多糖類を単糖類に転化す
る。加水分解物のPHを、その後、NaOHやKOH
のような塩基により調整し、約５ないし９の範囲
のPH、好ましくは中性に近いPHとする。
酸によつて加水分解し、多糖類を単糖類に転化す
る。加水分解物のPHを、その後、NaOHやKOH
のような塩基により調整し、約５ないし９の範囲
のPH、好ましくは中性に近いPHとする。
加水分解は、上澄み層に対し直接に行なつても
よいし、乾燥あるいは凍結乾燥した製品に対し行
なつてもよい。加水分解は、たとえば、H2SO4
を用いて100℃で６時間かけて遂行し、処理した
ものの最終的な酸濃度は約2Nとなる。
よいし、乾燥あるいは凍結乾燥した製品に対し行
なつてもよい。加水分解は、たとえば、H2SO4
を用いて100℃で６時間かけて遂行し、処理した
ものの最終的な酸濃度は約2Nとなる。
典型的な場合には、中和した加水分解物は次の
単糖類組成を有する。
単糖類組成を有する。
ラムノース 64〜84（モル比％）
グルコース ２〜22（モル比％）
ガラクトース 12〜21（モル比％）
グルクロン酸 ０〜12（重量％）
所望ならば、既知の単糖類分離技術によりラム
ノースを他の単糖類から単離することができる。
目安として述べれば、中和した加水分解物は、脱
塩後、イオン交換カラム上のクロマトグラフにか
けて分離し、使用したイオン交換樹脂に合う緩衝
剤で置換することができる。適当な樹脂の一例
は、ホウ酸緩衝剤と用いたDowex １×４である
が、他の多くの樹脂も使用できるであろう。
ノースを他の単糖類から単離することができる。
目安として述べれば、中和した加水分解物は、脱
塩後、イオン交換カラム上のクロマトグラフにか
けて分離し、使用したイオン交換樹脂に合う緩衝
剤で置換することができる。適当な樹脂の一例
は、ホウ酸緩衝剤と用いたDowex １×４である
が、他の多くの樹脂も使用できるであろう。
ラムノース含有量の高い単糖類混合物またはこ
の混合物から単離したラムノースは、フラネオー
ルおよびその誘導体のような調味料または香味料
合成の有用な出発原料になる。
の混合物から単離したラムノースは、フラネオー
ルおよびその誘導体のような調味料または香味料
合成の有用な出発原料になる。
さらに、本発明の培養物によつて産生された多
糖類は、一般的な多糖類の用途を有し、たとえ
ば、安定剤、懸濁剤、分散剤または増粘剤、膜形
成剤、保水剤、凝固剤、コロイド、潤滑剤とし
て、また、たとえば、粉末状洗在、織物、接着
剤、紙、塗料および食品に、さらに油回収に使用
できる。
糖類は、一般的な多糖類の用途を有し、たとえ
ば、安定剤、懸濁剤、分散剤または増粘剤、膜形
成剤、保水剤、凝固剤、コロイド、潤滑剤とし
て、また、たとえば、粉末状洗在、織物、接着
剤、紙、塗料および食品に、さらに油回収に使用
できる。
本発明を例示するため、以下、実施例を掲げる
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
以下の例のいずれかにおいても、600nｍで光
学濃度0.15を有する本発明培養物の接種物は、発
酵培地１リツトルあたり10ミリリツトルの割合で
用いた。
学濃度0.15を有する本発明培養物の接種物は、発
酵培地１リツトルあたり10ミリリツトルの割合で
用いた。
実施例 １
以下の組成を有する発酵培地を実験室用発酵器
（105500型発酵器、容量２リツトル；発売元：
BIOLAFITTE社、Saint−Germain en Laye、
France）に置いた。
（105500型発酵器、容量２リツトル；発売元：
BIOLAFITTE社、Saint−Germain en Laye、
France）に置いた。
ソルビトール 20ｇ／
フエニルアラニン １ｇ／
MgSO4・7H2O 0.2ｇ／
K2HPO4 ９ｇ／
KH2PO4 ３ｇ／
TWEEN 80
１ｇ／
製パン用イースト抽出物 20mg／
前に記載きた接種物をこの培地に加え、以下の
条件で発酵を遂行した。
条件で発酵を遂行した。
温 度 30℃
通 気 0.5VVM
撹 拌 400ないし600rpm
当初PH ７（調節せず）
７日間発酵させた後、ラムノース含有量は、分
光側光により測定して、発酵培地１につき３ｇ
であつた。ソリビトール50ｇ／およびフエニル
アラニン５ｇ／を培地に添加した。４日後、ラ
ムノース含有量は5.5ｇ／であつた。
光側光により測定して、発酵培地１につき３ｇ
であつた。ソリビトール50ｇ／およびフエニル
アラニン５ｇ／を培地に添加した。４日後、ラ
ムノース含有量は5.5ｇ／であつた。
実施例 ２
実施例１と同じ装置で発酵を遂行したが、以下
の発酵培地を用いた。
の発酵培地を用いた。
ソルビトール 20ｇ／
フエニルアラニン ２ｇ／
MgSO4・7H2O 0.2ｇ／
K2HPO4 ９ｇ／
KH2PO4 ３ｇ／
TWEEN 80
１ｇ／
イースト抽出物 20mg／
発酵条件は実施例１と同じにした。
８日間発酵させた後、発酵培地１につき5.5
ｇのラムノースが得られた。
ｇのラムノースが得られた。
実施例 ３
ソルビトールとフエニルアラニンの割合をそれ
ぞれ50ｇ／、５ｇ／に上げたほかは、実施例
２と同じにした。
ぞれ50ｇ／、５ｇ／に上げたほかは、実施例
２と同じにした。
７日間発酵させた後、発酵培地１につき5.5
ｇのラムノースが得ることができた。
ｇのラムノースが得ることができた。
実施例 ４
この例では、富ラムノース多糖類高産生性変異
株の、出発株BEC 441からの紫外線処理による
調製法を記載する。
株の、出発株BEC 441からの紫外線処理による
調製法を記載する。
BEC 441株培養物を以下の培地上につくつた。
ソルビトール 10ｇ／
フエニルアラニン １ｇ／
MgSO4・7H2O 0.2ｇ／
K2HPO4 ９ｇ／
KH2PO4 ３ｇ／
TWEEN 80
１ｇ／
通気条件下（0.5VVM）、30℃で４日間培養し
た後、この培養物５mlを遠心分離し（4000rpm、
５分間）、得られたケーキを生理的溶液５ml中に
取り出した。
た後、この培養物５mlを遠心分離し（4000rpm、
５分間）、得られたケーキを生理的溶液５ml中に
取り出した。
こうして得た細胞懸濁液をペトリ皿に移し紫外
線ランプ（Phlips社製5W）の下、20cm離して置
いた。露光を続ける間、手で撹拌した。１分間露
光した後、生き残つた細胞（全細胞の約１％）を
前記培地20mlに移し、30℃３時間培養して表現型
（phenotype）を顕現させた。
線ランプ（Phlips社製5W）の下、20cm離して置
いた。露光を続ける間、手で撹拌した。１分間露
光した後、生き残つた細胞（全細胞の約１％）を
前記培地20mlに移し、30℃３時間培養して表現型
（phenotype）を顕現させた。
この培養後、ペトリ皿中以下の培地上に細胞を
平板培養した。
平板培養した。
ソルビトール 50ｇ／
フエニルアラニン ５ｇ／
Tween
WEEN 80 １ｇ／
MgSO4・7H2O 0.2ｇ／
K2HPO4 ９ｇ／
KH2PO4 ３ｇ／
寒 天 15ｇ／
30℃で１時間培養した後、より多くの多糖類を
産生した変異株コロニーを識別した。識別は、非
変異株コロニーよりも大きなムコイド領域がコロ
ニー周辺に存在するかどうかで行なつた。
産生した変異株コロニーを識別した。識別は、非
変異株コロニーよりも大きなムコイド領域がコロ
ニー周辺に存在するかどうかで行なつた。
これらのコロニーは、単離した後、最初の株と
同様に増殖させ、保存した。
同様に増殖させ、保存した。
実施例 ５
この例では、オゾン処理による、出発株BEC
441からの富ラムノース多糖類高産生性変異株の
調製について記載する。
441からの富ラムノース多糖類高産生性変異株の
調製について記載する。
実施例４記載の液体培地上および条件下で、発
酵器中で、１リツトルの培養物をつくつた。
酵器中で、１リツトルの培養物をつくつた。
４縫置換培養した後、実験室用オゾン発生機を
用いてオゾン処理を遂行した。この目的のため、
発酵器に入る空気は、発酵器に導入される前にオ
ゾン発生機を経由するようにした。１時間の処理
後、通気を再開した。
用いてオゾン処理を遂行した。この目的のため、
発酵器に入る空気は、発酵器に導入される前にオ
ゾン発生機を経由するようにした。１時間の処理
後、通気を再開した。
処理前後の生存細胞数を測定したところ、処理
後の生残りの濃度は約10％であつた。
後の生残りの濃度は約10％であつた。
処理後さらに３時間、細胞を培養し、表現型を
顕現させた。ついで、細胞をペトリ皿上で平板培
養し、高産生性変異株を採るべく試験した。この
試験は、実施例４におけるのと同様に実行した。
顕現させた。ついで、細胞をペトリ皿上で平板培
養し、高産生性変異株を採るべく試験した。この
試験は、実施例４におけるのと同様に実行した。
実施例 ６
この例では、変異株を用いての富ラムノース多
糖類の産生を例示する。
糖類の産生を例示する。
使用株
−EP1およびEP2：
実施例４に記載した紫外線変異誘発により
BEC411株から得たもの。
BEC411株から得たもの。
−E41およびE42：
発酵器中であらかじめ培養したものから単離し
て自然変異株。富ラムノース多糖類高産生性自然
変異株コロニーの識別は、非変異株コロニーより
大きなムコイド領域がコロニーの周囲に存在する
かどうかで判断した。
て自然変異株。富ラムノース多糖類高産生性自然
変異株コロニーの識別は、非変異株コロニーより
大きなムコイド領域がコロニーの周囲に存在する
かどうかで判断した。
使用培養培地
ソルビートル 50ｇ／
カゼイン・ペプトン 4.5ｇ／
フエニルアラニン 0.1ｇ／
イースト抽出物 0.05ｇ／
Tween
80 １ｇ／
MgSO4・7H2O 0.2ｇ／
K2HPO4 1.8ｇ／
KH2PO4 0.6ｇ／
発酵器中での培養条件
温 度 32℃
PH 1N NaOHにより7.0に維持
通 気 0.5VVM
撹 拌 400ないし1000rpm
ラムノースの産生量を毎日追跡し、使用した変
異株の各々につき発酵時間とラムノース産生量の
関係をプロツトした。得られた曲線を第３図に示
す。
異株の各々につき発酵時間とラムノース産生量の
関係をプロツトした。得られた曲線を第３図に示
す。
７日未満発酵をした後、発酵培地１リツトルあ
たり12ｇまでのラムノースが得られることがわか
つた。
たり12ｇまでのラムノースが得られることがわか
つた。
第１図はAPI
50 CH（発売元：API System
S.A.）中での菌株BEC 441による酸性化を示す
図。第２図は菌株BEC 441と対照株を比較した
クロマトグラム。第３図は発酵時間とラムノース
産生量の関係を示す図。
S.A.）中での菌株BEC 441による酸性化を示す
図。第２図は菌株BEC 441と対照株を比較した
クロマトグラム。第３図は発酵時間とラムノース
産生量の関係を示す図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ラムノース含有量の高い単糖類混合物を得る
方法であつて：Ｉ−714号としてパスツール研究
所（Institut Pasteur）の国立微生物寄託所
（Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes）に寄託された菌株BEC 441
またはその同一種に属する変異株の培養物を炭素
源、窒素源および必要な無機塩類を含む栄養培地
中で６〜８のPH、30〜35℃の温度で、通気しなが
ら２〜12日間発酵させ；発酵培地から生じた多糖
類を単離し；ついで、これらの多糖類を加水分解
し；生じた加水分解のPHを５〜９の範囲に調整す
る；ことからなる方法。 ２ 請求項１に記載の方法であつて、菌株部
BEC 441の変異株が菌株BEC 441の紫外線照射
またはオゾン処理によつて得られるものである方
法。 ３ 請求項１または２に記載の方法であつて、炭
素源がソルビトール、マンニトール、グルコース
およびグリセロールから選ばれ、栄養培地に５〜
100ｇ／の割合で存在する方法。 ４ 請求項１または２に記載の方法であつて、窒
素源がカゼイン・ペプトン、とうもろこし浸出
液、イースト抽出物、大豆ペプトン、ジヤガイモ
粉、Ｌ−フエニルアラニン、トレオニンおよび硫
酸アンモニウムから選ばれ、栄養培地中に0.5〜
10ｇ／の割合で存在する方法。 ５ 請求項１または２に記載の方法であつて、栄
養培地中の炭素／窒素重量比が少なくとも５であ
る方法。 ６ 請求項１または２に記載の方法であつて、栄
養培地がマグネシウム塩、リン酸塩の少なくとも
一つを含む方法。 ７ 請求項１または２に記載の方法であつて、栄
養培地がイースト抽出物を含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8717285A FR2624522B1 (fr) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | Culture d'un micro-organisme du genre klebsiella sp., et procede de production d'un melange d'oses a teneur elevee en rhamnose mettant en oeuvre cette culture |
| FR87-17285 | 1987-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02138965A JPH02138965A (ja) | 1990-05-28 |
| JPH0558715B2 true JPH0558715B2 (ja) | 1993-08-27 |
Family
ID=9357768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63311047A Granted JPH02138965A (ja) | 1987-12-11 | 1988-12-10 | クレブシェラ属の菌株の培養物を用いてラムノース含有量の高い単糖類混合物を生産する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4950604A (ja) |
| EP (1) | EP0320398A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02138965A (ja) |
| FR (1) | FR2624522B1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5071977A (en) * | 1989-05-10 | 1991-12-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Plaque inhibiting oligosaccharide |
| US5190746A (en) * | 1989-05-10 | 1993-03-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Plaque inhibiting oligosaccharide |
| US5989874A (en) * | 1995-03-27 | 1999-11-23 | Tayca Corporation | Humectant, antistatic agent, dispersant and film-forming agent having polysaccharide as active principle, preparation process of polysaccharides, and Kliebsiella ocytoca TNM-3 strain |
| EP1631594A1 (fr) * | 2003-02-04 | 2006-03-08 | Solabia (SA) | Nouvel agent stimulant la liberation des beta-endorphines, compositions cosmetiques et/ou dermatologiques en contenant et leurs applications |
| CN111849806B (zh) * | 2020-06-28 | 2022-03-22 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一株海草根际促生固氮菌nxt28及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3214953A1 (de) * | 1982-04-22 | 1983-10-27 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide |
| ZA835832B (en) * | 1982-08-10 | 1984-04-25 | Hoechst Ag | Process for the preparation of rhamnose or fucose |
| DE3300633A1 (de) * | 1982-08-10 | 1984-03-01 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von rhamnose oder fucose |
-
1987
- 1987-12-11 FR FR8717285A patent/FR2624522B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-08 US US07/281,542 patent/US4950604A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-09 EP EP88403131A patent/EP0320398A3/fr not_active Withdrawn
- 1988-12-10 JP JP63311047A patent/JPH02138965A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2624522B1 (fr) | 1990-03-09 |
| EP0320398A2 (fr) | 1989-06-14 |
| JPH02138965A (ja) | 1990-05-28 |
| US4950604A (en) | 1990-08-21 |
| FR2624522A1 (fr) | 1989-06-16 |
| EP0320398A3 (fr) | 1989-12-06 |
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