JPH0559096B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はネコ白血病ワクチンに関する。 ウイルスによるリンパ性網皮状新生物は、はじ
め、マウスおよびラツト、後に、ニワトリおよび
シチメンチヨウにおいて見出された。1964年に、
ネコのリンパ様悪性腫瘍に関連したウイルスも見
出された。このウイルスはネコ白血病ウイルス
（FeLV）と命名された。FeLVはオンコルナウイ
ルス（oncornavirus、onco＝腫瘍または癌形成
性、RNA＝リボ核酸）として分類された。この
ウイルスは非常に不安定で、室温で数時間以上生
存することはまれである。大部分の消毒薬で不活
性化される。FeLVは抗原的に類似したＡ、Ｂお
よびＣ型またはこれらの型の組合せで存在する。 感染は感染ネコと感受性ネコとの接触によつて
起り、感染ネコは全く無症候の場合も、明らかな
ネコ白血病の場合もある。ネコ全体に対する感染
ネコの発生割合はいく分変動するが、地域によつ
て10分の数％から多くても数％程度と報告されて
いる。FeLV関連病が発生したネコ飼育場におけ
る感染ネコの発生割合はさらに高く、平均30％以
上と報告されている。FeLVに対する全死亡率は
感染後に持続性のウイルス血症となるネコの割合
に比例する。したがつて、ネコ飼育場や多数のネ
コを飼つている家庭における死亡が一般的な死亡
率より高いからといつて驚くべきことではなく、
それはその環境におけるウイルス保有ネコの割合
がより高いからである。一般の都会のネコ数で
は、FeLVに対する死亡割合は多分100000匹当り
350匹程度と推定されている。FeLVが定着した
ネコ飼育場における死亡率は３匹中１匹以上とな
りうる。 FeLV感染による病状は初期疾患、回復または
明らかな回復および終末疾患の３段階に分けられ
る。一般に、結果的に持続性ウイルス血症となる
ネコまたは子ネコのみが感染の初期疾患において
著しい臨床症状を示す。臨床症状は種々の程度の
発熱、倦怠、食欲不振、体重減、全身性リンパ節
疾患および血液学的異常からなる。感染初期に死
亡が起ることがあり、死亡が起る場合は、通常、
ひどい骨髄圧迫および／または二次感染に直接由
来する。感染から完全に回復するネコは、通常、
疾患の初期段階に何の臨床症状も、血液学的異常
も示さない。これに対し、疾患の初期段階に臨床
的および血液学的異常の進行するネコまたは子ネ
コは、通常、持続性のウイルス保有ネコとなる。
この初期疾患によつて死亡するネコまたは子ネコ
は比較的少ない。事実、持続性感染ネコの多くは
これらの初期症状から明らかに回復し、獣医や飼
主にとつて、完全に回復し、ウイルスが除去され
たとの誤つた感覚をいだかせる。ウイルス保有ネ
コは数週間、数ケ月、数年あるいは一生、無症状
であることもある。しかし、これらのネコの多く
は、結局、ある種のFeLV関連疾患を起す。 持続的なウイルス保有ネコは感染してからの各
年につき、１年当り約20％の割合で致命的な
FeLV関連疾患を起しうる。対症療法を行なわな
い場合やネコがストレスを受けている場合には死
亡率はさらに高くなりうる。このことは、４年間
以内に慢性のFeLV保有ネコの約50％が死亡する
ことを意味する。致命的な疾患に加え、持続的な
ウイルス保有ネコは、しばしば、はつきりしない
持続性もしくは断続性の疾患および種々のタイプ
の二次感染にかかる。ウイルスの作用に直接関係
するこれらの病気には腫瘍性疾患、骨髄圧迫性障
害、免疫的障害、再生問題およびその他種々の疾
患が包含される。また、FeLV感染に関接的に関
係するこれらの病気にはウイルス性および細菌性
二次感染症、原虫病およびその他の疾患が包含さ
れる。FeLVによつて起る病気全体からすれば、
はつきりしない疾患および二次感染がもつともよ
く起る。ついで、骨髄圧迫性障害、リンパ増殖性
新生物および骨髄増殖性疾患がよく起る。 従来、ジヤレツトらにより、FeLV予防用ワク
チン製造を目的とした提案がなされている
〔Jarret，The Development of Vaccines
Against Feline Leukemia，Origins of Human
Cancer，p1215〜1222（1977）；Jarret et.al，米
国特許第3966907号、第4034081号および第
4086134号〕。かかるワクチンは死菌（例えば、照
射、ヒドロキシルアミンまたはパラホルムアルデ
ヒドによる）または不活化（例えば、ミトマイシ
ンＤによる）ウイルスあるいは感染生細胞または
感染不活化細胞に基くものである。また、ピンタ
ー（Pinter，Preparation of Native
Oncornavirus Envelope Subunits and
Vaccines Therefrom，米国特許出願）は天然に
存在するgp70およびp15(E)ビリオン抗原のジスル
フイド複合体である未変性〔gp90〕のワクチン
を提案している。しかし、これらのワクチンはい
ずれもFeLVによつて引き起こされる疾患の予防
に真に有効であるとはいいがたい。 本発明の１つの態様は、非細胞毒性および出芽
を包含する増殖特性を示すウイルス感染細胞に付
随する細胞ネオ抗原の回収法である。この方法
は、感染細胞を血清含有増殖培地中で培養し、該
培養細胞を血清不含培地に移し、その中で、該細
胞から放出される細胞ネオ抗原が蓄積されるに適
した条件および時間で該細胞を維持し、細胞を該
ネオ抗原に富んだ培地から分離し、該培地中のネ
オ抗原を濃縮し、ついで、濃縮物中の蛋白分解酵
素を、好ましくは、有効量のプロテアーゼ・イン
ヒビタの添加により阻害することからなる。さら
に、本発明の１つの態様は、上記の方法をFeLV
感染細胞からネコ白血病に関係するネオ抗原の回
収に用いることである。 本発明のもう１つの態様はFeLVによつて引き
起される病気を予防するワクチンである。かかる
ワクチンはウイルスを含まない。蛋白分解酵素の
阻害された、細胞を含まない、ネコにおいて、対
応する抗体の出現により免疫反応を起すFOCMA
型ネオ抗原を包含するin vitroで得られたFeLV
関連抗原およびネコにおいて対応する抗体の出現
により免疫反応を起すgp70型のFeLVビリオン抗
原からなる。 本発明のワクチンはFeLVおよびそれに伴なう
腫瘍を包含する病気からネコを効果的に保護す
る。すなわち、ネコを病気から保護するのみなら
ず、該ワクチンを接種したネコはウイルス保有ネ
コではなくなる。現在までの他のネコワクチンは
かかる保護を提供しがたい。 本明細書で用いる主な記号および用語の意味は
つぎのとおりである。 FOCMA：ネコオンコルナウイルス付着細胞膜
抗原。 FeLV：ネコ白血病ウイルス。 出芽：ウイルス感染細胞がその細胞表面からウ
イルスを放出する１つの方法。 gp70：分子量約70000ダルトンのFeLV糖蛋白
質。gp70に対する抗体は該ウイルス全体
を中和できる。 p27：分子量約27000ダルトンのFeLV核蛋白
質。 p15：分子量約15000ダルトンの、FeLVに付随
する免疫抑制蛋白質。 p12：分子量約12000ダルトンのFeLV蛋白質。 CCL64F3CL7：FeSV（ネコ肉腫ウイルス）を
含有する標的ミンク細胞でその細胞膜上に
FOCMAを圧出するが、ビリオン蛋白質は
出さない。 STCV：溶性腫瘍細胞ワクチン、本発明の好ま
しいネコ白血病ワクチンである（実施例
１）。 ネオ抗原：正常な、あるいは健全な細胞からは
圧出されない抗原で、その細胞中における
存在はFeLVに付随している。 本発明はいくかの知見に基いている。１つの知
見は、ミリグラム量のウイルス付随抗原（ネオ抗
原）が本発明の独特な方法によつて速かに、経済
的に回収できるということである。もう１つ別の
知見はかかるネオ抗原の回収を実施する技術で、
それにより、回収法、したがつて、該ネコワクチ
ンの著しく経済的な、大規模な商業的生産を可能
とする。もう１つの知見は回収したネオ抗原中の
蛋白分解酵素が比較的短時間にネオ抗原に対して
望ましくなく作用し、該ネオ抗原をワクチンとし
て使用した場合、その免疫反応を非常に妨げるこ
とである。また、もう１つの知見はプロテアー
ゼ・インヒビタをネオ抗原に加えると、ネオ抗原
の活性が有効に保持されることである。さらにも
う１つの知見は該ネオ抗原回収法が出芽および非
細胞毒性の増殖特性を示すウイルスに感染した細
胞が産生する細胞ネオ抗原の回収に広く適用でき
ることである。本発明を構成するこれらおよび他
の知見ならびにそれらの実施を以下に詳しく説明
する。 ミリグラム量のウイルス付随抗原（ネオ抗原）
を回収する方法では、該回収法に用いる手ごろな
細胞系を、感染動物から取つた感染細胞から得
る。すなわち、本発明ではリンパ様またはリンパ
芽球様ネコ細胞がネコ白血症に付随したネオ抗原
の回収に都合よく用いられる。また、ガラス付着
細胞、ことに、懸濁させたビーズ上に単層で増殖
させた細胞またはin vitroで感染させた正常細胞
も有用であることが判明した。用いる感染細胞の
基本的な条件は高濃度の細胞が増殖培地中で効果
的に懸濁して増殖できることである。すなわち、
効果的に懸濁したビーズ上のガラス付着細胞が感
染正常細胞としての条件を満たす。本発明の方法
に使用するために感染させるのに適当と思われる
正常細胞は許容細胞と表現することができ、該細
胞はそれに対して非細胞毒性のウイルスを出芽さ
せる。非細胞毒性ウイルスには従来から非細胞毒
性とされているウイルスのみならず、通常は細胞
毒性であるが、感染させるために選択したある細
胞系においては非細胞毒性となる遺伝的ウイルス
変異型も包含する。 本発明により細胞合成ネオ抗原が回収できると
いうことは、偶然の事実によるものか、ある細胞
がその通常の増殖サイクルを通して細胞表面ネオ
抗原を連続的に放出しているという自然法則によ
るもの〔Olsen et.al.，In Vitro 12、37〜43
（1976）〕である。しかし、本明細書に開示すると
おり、そのような法則の認識は該法則に基いて操
作する方法の実施可能なものなしでは充分になし
えない。本発明方法の第１の工程として、選択し
た感染細胞を血清含有増殖培地に入れて培養す
る。かかる血清含有増殖培地は通常の血清不含増
殖培地に適当量のウシ胎児血清のような動物血清
を加えてなる。血清不含培地の適当なものにはマ
ツコイ（McCoy）の5A培地、RPMI 164培地お
よび同様な通常の培地が包含される。これらの血
清不含培地に適当量の血清および通常用いられる
抗生物質を添加する。該培地中で、所望により、
時々、さらに血清を加えながら、好ましくは、用
いた培地容積中で飽和濃度になるまで細胞を培養
する。通常の培養条件を採用できる。 本発明のつぎの工程は本発明における基本的知
見の１つに基いている。かかる工程は培養した細
胞を、培養工程で用いた培地と実質的に同じ組成
の、ただし、血清を加えない血清不含増殖培地に
移すことからなる。この血清不含培地に入れた細
胞は明らかに正常な増殖サイクルを停止し、明ら
かに、実質的にウイルス生成が停止する。細胞が
血清不含培地中で激しく圧迫され、ネオ抗原を包
含する多量の蛋白質や付随物質が細胞から相当量
放出されるものと考えられる。血清不含培地中に
細胞を数日維持するとミリグラム量のネオ抗原が
放出される。この工程で血清を使用しないのは、
血清がワクチン中に混入すると、しばしばアレル
ギー性因子となるので、これをさけるためであ
る。 ついで、ネオ抗原に富んだ血清不含培地を分離
工程に付し、上澄液またはネオ抗原に富んだ培地
と感染細胞を分離する。この分離工程で用いる都
合よい方法は、ネオ抗原に富んだ血清不含培地
を、例えば、約200〜500Gで約15分間遠心分離す
ることである。実際の遠心分離条件は培地量、培
地中の細胞濃度などによつて変化する。遠心分離
によつて得られた細胞不含上澄液中のネオ抗原を
調べた。ネオ抗原は溶解度の定義に明らかに適合
するので（すなわち、100000G、１時間の遠心分
離にかけても上澄液中に残つている）、水性上澄
液中に溶解しているものと考えられる。しかし、
本発明においてはネオ抗原が上澄液中に残つてい
ればよく、それが上記の定義に基いて、上澄液中
に溶解しているか、分散または懸濁しているかは
重要なことではない。このワクチン製造に用い、
分離された細胞は、完全な増殖培地で再構成され
てさらにワクチン製造に使用することができる。
さらに、所望により、最初の血清含有増殖培地は
新たな増殖培地と合して第１の工程に再循環させ
てもよく、これにより生産コストおよび得られる
ワクチンのコストを低くすることができる。 遠心分離されたネオ抗原に富む血清不含培地ま
たは上澄液は公知の技術で処理することができ
る。すなわち、ネオ抗原に富む培地は直接凍結乾
燥したり、透析し、ついで凍結乾燥したり、限外
過し、所望により、ついで凍結乾燥したりなど
することができる。大量の上澄液の処理、こと
に、本発明の方法を商業的に実施することを考慮
した場合、ことに好ましい方法は、細胞不含のネ
オ抗原に富む血清不含培地を、ウオルフら
〔Wolff et.al.，Journal of Immunological
Methods，26，155〜156（1979）〕によつて記載さ
れている連続分子過（continuous−
flowmolecular filtration）で濃縮することであ
る。この方法を行なうに適したフイルターの最大
除外サイズ（exclusion size）は約10000ダルト
ンであることが判明した。この除外サイズより大
きい物質である非過物（retenate）には所望の
ネオ抗原が包含され、保持される。この分子過
濃縮工程は、典型的には上澄液を20〜400倍程度
に濃縮するように行なうことができるが、これに
限定するものではない。本発明における好ましい
分子過濃縮工程はいくつかの非自明の利点を与
える。１つの利点は、感染細胞がはじめに生理的
条件下で増殖し、この条件をネオ抗原処理の間も
維持することが好ましいという事実に基く。本発
明で行なう分子過は、フイルターを通過する上
澄液のイオン濃度を実質的に同じに保ちながら、
フイルターの除外サイズより大きなサイズの全て
の物質を濃縮する能力を提供する。この上澄液は
最初の培養工程での生理的条件に関与する種々の
塩、アミノ酸等を含有しており、かかるイオン性
物質により分子過工程においても、実質的に同
じ条件を保つことができる。上澄液の主成分であ
る水は分子過工程で除去される。 分子過されたネオ抗原はさらにいくつかの経
路で処理することができる。ネオ抗原濃縮物は、
通常の透析に付して塩類を除去し、凍結乾燥する
ことができる。また、直接凍結乾燥することも、
さらに、公知の濃縮を行なうこともできる。選択
した濃縮法に関係なく、ネオ抗原は凍結乾燥する
ことが望ましく、必須ではないが、シエル−フリ
ージング（sell−freezing）法が好ましい。ネオ
抗原は凍結乾燥状態で保存でき、また、所望によ
り、再懸濁させて、例えば、−90℃程度の非常な
低温で保存することができる。 実際に用いた濃縮技術に関係なく、本発明の主
要な工程は、蛋白分解酵素がネコにおけるネオ抗
原濃縮物に対する免疫反応を抑制するので、回収
したネオ抗原濃縮物からネオ抗原に対する酵素作
用を取り除かなければならないという知見に基い
ている。蛋白分解酵素を抑制するために本発明で
用いる非常に好ましい方法はネオ抗原濃縮物にプ
ロテアーゼ・インヒビタを加えることである。し
かし、ネオ抗原に対する蛋白分解酵素の活性を除
くに有効な他の方法も用いられ、例えば、加熱、
生理的条件（PH、イオン強度など）の調整などが
挙げられる。プロテアーゼ・インヒビタは分子
過して得られた濃縮物に加えることも、凍結乾燥
後の再懸濁調製物に加えることもできる。ネオ抗
原調製のどの時点でプロテアーゼ・インヒビタを
加えるかは特に限定するものではないが、ある工
程ではその添加が必要である。通常の、各種のプ
ロテアーゼ・インヒビタが用いられ、例えば、ア
プロチニン、アンチパパイン、ロイペプチン、オ
ボムコイド、大豆トリプシン・インヒビタ、トリ
ル−Ｌ−リジン、クロロメチルケトンなどが包含
される。本発明の方法においては、FeLV感染細
胞を供給し、ネオ抗原調製物にプロテアーゼ・イ
ンヒビタを添加してワクチンが得られる。 上記した方法はさらに他のウイルスに対するネ
オ抗原濃縮物およびワクチン製造に用いることが
できる。この方法はFeLVと同様な増殖特性を有
するウイルスに好適に用いられる。かかるウイル
スはその増殖サイクルの間に細胞毒性を示さず、
出芽によつて細胞から放出されるものである。つ
ぎのリストはこれらの増殖特性を有し、本発明の
方法の適用可能なウイルスを示すものである。 レトロウイルス類 トリ白血症ウイルス ウシ白血病ウイルス ウマ伝染性貧血ウイルス アリユーシヤン・ミンク病ウイルス コロナウイルス類 伝染性胃腸炎ウイルス ネコ伝染性腹膜炎ウイルス ラブドウイルス類 狂犬病ウイルス ヘルペスウイルス類 仮性狂犬病（アウイエスキー病）ウイルス伝染
性ウシ鼻気管炎ウイルス 水痘ウイルス ウマ鼻腔肺炎（ウマ流産）ウイルス 家畜の悪性カタルウイルス ウシ潰瘍性乳頭炎（アラートン、Allerton）ウ
イルス ネコ鼻気管炎ウイルス イヌヘルペスウイルス エプスタイン−バー（Epstein−Barr）ウイル
ス マレク（Marek）病ウイルス 伝染性喉頭気管炎（トリ）ウイルス トリヘルペスウイルス ヒツジ肺腺腫（ジヤーグジエクト、
Jaagsieket）ウイルス サイトメガロウイルス FeLVウイルスによつて起る病気を予防するた
めの本発明のワクチンは細胞を含まない、in
vitroで調製されたネコ白血病関連抗原を含み、
これにプロテアーゼ・インヒビタを加えてなる。
このワクチンは何ら感染性ウイルス粒子を含ま
ず、実質的にウイルス不含と考えられる。FeLV
関連ネオ抗原には対応する抗体の出現によつてネ
コに免疫反応を起させるFOCMA型ネオ抗原およ
びgp70型のFeLVビリオン抗原が包含される。こ
れらの抗原をワクチン中に存在させると、ネコに
存在する抗体と免疫反応を起すことが確認され
た。さらに、FeLVに付随する免疫抑制蛋白質で
あるp15抗原が該ワクチン接種したネコに存在す
ることが判明した。p15抗原の存在は本発明のワ
クチンの効果上必須のものとは考えられず、ワク
チンに含有される抗原による明確な免疫抑制作用
は何ら認められない。また、後記実施例における
ワクチンの特性に示すごとく、さらに、本発明の
ワクチンにはウイルスのp27核蛋白質が存在する
ことが判明した。時々、先行文献においては、
FOCMAの定義を再定義したり、変更することが
あるが、該感染細胞中にFOCMA抗原の存在が確
認されているゆえ、「FOCMA型ネオ抗原」なる
表現の使用は適当と考えられる。本発明において
は、FOCMAネオ抗原の正確な呼び名は不必要と
考えられ、その存在は対応する抗体の出現による
ネコの免疫反応によつて確認される。また、本発
明のワクチン中に見出されるgp70ネオ抗原なら
びに他のビリオン蛋白質は前駆体もしくは非成熟
型でもよく、「FeLVビリオンネオ抗原」なる語
も適当と考えられる。後記実施例で示すように、
ワクチン中のgp70型蛋白質は対応する抗体の出
現によりネコにおいて起る免疫反応で確認、測定
されるので、gp70蛋白質自体か、その前駆体で
あるかは限定するものではない。 いずれにしても、有効性テストにおいて、本発
明のワクチン、好ましくは、適当なアジユバンド
または非特異性免疫刺激剤と乳化させたワクチン
はFOCMAおよびFeLVビリオンネオ抗原に対す
る抗体と反応し、該ワクチンを接種したネコにお
いてFeLVの攻撃から少なくとも約80％の保護を
示した。これに対し、ワクチンを接種しない対照
ネコでは100％の発病が認められた。 ワクチン接種時のネコの年令とワクチンの効果
は何ら関係しないことが判明した。すなわち、本
発明のワクチンは子ネコおよび成熟したネコに接
種でき、感染から充分保護する。子ネコに接種す
る場合の好ましい最低年令は、大多数の他のワク
チンと同様、子ネコが離乳し、親からの抗体が消
失した約８週目であるが、４週目の子ネコに接種
してもネコ白血病から保護することが判明してい
る。さらに、前記のごとく、本発明のワクチンに
はある種の非特異性免疫刺激剤またはアジユバン
トを常法に従つて用いることができ、かかるアジ
ユバントには、不完全および完全フロインド
（Freund）アジユバント、ミヨウバンなどが包含
される。 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、これらに限定されるものではない。 実施例 １ 本実施例ではFeLV感染細胞からのネコ白血病
関連ネオ抗原の回収を説明する。 細胞系はカワカミ−タイレンFeLV
（Kawakami−Theilen（KT）FeLV）誘発リン
パ腫から得られたFL−74細胞系を用いる。FL−
74細胞を、各々、10〜25％のウシ胎児血清、硫酸
ゲンタマイシン（50μｇ／ml）およびアムホテリ
シンＢ（30μｇ／ml）を含むマツコイの5A懸濁培
地200mlを入れた回転瓶に、1.6×10⁶細胞／mlの
濃度で入れ、培養する。４日間培養後、細胞に10
％ウシ胎児血清を含む新たな培地200mlを加える。 ４〜５×10⁶細胞／mlの飽和濃度まで細胞が増
殖したら、上記のような抗生物質を含有する血清
不含のマツコイ5A培地で３回洗浄し、最初と同
じ濃度で該血清不含培地に再懸濁する。細胞をさ
らに37℃で４日間維持する。放出されたネオ抗原
を収集するため、培養液を16000Gで15分間遠心
分離する。 細胞培養液中の抗原を処理する好ましい方法は
連続分子過である。分子過装置に５平方フイ
ート（0.45方メータ）の、約10⁴ダルトンの除外
サイズを有する膜カセツトを取り付ける。高容量
ぜん動ポンプを用いて細胞培養液流の過ユニツ
ト通過を容易にさせる。抗原に富む上澄液を該
過装置中で、最初の容量の約1/20となるまで循環
させて濃縮する。各濃縮作業の間、装置中で膜を
４の蒸留水で洗浄し、ついで、1N水酸化ナト
リウム１をポンプで加え、２時間保持する。水
酸化ナトリウム溶液を除いた後、装置を再び数
の水で洗浄する。汚染を除くため、装置を２％ホ
ルマリンで洗う。 濃縮した抗原調製物を凍結乾燥してさらに減量
する。20倍濃縮物は３日間３〜４の蒸留脱塩水
で３日間透析して脱塩する。あるいは、適当な脱
塩物質を用いたカラム過または同様な方法でも
除去できる。脱塩された濃縮物をついでシエル−
フリージングにより凍結乾燥する。得られた抗原
調製物を当初の容量の1/200の食塩水に再懸濁さ
せる。該食塩水は、最終の抗原調製物中の濃度が
約10％となるようなアプロチニン・プロテアー
ゼ・インヒビタ（約60トリプシン・インヒビタ単
位）を含有する。該抗原調製物は−90℃で貯蔵さ
れる。かかる抗原調製物が本発明のワクチンであ
り、以下、場合によりSTCVという。 実施例 ２ 本実施例は抗原に富む血清不含培地の濃縮に使
用する３方法の比較を示す。 最初の濃縮法Ａにおいては、清澄にしたネオ抗
原を100000Gで１時間遠心分離し、ついで、セル
ロース膜チユーブ中、ポリエチレングリコールに
対して透析する（Aquacide ，Calbiochem.，
La Jolla，California）。第２の濃縮法Ｂにおい
ては、清澄にしたネオ抗原を100000Gで１時間遠
心分離し、セルロース膜チユーブ中、各々、５容
の緩衝液（0.01Mトリス、PH7.6）を用い２回透
析して脱塩し、最後に凍結乾燥し、実施例１と同
様にして再構成する。第３の濃縮法Ｃにおいて
は、実施例１と同様な連続分子過を行なつた
後、100000Gで１時間遠心分離し、方法Ｂと同様
に脱塩、凍結乾燥および再構成を行なう。 間接膜免疫反応螢光分析〔IMI、Essex et.al.，
Ing.J.Cancer，８：384（1971）；Olsen et.al.，In
Vitro，12：37（1976）〕およびマイクロ細胞毒性
分析〔Mathes et.al.，J.Natl.Cancer Inst.，
56：1197（1976）〕をFeLV変性細胞の表面に特異
的な抗体定量に用いた。細胞毒性抑制分析
〔Wolff et.al.，J.Natl.Cancer Inst.，58：791
（1977）〕を用いて抗原を定量した。用いた対照ネ
コ抗血清は、無傷またはエーテル破壊KT−
FeLV（血清１ml当り、10¹¹粒子）での吸着が膜免
疫反応螢光分析またはマイクロ毒性テストにおい
て抗体力価を減少させないことからFOCMAに対
して特異性を有する。蛋白質はバイオ−ラド蛋白
質分析キツト（Bio−Rad Laboratories，
Richmond，Califonia）を用いて定量した。 結果をつぎに示す。

【表】 義される。
この結果は、細胞除去後、該抗原に富んだ血清
不含培地の濃縮にいくつかの異なつた方法がある
ことを示す。凍結乾燥だけで得られた抗原（方法
Ａ）の収量は透析（方法Ｂ）または分子過（方
法Ｃ）で得られたものの２倍である。しかし、本
発明の方法の商業的実施に必要な多量の液体を取
扱うには、分子過（方法Ｃ）がもつとも実施し
やすい。さらに、かかる過方法によれば、６
の液体を15倍に濃縮するのに、わずか４時間しか
かからない。本実施例は単にネオ抗原の収量を定
量するためのもので、プロテアーゼ・インヒビタ
は濃縮物に加えない。 実施例 ３ 本実施例ではワクチン中のFeLVビリオン抗原
の特性を調べた。 FeLVビリオン蛋白特異性の抗血清を用い、ワ
クチン調製物中の特定のビリオン蛋白質を同定す
る。このために、FeLVp15、p27およびgp70抗血
清を³⁵S−メチオニンでラベルしたワクチンと反
応させる。免疫複合体をスタフイロコツカス・ア
ウレウス（Staphylococcus aureus）に付着させ
て収集し、³⁵Sでラベルした蛋白質をSDSポリアク
リルアミド・スラブ・ゲル上で解離、電気泳動さ
せた。電気泳動後、ゲルを放射螢光分析に付した
ところ、p15は天然型で存在しないことを示し
た。その代り、分子量20000〜25000ダルトンの弱
いバンドが観察された。しかし、gp70およびp27
は、各々、分子量70000ダルトンおよび27000ダル
トンの天然蛋白質として検出された。さらに、抗
ｐ−12を用いてテストを行なつた。p12は³⁵S−メ
チオニンではほとんどラベルされないため、³⁵S−
メチオニンでラベルしたFeLVを抗−p12と反応
させた場合、何のバンドも見られなかつた。しか
し、抗−p12は80000〜90000ダルトンの蛋白質を
回収し、³⁵S−ワクチン調製物と反応した。すなわ
ち、p15およびp12ビリオン蛋白質はワクチン調
製物中、前駆体蛋白質の形で出現する。p15は分
子量20000〜25000ダルトンの形で、また、p12は
分子量80000〜90000ダルトンの形で回収される。
p27およびgp70は明らかに天然形で存在する。 実施例 ４ 本実施例は、実施例１において記載した方法に
従つて製造したワクチン（STCV）を使用した有
効性の試験結果を示す。 ２群のネコを本ワクチンの有効性試験に用い
た。第１群のネコは、オハイオ州立大学のSPF施
設より得られた実験用ネコである。このネコの年
令はワクチン接種の開始時において４週間ないし
５年である。ネコはすべて、完全フロインドアジ
ユバント（CFA）、不完全フロインドアジユバン
ト（IFA）、ミヨウバン−ヒドロキシンゲルとの
混合ワクチンあるいはアジユバントなしのワクチ
ンを１週間ごとに５週間接種して免疫付与する。
対照群にはこれらアジユバントの１つに
1640RPMI培地を加えて投与する。全てのネコは
第１回の免疫付与後、６週間攻撃される。この攻
撃は、デポーメドロール（体重１Kg当り10mg）の
筋肉内注射と腫瘍均質物の経口あるいは鼻からの
投与を合わせて行なう。この攻撃は連続２日間行
なわれる。ネコはすべて１週毎にFeLVウイルス
血症状態およびFL−74とCCL64F3CL7ミンク細
胞に対する抗体力価が観察される。抗体力価は間
接膜免疫螢光（IMI）によりエセツクスら
〔Essex et al.（1971）、前出〕およびオルセンら
〔Olsen et al.（1976）、前出〕に記載の方法に基
き測定される。ワクチン接種したネコは全て対照
の同産の子とともに収容される。 第２群のネコは24匹の通常の飼ネコであり、完
全フロインドアジユバントを含むワクチンを接種
されている。５種の免疫付与の全ては６週間の期
間内に実施される。これら飼ネコはいずれもウイ
ルス血症であるかワクチン接種開始時にウイルス
血症ネコと接触させられている。 第２表はCFA中に乳化したTSCVの免疫予防
値の完全分析である。ここで可能であれば、同産
の子ネコはワクチン接種をしたものと対照群とに
等分にわけられる。

【表】 この結果に示すごとく、STCVとCFAをワク
チン接種したネコは全て攻撃前において平均力価
94.5のFL−74細胞に対する高い抗体力価をあら
わす。またワクチン接種をしたネコはすべて、
CCL64F3CL7ミンク細胞におけるFOCMAに対
する抗体反応を示す。抗体力価は、持続性のウイ
ルス血症となつたネコを除き、攻撃後ワクチン接
種した全てのネコにおいて同等あるいは増加して
いる。ウイルス血症となつた３匹のネコは同等あ
るいはそれ以下の抗体力価を有するようになつた
が、これらは健康体となつた。対照ネコは攻撃
前、FL−74またはCCL64F3CL7細胞のいずれに
対する抗体力価も示さない。ワクチン接種をした
成熟ネコのみが、いくぶんかの検知可能な一時的
ウイルス血症を示す。ワクチン接種を行なつた子
ネコの抗体力価は攻撃ののち低下し、攻撃後６〜
22週の間は再上昇しない。プロテアーゼ・インヒ
ビタを除き、生後４週間の子ネコへのネオ抗原濃
縮物を接種したところ、子ネコは最高幾何平均
FOCMA抗体力価１：20を達成し、FeLV症に対
する子ネコの保護はできなかつた。 第３表は、ワクチン単独（たとえばアジユバン
トなし）でネコの免疫付与を行なつて得られた結
果の概要である。

【表】 これらの結果はCFAを加えたワクチンを接種
したネコにおける抗体力価よりワクチン単独の場
合の抗体力価の方がはるかに低いことを示してい
る。１匹の子ネコは何ら検知しうる反応を示さな
かつた。持続性ウイルス血症を示した５匹中４匹
のネコは攻撃前、ワクチンに対して最小の反応を
示した（１：８）。対照ネコはいずれも、攻撃３
週間後にウイルス血症となつた。ウイルス血症と
なつたワクチン接種ネコは２〜８週間、平均4.6
週間で転換した。 第４表および第５表にワクチンにミヨウバン−
ヒドロキシン・ゲル（第４表）またはIFA（第５
表）を加えて接種した結果を示す。

【表】

【表】 これらの結果はワクチンで免疫付与された全て
のネコがFL−74およびCCL64F3CL7標的細胞に
対する高い抗体力価を生じたことを示している。 第６表に第２表〜第５表で得られた結果を総括
する。全49匹のネコに、各種のアジユバントで乳
化したワクチンを接種して免疫付与した。

【表】 この結果、CFA中に乳化した培地を投与した
13匹のネコはいずれもFOCMA抗体を形成せず、
さらに、攻撃後、13匹のネコはいずれも持続性の
ウイルス血症となつたことを示す。該ワクチン単
独またはアジユバントと乳化したものは、子ネコ
および成熟ネコにおいてFOCMAに対する抗体反
応能力を示した。単独のワクチン、CFAと乳化
したワクチン共にFeLV攻撃から子ネコおよび成
熟ネコを充分に保護した（各々、62％および81
％）。この第６表の結果を添付の第１図にグラフ
で示す。第１図のグラフはFOCMA力価を、ワク
チン接種６週間後まで、各週ごとにプロツトした
もので、１はSTCV、２はSTCV＋ミヨウバン−
ヒドロキシンゲル、３はSTCV＋CFAおよび４
はSTCV＋IFAについて示す。 第７表には飼ネコのワクチン接種で得られた結
果を示す。

【表】 第７表に示すテストにおいては、ウイルス血症
群のネコは16匹の成熟ネコからなる。最初のワク
チン接種から６週間後、これらの全てのネコは
FL−74細胞に対する抗体力価の著しい増加を示
した。この群では一匹のネコだけが死亡した。残
つた全てのネコはワクチン接種完了１ケ月後、
FL−74細胞に対する抗体力価の低下を示し、
FeLV病に対して無症候であつた。ウイルス血症
陰性群は８匹の成熟ネコからなり、FL−74細胞
に対する抗体力価が１：４〜１：256、平均41.4
に増加した。これらのネコはワクチン接種前、少
なくとも１匹のウイルス血症ネコと接触させた。
現在まで、これらのネコはFeLV病の症候を全く
示していない。 実施例 ５ 本実施例ではCFA中で乳化したワクチンを接
種したネコによるFeLVビリオン抗体発達特性を
説明する。 ³⁵S−メチオニンでラベルしたFeLVをFL−74
細胞から得る。10％のウシ胎児血清とマツコイ
5A培地を含むフラスコ中に懸濁し、１日培養し
たFL−74細胞を遠心分離して収集し、10％透析
FCSを含有するメチオニン除（１：50N濃度）
5A培地40mlで１回洗浄し、同培地に再懸濁させ
る。24時間後、培養容器に0.1Mメチオニン溶液
0.04mlを加える。48時間後、培養液を遠心分離し
て収集し、ポリエチレングリコールに対して透析
して４倍に濃縮する。濃縮物10mlを０〜50％シユ
ークロース・グラジエント（29ml）およびTNE
緩衝液（0.01Mトリス、0.1MNaCl、
0.001MEDTA、PH7.4）のトツプにのせ、
100000Gで１時間遠心分離する。ついで、グラジ
エントを１ml容のフランクシヨンに分け、ウイル
スを1.16ｇ／cm³の割合で収集する。10容のTNE
に対して一夜透析してウイルスからシユークロー
スを除去する。 gp70、p27、p15およびp12に対する抗体をテス
トすべき血清試料をNP−40緩衝液〔0.1％NP−
40／NET緩衝液（0.15MNaCl、0.005MEDTA、
0.05Mトリス）全100μ）〕で１〜４倍に稀釈し、
³⁵SでラベルしたFeLV50μに加える。混合液を
一定の振とうを加えながら４℃で一夜培養する。
免疫複合体をケツスラー〔Kessler，J.Imm.，
115：1617（1975）〕の記載するようなコウインＩ
（Cowin Ｉ）で染色したスタフイロコツカス・ア
ウレウスを用いて回収する。各試験管に死菌スタ
フイロコツカス・アウレウス50μを加え、４℃
で24時間振とうする。ついで、NP−40緩衝液で
遠心分離することによりスタフイロコツカス・ア
ウレウスを３回洗浄する。最終の遠心分離ペレツ
トをSDSおよびDTTを含有するトリス−Ｔ−ア
セテート緩衝液に入れて免疫複合体を再懸濁さ
せ、100℃で５分間加熱する。SPS PAGFシステ
ムは7.5％アクリルアミドと５％ビスアクリルア
ミドからなる12cmスラブ・ゲルを用いる。100μ
の試料をゲルのトツプにのせ、100Vで４時間
電気泳動させる。ゲル・スラブをゲル乾燥器で乾
燥させる。 ボンナーおよびラスキイ〔Bonnerおよび
Laskey，Eur.J.Biochem.，46：83〜88（1974）〕
の記載する螢光分析法を用いた。螢光分析の結果
を添付の第２図に示す。第２図に示すごとく、テ
ストした血清試料中にはgp70、p27およびp15抗
体が見られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４におけるテスト結果を示すも
ので、各種アジユバンドを含むワクチンを接種し
たネコにおけるFOCMA力価を接種後の経時
（週）に対してプロツトしたグラフ、第２図は実
施例５における螢光分析結果を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白分解酵素を阻害した、ウイルスを含ま
   ず、細胞を含まない、in vitroで調製したネコ白
   血病ネオ抗原からなり、該ネコ抗原が、 (a) FOCMA抗血清と反応でき、対応する抗体の
   出現でネコに免疫反応を起させるFOCMA型ネ
   オ抗原、 (b) gp70−抗血清と反応でき、対応する抗体の
   出現でネコに免疫反応を起させるネコ白血病ウ
   イルス（FeLV）ビリオンgp70ネオ抗原、 (c) FeLVビリオンp27抗原、 (d) 前駆体形のFeLVビリオンp15ネオ抗原、お
   よび (e) 前駆体形のFeLVビリオンp12ネオ抗原から
   なることを特徴とするネコ白血病ウイルスによ
   る病気の予防用ワクチン。 ２ 該ネオ抗原に有効量のプロテアーゼ・インヒ
   ビタを加えて蛋白分解酵素阻害を行なつた前記第
   １項のワクチン。 ３ さらに医薬上許容されるアジユバンドを含む
   前記第１項または第２項のワクチン。 ４ (a) リンパ様ネコ細胞またはリンパ芽球様ネ
   コ細胞であるネコ白血病ウイルス感染細胞を血
   清含有増殖培地中で培養し、 (b) 該培養細胞を血清不含培地に移し、その中で
   該細胞から放出されるネオ抗原であつて、
   FOCMA型ネオ抗原、FeLVビリオンgp70ネオ
   抗原、FeLVビリオンp27抗原、FeLVビリオン
   p15抗原およびFeLVビリオンp12ネオ抗原から
   なるネオ抗原が蓄積されるに適した条件および
   時間で該細胞を維持し、 (c) 該培養細胞を血清不含培地から分離し、それ
   により、細胞を含まない、血清を含まない培地
   を得、 (d) 得られた培地を、該ネオ抗原の実質的な損失
   なしに濃縮し、該ネオ抗原に富んだ培地を得、
   ついで、 (e) 該ネオ抗原に富んだ培地中の蛋白分解酵素を
   阻害することを特徴とするネコ白血病ウイルス
   感染細胞からのウイルスを含まず、細胞を含ま
   ないネコ白血病関連ネオ抗原の回収方法。 ５ 該工程(c)の細胞分離を遠心分離で行なう前記
   第４項の回収方法。 ６ 凍結乾燥、限外濾過および連続分子濾過のう
   ちの少なくとも１つの方法により該工程(d)の濃縮
   を行なう前記第４項の回収方法。 ７ 連続分子濾過し、ついでネオ抗原含有非濾過
   物を凍結乾燥して工程(d)の濃縮を行なう前記第４
   項または第５項の回収方法。 ８ 除外サイズが約10000ダルトンのフイルター
   を用いて分子濾過を行なう前記第７項の回収方
   法。 ９ 蛋白分解酵素の阻害を有効量のプロテアー
   ゼ・インヒビタの添加により行なう前記第４項の
   回収方法。 １０ 蛋白分解酵素の阻害を、該ネオ抗原をその
   中に含まれる蛋白分解酵素の阻害に有効な温度へ
   の加熱によつて行なう前記第４項の回収方法。 １１ 蛋白分解酵素の阻害を、該ネオ抗原のPH変
   化によつて行なう前記第４項の回収方法。 １２ 蛋白分解酵素の阻害を、該ネオ抗原のイオ
   ン強度変化で行なう前記第４項の回収方法。 １３ (a) リンパ様ネコ細胞またはリンパ芽球様
   ネコ細胞であるネコ白血病ウイルス感染細胞を
   血清含有増殖培地中で培養し、 (b) 該培養細胞を血清不含培地に移し、その中で
   該細胞から放出されるネオ抗原であつて、
   FOCMA型ネオ抗原、FeLVビリオンgp70ネオ
   抗原、FeLVビリオンp27抗原、FeLVビリオン
   p15ネオ抗原およびFeLVp12ネオ抗原からなる
   ネオ抗原が蓄積されるに適した条件および時間
   で該細胞を維持し、 (c) 該培養細胞を血清不含培地から分離し、それ
   により、細胞を含まない、血清を含まない培地
   を得、 (d) 得られた培地を濃縮し、ついで、 (e) その中の蛋白分解酵素を阻害して得られるネ
   コ白血病関連ネオ抗原濃縮物。 １４ 除外サイズが約10000ダルトンのフイルタ
   ーを用いて分子濾過し、ついで凍結乾燥して工程
   (d)の濃縮を行なつて得られる前記第１３項のネオ
   抗原濃縮物。