JPH05247099A - ウマのヘルペスウイルスに対するワクチンおよびそれらの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、分離した糖タンパク質および／ま
たはＥＨＶ感染した細胞および細胞外ＥＨＶヴィリオン
からのレクチンとのそれらのコンプレックスに基づく、
ウマのヘルペスウイルスによる感染に対するウマのワク
チンに関する。 【効果】 ウマのＥＨＶ感染の予防のためのワクチンが
提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、分離した糖タンパク質に基づ
く、ウマのヘルペスウイルスによる感染に対するウマの
ワクチン、およびその調製方法に関する。

【０００２】ウマのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、世
界のすべてのウマを飼育する領域において風土病的に分
布しており、そしてウマの伝染病において主に重要であ
る。一次的感染は、感染した動物において生涯持続する
ことがある。今日まで、合計４つのヘルペスウイルスの
血清型がウマにおいて同定された。

【０００３】ＥＨＶ−１ （ウマ流産ウイルス）、アルファヘルペスウイルスに属
する病原体、従来ＥＨＶ−１サブタイプ１（鼻肺炎ウイ
ルス）と呼ばれた、 ＥＨＶ−２ （ウマサイトメガロ様ウイルス）、ベータヘルペスウイ
ルス、 ＥＨＶ−３ （ウマ交疹ウイルス）、アルファヘルペスウイルスに属
する、および ＥＨＶ−４ アルファヘルペスウイルス類似する、従来ＥＨＶ−１サ
ブタイプ２と呼ばれた。血清型１〜４のウマのヘルペス
ウイルスは、世界を通じてウマの飼育において経済的損
害を絶えず引き起こす。

【０００４】この損害は、とくに、流産、呼吸器そし
て、ある場合において劇的な過程を経て、脳脊髄炎の再
発性流行病から生ずる。主として１、２および４型のウ
マのヘルペスウイルスによる呼吸器の形態の感染により
引き起こされる、飼育の間の損失、訓練の欠乏および行
動の損失の経済的重要性は、過小評価すべきではない。
すべてのヘルペスウイルスは、一次感染後、宿主におい
て存続することができるという性質を有しそしてこの性
質はウマのヘルペスウイルスがまた有する。こうして、
潜伏性の感染をもつウマは、ウイルスの貯蔵庫として重
要な役割を演ずる。ストレスの因子、例えば、化学療
法、分娩、去勢または輸送は潜伏性のＥＨＶ感染の再活
性化に導くことがある。このような再活性化は、ウイル
スの排出に関連するが、臨床的に明らかではない過程を
取ることがあるので、すべてのウマは、いったん感染す
ると、潜在的な排出体と見なすことができ、こうして可
能な感染巣と見なすことができる。

【０００５】ヘルペスウイルスは、一般に、定量的にわ
ずかの体液の免疫応答を生ずる、弱い免疫原性を表す。
とくに、ＥＨＶ−４の感染後の呼吸の形態は、頻繁に、
血清型学的に弱い免疫応答を生ずる。

【０００６】ヘルペスウイルスの免疫原性構造成分につ
いての研究は、最初に、ウイルスの膜のみが免疫性の誘
発において意味を有することを示した。近年において、
免疫応答のためのヘルペスウイルスの個々のウイルスの
糖タンパク質の重要性についての情報が得られた。こう
して、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｇＡ、ｇＢ、
ｇＣ、ｇＤ、ｇＥおよびｇＦ糖タンパク質に対するモノ
クローナル抗体を使用して、各場合において受動免疫性
をマウスに伝達することができた。これらの抗体はウイ
ルス中和性質を示さなかったが、致死的投与量のＨＳＶ
による感染後、マウスを事実保護した［バラチャドラン
（Ｂａｌａｃｈａｄｒａｎ）ら、インフェクション・ア
ンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ）３７（１９８２）１１３２−１１３７
ページ］。

【０００７】ハムスターのモデルにおけるウマＥＨＶ−
１ヘルペスウイルスを使用する実験において、相同性の
負荷の感染からの保護は、生きている、不活性化した、
完全なヴィリオンおよび精製した完全な膜のタンパク質
を使用して達成された。対照的に、膜のタンパク質の分
画の投与は高分子量の分画による部分的保護のみを生じ
た［パップ−ビッド（Ｐａｐｐ−Ｖｉｄ）およびデルバ
シャイアー（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ）、カナディアン・
ジャーナル・オブ・コンパラティブ・メディシン（Ｃａ
ｎ．Ｊ．Ｃｏｍ．Ｍｅｄ．）４２（１９７８）２１９−
２２６ページ］。

【０００８】細胞外ＥＨＶヴィリオンは２８〜３０構造
タンパク質から構成されており、これらの構造タンパク
質は、カプシドの６ポリペプチドを除外して、すべてウ
イルスの膜の中に見いだされる。これらの膜の分子量は
１６〜２７０ｋＤａの範囲である。糖タンパク質の数は
１２〜１４である述べられている。これらの糖タンパク
質のうちの６は、ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４の主要な
糖タンパク質として同定された。

【０００９】ＥＨＶ−１について同定された６つの主要
なマウスは、ｇｐ２について２５２〜２６０ｋＤａであ
り、ｇｐ１０について１２７〜１３８ｋＤａであり、ｇ
ｐ１３について９２〜９７ｋＤａであり、ｇｐ１４につ
いて８１〜８７ｋＤａであり、ｇｐ１８について６０〜
６５であり、そしてｇｐ２２について４２〜４６ｋＤａ
である。

【００１０】シミズら、アーチーブス・オブ・ビロロジ
ー（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．）１０４（１９８９）１６
９〜１７４ページは、ＥＨＶ−１のｇｐ１３およびｇｐ
１４に対するモノクローナル抗体の調製を記載してお
り、これは、ハムスターに投与すると、実験的に致死的
なＥＨＶ−１の感染に対する受動免疫性を付与する。さ
らに、それらは生体外で種々のＥＨＶ−１菌株を中和し
た。

【００１１】抗体を使用するハムスターの受動免疫化
は、ウマにおける精製した糖タンパク質の免疫原性につ
いて結論を引き出さなかった。一方において、モノクロ
ーナル抗体はマウスにおいて調製されそして、他方にお
いて、調製は完全なウイルスから出発した。

【００１２】現在、１価のＥＨＶ−１の生ワクチンまた
は不活性化ワクチンを他の抗原と組み合わせて、実際に
使用されている。これらのワクチンの使用にかかわら
ず、ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４による感染のために、
臨床的病気を反復して起こる。これは次の事実部分的に
寄与する。すなわち、処方した、非常に苦心したワクチ
ン接種のスケジュールに従わず、そして、他方におい
て、ワクチンの効能は完全にな満足すべきものではな
く、とくにＥＨＶ−４に対する免疫性は存在しない。こ
うして、全体的に、現在使用されているワクチンを使用
する実際の場合は不満足である。

【００１３】直接使用しかつ高い効能を有するＥＨＶワ
クチンを発見することは望ましかった。

【００１４】本発明は、次に関する： １、分離した糖タンパク質および／またはウマのヘルペ
スウイルス（ＥＨＶ）感染した細胞および細胞外ＥＨＶ
ヴィリオンからのレクチンとの前記糖タンパク質のコン
プレックスを含有することを特徴とする、ウマのヘルペ
スウイルス（ＥＨＶ）による感染に対するウマのワクチ
ン。

【００１５】２、工程： ａ）ＥＨＶウイルスを成長させ、 ｂ）感染した細胞または細胞外のウイルスを洗浄剤で処
理し、 ｃ）このようにして得られたリゼイトをレクチンで処理
し、 ｄ）レクチン−リガンドのコンプレックスを残りのリゼ
イトから分離し、 ｅ）適当ならば、レクチン−リガンドのコンプレックス
を分割し、そして糖タンパク質の混合物を分離し、そし
て ｆ）引き続いてレクチン−リガンドのコンプレックスお
よび／または分離した糖タンパク質の混合物を慣用の方
法で配合する、からなることを特徴とする、上記１のワ
クチンを調製する方法。

【００１６】３、ウマのヘルペスウイルスまたはウマの
ヘルペスウイルスで感染した細胞からの糖タンパク質、
レクチンおよび不活性マトリックス上のそれらのカップ
リング生成物のコンプレックス。

【００１７】４、分離しかつレクチンで精製したウマの
ヘルペスウイルスからの糖タンパク質。

【００１８】ワクチンはＥＨウイルス型１〜４に基づ
き、ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４をとくに述べることが
でき、そしてＥＨＶ−１は好ましい。

【００１９】ワクチンは原理的にはすべてのＥＨＶウイ
ルス株から調製することができる。述べることができる
ＥＨＶ株の例は、次の通りである： １、ＲＡＣ−Ｈ（ＥＨＶ−１）株、流産したウマの胎児
から分離したウイルス。この株は、例えば、また、「ウ
マ鼻肺炎に対する生ワクチンの開発の研究（完全に成長
した馬の雌における流産）（Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇ
ｚｕｒ Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇ ｅｉｎｅｓ Ｌｅ
ｂｅｎｄｉｍｐｆｓｔｏｆｆｅｓ ｇｅｇｅｎ ｄｉｅ
Ｒｈｉｎｏｐｎｅｕｍｏｎｔｉｔｉｓ（Ｓｔｕｔｅｎ
ａｂｏｒｔ）ｄｅｒ Ｐｆｅｄｅ」［メイヤー（Ｍｅｙ
ｅｒ）ら、１９６８；Ｚｂｌ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｖｏ
ｌ．５、４０６−４０８）］に記載されている。

【００２０】２、ＤＡ８（ＥＨＶ−１）株は、ブダベス
ト条約の規定に従い１９９０年７月２４日にインスチチ
ュート・パスツール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅ
ｕｒ）ＣＮＣＭ、フランス国パリ、に、Ｊ−９７９の表
示で受託された。

【００２１】３、Ｔｈｅｉｎ ４００／３（ＥＨＶ−
２）株は、ブダベスト条約の規定に従い１９９０年７月
２４日にインスチチュート・パスツール（Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅＰａｓｔｅｕｒ）ＣＮＣＭ、フランス国パリ、
に、Ｊ−９８１の表示で受託された。

【００２２】４、Ｔｈｅｉｎ １６６（ＥＨＶ−３）。

【００２３】５、Ｔｈｅｉｎ ２５２／１（ＥＨＶ−
４）株は、ブダベスト条約の規定に従い１９９０年７月
２４日にインスチチュート・パスツール（Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅＰａｓｔｅｕｒ）ＣＮＣＭ、フランス国パリ、
に、Ｊ−９８２の表示で受託された。

【００２４】６、ＭＡＲ ８７（ＥＨＶ−１）は、ブダ
ベスト条約の規定に従い１９９０年７月２４日にインス
チチュート・パスツール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓ
ｔｅｕｒ）ＣＮＣＭ、フランス国パリ、に、Ｊ−９８０
の表示で受託された。

【００２５】本発明によるワクチンを調製する糖タンパ
ク質は、細胞外ウイルスまたは感染した細胞から得るこ
とができる。ウイルスはこの目的にそれ自体既知の方法
に従い成長させる。

【００２６】ウイルスの成長は、通常の方法で、動物細
胞の組織培養において実施し、動物の細胞の例は次の通
りである：ウマの細胞、ブタの細胞、サルの細胞または
ウサギの細胞、好ましくはウマの皮膚細胞、例えば、ウ
マの永久的皮膚細胞ＥＤ（ＡＴＣＣ ５７またはその誘
導体）またはブタの腎臓細胞、例えば、ブタの永久的腎
臓細胞ＲＫ１５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３３またはその誘
導体）またはウサギの腎臓細胞、例えば、ウサギの腎臓
細胞ＲＫ−１３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３７またはその誘
導体）またはサルの腎臓細胞。

【００２７】成長は、それ自体既知の方法に従い、静
止、ローラーまたは担体の培養において、合体した細胞
の集合体の形態または懸濁培養において実施する。成長
培地として、それ自体既知の細胞培地を使用し、このよ
うな培地の例は次の通りである：例えば、フロー・ラボ
ラトリーズ社（Ｆｌｏｗ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＧ
ｍｂＨ）（メッケンヘイム５３０９、ポスト１２４９）
に記載されているもの、例えば、とくに必須構成成分の
アミノ酸、ビタミン、塩類および炭水化物を含有し、緩
衝物質、例えば、重炭酸ナトリウムまたは（ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ヘペ
ス））および、適当ならば、動物血清、例えば、畜牛、
ウマまたはそれらの胎児の血清を使用して完成した最小
必須培地（ＭＥＭ）。胎児仔ウシ血清を１〜３０容量
％、好ましくは２〜１０容量％の濃度で使用することは
とくに好ましい。

【００２８】ウイルスを成長させるために使用する細胞
および細胞の菌叢は、慣用の方法においてほとんど全面
生長にまたは最適な細胞密度に成長させる。ウイルスで
感染させる前に、好ましくは細胞成長培地を除去し、そ
して細胞を好ましくはウイルス成長培地で洗浄する。ウ
イルス成長培地として、好ましくは、それ自体既知のす
べての培地、例えば、とくに前述のＭＥＭを使用する。
次いで、ウイルスの懸濁液を使用する感染を実施する。
感染が０．００１〜５０、好ましくは０．１０〜１０の
ＭＯＩ（＝感染の多重度は存在する各細胞についての感
染性ウイルス粒子に相当する）であるような方法におい
て、ウイルスはウイルスの成長培地中で希釈したウイル
スの懸濁液の中に存在する。

【００２９】ウイルスは動物の血清を添加するか、ある
いはしないで成長させる。その血清を使用する場合、そ
れは成長培地に１〜３０容量％、好ましくは２〜１０容
量％の濃度で添加する。

【００３０】感染およびウイルスの成長は、室温〜４０
℃、好ましくは３２〜３９℃の温度、とくに３７℃にお
いて実施する。

【００３１】本発明を引き続いて細胞外ウイルスを使用
して実施する場合、成長は細胞の基質が完全に破壊され
るまで実施する。本発明を感染した細胞からのウイルス
のタンパク質を使用する場合、成長はウイルス特異的抗
原の最大に到達するまで実施する。ウイルス特異的抗原
の最大濃度が、例えば、単一層の培養の場合において、
３０〜１００％の細胞変性の変化（ｃｐＥ）に到達す
る。７０〜９０％のｃｐＥ付近の領域は好ましい。

【００３２】細胞外ウイルスを使用して本発明を実施す
る場合、細胞のデトリツスを除去し、そしてウイルスの
成長培地からウイルス粒子を分離しそして濃縮すること
によって、ウイルスを仕上げる。これはそれ自体既知の
方法に従い濾過、例えば、膜または深さ型フィルターを
使用する限外濾過によるか、あるいは遠心によって実施
する。細胞のデトリツスは、例えば、５００〜１５，０
００×ｇ、好ましくは５，０００〜１５，０００×ｇに
おける遠心により温度する。ウイルスの分離は、ゾーナ
ル遠心または等密度の遠心により、例えば、スクロース
密度の勾配で達成される。この目的で、例えば、ウイル
スを含有する成長培地は、細胞のデトリツスの除去後、
ウイルス粒子が沈降するまで、１００，０００×ｇのゾ
ーナル遠心にかける。より高い純度は、ウイルス粒子を
沈澱するゾーナル遠心をウイルス含有培地より高い密度
の水溶液により実施するとき、達成される。水溶液とし
て、例えば、１０〜４０％ｗ／ｗ、好ましくは２５〜４
０％ｗ／ｗのスクロースの緩衝化溶液を使用することが
できる。

【００３３】なおいっそう効率よい精製は密度勾配の遠
心により達成される。この目的で、例えば、５，０００
〜１５，０００×ｇにおける低い形態の予備精製しそし
て１００，０００×ｇの引き続く遠心により沈澱された
ウイルス物質は、ゾーナル遠心または等密度の勾配遠心
により分離される。緩衝化水溶液中の、例えば、３０〜
５０％ｗ／ｗのスクロース密度勾配の等密度の遠心は、
例えば、１００，０００〜１５０，０００×ｇの遠心の
加速において、好ましい。感染した細胞からのウイルス
のタンパク質を使用して本発明を実施するとき、ウイル
スの成長に使用した感染した細胞を、必要に応じて、懸
濁し、そして懸濁した細胞を濃縮する。濃度は濾過また
は遠心により実施する。遠心は好ましくは３００〜２，
０００ｇにおいて実施する。遠心は約１リットルの体積
で約１５〜４５分の間実施する。濃縮後、細胞を、好ま
しくは、例えば、生理食塩水で洗浄する。

【００３４】このようにして得られたウイルスまたは細
胞濃縮物は洗浄剤で処理する。

【００３５】適当な洗浄剤は、次の通りである：アニオ
ン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、脂
肪族アルコールエーテルサルフェート、モノ／ジアルキ
ルポリグリコールエーテルオルトリン酸エステルモノエ
タノールアミン、カルシウムアルキルアリールスルホネ
ート、ナトリウムデオキシコレート、カチオン性界面活
性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウムクロライ
ド、両性界面活性剤、例えば、ジ−ナトリウムＮ−ラウ
リル−：−イミドジプロピオントまたはレシチン、非イ
オン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチル化ヒマシ
油、ポリオキシエチル化ソルビタンオレエート、ソルビ
タンモノステアレート、グリセロールモノステアレー
ト、ポリオキシエチル化ステアレート、アルキルフェノ
ールポリグリコールエーテル。

【００３６】非イオン性洗浄剤を、とくに述べることが
できる：１０より大きいＨＬＢ（親水性／疎油性／バラ
ンス値）をもつ非イオン性水溶性乳化剤、例えば、エマ
ルゲイター（Ｅｍａｌｇａｔｏｒ^R）（バイエル社）、
アルキルアリールポリグリコールエーテル；レネックス
（Ｒｅｎｅｘ）６７８^R［アトラス・ケミカル・インダ
ストリーズ（Ａｔｌａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉｅｓ）］、ポリオキシエチレンアルキルアリー
ルエーテル；ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０^R（アトラ
ス）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテー
ト；ミリ（Ｍｙｒｉ）５３^R（アトラス）、ポリオキシ
エチレンラウリルエーテル；アトラス（Ａｔｌａｓ）Ｇ
３９２０^R、ポリオキシエチレンオレイルエーテル；ア
トラス（Ａｔｌａｓ）Ｇ９０４６^R、ポリオキシエチレ
ンマンニタンモノラウレート；エマルゲイター（Ｅｍａ
ｌｇａｔｏｒ）１３７１Ｂ^R（バイエル社）、アルキル
ポリグリコールエーテル；エマルゲイター（Ｅｍａｌｇ
ａｔｏｒ）１７３６^R（バイエル社）、アルキルポリグ
リコールエーテル（オレイルポリグリコールエーテ
ル）；エマルゲイター（Ｅｍａｌｇａｔｏｒ）ＯＸ
^R（バイエル社）、アルキルポリグリコールエーテル
（ドデシルポリグリコールエーテル）；ニノックス（Ｎ
ｉｎｏｘ）ＢＭ−２^R［ステパン・ケミカル・カンパニ
ー（Ｓｔｅｐａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）］、エ
トキシル化ノニルフェノール；トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００^R［ローム・アンド・ハース・カンパニ
ー（Ｒｏｈｍ ａｎｄＨａａｓ Ｃｏ．）］、イソオク
チルフェノールポリエトキシエタノール；クレモフォー
ル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ^R、ノニデット（Ｎｏｎ
ｉｄｅｔ）Ｐ４０^R［シェル（Ｓｈｅｌｌ）、グリコピ
ラノシド［スゲナ（Ｓｕｇｅｎａ）］、Ｎ−デカントイ
ル−Ｎ−メチル−グリコシド。

【００３７】洗浄剤は希釈した水溶液の形態で使用す
る。述べることができる溶液は、０．１〜１０容量％、
好ましくは０．５〜５容量％、とくに好ましくは約１容
量％の洗浄剤を含有するものである。

【００３８】洗浄剤溶液は、細胞またはウイルス濃縮物
に対して約１：１〜約１０：１の比で添加する。洗浄剤
溶液対細胞またはウイルス濃縮物の好ましい比は約３：
１である。

【００３９】洗浄剤の処理を改良するために、溶液を超
音波処理に追加的にかけることができる。洗浄剤の処理
は０〜約２４℃、好ましくは２〜８℃の温度において実
施する。洗浄剤処理は１２分〜２日間、好ましくは１２
〜２４時間実施する。

【００４０】この処理により溶解しない粒子は、好まし
くは遠心または濾過により、除去する。遠心を使用する
とき、上で得られたリゼイトを、例えば、１００，００
０×ｇの遠心の加速に、例えば、１時間暴露する。

【００４１】このようにして得られた遠心の上澄み液ま
たは濾液は、それをさらに処理する前に、低温（０〜７
０℃）において貯蔵することができる。

【００４２】溶液の中に含有される糖タンパク質を分離
するために、それをレクチンで処理する。このために、
それを前以て十分な塩化ナトリウムおよび既知のレクチ
ン安定化塩と混合して、０．５〜２モル、好ましくは
０．７〜１．２モルの塩化ナトリウムの濃度を生ずる。
レクチン−安定化試料の要求される濃度は、この分野に
おいて知られており、そして使用すべきレクチンに対し
て特異的である。濃度は好ましくはリゼイトの透析によ
り調節する。

【００４３】レクチンは、植物、詳しくはそれらの種
子、微生物、脊椎動物および無脊椎動物からのタンパク
質または糖タンパク質であり、糖類およびそれらの接合
体に特異的に結合する。本発明に従い使用するレクチン
は、ＥＨＶ感染した細胞からまたはＥＨＶウイルスから
の糖タンパク質を認識しそしてそれらと結合し、そして
リンパ球に対してミトゲンの作用を有するレクチンであ
る。

【００４４】実際には、すべてのレクチンを本発明に従
い使用することができる。使用することが好ましいレク
チンは、マンノースおよび／またはグルコースおよびそ
れらの接合体を認識するものである。

【００４５】次のレクチンを特に述べることができる：
カナバリア・エンフォルニス（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅ
ｎｓｉｆｏｒｎｉｓ）、レンズ・クリニナリス（Ｌｅｎ
ｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、ラチロス・オドラツス（Ｌａ
ｔｈｙｒｏｓ ｏｄｏｒａｔｕｓ）、ピスム・サチブム
（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ビシア・ファバ（Ｖ
ｉｃｉａ ｆａｂａ）、サムブクス・ニグラ（Ｓａｍｂ
ｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、グリシン・マクス（Ｇｌｙｃ
ｉｎｅ ｍａｘ）、ウレックス・エウロペンス（Ｕｌｅ
ｘ ｅｕｒｏｐａｅｎｓ）、ヘリックス・ポマチア（Ｈ
ｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）、フィトラッカ・アメリカ
ナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、リ
コペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃ
ｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ダツラ・ストランモニウ
ム（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、バンデイ
ラエア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａｓ
ｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）。

【００４６】レクチンは、本発明による方法のために、
水溶性または水不溶性の形態で使用することができる。
水不溶性の形態で、レクチンは、好ましくは、ゲルとし
て不活性マトリックス、例えば、テキスラン、アガロー
ス、セルロースにカップリングすることによって固定化
する。

【００４７】コンカナバリンＡ−アガロース、コンカナ
バリンＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、レン
チルラクチン−セファロース、アメリカヤマゴボウのミ
トゲンを特別に述べることができる。

【００４８】レクチンは、洗浄剤および塩を含有する溶
液、懸濁液またはゲルの形態で使用する。

【００４９】この溶液、溶液またはこのゲルを調製する
ために、レクチンを塩の溶液中の細胞のリゼイトまたは
ウイルスのリゼイトの処理のために使用した洗浄剤を混
合する。この塩溶液は、レクチンの安定性および反応性
のために慣用のかつ必要な既知の塩に加えて、約０．５
〜２モル、好ましくは０．７〜１．２モルの塩化ナトリ
ウムを含有する。こうして、レクチンの塩および洗浄剤
の溶液は、細胞およびウイルスのリゼイト中の塩および
洗浄剤の濃度の調節に使用する溶液と同一である。

【００５０】純粋なレクチンの約１〜１５０ｍｇ、好ま
しくは１〜５０ｍｇ、とくに好ましくは５〜２０ｍｇを
溶液、懸濁液またはゲルの１ｍｌ当たりに使用し、ここ
で溶液、懸濁液またはゲルは細胞のリゼイトまたはヴィ
リオンの処理において使用される濃度で洗浄剤を含有す
る。

【００５１】洗浄剤を含有する細胞のリゼイトまたはウ
イルスのリゼイトに添加する、このレクチンの溶液、懸
濁液またはゲルの量は、合計のタンパク質の１ｍｇ当た
り０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ、
とくに好ましくは０．５〜５ｍｇのレクチンの使用する
ために十分な量である。各場合において、細胞またはウ
イルスのリゼイト中のすべての糖タンパク質が結合する
ことができるように、レクチンの量を選択することが必
要である。

【００５２】レクチンの処理は、−５〜＋３０℃、好ま
しくは２〜８℃において約１０分〜３日間、好ましくは
１時間〜２日間実施する。

【００５３】レクチンと糖タンパク質との反応は、ま
た、カラムクロマトグラフィーを経て実施することがで
きる。このために、固定化した、好ましくはゲル様マト
リックスに結合した、レクチンを細胞のリゼイトまたは
ウイルスのリゼイトとクロマトグラフィーのカラムの中
で接触させる。詰めたゲルの１ｍｌ当たりに、約０．１
〜１００ｍｇ、好ましくは１〜５０ｍｇ、とくに好まし
くは５〜２０ｍｇのレクチンを使用する。

【００５４】糖タンパク質−レクチンのコンプレックス
を、慣用方法において完全な溶液または懸濁液から除去
する。これは遠心、濾過によるか、あるいはクロマトグ
ラフィーの場合において、洗浄により、実施することが
できる。

【００５５】糖タンパク質−レクチンのコンプレックス
を含有し、そしてこの工程において得られる懸濁液また
はゲルを洗浄して、塩または洗浄剤の濃度を減少する。
このために、懸濁液またはゲルを、細胞またはウイルス
のリゼイトの処理において使用される洗浄剤濃度および
塩化ナトリウム濃度の０．１〜０．０１倍を含有する溶
液と混合し、こうして糖タンパク質−レクチンのコンプ
レックスを含有する懸濁液またはゲル中の０．１〜０．
０１倍の濃度の洗浄剤および塩化ナトリウムが存在する
ようにする。

【００５６】このようにして得られた糖タンパク質−レ
クチンのコンプレックスの懸濁液またはゲルは、直接使
用するか、あるいは、適当ならば、ウマの免疫化のため
のアジュバントの添加後、使用することができる。レク
チン結合した糖タンパク質の含量に依存して、免疫化の
ために使用する懸濁液またはゲルはさらに濃縮または希
釈することができる。結合した糖タンパク質の含量を調
節して、各ワクチンが１０〜５０ｍｇ、好ましくは１０
〜１００ｍｇ、とくに好ましくは２５〜５０ｍｇの糖タ
ンパク質を含有するようにする。

【００５７】糖タンパク質−レクチンのコンプレックス
の生ずる懸濁液またはゲルにおいて、洗浄剤の濃度は、
それを排除するまで、濾過、遠心、透析または他の洗浄
プロセスにより変更することができる。同一の方法を、
また、使用して、生理学的に許容される範囲で塩の濃度
を変更することができる。

【００５８】糖タンパク質−レクチンのコンプレックス
の懸濁液またはゲルは、８℃以下の温度において貯蔵す
ることができる。それらは、また、凍結乾燥することが
できる。

【００５９】糖タンパク質は、ワクチンを調製するため
に、糖タンパク質−レクチンのコンプレックスの生ずる
懸濁液またはゲルから分離することができる。このため
に、懸濁液またはゲルを糖を含有する、水性塩溶液で処
理する。

【００６０】使用すべき糖の性質は、使用するレクチン
の特異性に依存する。糖の濃度は、０．１〜１モル、好
ましくは０．１〜０．５モル、とくに好ましくは０．３
〜０．５モルである。糖の溶液の塩含量および洗浄剤含
量の濃度および組成は、糖タンパク質−レクチンのコン
プレックスを含有するゲルまたは懸濁液のそれらに相当
する。

【００６１】糖溶液を使用する処理は、−５〜＋３０
℃、好ましくは２〜＋８℃において実施する。処理時間
は約１５分〜４日間、好ましくは１時間〜２日間、とく
に好ましくは１０〜２４時間である。

【００６２】このようにして溶離した糖タンパク質をレ
クチンから遠心、濾過または慣用の方法（例えば、クロ
マトグラフィー）により分離する。

【００６３】洗浄剤、塩または糖を含有する溶液中のこ
のようにして得られた分離した糖タンパク質は、直接使
用するか、あるいは糖タンパク質の含量に依存してウマ
の免疫化のためのアジュバントの添加後に使用すること
ができる。

【００６４】糖タンパク質の含量に依存して、免疫化に
使用する溶液は濃縮するか、あるいは希釈することがで
きる。糖タンパク質の含量を調節し、こうして各ワクチ
ンの投与量／ウマが１０〜２５０ｍｇ、好ましくは１０
〜１００ｍｇ、とくに好ましくは２５〜５０ｍｇの糖タ
ンパク質を含有するようにする。

【００６５】ウイルスのリゼイトからの調製物の場合に
おいて、糖タンパク質の含量を調節して、それがワクチ
ンの投与量より０．１〜０．０１倍低いようにする。

【００６６】調製物中の洗浄剤および塩の濃度は、前述
したように変更することができる。調製物は低温（０℃
以下）で溶液の形態でまたは凍結乾燥した形態で貯蔵す
る。糖タンパク質−レクチンのコンプレックスおよび分
離した糖タンパク質は、慣用のアジュバントと混合した
後、免疫応答を増強するために投与することができる。

【００６７】述べることができるアジュバントは、次の
通りである：水性および油性のアジュバント、例えば、
水酸化アルミニウムまたはハブロゲン（Ｈａｖｌｏｇｅ
ｎ^R）。

【００６８】投与は、慣用の非経口的方法で、例えば、
筋肉内、皮下、鼻内に実施する。

【００６９】

【実施例】１．細胞培養物の調製 １．１ 培地および溶液 培地：Ｅ−ＭＥＭ ０．８５ｇ（アーレ（Ｅａｒｌｅ）
最小必須培地（参照、ウイルス学の作業方法（Ｖｉｒｏ
ｌ．Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ）Ｖｏｌ．１、ス
ツットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）、グスタフ・フィ
ッシャー−フェルラーグ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９７４、Ａ．メイヤー（Ｍａｙ
ｅｒ）、Ｐ．Ａ．バッチマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）、
Ｂ．ビブラック（Ｂｉｂｒａｃｋ）＋Ｇ．ウィットマン
（Ｗｉｔｔｍａｎ）＋０．８５ｇのＮａＨＣＯ₃／ｌ。

【００７０】トリプシンＥＤＴＡ：０．２ｇのＥＤＴＡ
−エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩；１ｇのグルコ
ース；０．４ｇのＫＣｌ；８ｇのＮａＣｌ；０．５８ｇ
のＮａ₂ＣＯ₃；０．５ｇのトリプシンを１リットルの蒸
留水に添加する。

【００７１】胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）：「ギブコ（Ｇ
ｉｂｃｏ）」により供給された。

【００７２】１．２ 細胞の培養 ウイルスの培養およびウイルスの滴定は、ＥＤ（ウマの
皮膚）およびＰＫ１５細胞（ブタの腎臓）を使用して実
施した。細胞の培養に使用した培地は、１０％の胎児仔
ウシ血清を添加したＥ−ＭＥＭ ０．８５ｇであった。
全面生長において、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにより
単一層のアセンブレイジ（ａｓｓｅｍｂｌａｇｅ）から
分離し、そして培養容器に相当する密度において継代培
養した。２．ウイルス培養物の調製 ２．１ 培地および溶液 維持培地：Ｅ−ＭＥＭ（２．０ｇ（アーレ（Ｅａｒｌ
ｅ）最小必須培地（参照、ウイルス学の作業方法（Ｖｉ
ｒｏｌ．Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ）Ｖｏｌ．
１、スツットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）、グスタフ
・フィッシャー−フェルラーグ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓ
ｃｈｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９７４、Ａ．メイヤー
（Ｍａｙｅｒ）、Ｐ．Ａ．バッチマン（Ｂａｃｈｍａｎ
ｎ））＋２．０ｇのＮａＨＣＯ₃／ｌ）。

【００７３】ＰＢＳ：８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ
₂ＰＯ₄、１．４４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．２ＫＣｌを１
リットルの蒸留水に添加した。

【００７４】２．２ ウイルスの培養 全面生長において、細胞の培地はデカンテーションし、
そして細胞を維持培地で洗浄した。引き続く感染は、維
持培地中で希釈したウイルスのストックを添加すること
によって実施した。これは、０．１のｍ．ｏ．ｉ．（感
染の多重度）に相当する１：１００に希釈したＥＨＶ−
１および１：０に希釈した（０．００１のｍ．ｏ．
ｉ．）ＥＨＶ−４を要した。接種した細胞培養物を３７
℃においてインキュベーションした。ＥＨＶ−１で接種
した細胞は感染後約２４時間後に１００％ｃｐＥ（細胞
変性作用）に到達したが、ＥＨＶ−４感染した細胞は少
なくとも４８時間を要した。

【００７５】３．細胞リゼイトの調製 ３．１ 化学物質および溶液 抽出緩衝液：２５ミリモルのトリスＨＣＬ（トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタンＨＣｌ）、１％のＮＰ
４０；ｐＨ８．６。

【００７６】ＮＰ４０：ノジデント（Ｎｏｎｉｄｅｎ
ｔ）Ｐ４０（エチルフェニルポリエチレングリコー
ル）。

【００７７】貯蔵緩衝液：０．１モルのＮａＣＨ₃ＣＯ
Ｏ、１ミリモルのＣａＣｌ₂、１ミリモルのＭｇＣｌ₂、
１ミリモルのＭｎＣｌ₂、１モルのＮａＣｌ、ｐＨ６。

【００７８】溶離緩衝液：０．１モルのＮａＣＨ₃ＣＯ
Ｏ、１ミリモルのＣａＣｌ₂、１ミリモルのＭｇＣｌ₂、
１ミリモルのＭｎＣｌ₂１モルのＮａＣｌ、０．１％の
ＮＰ４０、０．３モルのメチルモノピラノシド、ｐＨ
６。

【００７９】３．２ 検出の処理 ローラーびん［８５０ｃｍ²のファルコン（Ｆａｌｃｏ
ｎ）］または皿の積み重ね［６０００ｃｍ²のヌンク
（Ｎｕｎｃ）］を、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４で９０
〜１００％の全面生長で接種した。反応速度論の研究結
果に従い（１０〜１００％のｃｐＥで収穫する）、感染
した細胞を調製実験のために８０％のｃｐＥで収穫し
た。このために、ローラー培養物からの細胞を、無菌の
ゴムのスクレーパー［細胞スクレーパー、コスター（Ｃ
ｏｓｔａｒ）により供給される］を使用して容器の壁か
らかきとって培地の中にいれるか、あるいは皿の積み重
ねを激しく震盪することによって培地の中に懸濁した。
懸濁液を引き続いて３，０００ｇで２０分間遠心し、そ
してこのようにして得られた細胞の沈澱を２×ＰＢＳ中
で洗浄した後、それを最後に１：２のＰＢＳｖ／ｖの中
に取り、そして−７０℃において貯蔵した。抽出は細胞
の懸濁液の１ｍｌ当たり３ｍｌの抽出緩衝液を添加する
ことによって実施し、引き続いて超音波で処理した（各
７ミクロンにおいて５秒の３バースト）。このリゼイト
を４℃で２４時間撹拌した後、不溶性粒子をＳＷ４１ロ
ーター中で遠心（３８，０００ｒｐｍ、１時間）により
沈澱させた。上澄み物質を−７０℃において貯蔵した。
上澄み物質のアリコートの限外濾過後、膜のリゼイト中
のタンパク質濃度を決定した。

【００８０】４．糖タンパク質の分離 親和クロマトグラフィーによりコンカナバリンＡ−セフ
ァローズで糖タンパク質を精製することは、アウエスキ
ー病ウイルスからのタンパク質の調製について、トッド
（ＴＯＤＤ）ら、アーチーブス・オブ・ビロロジー（Ａ
ｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．）、２１５−２２４ページに記載
された。細胞のリゼイトを最初に４℃において２４時
間、コンカナバリンＡ−セファローズ４Ｂの洗浄剤ＮＰ
４０（１％の最終濃度）で完全した貯蔵緩衝液に対して
透析した。コンカナバリンＡ−セファローズ４Ｂ［シグ
マ（Ｓｉｇｍａ）Ｃ９０１７］をカラム［ファーマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）直径１．５ｃｍ］に泡が含まれ
ないように導入し、そして４℃において２０倍のベッド
体積の前述の貯蔵緩衝液（＋１％のＮＰ４０）と平衡化
した。引き続いて、細胞リゼイトをカラムに適用する
（詰めたゲルの１ｍｌ当たり１５μｇののタンパク質）
ことによって、糖タンパク質をレクチン上に吸着させ
た。このために、細胞リゼイト（平均のタンパク質含量
２．１ｍｇ／ｍｌ）を、蠕動ポンプにより１ｍｌ／時の
ポンピング速度で、ゲルの中に導入し、そして静止して
１２時間インキュベーションした。次いで、カラムを平
衡化緩衝液で洗浄して、非結合タンパク質を洗浄除去し
た。この操作および他のクロマトグラフィーの操作は約
４℃において実施した。洗浄剤および塩の濃度を減少す
るために、糖タンパク質を吸着したゲルを２０倍のカラ
ム体積の減少したＮａＣｌ（０．１モル）およびＮＰ４
０含量（０．１％）の変性した平衡化緩衝液で再平衡化
した。０．１〜０．５モルのメチルマンンノピラノシド
の添加後、糖タンパク質をこの減少した緩衝液で溶離し
た。溶離緩衝液をゲルの中に２〜５ｍｌ／時のポンピン
グ速度で導入し、引き続いて静止して溶離緩衝液ととも
に一夜インキュベーションした。溶離液を引き続いて２
ｍｌ／時のポンピング速度で得、フローフォトメーター
でフォトメトリー（２７５ｎｍ）により監視した。高い
メチルマンンノピラノシド濃度を使用してさえ、１回の
溶離実験において吸着された糖タンパク質を定量的に分
離することができないので、ゲルのベッドをさらに１回
溶離緩衝液中で静止インキュベーションすることによっ
て、他の溶離を実施した。第２溶離は品質および量が匹
敵する量の糖タンパク質を生じた。これらの糖タンパク
質の溶離液の分画を−２０℃において貯蔵した。最適化
試験における結果に基づいて、前述の０．１モルのＮａ
Ｃｌ、０．１％のＮＰ４０および０．３モルのメチルマ
ンンノピラノシドを含有する溶離緩衝液を日常的に使用
した。

【００８１】５．タンパク質の決定 細胞リゼイト中の１％および溶離液中の０．１％のＮＰ
４０含量はタンパク質のフォトメトリーの決定を妨害す
るので、先行する限外濾過により試料中のＮＰ４０を希
釈することが必要であった。このために、決定すべき試
料の５０μｌ（１％のＮＰ４０を含有するリゼイトの場
合において）または５００μｌ（１％のＮＰ４０）０．
１％のＮＰ４０を含有する溶離液の場合において）のア
リコートをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０管
［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）により供給される］中で蒸
留水で２ｍｌまでにし、そして８，０００ｒｐｍ（Ａ
８．２４ローター）で３０分間遠心した。リテンテイト
（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を各回２ｍｌの水で洗浄し、次
いで蒸留水で正確に１ｍｌとし、そしてバイオ−ラド
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質アッセイの添加後、タン
パク質の含量を５９５ｎｍにおいてフォトメトリーによ
り決定した。最初の試料中のタンパク質の含量は、これ
から試料の計算により計算することができるであろう。

【００８２】６．レクチン結合した糖タンパク質の調製 詰めたコンカナバリンＡ−セファローズ４Ｂ（シグマＣ
９０１７）を、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管中で、沈
澱（３，０００ｒｐｍ）および再懸濁により、各回２倍
の体積の貯蔵緩衝液（１％のＮＰ４０を補充した）で洗
浄した後、同一緩衝液に対して透析した細胞リゼイトを
添加した。レクチンへの糖タンパク質の吸着は、タンブ
ラー上で撹拌しながら４℃において１６時間実施した。
引き続いて、結合しないタンパク質を２倍体積の貯蔵緩
衝液（＋１％のＮＰ４０）で反復して洗浄することによ
って除去した。塩含量を減少しそして洗浄剤を排除する
ために、レクチンを反復してまず変性した貯蔵緩衝液
（０．１モルのＮａＣｌおよび０．１％のＮＰ４０を含
有する）で洗浄し、引き続いてＮＰ４０を含有しない同
一の緩衝液中で洗浄した。糖タンパク質を吸着したレク
チンのこの懸濁液を４℃において貯蔵した。コンカナバ
リンＡに結合した調製を次のようにして定量した：糖タ
ンパク質を結合したレクチンの２００μｌのアリコート
を各回５００μｌの溶離緩衝液（０．１モルのＮａＣ
ｌ、０．５モルのメチルマンノピラノシドを含有する貯
蔵緩衝液）とともに２回各回１６時間インキュベーショ
ンした。これから集めた溶離液中のタンパク質の量を、
フォトメトリーにより決定し、そして試料の計算により
１ｍｌの詰めたコンカナバリンＡに結合したタンパク質
の量に対する外挿した。

【００８３】７．抗原性の分析 転移緩衝液： ５０ミリモルのトリス（ヒドオキシメチル）アミノメタ
ン ４０ミリモルのグリシン １．３ミリモルのドデシル硫酸ナトリウム ２０％のメタノール ｐＨ９．３ 試料緩衝液： １５ミリモルのトリス（ヒドオキシメチル）アミノメタ
ン ２％のｗ／ｖのドデシル硫酸ナトリウム １０％のｗ／ｖのβ−メルカプトエタノール ６モルの尿素 １０％のグリセロール ０．０２％のブロモフェノールブルー ｐＨ６．８ ７．１ 電気泳動によりタンパク質の分画 ＳＤＳ Ｐａｇｅ（ドデシル硫酸ナトリウムのポリアク
リルアミドゲルの電気泳動）は、レムリ（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７（１９７
０）、６８０−６８５ページ、に記載されている方法に
より実施した。７．５％〜１５％のポリアクリルアミド
の勾配のゲルを使用して、溶液の中に存在するすべての
タンパク質の適切な分離を達成した。

【００８４】研究すべき試料を真空濃縮し、そして各場
合において２５μｌの変性試料緩衝液の中に再溶解し
た。５分間超音波処理した後、それらを４分間沸騰さ
せ、そして試料のみぞの中に負荷した。

【００８５】使用したマーカータンパク質は、タンパク
質の分子量が１１０、８４、４７、３３、２４および１
６ｋＤａのバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）「前以て染
色したＳＤＳ−Ｐａｇｅの低い範囲の標準」であった。

【００８６】電気泳動後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルを、室温においておだやかに震盪しながら、クーマッ
シー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色溶液中で１６時間染色
した。次いで、非特異的染色物を、脱染色溶液中で２〜
３時間インキュベーションすることによって排除した。
次いで、ゲルを濾紙上で乾燥し、真空中で加熱した。 ７．２ 分画したタンパク質のニトロセルロースへの転
移 染色後の評価後、ＳＤＳ Ｐａｇｅにより分画したタン
パク質を、バーネッテ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）Ａ．、アナ
リティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）１１３（１９８１）、１９５−２０３ペ
ージ、に記載される原理に従い、ニトロセルロース膜へ
移した。

【００８７】ゲルをまず転移緩衝液中で平衡化した。次
いで、サンドイッチを順次に濾紙、ゲル、ニトロセルロ
ース、濾紙で調製し、そして泡が存在しなようにしてサ
ートブロット（Ｓａｒｔｏｂｌｏｔ）ＩＩ Ｓ［サート
リウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）］のカソード上に配置し
そして、アノードプレートを配置した後、転移を開始し
た。室温および一定の１ｍＡ／ｃｍ²のゲルにおいて１
時間後に、それを停止した。

【００８８】７．３ 免疫染色 染色すべきニトロセルロースのストリップを、最初に、
ブロッキング緩衝液（３％のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ＰＢＳ中の０．０５％のツイーン２０）中の１時
間撹拌して、遊離のタンパク質結合部位をブロッキング
した。引き続いて、ニトロセルロースを同一緩衝液中の
それらの特別の希釈物（１：１５０〜１：１０，００
０）中の抗血清とともに室温において２時間インキュベ
ーションした。ＰＢＳでよく洗浄した後、使用した抗血
清に相当するペルオキシダーゼ標識した抗種ＩｇＧ接合
体（シグマにより供給された）をＰＢＳ中の１：１５０
の希釈でニトロセルロース上に配置し、そしてニトロセ
ルロースをさらに２時間インキュベーションした。ＰＢ
Ｓ中で３回洗浄した後、基質溶液を添加した。使用前
に、後者を５０ｍｌの２０ミリモルの酢酸ナトリウム中
の３−アミノ−９−エチルカルバゾールで新鮮に調製し
た。染色反応を蒸留水中の希釈により停止した。分離ゲ
ル中のマーカータンパク質による移動距離を決定した
後、これらの値をそれに属する分子量に対して半対数的
にプロットし、そして各ゲルに対して特異的な、この目
盛り定めプロットを使用して、免疫染色した分子量を決
定した。

【００８９】免疫学的研究のために使用したウマの血清
は、次の動物からの血清であった： 「マイエンシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈｅｉｎ）」：実
験的に調製し、不活性化した、二価のワクチン（ＥＨＶ
−１およびＥＨＶ−４）で、および高いＥＨＶ−１ Ｓ
Ｎ力価（１：１１２）および低いＥＨＶ−４ＳＮ力価
（１：６）で免疫化した温血ウマ。

【００９０】「アルフェ（Ａｒｆｅ）」：高いＥＨＶ−
１ ＳＮ力価（１：８０）および低い、交差反応性のＥ
ＨＶ−４ＳＮ力価（１：６）を使用した下に記載する：
８）試験からのウマ。

【００９１】「エリス（Ｅｌｌｉｓ）」：実験的に米国
においてＥＨＶ−１で感染しそしてこの感染の間に流産
した、高いＥＨＶ−１ ＳＮ力価（１：１４４）および
低いＥＨＶ−４ ＳＮ力価（＜１：８）をもつ、完全に
成長したウマの雌。

【００９２】「フェルドセルム（Ｆｅｒｄｓｅｒｕ
ｍ）」：呼吸器の疾患の臨床的徴候をもつおよび中程度
に高いＥＨＶ−１ ＳＮ力価（１：６４）およびＥＨＶ
−４ ＳＮ力価（１：１４）をもつ乗用馬。

【００９３】単一特異的ヤギ血清を、種々のＥＨＶ−１
株またはＥＨＶ−４に対して超免疫化した動物から得
た。

【００９４】ＥＨＶ−１に対する単一特異的超免疫血清
を、バンド精製したウイルス物質および「大型ニュージ
ーランド」飼育のウサギで調製した。このために、１０
０μｇの溶解したタンパク質／投与を各場合においてフ
ロインド不完全アジュバントを使用して３×１４日の間
隔で均質に配合し、そしてウサギの皮下に投与した。血
清を２週の間隔で得た。

【００９５】８．ウマについての免疫原性 ８．１ ワクチンの調製 ８．１．１ 溶離液のワクチンの調製 フォトメトリーにより糖タンパク質の溶離液の分画のタ
ンパク質含量の決定後、後者を滅菌濾液した溶離緩衝液
で２ｍｌのワクチン投与量当たり要求されるタンパク質
含量に調節した。ワクチンの配合は、アジュバントとし
て０．２ｍｌのＲハロゲンＤ（１０％に相当する）およ
び防腐剤として０．００１％のメリチオレート（Ｍｅｒ
ｉｔｈｉｏｌａｔｅ）を添加することによって完結し、
引き続いてｐＨおよび安定性について検査した。このよ
うにして、次の試験ワクチンを調製した： ＥＨＶ−１ Ａ１： １２．５μｇのタンパク質／投与量（＝２ｍ
ｌ） Ａ２： ７５．０μｇのタンパク質／投与量（＝２ｍ
ｌ） Ａ３：２２５．０μｇのタンパク質／投与量（＝２ｍ
ｌ） ８．１．２ レクチンのワクチンの調製 糖タンパク質と複合化したレクチンの懸濁液を、滅菌濾
過したＰＢＳの添加により、投与のために投与量当たり
糖タンパク質の要求されるタンパク質濃度に希釈した。
アジュバントとして１０％のＲハロゲンＤおよび防腐剤
として０．００１％のメリチオレートは配合物を完成し
た。

【００９６】溶離液の濃度に類似する方法で、次の試験
ワクチンを調製した： ＥＨＶ−１ Ｂ４： １２．５μｇのコンカナバリンＡ結合タンパク
質／投与量（＝２ｍｌ） Ｂ５： ７５．０μｇのコンカナバリンＡ結合タンパク
質／投与量（＝２ｍｌ） Ｂ６：２２５．０μｇのコンカナバリンＡ結合タンパク
質／投与量（＝２ｍｌ） ８．２ 試験動物 研究のために２６のイアリングを入手できた。群は「ド
イチェス・レイトプフェルド（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｒ
ｅｉｔｐｆｅｒｄ）」血統種および純血統種のアラビア
馬の温血馬からなっていた。

【００９７】８．３ 免疫化のスケジュール 試験に意図した馬は、最初に、ＥＨＶ−１およびＥＨＶ
−４に関して、それらの免疫状態について血清中和試験
で検査した。次いで、均質な群を構成し、そして０試料
の血清試料を一次ワクチン接種の日に得た。ＥＨＶ−１
の研究において、各場合において各群４頭のウマの６群
の基本的免疫化は５週の間隔で２回ワクチン接種により
実施した。これは一次ワクチン接種のために各場合にお
いてアジュバントとしてハブロゲン（Ｈａｖｌｏｇｅ
ｎ）を有する溶離した糖タンパク質の１２．５μｇの促
進を受ける群Ａ１、７２μｇの群Ａ２および２２５μｇ
の群Ａ３における動物を必要とした。群Ｂ４〜Ｂ６にお
けるウマは、対応してレクチンのワクチンで免疫化し
た。２７週後、溶離液の配合物の再ワクチン接種（７５
μｇのタンパク質／投与量）をすべての群について均一
に実施した。

【００９８】ワクチンは胸の筋肉の中に深い筋肉内注射
により投与した。２頭の動物を非ワクチン接種対照とし
て使用した。さらに、血清試料を試験の過程を通じて５
〜７週の間隔で取った。

【００９９】８．４ 臨床的許容度の研究 最初に、２つの配合物の許容度を予備的試験において検
査した。一方において溶離緩衝液（２ｍｌ／投与）、お
よび他方において詰めたコンカナバリンＡ−セファロー
ズ（５μｌ／投与）を、各場合において、ウイルスのタ
ンパク質およびアジュバントなしになしに、各場合にお
いて３頭の動物に投与した。１時間の間隔で、体温、心
臓、循環、皮膚のツルガー（ｔｒｕｇｏｒ）、頭、粘
膜、全体的徴候および注射部位の局所的反応を研究し
た。これは、これらのパラメーターのいずれにおいても
生理学的基準から逸脱が存在しないことが明らかにされ
た。免疫原性の研究の過程の間に実施した許容度の試験
は、群Ｂ５における１頭の動物（ワクチン接種後２４時
間に、わずかの局所的反応をもつ）を除外して、ワクチ
ン接種に対して局所的または全身的反応はまったく示さ
なかった。

【０１００】８．５ ＳＮＴにおいて血清学的研究 血清はＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４に対する抗体の中和
について研究した（血清中和試験ＳＮＴ）。これはマイ
クロタイタープレート中の血清希釈法により実施した。
研究すべき血清試料は、不活性化（５６℃において３０
分）後、Ｅ−ＭＥＭ ２．０ｇとの２倍の２５μｌの反
応量で希釈し、そして４ウェル／希釈段階に入れた。２
５μｌ／ウェルの１００ＣＩＤ₅₀のウイルス投与量を添
加し、次いで３７℃において２時間インキュベーション
した。３００×１０³細胞／ｍｌ（ＥＨＶ−１ ＳＮＴ
においてＰＫ１５細胞およびＥＨＶ−４ ＳＮＴにおい
てＥＤ細胞）を有する細胞懸濁液の５０μｌをウェル当
たりに添加し、そしてプレートを５％のＣＯ₂中の通過
で３７℃において７日間インキュベーションした。ｃｐ
Ｅを第４日および第７日に読んだ。評価は、ケルベル
（Ｋａｅｒｂｅｒ）、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅ
ｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ．ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒ
ｍ．１６２（１９３１）ｐ．４８０またはリード（Ｒｅ
ｅｄ）およびムエンチ（Ｍｕｅｎｃｈ）、Ａｍ．Ｊ．Ｈ
ｙｇ．２７（１９３８）ｐ．４９３の方法により実施し
た。

【０１０１】結果 １．ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４の膜抗原の発現の反応
速度論は細胞を感染した。

【０１０２】感染した細胞培養からウイルス特異的抗原
を調製するために最適な収穫時間を決定するために、細
胞膜の中にウイルス特異的タンパク質を組み込む時間の
過程を反応速度論的に研究した。このために、感染した
細胞を感染後種々の時間に収穫し、そしてＮＰ４０で溶
菌した。次いで、これらのリゼイトの洗浄剤可溶性タン
パク質を非感染細胞と平行に、還元性ＳＤＳ Ｐａｇｅ
における細胞のリゼイトにより分画した。ニトロセルロ
ースのストリップへのこれらのタンパク質のエレクトロ
トランスファーを免疫染色により追跡して、これらの抗
原性を分析した。

【０１０３】収穫時間への抗原含量の依存性を、「マイ
ンシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈｅｉｎ）」の血清で３５
％、７５％および９０％ｃｐＥにおいて収穫したとき、
ＥＨＶ−１感染した細胞のリゼイトタンパク質の免疫染
色により評価した。８２および４４ｋＤａをもつわずか
２つの抗原は３５％のｃｐＥにおいて収穫したリゼイト
の調製物のイムノブロットにおいて弱く検出可能であっ
たが、７つのウイルス特異的抗原タンパク質は７５％の
ｃｐＥにおいて得られたリゼイトにおける検出可能であ
った。これらのタンパク質の相対的分子量は、１３７、
９６、８６〜７８、５６、４４、３５〜２７ｋＤａであ
った。優性の染色は８６〜７８および４４ｋＤａのバン
ドであった。同一の抗原は、減少した量であったが、ま
た、９０％のｃｐＥにおいて収穫した膜のリゼイトにお
いて実証された。すべての調製物において、また、６０
〜４８ｋＤａのタンパク質のバンドは明らかであり、こ
れらは、また、陰性の対照において検出可能であった。

【０１０４】これらの反応速度論の結果により、ウイル
スの抗原の収率は、定性的および定量的の両者におい
て、７５％のｃｐＥにおいて収穫したＥＨＶ−１感染し
た細胞のリゼイトにおいて最高であることが明らかされ
た。感染の後の時間において（９０％のｃｐＥ）、調製
物中の抗原含量は再び減少した。このようにして、これ
らの再現した反応速度論の研究から決定した感染した細
胞の収穫時間は、ＥＨＶ−１膜抗原の最適な収率を得る
ためには、約８０％のｃｐＥであった。

【０１０５】１０％のｃｐＥにおいて収穫したＥＨＶ−
４感染した細胞のリゼイトは、なお、単一特異的ＥＨＶ
−４ヤギ血清により検出可能なウイルス特異的抗原を含
有しなかった。対照的に、分子量６２および４４ｋＤａ
の２つのウイルス特異的タンパク質は４０％のｃｐＥに
おいて調製したリゼイト中の抗原として検出可能であっ
た。これらの優性の抗原に加えて、さらに５８、５６、
３７および２５ｋＤａの分子量のＥＨＶウイルス、およ
び１４０ｋＤａにおいてわずかに弱く検出可能な抗原
が、６０％のおよび９０％の漸進的にｃｐＥのリゼイト
において見いだされた。この研究に基づいて、約８０％
における収穫は、また、ＥＨＶ−４膜抗原を得るために
日常的に選択した。

【０１０６】ＥＨＶ−１の細胞外のヴィリオンにおいて
既に同定された、大きい比率のウイルス抗原は、また、
感染した細胞のリゼイトにおいて検出可能であった。こ
れに関して、１４０、９８〜８８、８４〜７８、４４お
よび２７ｋＤａの分子量をもつ抗原は、両者の抗原調製
物の中に存在した。

【０１０７】対照的に、ＥＨＶ−４の場合において、抗
原のパターンは抗原調製物に依存して異なった。感染し
た細胞から得られた膜タンパク質は、２７〜６２ｋＤａ
の分子量のウイルス特異的抗原を表した。こうして、細
胞外ウイルス中の単一特異的ＥＨＶ−４血清により認識
された、高分子量の抗原（１４０〜７０ｋＤａ）は、こ
れらの膜タンパク質の調製物の中に存在しなかった。

【０１０８】２．ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４感染した
細胞の膜リゼイトからの糖タンパク質の分離 予備的スクリーニングにおいて、コンカナバリンＡ（ｃ
ｏｎ−Ａ）、ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏ
ｍａｔｉａ）およびフィトラッカ・アメリカナ（Ｐｈｙ
ｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎ）を、親和クロマト
グラフィーにおいて検査して、これらの研究に適当なレ
クチンを選択した。ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ
ｐｏｍａｔｉａ）およびフィトラッカ・アメリカナ
（Ｐｈｙｔの小さい比率のみを吸着した。対照的に、コ
ンカナバリンＡは、定性的かつ定量的に、最高の収率で
ウイルス特異的抗原を産生した。したがって、コンカナ
バリンＡを引き続いてレクチンの親和クロマトグラフィ
ーにおいて使用した。

【０１０９】精製法を評価しかつ精製した糖タンパク質
の分画の抗原性を分析するために、膜リゼイトのタンパ
ク質、クロマトグラフィーから貫流したののタンパク質
（レクチン上に吸着されなかった）およびＥＨＶ−１感
染した細胞の溶離液のタンパク質をイムノブロッティン
グにより試験した。

【０１１０】試料中の同一量のタンパク質にかかわら
ず、「マインシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈｅｉｎ）」の
血清により特定の抗原の染色は、対応するリゼイトにお
けるより、溶離液において強かった。これが意味するよ
うに、ＥＨＶ−１特異的抗原の相対的含量は、リゼイト
におけるより溶離液の調製物において高かかった。その
うえ、このイムノブロットにおいて分子量９６〜８８、
７８〜７６、６２および４６〜４２ｋＤａの４つのタン
パク質により特定の反応が存在した。さらに、リゼイト
中で検出不可能であった１３５および２７ｋＤａにおい
て弱く検出可能な抗原が溶離液の試料の中に存在し、こ
うしてこれらの抗原は同様に溶離液において濃縮され
た。また、クロマトグラフィーから還流したものの中に
含有される抗原のみは６２ｋＤａのタンパク質であり、
これは「マインシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈｅｉｎ）」
の血清中の抗原と反応した。しかしながら、このタンパ
ク質は、また、非感染細胞のリゼイト、還流したものお
よび溶離液中で検出可能であり、これが示すようにこれ
は細胞膜のタンパク質であった。

【０１１１】イムノブロッティングによりＥＨＶ−４感
染した細胞のリゼイトおよび溶離液中の膜抗原を比較す
ると、両者の調製物中の同一のタンパク質は使用した抗
ＥＨＶ−４ヤギ血清により抗原として認識された。これ
らは６２、５６、５４、４４および２７ｋＤａの分子量
のタンパク質であり、６２ｋＤａにおける抗原は量が多
かった。さらに、溶離液調製物において、７６および３
５ｋＤａにおいて非常に弱く表されるバンドが検出可能
であった。

【０１１２】これらの試験が示すように、コンカナバリ
ンＡを使用するレクチンの親和クロマトグラフィーによ
り、その抗原性構造を変更せずに、ＥＨＶ感染した細胞
のリゼイトからの膜糖タンパク質の精製を達成すること
ができる。溶離液の抗原のパターンは、リゼイトのそれ
らと本質的に同一であった。免疫染色において使用する
とき、リゼイトと比較して、溶離液中の抗原のタンパク
質の明確にいっそう強い色の反応は、溶離液調製物中の
これらの抗原の含量の増加、こうして濃縮を実証した。

【０１１３】タンパク質のパターンは、精製の前後の個
々の調製物の抗原性を無視して、電気泳動により分画し
たタンパク質のタンパク質特異的クーマッシー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ）の染色により分析した。膜リゼイトの中
には少なくとも３０のタンパク質がなお存在するが、ク
ーマッシーで検出可能な検出可能なタンパク質の数は溶
離液において約１２に減少した。この結果は、ＥＨＶ−
１感染細胞およびＥＨＶ−４感染細胞の特定の調製物に
等しく適用される。

【０１１４】こうして、この記載した方法により、異な
るタンパク質の合計の数を減少して、溶離液中の抗原の
含量を増加することができることを示すことが可能であ
った。精製の間の個々の糖タンパク質の含量のバランス
を、表１に線図的に要約する。

【０１１５】

【表１】

【０１１６】３、精製したタンパク質の特異性 今日まで「マインシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈｅｉ
ｎ）」の血清により認識された、ＥＨＶ−１感染細胞の
精製した糖タンパク質の抗原が、また、他の免疫血清を
使用する免疫染色により抗原として認識される程度を、
最初に分析した。

【０１１７】このために、各場合において、非感染細胞
のリゼイトからの溶離液を、還元性ＳＤＳ Ｐａｇｅに
おけるリゼイトからのＥＨＶ−１感染細胞の外に、分画
し、そしてイムノブロットにおいて異なる血清で試験し
た。これにおいて、ＥＨＶ−１免疫原性の研究からのウ
マ「アルフェ（Ａｒｆｅ）」の血清を使用する相同性免
疫染色により染色した抗原は、標準の血清の場合と同一
であった。「フェルドセルム（Ｆｅｌｄｓｅｒｕ
ｍ）」、「エリス（Ｅｌｌｉｓ）」の血清およびＥＨＶ
−１株ＤＡ３５、ＤＡ８およびＭＳＵに対する単一特異
的ヤギ血清は、また、原理的に、「マインシェイン（Ｍ
ａｉｅｎｓｃｈｅｉｎ）」の血清と同一の抗原のパター
ンを認識した。詳しくは、１４０、１１８、９４〜８
８、７８、６２ｋＤａの相対的分子量をもつ抗原および
４８および４４ｋＤａをもつ抗原は、弁別が困難である
が、この実験の設計において染色された。そのうえ、免
疫血清により認識されたＥＨＶ−１溶離液の抗原は、使
用した血清に依存して、定性的ではなく、純粋に定量的
に変化した。これは、多分、異なるＳＮの力価にかかわ
らず、イムノブロットにおけるすべての血清の同一の希
釈に起因する。

【０１１８】１つの例外はＥＨＶ−１ ＭＳＵの血清で
あり、これは、１８８ｋＤａの抗原の代わりに、糖タン
パク質分画中の１０５ｋＤａのタンパク質を認識した。
各場合において、また、染色された陰性の対照におい
て、「マインシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈｅｉｎ）」の
血清により６２ｋＤａにおいておよび「アルフェ（Ａｒ
ｆｅ）」の血清により６２および４８ｋＤａにおいて染
色するときにのみ弱く可視のタンパク質のバンドが存在
した。

【０１１９】種々のＥＨＶ−１株の交差反応性を研究す
るために、ＥＤ細胞を７つの異なるＥＨＶ−１株、およ
び関係するリゼイトをレクチン親和クロマトグラフィー
により精製した。これらの調製物の抗原パターンを比較
するために、抗原の糖タンパク質を、ＳＤＳ Ｐａｇｅ
において分離しそしてニトロセルロースへの転移後、種
々の血清でウェスターン・ブロットにおいて免疫染色し
た。結果を表２および３に要約する。

【０１２０】個々の免疫染色は、すべての研究したＥＨ
Ｖ−１調製物について均一な抗原パターンを生じた。し
かしながら、もう一度、各場合において優性である抗原
は使用した血清に依存して変化した。「フェルドセルム
（Ｆｅｌｄｓｅｒｕｍ）」およびＥＨＶ−１ウサギ血清
は、一般に、７８〜８６ｋＤａの抗原とことに明確に反
応したが、４４〜４６ｋＤａのタンパク質は研究したす
べての株について「マインシェイン（Ｍａｉｅｎｓｃｈ
ｅｉｎ）」の血清を使用する染色において優性であっ
た。抗原の糖タンパク質のほとんど均一な染色は、ウマ
「アルフェ（Ａｒｆｅ）」からの血清を使用して達成さ
れた。

【０１２１】個々のＥＨＶ−１調製物の糖タンパク質
は、ＥＨＶ−４ヤギ血清と異なるように反応した。この
場合において、６０および４２の２つのタンパク質はＥ
ＨＶ−１株ＡＢ６９およびＤＡ３５の場合において染色
された。ＥＨＶ−１株ＤＡ８の場合において、６５ｋＤ
ａのタンパク質のみがＥＨＶ−４血清により抗原として
認識された。対照的に、すべての７つのＥＨＶ−１株で
は、各場合において８４および１４０ｋＤａにおいて抗
原のバンドが存在した。しかしながら、後者は、また、
このイムノブロットにおいて陰性の対照において染色さ
れた。

【０１２２】６２ｋＤａのタンパク質は、各場合におい
て平行に研究した、非感染細胞リゼイトからの溶離液の
対照において３つのウマの血清で染色された。さらに、
６４ｋＤａのタンパク質は「マインシェイン（Ｍａｉｅ
ｎｓｃｈｅｉｎ）」の血清と反応し、そして２５および
１１０ｋＤａの分子量のタンパク質は「アルフェ（Ａｒ
ｆｅ）」の血清と反応した。

【０１２３】こうして、感染した細胞の膜リゼイトから
の糖タンパク質の分画においてすべての研究したＥＨＶ
−１株における分子量１４０、９６〜８８、８６〜７
８、４６〜４４および２７ｋＤａの抗原の存在を、種々
の免疫血清により評価することができた。

【０１２４】

【表２】

【０１２５】

【表３】

【０１２６】（＋）すべてのイムノブロツトにおけるほ
んの弱い染色、または検出可能ではないバンド ＋〜＋＋＋抗原−抗体反応の強さ ４．ＥＨＶ−１感染した細胞の精製した糖タンパク質を
使用するコントロールされた免疫原性の研究 ４．１ 相同性ＥＨＶ−１に対する抗体反応 一次ワクチン接種は、すべての２４頭の免疫化したウマ
において２つの配合物の使用した３つの投与量でワクチ
ン接種後５週内で、ウイルス中和性抗体の誘発に導い
た。一次ワクチン接種後５週で実施した、促進ワクチン
接種は、血清抗体力価を１：１００までの値に増加し
た。この場合において、抗体の産生は一次ワクチン接種
後わずかに弱いが、コンカナバリンＡ（ｃｏｎ−Ａ）で
ワクチン接種したウマは、溶離液配合物でワクチン接種
したウマよりすぐれる促進作用についての傾向を示し
た。力価の明確な低下はすべての群において見いだされ
たが、ことに群Ｂ４〜Ｂ６（ｃｏｎ−Ａワクチン）にお
いて、促進後１０週において、群Ｂ４〜Ｂ６において、
促進後２２週において、再びゼロの試料にほとんど相当
する力価を生じた。

【０１２７】一次ワクチン接種後２７週において、実験
においてすべてのウマは７５μｇの糖タンパク質／投与
量の溶離液配合物で均一に再ワクチン接種された。この
促進ワクチン接種は、再び、群Ａ１〜Ａ３において２の
１〜２乗そして群Ｂ４〜Ｂ６において２の２〜３乗の力
価の明確な増加を生じた。

【０１２８】そのうえ、群Ａ１〜Ａ３における力価は、
１：１７０までの値において、それにもかかわらずなお
群Ｂ４〜Ｂ６（１：１２０）におけるそれらより明確に
大きかった。最低の抗原を有するワクチンを使用する基
本的免疫化を受けた群Ａ１〜Ａ３のウマは、事実、再ワ
クチン接種に対して反応して、力価を最大に増加させ
た。

【０１２９】抗体はこの促進ワクチン接種後かなり長く
持続した；促進後最大値のそれらにほぼ相当する力価
は、再ワクチン接種後２５週でなお検出可能であった
（研究の開始後１年に相当する）。次いで、このサンプ
リング日後さらに１０週後、抗体が非常に減少したの
で、力価は非ワクチン接種の対照の動物の範囲であっ
た。

【０１３０】観測期間を通じて非ワクチン接種の対照の
いずれにおいても、血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓ
ｉｏｎ）は検出できなかった。さらに、１年の観測期間
の間、呼吸器の疾患およびウイルス性の流産は種ウマに
おいて起こらなかった。これにより、発現または併発性
のＥＨＶの感染が起こらないこと、および記載した抗体
は実験のワクチン接種の結果であることが保証される。

【０１３１】表４は個々の動物の血清学的研究の結果を
示し、そして表５は群の結果を個々の値の幾何平均とし
て再生する。

【０１３２】４．２ ＥＨＶ−４に対する交差反応性抗
体についての研究 ＥＤ細胞へのＥＨＶ−４、株Ｔ２５２に対する記載した
ＥＨＶ−１の免疫原性の研究からの血清の滴定の結果
を、表６において再生する。ある場合において、明瞭に
読むことができる力価は、ＳＮ試験において使用したＥ
Ｄ細胞への低い希釈の段階における血清の細胞障害性の
作用のために、血清の希釈が１：８であるまで見いださ
れなかった。

【０１３３】ＥＨＶ−１感染した細胞からの膜の糖タン
パク質を使用する免疫化によりウマにおいて誘発された
抗体は、また、ウイルスの中和においてＥＨＶ−４と交
差反応した。１：２０までのＥＨＶ−４中和力価は、一
次ワクチン接種後５週、しかしことに促進後５週および
再ワクチン接種後５および１０週におけるサンプリング
時間において、検出可能であった。

【０１３４】

【表４】

【０１３５】

【表５】

【０１３６】

【表６】

【０１３７】

【表７】

【０１３８】

【表８】

【０１３９】

【表９】

【０１４０】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【０１４１】１、分離した糖タンパク質および／または
ウマのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）感染した細胞および
細胞外ＥＨＶヴィリオンからのレクチンとの前記糖タン
パク質のコンプレックスを含有することを特徴とする、
ウマのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）による感染に対する
ウマのワクチン。

【０１４２】２、糖タンパク質はレクチン上のコンプレ
ックスの形成により分離されたものであることを特徴と
する、上記第１項記載のワクチン。

【０１４３】３、マンノースおよび／またはグルコース
に結合するレクチンおよびそれらの接合体を、糖タンパ
ク質のコンプレックスの形成に使用することを特徴とす
る、上記第１項記載のワクチン。

【０１４４】４、カナバリア・エンフォルミス（Ｃａｎ
ａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）またはヘリック
ス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）からのレ
クチンおよび不活性マトリックス上のそれらのカップリ
ング生成物をコンプレックスの形成に使用することを特
徴とする、上記第１項記載のワクチン。

【０１４５】５、糖タンパク質は血清型１〜４のウマの
ヘルペスウイルスから分離されたものであることを特徴
とする、上記第１項記載のワクチン。

【０１４６】６、工程： ａ）ＥＨＶウイルスを成長させ、 ｂ）感染した細胞または細胞外のウイルスを洗浄剤で処
理し、 ｃ）このようにして得られたリゼイトをレクチンで処理
し、 ｄ）レクチン−リガンドのコンプレックスを残りのリゼ
イトから分離し、 ｅ）適当ならば、レクチン−リガンドのコンプレックス
を分割し、そして糖タンパク質の混合物を分離し、そし
て ｆ）引き続いてレクチン−リガンドのコンプレックスお
よび／または分離した糖タンパク質の混合物を慣用の方
法で配合する、からなることを特徴とする、上記第１項
記載のワクチンを調製する方法。

【０１４７】７、ウマのヘルペスウイルスまたはウマの
ヘルペスウイルスで感染した細胞からの糖タンパク質、
レクチンおよび不活性マトリックス上のそれらのカップ
リング生成物のコンプレックス。

【０１４８】８、ウマのワクチンを調製するための、ウ
マのヘルペスウイルスの分離した糖タンパク質および／
またはＥＨＶ感染細胞または細胞外ＥＨＶウイルスから
のレクチンまたは不活性混合物上のそれらのカップリン
グ生成物との前記糖タンパク質のコンプレックスの使
用。

【０１４９】９、分離しかつレクチンで精製したウマの
ヘルペスウイルスからの糖タンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 エルンスト・ベツチヤー ドイツ連邦共和国デー8000ミユンヘン・オ ーベルレンデルシユトラーセ24

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分離した糖タンパク質および／またはウ
   マのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）感染した細胞および細
   胞外ＥＨＶヴィリオンからのレクチンとの前記糖タンパ
   ク質のコンプレックスを含有することを特徴とする、ウ
   マのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）による感染に対するウ
   マのワクチン。
2. 【請求項２】 工程： ａ）ＥＨＶウイルスを成長させ、 ｂ）感染した細胞または細胞外のウイルスを洗浄剤で処
   理し、 ｃ）このようにして得られたリゼイトをレクチンで処理
   し、 ｄ）レクチン−リガンドのコンプレックスを残りのリゼ
   イトから分離し、 ｅ）適当ならば、レクチン−リガンドのコンプレックス
   を分割し、そして糖タンパク質の混合物を分離し、そし
   て ｆ）引き続いてレクチン−リガンドのコンプレックスお
   よび／または分離した糖タンパク質の混合物を慣用の方
   法で配合する、からなることを特徴とする、請求項１の
   ワクチンを調製する方法。
3. 【請求項３】 ウマのヘルペスウイルスまたはウマのヘ
   ルペスウイルスで感染した細胞からの糖タンパク質、レ
   クチンおよび不活性マトリックス上のそれらのカップリ
   ング生成物のコンプレックス。
4. 【請求項４】 分離しかつレクチンで精製したウマのヘ
   ルペスウイルスからの糖タンパク質。