JPH0560352B2 - - Google Patents
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- JPH0560352B2 JPH0560352B2 JP63049913A JP4991388A JPH0560352B2 JP H0560352 B2 JPH0560352 B2 JP H0560352B2 JP 63049913 A JP63049913 A JP 63049913A JP 4991388 A JP4991388 A JP 4991388A JP H0560352 B2 JPH0560352 B2 JP H0560352B2
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は氷核形成活性（ice nucleating
activity：INA）をもつ微生物の発酵方法に関す
る。 〔従来の技術〕 米国特許第4200228号明細書には雪を製造する
方法が開示されており、この方法によれば空気中
に噴霧される小滴中に微生物が含まれている。使
用されている微生物は氷核形成を促進することが
知られている種類のものである。その結果、通常
の温度より可成り高い温度で雪を製造することが
できる。このプロセスに有用な代表的な微生物は
シユードモナス（Pseudomonas）、更に詳しくは
シユードモナス・シリンゲ（Pseudomonas
syringae）である。 このプロセスをいかなる規模でも使用しようと
すると、多量の微生物を必要とすることは明白で
ある。更に、微生物は、その貯蔵、取扱及び運搬
輸送を容易にするために、乾燥形態で得るのが望
ましい。 氷核形成活性をもつ微生物の生長条件は当業界
で知られている。例えばMaki及びWilloughbyの
Bacteria as Biogenic Sources of Freezing
Nuclei、J.Applied Meteorogy 17、1049〜
1053頁には、シユードモナス・シリンゲのような
微生物を20℃より低い温度、即ち５℃でKoserク
エン酸液体培地（citrate broth）で生長させる
ことが記載されている。 別の文献、即ちKoxloff、Schofield及びLute
のIce Nucleating Activity of Pseudomonas
syringae and Erwinia herbicola、J.Bacter.
153、222〜231頁（1983）には、PHが約7.0のトリ
プトン−酵母エキス−グリセロール培地上で微生
物を生長させている。この文献では、微生物は乾
燥状態では回収されておらず、懸濁液の状態で直
接、活性のテストをしている。この氷核形成活性
は懸濁液中では安定でなく、一夜で活性が低下す
ることが認められている。 前記微生物の大量生産に前記した公知の方法を
用いた場合には所望の氷核形成活性のものは得ら
れない。最初の懸濁液の氷核形成活性が所望の活
性より低くなるばかりでなく、大量の微生物を凍
結乾燥する間に活性の大半が失なわれてしまう。
この結果は、前記方法が商業的な量の微生物を妥
当なコストで製造することのできないプロセスで
あることを示している。 特願昭62−236411号には、氷核形成微生物を製
造するものとして当業界で知られていた方法の改
良が記載されている。この方法ではPHを6.7〜5.5
にコントロールする。PHが約6.7に近づいた時に
酸を添加し、そしてPHが5.5に近づいた時には塩
基を添加する。前記の特願昭62−236411号には、
氷核形成性微生物の発酵方法についての他の改良
も記載されている。例えば、炭素源としてのマン
ニトールと窒素源としての酵母抽出物とを含む好
ましい培地が記載されている。 前記特願昭62−263411号に記載の方法で得られ
るINAは許容できる。例えば、特願昭62−
236411号の例１の記載に従つて生成される発酵器
INAは5.0×1011である（ここで「発酵器INA」
とは、乾燥細胞１ｇ当りの核の数の単位をもつ）。
しかしながら、生産性は望ましい水準に達してい
ない。発酵はかなりの細胞密度18ｇ／に達する
が、完遂には36時間を必要とした。その結果、
「発酵器生産性」（定義は後述）はわずかに2.5×
1011核数／hourでしかなかつた。 特願昭62−323063号には、前記の特願昭62−
236411号記載の方法よりも優れた結果をもたらす
方法が記載されている。その例１では、発酵器
INAは10×1011に増加したが、発酵器生産性は
6.59×1011であつた。これらの結果は、炭素源と
しての糖と、α−ケトグルタレート又はα−ケト
グルタレート生成性アミノ酸とを含む培地を使用
することによつて達成された。 〔発明が解決しようとする課題〕 前記の各特願昭の記載は、従来技術の発酵法を
大きく改良した発酵法をもたらしたが、更に改良
が求められている。より具体的には、発酵法の経
済性を改良するためには発酵器生成性を改良する
必要があつた。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、氷核形成活性をもつ微生物を培地に
おいて発酵させる工程とその微生物を回収する工
程とを含む、氷核形成活性をもつ微生物の発酵方
法の改良を提供する。その改良は、 (1) 前記の微生物を窒素源含有培地において少な
くとも29℃の温度で増殖させる工程、及び (2) 前記の発酵を温度約24℃以下で定常期の間、
続ける工程 を含んでなり、しかも前記の窒素源の濃度が (a) 少なくとも20ｇ／の細胞塊を提供するのに
十分であり、しかも (b) 増殖期の終期においては、後の定常期におけ
る氷核形成活性の形成を阻害するには不充分な
窒素源しか残留しないようにするには充分な程
度に低いものであることを特徴としている。 前記から明らかなとおり、本発明には２つの本
質的な特徴がある。第１は増殖期における窒素源
の濃度であり、そして第２は増殖期及び定常期の
間の温度である。これらの特徴は、高INAを得
ると同時に高い発酵器生産性を提供するためには
必要である。例えば、前記の特願昭62−323063号
の例１の細胞密度はわずか14.5ｇ／であつた。
仮に、細胞増殖を改良するために栄養素濃度を増
加させ、そして温度を上げて維持すると、INA
が激しく低下した。同様に、栄養素濃度を調整せ
ずに、温度を調整したとすると（このようにする
ことは、前記の特願昭62−323063号には示唆され
ていないが）、得られる生産性は劣つたものであ
つた。 窒素源の初期濃度は、増殖期の間の発酵温度に
関連する。少なくとも20ｇ／の細胞塊を最終的
に提供するのに充分な窒素源が存在する。しかし
ながら、多くなり過ぎて、阻害量の窒素源が増殖
期の終了後に残留してはならない。これらの量は
温度と関連がある。なぜなら、温度が上昇する
と、細胞塊の可能性も上昇（ある点まで）し、そ
して窒素源も相当に増加させる必要がある。微生
物に対する最適増殖温度を超えると、増殖の可能
性が低下し、そして窒素源はそれに従つて減少さ
せる必要がある。 30℃におけるシユードモナス・シリンゲの代表
的な増殖期では、窒素源の初期濃度は約45ｇ／
〔グルタミン酸モノナトリウム（MSG）を基準と
する〕であり、これによつて増殖期の終点では細
胞塊約24ｇ／が生成される。MSGはほとんど
残留しない。33℃では、この微生物の最適増殖温
度を越えており、濃度を例えば約40ｇ／のよう
にわずかに低下させる。 増殖期の最後に残留する窒素源の量は、通常の
方法を用いて測定することができる。使用する的
確な方法は窒素源の性質に依存する。MSGが窒
素源である場合には、当業界で知られている
OPA−メルカプトエタノール蛍光誘導体を用い
るHPLC法によつて、それを培地中で測定するこ
とができる。 前記の基準では、先に使用した濃度よりも若干
高い初期濃度をもたらす点に注意されたい。例え
ば、30℃において、MSG濃度は45ｇ／であり、
これは細胞密度24ｇ／を生成する。これに対し
て、前記特願昭62−323063号の例１におけるＬ−
グルタミン酸の初期濃度は、増殖温度24℃におい
て20ｇ／であつた。 本発明によれば、窒素源は、増殖期の終期にお
いては、後の定常期における氷核形成活性の形成
を阻害するには不充分な窒素源しか残留しないよ
うにするのに充分な程度に低いものである。すな
わち、これよりも多い量を使用するとINAは約
60％以上低下する。実験を数回実施すれば、正確
な量を決定することができる。これは、この時点
で発酵培地中に20ｇ／未満が残留するのが好ま
しく、５ｇ／未満残留するのが特に好ましいこ
とを意味する。 本発明の微生物及びその他の微生物の発酵にお
いては、微生物が急速に増加する増殖期と呼ばれ
る時期がある。この時期は、当業界において「対
数期」又は「対数増殖期」としても知られてい
る。この時期に、生長培地の光学密度の対数を時
間に対してプロツトすると直線が得られる。この
時期の終点において、前記の線の傾斜は劇的に低
下する。これは微生物がもはや増殖しないこと、
すなわち定常期に入つたことを示している。これ
らの２つの期間の間には短期の遷移状態がある。
例えば、22時間続く代表的な発酵では、遷移状態
はわずかに１時間だけ続くことがある。本明細書
において「増殖期の終期」とは、前記の直接部分
の終りのあたりから短期の遷移期間のいずれをも
含むものとする。 良好な増殖を促進するには、増殖期における温
度を約29℃以上にする。本発明方法では、それよ
りも高い温度を使用することができるが、約35℃
よりも高い温度は必要ない。本発明で使用する好
ましい微生物すなわちシユードモナス・シリンゲ
においては、33℃より高い温度は増殖を低下させ
る。それよりも低い温度において非常に高い細胞
密度を得ることができる。増殖期における現在の
ところ好ましい温度は約30℃である。 我々が見出したところによれば、INAは発酵
の定常期において主に生成される。更に、この定
常期においては、生成されるINAの量を有意に
するために、温度を24℃以下に下げることが必要
である。温度を24℃よりも低くすることができる
が、約21℃よりも低い温度ではINAの改良はほ
とんど観察されない。従つて、定常期における現
在のところ好ましい温度は21℃である。 本発明を実施する際には任意の通常の培地を用
いることができるが、前記の特願昭62−323063号
に記載の培地が現在のところ好ましい培地であ
る。この培地は２つの必須成分すなわち糖及びα
−ケトグルタレート又はα−ケトグルタレート生
成性アミノ酸からなる。有用な糖としてはグルコ
ース（又は粗グルコース例えばデキストロース）、
シユークロース、フラクトース、エリスロース、
マンノース、キシロース及びリボースが含まれ
る。市販されているこれらの糖源を便利に使用す
ることができる。これらの糖源としては、液状シ
ユークロース、高フルクトースコーンシロツプ及
びデキストロースコーンシロツプが含まれる。こ
れらの糖の混合物を使用することもできる。これ
らの糖と組み合せて他の炭素源例えばマンニトー
ル及び他の糖誘導体を使用することができる。 他の必須の成分はα−ケトグルタレート又はα
−ケトグルタレート生成性アミノ酸である。生物
学的工程でα−ケトグルタレートを生成するアミ
ノ酸はアルギニン、ヒスチジン、グルタミン、グ
ルタミン酸及びプロリンである。これらの酸の塩
例えばグルタミン酸モノナトリウム（MSG）も
有用である。これらのアミノ酸からα−ケトグル
タレートを製造することに関する記載は、
Biochem−istry、第２版、Lehninger、Worth
（1975）574頁以後にある。これらの化合物の混合
物も使用することができる。 前記の培地が、リン酸塩例えばリン酸カリウム
を含有することも好ましい。リン酸塩の有用な初
期濃度範囲は、0.2〜６ｇ／、好ましくは0.6〜
３ｇ／である。好ましい態様においては、増殖
期の終点においてほとんど残留しない（例えば１
ｇ／未満）ように初期ホスフエート濃度を選択
する。 前記の培地は、好ましくは他の成分を含有す
る。前記の微生物の発酵用として当業界で知られ
ているように、硫酸マグネシウムが好ましい。更
に、前記の培地が痕跡量の金属を含有することが
望ましい。痕跡量の鉄及び亜鉛が特に有効であ
る。 増殖期温度が30℃である発酵に使用するには、
以下の培地が好ましい。 シユークロース 90ｇ／ MSG 90ｇ／ 硫酸マグネシウム ４ｇ／ リン酸カリウム 2.75ｇ／ 硫酸鉄 0.112ｇ／ 硫酸亜鉛 0.0024ｇ／ 発酵の間では、前記特願昭62−236411号に記載
されているとおり、PHを制御するのが望ましい。
温度は19℃〜25℃が好ましい。 本発明によれば、氷核形成活性をもつ任意の微
生物を製造することができる。適当な微生物とし
ては、P.シリンゲ（syringae）及びP.フルオール
センズ（fluorscens）、P.コロナフアシエンズ
（coronafaciens）及びP.ピシ（pisi）などのシユ
ードモナス（Pseudomonas）属の微生物を例示
することができる。本発明において使用するのに
有用な他の微生物としては、例えばエルウイナ・
ヘルビコラ（Erwina herbicola）を挙げること
ができる。現在のところ好ましい微生物はP.シリ
ンゲ（syringae）ATCC No.53543〔ブタペスト条
約に従つて米国メリーランド州のロツクビルの
ATCC（American Type Culture Collection）
に1986年９月23日に寄託〕である。 前記の発酵法で製造される微生物は種々の方法
で乾燥させることができる。典型的な例は、スプ
レー乾燥及び凍結乾燥である。いずれの乾燥方法
もINAを或る程度低下させる。発酵器中で生成
される大量のINAを保存する或る好ましい方法
は、米国特許第4706463号明細書（1987年11月17
日発行）に記載の方法であるこの方法では、培地
を冷却し、濃縮し、そして超低温液体中に流して
ペレツトを形成し、そしてこれらのペレツトを次
に比較的低温で凍結乾燥する。 以下の実施例においては、INAは慣用技術を
用いて計算した。INAは複数個の微生物を含む
水滴（10μ）をパラフイン被覆アルミ箔上に置
きこれを−５℃の恒温浴中に入れることによつて
求めた。この方法の詳細は、例えば文献Vali、
Quantitative Evaluation of Experimental
Results on the Hererogenaus Freezing of
Supercooled Liquids、J.Atoms Sci.、28402〜
409頁（1971年）に記載されている。以下の実施
例で報告したINAは、乾燥微生物１ｇ当りの氷
核形成部位の数である。本発明の目的に対して、
乾燥することなく発酵器から直接サンプリングし
たサンプルを用いてINAを測定した。従つて、
これを「発酵器INA」と称する。その単位は、
乾燥微生物１ｇ当りの核の数である。INAの測
定を間隔を置いてしばしば行うことにより、最適
のINA生産を決めることができる。 以下の表に示す発酵器生産性は、発酵器INA
に細胞塊を剰じ、10％種の接種から開始した発酵
時間で除したものと定義される。単位は、・時
間当りの核数である。 〔実施例〕 以下、実施例によつて本発明を具体的に説明す
る。 種の培養 前記の発酵培地５を含有する14発酵中に、
シユードモナス・シリンゲ（P.syringae）ATCC
No.53543の試料4.5mlを装入した。温度を30℃に
維持した。PHが6.6に近づいた場合には硫酸を加
えた。この種（シード）発酵器中での発酵は21時
間続けた。 例 １〜３ 本発明を説明するために一連の発酵を実施し
た。 核発酵において、種培養体の0.5試料を、同
じ成分の培地4.5を含有する別の14発酵器に
移した。特に断らない限り、成分の濃度は同じで
ある。温度は、発酵の間、表に示すようにコント
ロールした。表中において、第１の温度は増殖期
における温度であり、第２の温度は定常期におけ
る温度である。温度が１つの場合には、発酵の間
に温度変化がなかつたことを示す。培地試料を増
殖期の終点で採取し、MSG含量を分析した。結
果を表中「窒素含量」として示す。PHが6.6にな
つたら硫酸を添加し、PHが5.6になつたら水酸化
ナトリウムを添加した。溶解酸素は10％飽和より
上に維持した。すべての発酵は22時間行つた。発
泡抑制剤は発泡をコントロールするのに必要な場
合に添加した。結果を以下の表に示す。 【表】 【表】 〔発明の効果〕 本発明は、氷核形成活性の高い生産性を提供す
るものである。
activity：INA）をもつ微生物の発酵方法に関す
る。 〔従来の技術〕 米国特許第4200228号明細書には雪を製造する
方法が開示されており、この方法によれば空気中
に噴霧される小滴中に微生物が含まれている。使
用されている微生物は氷核形成を促進することが
知られている種類のものである。その結果、通常
の温度より可成り高い温度で雪を製造することが
できる。このプロセスに有用な代表的な微生物は
シユードモナス（Pseudomonas）、更に詳しくは
シユードモナス・シリンゲ（Pseudomonas
syringae）である。 このプロセスをいかなる規模でも使用しようと
すると、多量の微生物を必要とすることは明白で
ある。更に、微生物は、その貯蔵、取扱及び運搬
輸送を容易にするために、乾燥形態で得るのが望
ましい。 氷核形成活性をもつ微生物の生長条件は当業界
で知られている。例えばMaki及びWilloughbyの
Bacteria as Biogenic Sources of Freezing
Nuclei、J.Applied Meteorogy 17、1049〜
1053頁には、シユードモナス・シリンゲのような
微生物を20℃より低い温度、即ち５℃でKoserク
エン酸液体培地（citrate broth）で生長させる
ことが記載されている。 別の文献、即ちKoxloff、Schofield及びLute
のIce Nucleating Activity of Pseudomonas
syringae and Erwinia herbicola、J.Bacter.
153、222〜231頁（1983）には、PHが約7.0のトリ
プトン−酵母エキス−グリセロール培地上で微生
物を生長させている。この文献では、微生物は乾
燥状態では回収されておらず、懸濁液の状態で直
接、活性のテストをしている。この氷核形成活性
は懸濁液中では安定でなく、一夜で活性が低下す
ることが認められている。 前記微生物の大量生産に前記した公知の方法を
用いた場合には所望の氷核形成活性のものは得ら
れない。最初の懸濁液の氷核形成活性が所望の活
性より低くなるばかりでなく、大量の微生物を凍
結乾燥する間に活性の大半が失なわれてしまう。
この結果は、前記方法が商業的な量の微生物を妥
当なコストで製造することのできないプロセスで
あることを示している。 特願昭62−236411号には、氷核形成微生物を製
造するものとして当業界で知られていた方法の改
良が記載されている。この方法ではPHを6.7〜5.5
にコントロールする。PHが約6.7に近づいた時に
酸を添加し、そしてPHが5.5に近づいた時には塩
基を添加する。前記の特願昭62−236411号には、
氷核形成性微生物の発酵方法についての他の改良
も記載されている。例えば、炭素源としてのマン
ニトールと窒素源としての酵母抽出物とを含む好
ましい培地が記載されている。 前記特願昭62−263411号に記載の方法で得られ
るINAは許容できる。例えば、特願昭62−
236411号の例１の記載に従つて生成される発酵器
INAは5.0×1011である（ここで「発酵器INA」
とは、乾燥細胞１ｇ当りの核の数の単位をもつ）。
しかしながら、生産性は望ましい水準に達してい
ない。発酵はかなりの細胞密度18ｇ／に達する
が、完遂には36時間を必要とした。その結果、
「発酵器生産性」（定義は後述）はわずかに2.5×
1011核数／hourでしかなかつた。 特願昭62−323063号には、前記の特願昭62−
236411号記載の方法よりも優れた結果をもたらす
方法が記載されている。その例１では、発酵器
INAは10×1011に増加したが、発酵器生産性は
6.59×1011であつた。これらの結果は、炭素源と
しての糖と、α−ケトグルタレート又はα−ケト
グルタレート生成性アミノ酸とを含む培地を使用
することによつて達成された。 〔発明が解決しようとする課題〕 前記の各特願昭の記載は、従来技術の発酵法を
大きく改良した発酵法をもたらしたが、更に改良
が求められている。より具体的には、発酵法の経
済性を改良するためには発酵器生成性を改良する
必要があつた。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、氷核形成活性をもつ微生物を培地に
おいて発酵させる工程とその微生物を回収する工
程とを含む、氷核形成活性をもつ微生物の発酵方
法の改良を提供する。その改良は、 (1) 前記の微生物を窒素源含有培地において少な
くとも29℃の温度で増殖させる工程、及び (2) 前記の発酵を温度約24℃以下で定常期の間、
続ける工程 を含んでなり、しかも前記の窒素源の濃度が (a) 少なくとも20ｇ／の細胞塊を提供するのに
十分であり、しかも (b) 増殖期の終期においては、後の定常期におけ
る氷核形成活性の形成を阻害するには不充分な
窒素源しか残留しないようにするには充分な程
度に低いものであることを特徴としている。 前記から明らかなとおり、本発明には２つの本
質的な特徴がある。第１は増殖期における窒素源
の濃度であり、そして第２は増殖期及び定常期の
間の温度である。これらの特徴は、高INAを得
ると同時に高い発酵器生産性を提供するためには
必要である。例えば、前記の特願昭62−323063号
の例１の細胞密度はわずか14.5ｇ／であつた。
仮に、細胞増殖を改良するために栄養素濃度を増
加させ、そして温度を上げて維持すると、INA
が激しく低下した。同様に、栄養素濃度を調整せ
ずに、温度を調整したとすると（このようにする
ことは、前記の特願昭62−323063号には示唆され
ていないが）、得られる生産性は劣つたものであ
つた。 窒素源の初期濃度は、増殖期の間の発酵温度に
関連する。少なくとも20ｇ／の細胞塊を最終的
に提供するのに充分な窒素源が存在する。しかし
ながら、多くなり過ぎて、阻害量の窒素源が増殖
期の終了後に残留してはならない。これらの量は
温度と関連がある。なぜなら、温度が上昇する
と、細胞塊の可能性も上昇（ある点まで）し、そ
して窒素源も相当に増加させる必要がある。微生
物に対する最適増殖温度を超えると、増殖の可能
性が低下し、そして窒素源はそれに従つて減少さ
せる必要がある。 30℃におけるシユードモナス・シリンゲの代表
的な増殖期では、窒素源の初期濃度は約45ｇ／
〔グルタミン酸モノナトリウム（MSG）を基準と
する〕であり、これによつて増殖期の終点では細
胞塊約24ｇ／が生成される。MSGはほとんど
残留しない。33℃では、この微生物の最適増殖温
度を越えており、濃度を例えば約40ｇ／のよう
にわずかに低下させる。 増殖期の最後に残留する窒素源の量は、通常の
方法を用いて測定することができる。使用する的
確な方法は窒素源の性質に依存する。MSGが窒
素源である場合には、当業界で知られている
OPA−メルカプトエタノール蛍光誘導体を用い
るHPLC法によつて、それを培地中で測定するこ
とができる。 前記の基準では、先に使用した濃度よりも若干
高い初期濃度をもたらす点に注意されたい。例え
ば、30℃において、MSG濃度は45ｇ／であり、
これは細胞密度24ｇ／を生成する。これに対し
て、前記特願昭62−323063号の例１におけるＬ−
グルタミン酸の初期濃度は、増殖温度24℃におい
て20ｇ／であつた。 本発明によれば、窒素源は、増殖期の終期にお
いては、後の定常期における氷核形成活性の形成
を阻害するには不充分な窒素源しか残留しないよ
うにするのに充分な程度に低いものである。すな
わち、これよりも多い量を使用するとINAは約
60％以上低下する。実験を数回実施すれば、正確
な量を決定することができる。これは、この時点
で発酵培地中に20ｇ／未満が残留するのが好ま
しく、５ｇ／未満残留するのが特に好ましいこ
とを意味する。 本発明の微生物及びその他の微生物の発酵にお
いては、微生物が急速に増加する増殖期と呼ばれ
る時期がある。この時期は、当業界において「対
数期」又は「対数増殖期」としても知られてい
る。この時期に、生長培地の光学密度の対数を時
間に対してプロツトすると直線が得られる。この
時期の終点において、前記の線の傾斜は劇的に低
下する。これは微生物がもはや増殖しないこと、
すなわち定常期に入つたことを示している。これ
らの２つの期間の間には短期の遷移状態がある。
例えば、22時間続く代表的な発酵では、遷移状態
はわずかに１時間だけ続くことがある。本明細書
において「増殖期の終期」とは、前記の直接部分
の終りのあたりから短期の遷移期間のいずれをも
含むものとする。 良好な増殖を促進するには、増殖期における温
度を約29℃以上にする。本発明方法では、それよ
りも高い温度を使用することができるが、約35℃
よりも高い温度は必要ない。本発明で使用する好
ましい微生物すなわちシユードモナス・シリンゲ
においては、33℃より高い温度は増殖を低下させ
る。それよりも低い温度において非常に高い細胞
密度を得ることができる。増殖期における現在の
ところ好ましい温度は約30℃である。 我々が見出したところによれば、INAは発酵
の定常期において主に生成される。更に、この定
常期においては、生成されるINAの量を有意に
するために、温度を24℃以下に下げることが必要
である。温度を24℃よりも低くすることができる
が、約21℃よりも低い温度ではINAの改良はほ
とんど観察されない。従つて、定常期における現
在のところ好ましい温度は21℃である。 本発明を実施する際には任意の通常の培地を用
いることができるが、前記の特願昭62−323063号
に記載の培地が現在のところ好ましい培地であ
る。この培地は２つの必須成分すなわち糖及びα
−ケトグルタレート又はα−ケトグルタレート生
成性アミノ酸からなる。有用な糖としてはグルコ
ース（又は粗グルコース例えばデキストロース）、
シユークロース、フラクトース、エリスロース、
マンノース、キシロース及びリボースが含まれ
る。市販されているこれらの糖源を便利に使用す
ることができる。これらの糖源としては、液状シ
ユークロース、高フルクトースコーンシロツプ及
びデキストロースコーンシロツプが含まれる。こ
れらの糖の混合物を使用することもできる。これ
らの糖と組み合せて他の炭素源例えばマンニトー
ル及び他の糖誘導体を使用することができる。 他の必須の成分はα−ケトグルタレート又はα
−ケトグルタレート生成性アミノ酸である。生物
学的工程でα−ケトグルタレートを生成するアミ
ノ酸はアルギニン、ヒスチジン、グルタミン、グ
ルタミン酸及びプロリンである。これらの酸の塩
例えばグルタミン酸モノナトリウム（MSG）も
有用である。これらのアミノ酸からα−ケトグル
タレートを製造することに関する記載は、
Biochem−istry、第２版、Lehninger、Worth
（1975）574頁以後にある。これらの化合物の混合
物も使用することができる。 前記の培地が、リン酸塩例えばリン酸カリウム
を含有することも好ましい。リン酸塩の有用な初
期濃度範囲は、0.2〜６ｇ／、好ましくは0.6〜
３ｇ／である。好ましい態様においては、増殖
期の終点においてほとんど残留しない（例えば１
ｇ／未満）ように初期ホスフエート濃度を選択
する。 前記の培地は、好ましくは他の成分を含有す
る。前記の微生物の発酵用として当業界で知られ
ているように、硫酸マグネシウムが好ましい。更
に、前記の培地が痕跡量の金属を含有することが
望ましい。痕跡量の鉄及び亜鉛が特に有効であ
る。 増殖期温度が30℃である発酵に使用するには、
以下の培地が好ましい。 シユークロース 90ｇ／ MSG 90ｇ／ 硫酸マグネシウム ４ｇ／ リン酸カリウム 2.75ｇ／ 硫酸鉄 0.112ｇ／ 硫酸亜鉛 0.0024ｇ／ 発酵の間では、前記特願昭62−236411号に記載
されているとおり、PHを制御するのが望ましい。
温度は19℃〜25℃が好ましい。 本発明によれば、氷核形成活性をもつ任意の微
生物を製造することができる。適当な微生物とし
ては、P.シリンゲ（syringae）及びP.フルオール
センズ（fluorscens）、P.コロナフアシエンズ
（coronafaciens）及びP.ピシ（pisi）などのシユ
ードモナス（Pseudomonas）属の微生物を例示
することができる。本発明において使用するのに
有用な他の微生物としては、例えばエルウイナ・
ヘルビコラ（Erwina herbicola）を挙げること
ができる。現在のところ好ましい微生物はP.シリ
ンゲ（syringae）ATCC No.53543〔ブタペスト条
約に従つて米国メリーランド州のロツクビルの
ATCC（American Type Culture Collection）
に1986年９月23日に寄託〕である。 前記の発酵法で製造される微生物は種々の方法
で乾燥させることができる。典型的な例は、スプ
レー乾燥及び凍結乾燥である。いずれの乾燥方法
もINAを或る程度低下させる。発酵器中で生成
される大量のINAを保存する或る好ましい方法
は、米国特許第4706463号明細書（1987年11月17
日発行）に記載の方法であるこの方法では、培地
を冷却し、濃縮し、そして超低温液体中に流して
ペレツトを形成し、そしてこれらのペレツトを次
に比較的低温で凍結乾燥する。 以下の実施例においては、INAは慣用技術を
用いて計算した。INAは複数個の微生物を含む
水滴（10μ）をパラフイン被覆アルミ箔上に置
きこれを−５℃の恒温浴中に入れることによつて
求めた。この方法の詳細は、例えば文献Vali、
Quantitative Evaluation of Experimental
Results on the Hererogenaus Freezing of
Supercooled Liquids、J.Atoms Sci.、28402〜
409頁（1971年）に記載されている。以下の実施
例で報告したINAは、乾燥微生物１ｇ当りの氷
核形成部位の数である。本発明の目的に対して、
乾燥することなく発酵器から直接サンプリングし
たサンプルを用いてINAを測定した。従つて、
これを「発酵器INA」と称する。その単位は、
乾燥微生物１ｇ当りの核の数である。INAの測
定を間隔を置いてしばしば行うことにより、最適
のINA生産を決めることができる。 以下の表に示す発酵器生産性は、発酵器INA
に細胞塊を剰じ、10％種の接種から開始した発酵
時間で除したものと定義される。単位は、・時
間当りの核数である。 〔実施例〕 以下、実施例によつて本発明を具体的に説明す
る。 種の培養 前記の発酵培地５を含有する14発酵中に、
シユードモナス・シリンゲ（P.syringae）ATCC
No.53543の試料4.5mlを装入した。温度を30℃に
維持した。PHが6.6に近づいた場合には硫酸を加
えた。この種（シード）発酵器中での発酵は21時
間続けた。 例 １〜３ 本発明を説明するために一連の発酵を実施し
た。 核発酵において、種培養体の0.5試料を、同
じ成分の培地4.5を含有する別の14発酵器に
移した。特に断らない限り、成分の濃度は同じで
ある。温度は、発酵の間、表に示すようにコント
ロールした。表中において、第１の温度は増殖期
における温度であり、第２の温度は定常期におけ
る温度である。温度が１つの場合には、発酵の間
に温度変化がなかつたことを示す。培地試料を増
殖期の終点で採取し、MSG含量を分析した。結
果を表中「窒素含量」として示す。PHが6.6にな
つたら硫酸を添加し、PHが5.6になつたら水酸化
ナトリウムを添加した。溶解酸素は10％飽和より
上に維持した。すべての発酵は22時間行つた。発
泡抑制剤は発泡をコントロールするのに必要な場
合に添加した。結果を以下の表に示す。 【表】 【表】 〔発明の効果〕 本発明は、氷核形成活性の高い生産性を提供す
るものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 氷核形成活性をもつ微生物を培地において発
酵させる工程とその微生物を回収する工程とを含
む、氷核形成活性をもつ微生物の発酵方法におい
て、 (1) 前記の微生物を窒素源含有培地において少な
くとも29℃の温度で増殖させる工程、及び (2) 前記の発酵を温度約24℃以下で定常期の間、
続ける工程 を含んでなり、しかも前記の窒素源の濃度が (a) 少なくとも20ｇ／の細胞塊を提供するのに
十分であり、しかも (b) 増殖期の終期においては、後の定常期におけ
る氷核形成活性の形成を阻害するには不充分な
窒素源しか残留しないようにするのに充分な程
度に低いものであることを特徴とする、氷核形
成活性をもつ微生物の発酵方法。
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