JPH0560917B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規プラスミドDNA、該プラスミ
ドDNAを保有する微生物、該微生物を用いる蛋
白質の製造法、及びそれによつて得られる新規蛋
白質に関する。

更に詳細には、本発明は、マルトペンタオース
生成酵素遺伝子情報を担うDNA、該DNAを組み
込んだ新規プラスミド、該プラスミドを導入した
新規な微生物、該微生物を用いてマルトペンタオ
ース生成酵素を製造する方法、並びに、それによ
つて得られる新規マルトペンタオース生成酵素に
関するものである。

（従来の技術） マルトペンタオース生成酵素は、1986年
Okamoto等によつてシユードモナス．エスピー
（Pseudomonas.sp）の培養液中に初めて発見さ
れたものであつて、澱粉類からマルトペンタオー
スを効率よく生成する酵素である（特公昭61−
49955）。

本酵素を澱粉に作用させて得られるマルトペン
タオースは、アミラーゼ活性測定用試薬として、
臨床試験、バイオアツセイ用試薬、分析試薬の分
野で重用されるのみでなく、機能性食品素材とし
ても非常に重要であつて食品の分野でも重用され
るものである。

したがつて、マルトペンタオースの需要は高ま
り、大量生産が強く望まれているのが当業界の現
状である。

そして当業界における上記ニーズに対応してマ
ルトペンタオースを大量に製造するには、それを
生成する酵素つまりマルトペンタオース生成酵素
が大量に必要となつてくる。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来の微生物による方法では、
シユードモナス属菌をはじめ各種の微生物をスク
リーニングしたけれども、いずれもマルトペンタ
オース生成酵素の産生量は低く、業界のニーズに
は到底応えられないものである。

（問題点を解決するための手段） そこでマルトペンタオース生成酵素の有利な製
造方法を開発するために各方面から検討を行い、
遺伝子工学による方法が最も適当であるとの知見
を得た。

そして本発明は、更に研究を行つてなされたも
のであつて、マルトペンタオース生成酵素をコー
ドする遺伝子を含むDNA、さらに、マルトペン
タオース生成酵素遺伝子を種々のベクターに組み
込んで宿主微生物に導入した新規組換え体微生物
及び新規に創製された新規組換え体微生物を培養
しマルトペンタオース生成酵素を製造する方法を
開発する目的でなされたものである。

本発明者らは、上記の目的を達成するため、マ
ルトペンタオース生成酵素生産菌より、マルトペ
ンタオース生成酵素遺伝子をクローン化した。さ
らに該遺伝子を種々のベクターに組み込んで宿主
微生物に導入し、得られた組換え体微生物を培養
することによりマルトペンタオース生成酵素を産
生させることに成功し、そしてまた、得られた酵
素が従来より知られていた酵素とは異なり新規な
酵素であることも確認し、本発明を完成した。

以下に、本発明を具体的に説明する。

(1) マルトペンタオース生成酵素遺伝子のクロー
ン化 マルトペンタオース生成酵素産生能を有する
供与体微生物よりその微生物のDNAを分離精
製した後、例えば、超音波、制限酵素などで切
断し、得られたDNA断片と、同様にしてベク
ターを切断して得られたベクター断片とを、例
えば、DNAリガーゼ等により結合させ、マル
トペンタオース生成酵素遺伝子を含む組換え
DNAを形成する。

また、マルトペンタオース生成酵素生産能を
遺伝子組換えにより導入した形質転換微生物を
供与体微生物として利用することもできる。

供与体微生物としては、マルトペンタオース
生成酵素産生能を有する微生物が広く使用でき
る。そのような微生物としては例えばシユード
モナス属細菌が使用され、具体的にはシユード
モナスエスピーKO8940株（FERM Ｐ−7456）
等が例示されるがこれのみに限定されるもので
はない。

供与体微生物由来のDNAは、供与体微生物
を、例えば、液体培地で約１〜３日間通気撹拌
培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによつて調製
することができる。溶菌方法は、例えば、リゾ
チームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波処理などが用いられる。
また、必要によりプロテアーゼ、リボヌクレア
ーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウ
ムなどの界面活性剤が併用される。また凍結融
解処理を施すこともある。このようにして得ら
れる溶菌物からDNAを分離、精製するには、
常法にしたがつて、例えばフエノール抽出、除
蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアー
ゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法
を適宜組み合わせることによつて行うことがで
きる。

DNAを切断する方法は、例えば、超音波処
理、制限酵素処理などにより行うことができ
る。切断後、必要に応じてホスフアターゼや
DNAポリメラーゼ等の修飾酵素が用いられる。
また種々のリンカーやアダプターを用いること
によりDNA断片末端の塩基配列を変えること
ができる。

切断されたDNA断片から、蔗糖密度勾配遠
心法や電気泳動したゲルからの抽出等によつて
最適な長さの断片のみが得られる。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増
殖し得るフアージまたはプラスミドが適してい
る。

フアージとしては、既知のものが適宜使用で
き、例えば、エシエリヒア コリ
（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合
には、λフアージやM13フアージなどが使用出
来る。

また、プラスミドとしては、例えば、エシエ
リヒア コリを宿主微生物とする場合には、
pBR322、PUC18やそれらの派生体、例えば
pBR−AN3などが使用できる。更に、例えば、
エシエリヒア コリ、バチルス ズブチリスな
どの二種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能
な、例えば、pHY300PLK、YIp5、YEp13な
どのベクターのほか、各種の既知のシヤトルベ
クターを利用することも可能である。このよう
なベクターを、先に述べたDNAと同様に制限
酵素などで切断し、ベクター断片を得る。

DNA断片とベクター断片とを結合させる方
法は、公知のDNAリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば、DNA断片とベクター断片
とをアニーリングの後、生体外で適当なDNA
リガーゼの作用により組換えDNAを作成する。
必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に
導入して、生体内のDNAリガーゼを利用して
組換えDNAにすることもできる。

宿主微生物としては、組換えDNAが安定か
つ自律的増殖が可能でその形質発現のできるも
のであればどのようなものでもよい。

宿主微生物に組換えDNAを導入する方法は、
公知の方法、例えば、宿主微生物がエシエリヒ
アコリの場合にはカルシウム法（Lederberg、
E.M.and Cohen、S.N.、J.Bacteriol.、119、
1072、（1974））などを採用することができる。

λフアージDNAであれば、イン ビトロ
パツケイジング法（Horn、B.、Methods in
Enzymology、68、299（1979））によりλフア
ージ粒子を形成し、このλフアージ粒子をエシ
エリヒアコリの培養菌懸濁液に添加して、マル
トペンタオース生成酵素生産能を保有する特殊
形質導入フアージを得ることができる。

組換えDNAが導入された形質転換微生物の
選択方法は、常法によつて行い、例えば液体選
択培地で培養し、培養液中のマルトペンタオー
ス生成酵素活性を測定する。液体選択培地には
ベクター上のマーカーによつて、最小培地や、
抗生物質添加培地が適宜用いられる。

酵素活性の測定は、培養液に澱粉溶液を加
え、45℃で保温した後、薄層クロマトグラフイ
ーや高速液体クロマトグラフイーを用いて生成
されたマルトペンタオースの同定や定量が行な
われる。

得られたマルトペンタオース生成酵素生産菌
を液体選択培地にて37℃で培養し、公知の方
法、例えばアルカリ抽出法（Birnboim、H.C.
and Doly、J.、Nucleic Acids Res.、７、
1513（1979））によつてプラスミドを得ることが
できる。

マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む組
換えDNAは、上記の方法で、適宜制限酵素で
切断し、他のベクターに組み込んだり、他の宿
主に導入することができる。

(2) マルトペンタオース生成酵素の調製 マルトペンタオース生成酵素は次のようにし
て調製することができる。マルトペンタオース
生成酵素生産菌、あるいは上記の方法によつて
マルトペンタオース生成酵素生産能を獲得した
形質転換微生物を液体培養する。培地として
は、該微生物の通常の培養に用いられるもので
あればいずれでもよいが、例えば、炭素源とし
ては澱粉、液化澱粉、グルコース、グリセリ
ン、糖蜜、廃糖蜜などがあり、窒素源としては
各種蛋白分解物、大豆粉、肉エキス、ペプト
ン、尿素、硝酸塩、アンモニウム塩、酵母エキ
ス、コーンステイープリカーなどがある。その
他ビオチンなどの栄養素や微量金属などが適宜
使用される。

培養後、酵素が菌体内にある場合には、培養
液を遠心分離して菌体を得、超音波や細胞壁溶
解酵素等で処理し、破砕菌体を遠心分離して除
き、粗酵素液とする。また、酵素が培地中にあ
る場合には、培養液を遠心分離して菌体を除
き、以後の精製を行なう。

得られた粗酵素液から、塩析、透析、イオン
交換樹脂、アフイニテイクロマトグラフ処理等
一般的酵素精製法によりマルトペンタオース生
成酵素を単離することができる。

このようにして得た精製酵素を用いて、本酵
素の性質を検討した結果、特に分子量が65000
（SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳
動）、至適PHが6.0、至適温度が37〜45℃におい
て特徴的である。

このような性質を有する酵素は既知のマルトペ
ンタオース生成酵素には見当らず、したがつて本
酵素は従来未知の新規酵素と認定した。

次に本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例 １ マルトペンタオース生成酵素遺伝子のクローン
化 シユードモナス・エスピー（Pseudomonas.
sp）KO−8940（FERM Ｐ−7456）を可溶性澱粉
を含む液体培地（可溶性澱粉１ｇ、ポリペプトン
１ｇ、肉エキス0.3ｇ、酵母エキス0.2ｇ、塩化ナ
トリウム0.3ｇ、水100ml、PH7.5）で40℃で６時
間培養し、遠心分離にて集菌、洗浄し、得られた
菌からSaito、Miuraの方法（Saito、H.and
Miura、K.、Biochim.Biophys.Acta、70、619
（1963））によつて染色体DNAを分離し、これを
トリス塩酸・EDTA緩衝液に溶解し、制限酵素
Sau3AI（宝酒造社製）を添加して、37℃で部分分
解した後、分解物から蔗糖密度勾配超遠心法で約
2Kb以上の染色体DNA断片を分離、取得した。

ベクターにはフアージλL47（アマーシヤム社
製）を用い、Bam HI（宝酒造社製）切断した
λL47 DNAと前記のシユードモナス．エスピー
KO−8940株から得られた約2Kb以上の染色体
DNA断片を混合し、T4DNAリガーゼ（宝酒造
社製）を添加して連結処理した（Weiss、B.、
Sablon、A.J.、Live、T.R.、Fareed、G.C.and
Richardson、C.C.J.Biol.Chem.、243、4543
（1968））。処理液を、イン ビトロ パツケイジ
ング キツト（宝酒造社製）に添加してイン ビ
トロ パツケイジング法（Horn、B.、Methods
in Enzymology、68、299、（1979））により当該
DNAをフアージ粒子に導入した。このフアージ
粒子をエシエリヒア コリWL95の菌体懸濁液に
添加し、１％可溶性澱粉、1.2％の寒天を含むλ
培地（バクトトリプトン10ｇ、塩化ナトリウム
2.5ｇ、水１）に添加して、37℃で培養し、出
現したプラーク、ヨウ素反応を起こさなかつたフ
アージをマルトペンタオース生成酵素生産フアー
ジとして分離することができた。

得られたマルトペンタオース生成酵素生成フア
ージを単離し、これをエシエリヒア コリWL66
株とともにλ培地で37℃で培養した。培養液を遠
心分離して宿主菌体を除き、ポリエチレングリコ
ールを加えてフアージ粒子を凝集させたのち、遠
心分離によつてフアージ粒子を集め、新規なフア
ージを得た。このフアージをλOS501と名づけた。
このフアージ粒子を、50％ホルムアミドを含むフ
アージ懸濁用緩衝液に対して透析し、λOS501フ
アージDNAを得た。フアージλOS501DNAは
46.0Kbの大きさで、そのフイジカルマツプ（制
限酵素切断地図）を第１図に示す。ここで白ぬき
の部分はベクターλL47由来で、斜線の部分は染
色体DNA断片部分である。各略記号はすべて制
限酵素である。

ここに得られたλOS501フアージDNAをトリス
塩酸・EDTA緩衝液に溶解し、制限酵素Nru Ｉ
を添加し、37℃で完全分解した。分解物を
Agarose gel電気泳動後、3.5Kbの染色体DNA断
片を分離、取得し、プラスミドpUC18を用いて
再クローン化を図つた。プラスミドpUC18（宝酒
造社製）は2.7Kbでアンピシリン耐性（Ap^r）を
有し、制限酵素Sma Ｉによつて１箇所切断され
るものである。Sma Ｉで１箇所切断したpUC18
をアルカリフオスフアターゼ（宝酒造社製）処理
した後、前記のλOS501フアージから得られた
3.5Kbの染色体DNA断片を混合し、T4 DNAリ
ガーゼを添加して連結処理した。この処理液を用
い、エシエリヒア コリJM109株を宿主として、
Lederberg、Cohen法（Lederberg、E.M.and
Cohen、S.N.、J.Bacteriol.、119、1072、
（1974））により、当該プラスミドを導入した。

上記によつて得た3.5Kbの染色体DNA断片、
つまりNru Ｉ−Nru Ｉの3.5Kb断片のフイジカ
ルマツプは、第３図に示すとおりである。

当該プラスミドを導入して得られた形質転換処
理菌体を選択培地である可溶性澱粉１％、アンピ
シリン50μｇ／ml、寒天1.5％を含むＬ培地（バク
トトリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリ
ウム５ｇ、水１、PH7.0）にて37℃で培養し、
アンピシリン耐性株を得た。このアンピシリン耐
性株をアンピシリン50μｇ／ml、１％可溶性澱粉
を含むＬ培地にて37℃で24時間培養し、培養液中
のマルトペンタオース生成酵素活性の有無を薄層
クロマトグラフイーによつて調べた。

薄膜クロマトグラフイーは培養液をｎ−ブタノ
ール／ｎ−プロパノール／水（３／５／４）の溶
媒系で60℃、２回上昇展開を行つたのち、20％硫
酸メタノールを噴霧してマルトペンタオースの有
無を検索し、マルトペンタオース生成酵素生産株
を分離することができた。

得られたマルトペンタオース生成酵素生産菌株
を単離し、これをアンピシリン50μｇ／mlを含む
Ｌ培地にて37℃で培養し、培養液を遠心分離して
集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法
（Bironboim、H.C.and Doly、J.、Nucleic
Acids Res.、７、1513、（1979））によつてプラ
スミドを分離し、新規なプラスミドを得た。この
プラスミドをプラスミドpOS201と名づけた。

プラスミドpOS201は6.2Kbの大きさで、その
フイジカルマツプを第２図に示す。ここで白ぬき
の部分はベクターpUC18由来で、斜線の部分は
染色体DNA断片部分であり、各略記号はすべて
制限酵素である。

プラスミドpOS201で形質転換されたエシエリ
ヒア コリJM109−pOS201（Escherichia coli
JM109−pOS201）は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている（FERM Ｐ−10973）。

そして、マルトペンタオース生成酵素遺伝子を
含有するNruI断片について塩基配列の決定を行
つて第４図の結果を得た。そしてその位置からの
塩基配列（及び、シグナル開始点からは塩基配列
から予想されるアミノ酸配列）については、第５
図に示した。

第６図は、マルトペンタオース生成酵素遺伝子
周辺のDNA配列及びアミノ酸配列を図示したも
のである。図中、シグナルはメチオニン（−41の
位置）に対置するATG（−123位置）且つ／又は
メチオニン（−23の位置）に対応するATG（−69
の位置）から開始され、マルトペンタオース生成
酵素の構造遺伝子はバリン（１の位置）に対応す
るGTG（１の位置）から開始され、リジン（591
の位置）に対応するAAG（1771の位置）で終了す
る。

第６図からも判るように、マルトペンタオース
生成酵素遺伝子は、ATGを開始コドンとし、
TGAを終止コドンとしている。

第７図及び第８図は、マルトペンタオース生成
酵素遺伝子のDNA配列及びアミノ酸配列をそれ
ぞれ図示したものである。

第９図は、シグナルを含んだマルトペンタオー
ス生成酵素遺伝子のアミノ酸配列を図示したもの
であつて、シグナル切断点は、４１の位置のＡ
（アラニン）と、４２の位置のＶ（バリン）の間と
予想される。

上記によつて調製した新規プラスミド
pOS201DNAをXho Ｉ（宝酒造社製）で切断し、
0.75Kbの断片を得る。この断片を³²Pでラベル
し、シユードモナス．エスピーKO−8940株染色
体DNA、エシエリヒア コリJM109株染色体
DNAおよびλOS501DNAのそれぞれのXhoI分解
物とサザンハイブリダイゼーシヨン（Sauthern、
E.M.、J.Mol.Biol.、98、503、（1975））を行つ
た。エシエリヒア コリ染色体DNAとは全くハ
イブリダイズしなかつたが、シユードモナス．エ
スピーKO−8940株染色体DNA、λOS501 DNA
には特異的にハイブリダイズする0.75Kbのバン
ドが見いだされた。このことからクローン化した
DNAはシユードモナス．エスピーKO−8940株
由来であることが確かめられた。

実施例 pOS321−CEの構築 (1) pOS320の構築 マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む
SphI−KpuI 2.1KbDNA断片をpUC18に連結
したプラスミドpOS201（実施例１、第２図）を
SphIで切断した突出末端をMung Bean
Nucleaseにより平滑化、Klenow fragmentに
て修復した後、KpnIで切断しマルトペンタオ
ース生成酵素遺伝子を含む2.1KbDNA断片を
得た。

一方、pBR−AN3（pBR322にマルチクロー
ニングサイトを導入したプラスミドベクター）
をBamHIで切断、Klenow fragmentにより突
出末端平滑化後、KpnIで切断し、Bacterial
Alkaline Phosphatase（BAP）処理し、前記
のマルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む、
2.1KbDNA切断とT4リガーゼにより連結した
後、E.coli JM109を形質転換した。

得られたプラスミドpOS320は第１２図に示
す通り、区結部位は、BamHIサイトが再生さ
れ、マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む
DNA断片はBamHI−KpnIDNAfragmentとし
て回収可能となる。

(2) pOS321−CEの構築 pOS320をBamHIで切断し、突出末端を
Mung Bean Nucleaseで平滑化し、Klenow
fragmentにより修復後、Hindで切断し、マ
ルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む
2.1KbDNA断片を得た。

また、pKK223−３（フアルマシア社製）を
EcoRで切断後、Klenow fragmentにより突
出末端を平滑化後、Hindで切断し、BAP処
理後、前記のDNA断片とT4リガーゼにより連
結し、E.coli JM109を形質転換した。得られ
たプラスミドpOS321−CEは第１３図に示す通
り連結部位のEcoRサイトは再生し、tacプロ
モーターの下流にマルトペンタオース生成酵素
遺伝子を含む2.1KbDNA断片が連結された発
現プラスミドとなる。形質転換株としてJM109
−pOS321−CE（FERM Ｐ−11672）を得た。

実施例 ３ 合成DNAを用いるマルトペンタオース生成酵
素遺伝子のtacプロモータへの連結 (1) pOS3410の構築 第１５図イに示すような合成DNAを設計し
た。これは、G5生成アミラーゼ遺伝子（マル
トペンタオース生成酵素遺伝子、G5 amyと略
記することもある）の開始コドンATGから19
塩基のHaeサイトまでの塩基配列とその５側
にEcoRサイトを付加したものである。さら
にrOS320をHae、Bclで消化して得られた
250bpの断片ロと、同じくBclとHindで消
化して得られる1.7KbのDNA断片ハをそれぞ
れ用意した。ベクターはpKK223−３ニを用い
EcoR、Hindで切断後BAP処理しておい
た（第１４図、第１５図）。

第１４図に示すように上記４種のDNAフラ
グメント（イ〜ニ）を連結した後、E.coli
JM109を形質転換し、G5生成アミラーゼ活性
を有する形質転換体を選択した。この組換体の
保持するPlasmidのjunction部分のSequenceを
確認し、pOS3410と命名した。

(2) pOS3414の構築 pOS3410をEcoRで切断後、Klenow
fragmentにより突出末端を平滑化し、Self
ligationした。このDNAでE.coli JM109を形
質転換した。得られたプラスミドにおいて、
EcoR siteは消失しVsp Siteが新た
に生成した（第１４図）。このようにして得た
プラスミドをpOS3414と命名した。

(3) pOS3406、pOS3412の構築 pOS3410をEcoR で切断後、Mung Bean
Nucleaseで突出末端を平滑化した。これを
Self ligationし、E.coli JM109を形質転換し
た。これにより得られたプラスミドをpOS3406
と命名した。一方EcoR siteを平滑化し
たDNAにHpa リンカーを導入し、E.coli
JM109を形質転換して得たプラスミドを
pOS3412と命名した（第１４図）。

実施例 ４ pOS3408の構築 第１６図に示すように、pOS3410をEcoR
で切断し、突出部分をMung Bean Nucleaseで
平滑化、Klenow fragmentで修復した後Hind
で切断し、G5生成アミラーゼ遺伝子を含む2.0Kb
のDNA断片を得た。pKK233−２（tac
Promoter、ori：pBR322）をNcoで切断し、
突出末端をMung Bean Nucleaseで平滑後、
Hindで切断しBAP処理した。両DNAを
ligationし、E.coli JM109を形質転換しpKK233
−G5を得た。pKK233−G5をVspで切断し、
tacプロモーターの−10領域とG5生成アミラーゼ
遺伝子を含む3.2kbのDNA断片を得た。

一方ベクターpKK233−３をVspで切断し、
ori及びtacプロモーターの−35領域を含む3.4kb
のDNA断片を得た。両DNA断片をligationし、
E.coli JM109を形質転換しpOS3408を得た（第
１７図）（pOS3408のjunction部分のsequenceは
pKK233−G5と同じである）。

このようにして得た形質転換体は、
Escherichia coli JM109−pOS3408と命名し、
これを工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し
た（FERM Ｐ−11673）。

実施例 ５ マルトペンタオース生成酵素の生産(1) エシユリヒア コリ JM109−pOS201
（FERM Ｐ−10973）を、Ampicirinを含むＬ液
体培地（トリプトン１ｇ、酵母エキス0.5ｇ、
NaCl0.5ｇ、Ampicirin50μｇ／ml、水100ml、PH
7.0）３mlで37℃で12時間培養し、この培養液を
種培養とした。種培養１mlをアンピシリン、
IPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノサイド）を含むＬ液体培地（トリプトン１
ｇ、酵母エキス0.5ｇ、NaCl0.5ｇ、アンピシリン
50μｇ／ml、TPTG 100mmole、水100ml、PH
7.0）に接種し、37℃で24時間培養後、遠心分離
にて培養上清画分と菌体画分を得た。菌体画分を
トリス塩酸・酢酸カルシウム緩衝液100mlに懸濁
した後、超音波により菌体を破砕し遠心分離によ
り得た上清画分と、培養上清画分とを混合し200
mlの粗酵素液とした。４℃の低温で得られた粗酵
液に硫酸アンモニウムを加え、0.2から0.5飽和で
沈澱する画分を集め、10mMリン酸緩衝液（PH
7.5）に溶解する。この酵素液を同緩衝液にして
一晩透析した。次にDEAE−トヨパール650Mに
よるイオン交換クロマトグラフイーおよびトヨパ
ールHW55Sによるゲルろ過クロマトグラフイー
により精製し、電気泳動的に単一バンドを示す標
本を得ることができた。さらに、Asahipak ES
−520N（旭化学工業社製）を用いた高速液体クロ
マトグラフイーによる精製を行い、精製酵素を得
た。

このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の
性質を検討し、以下の結果を得た。

(1) 作 用 本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下
のオリゴ糖を基質にした場合、次のとおりであ
る。

G₈→G₅＋G₃ G₇→G₅＋G₂ G₆→G₅＋G₁ G₅→G₃＋G₂ G₄→G₂＋G₂ G₃、G₂：作用しない （但し、G₁：グルコース、G₂：マルトース、
G₃：マルトトリオース、G₄：マルトテトラオー
ス、G₅：マルトペンタオース、G₆：マルトヘキ
サオース、G₇：マルトヘプタオース、G₈：マル
トオクタオースをそれぞれ表わす。） (2) 基 質 本酵素は、アミロース、可溶性澱粉のほか、馬
鈴薯、甘藷、トウモロコシ、モチトウモロコシ、
大麦、小麦、米、タピオカ、サゴなどの各種澱粉
に作用して、マルトペンタオースを生成する。

(3) 作用至適PH 反応液組成を以下のとおりとした： 基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 各種緩衝液（0.1M） （酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸ナトリウム
緩衝液） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml 上記組成液を45℃で15分間反応させて還元力を
測定し、最高値を100として表わしたときの結果
を第１０図に示した。

図から明らかなように、本酵素の至適PHは6.0
である。

(4) 作用至適温度 反応液組成を以下のとおりとした： 基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml 上記組成液を20〜70℃の各種温度で15分間反応
させて還元力を測定し、最高値を100として表わ
したときの結果を第１１図に示した。

図から明らかなように、本酵素の至適温度は37
〜45℃である。

(5) 分子量 SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動
法によつて得られた本酵素の分子量は65000であ
る。

以上に示した性質を有する本酵素は、従来知ら
れている酵素とは全く異なるものであつて、マル
トペンタオースを大量に生成する新規な酵素であ
る。

実施例 ６ マルトペンタオース生成酵素の生産(2) エシエリヒア コリJM109−pOS321−CE
（FERM Ｐ−11672）をampicirinを含むＬ培地
３mlで37℃で12時間培養し、この培養液を種培養
とした。種培養１mlを、アンピシリン、IPTGを
含むＬ培地（トリプトン１ｇ、酵母エキス0.5ｇ、
NaCl0.5ｇ、アンピシリン50μ、
IPTG100mmole、水100ml、PH7.0）に接種し、
37℃24時間培養後、遠心分離にて培養上清画分と
菌体画分を得た。菌体画分をトリス塩酸・酢酸緩
衝液100mlに懸濁した後、超音波により菌体を破
砕し遠心分離により得た上清画分と、培養上清画
分とを混合し200mlの粗酵素液とした。

この粗酵素液0.1μ、２％可溶性澱粉（Merck
社製）0.5μ、0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）0.4μ
を混合し45℃で10分間反応させSomogyii−
Nelson法で還元力を測定した。その結果、
20IU／mlの活性を示した（1IUは１分間に
1μmoleのα−１，４グルコシド結合を切断する
酵素活性である）。

実施例 ７ マルトペンタオース生成酵素の生産(3) エシエリヒア コリ JM109−pOS3408
（FERM Ｐ−11673）をampicirinを含むＬ培地
3mlで37℃で12時間培養し、この培養液を種培養
とした。種培養１mlを、アンピシリン、IPTGを
含むＬ培地（トリプトン１ｇ、酵母エキス0.5ｇ、
NaCl0.5ｇ、アンピシリン50μｇ／ml、
IPTG0.1mM、水100ml、PH7.0）に接種し、37℃
24時間培養後、遠心分離にて培養上清画分と菌体
画分を得た。菌体画分をトリス塩酸・酢酸緩衝液
100mlに懸濁した後、超音波により菌体を破砕し
遠心分離により得た上清画分と、培養上清画分と
を混合し200mlの粗酵素液とした。

この粗酵素液0.1μ、２％可溶性澱粉（Merck
社製）0.5μ、0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）0.4μ
を混合し45℃で10分間反応させ（Somogyii−
Nelson法で還元力を測定した。その結果、
50IU／mlの活性を示した（1IUは１分間に
1μmoleのα−１，４グルコシド結合を切断する
酵素活性である）。

（発明の効果） 本発明によつてはじめてマルトペンタオース生
成酵素遺伝子の構造が解明され、微生物で発現せ
しめることに成功した。

その結果、マルトペンタオース生成酵素が大量
に産生されることとなつた。本発明に係るこの酵
素は、活性が高いのみでなく従来未知の新規酵素
であるという特徴を有する。したがつて本発明に
よれば、本酵素を利用することによつてマルトペ
ンタオースを大量に製造できることになる。

マルトペンタオースは現在、α−アミラーゼ活
性測定用基質として診断薬、試薬などへの用途が
あり、本酵素が本発明によつて安価に生産される
ことにより、食品をはじめ各種用途に広く利用す
ることができる。マルトペンタオースは溶解性に
優れ、甘味がなく、ボデイ感があるので製菓用材
料として有用であり、また消化・吸収性が良いの
で、幼児、老人、患者用の滋養食としても利用す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はフアージλOS501のフイジカルマツプ
（制限酵素切断地図）、第２図はプラスミド
pOS201のフイジカルマツプ、第３図はプラスミ
ドpOS201に挿入されているNru Ｉ−Nru Ｉ
3.5Kb断片のフイジカルマツプをそれぞれ示して
いるが、第２図及び第３図における矢印はマルト
ペンタオース生成アミラーゼのコード領域を示し
ている。第４図の１ないし３はNru Ｉ−Nru Ｉ
断片のDNA配列を示したものであり、第５図の
１ないし５は第４図の全DNA配列並びに１部の
アミノ酸配列（シグナル及び酵素遺伝子）を図示
したものである。第６図の１ないし３はマルトペ
ンタオース生成酵素遺伝子周辺のDNA配列及び
アミノ酸配列を図示したものである。第７図の１
ないし２及び第８図は、マルトペンタオース生成
酵素の構造遺伝子のDNA配列及びアミノ酸配列
をそれぞれ図示したものである。第９図はシグナ
ルを含んだマルトペンタオース生成酵素遺伝子の
アミノ酸配列を図示したものであり、図中の矢印
は予想されるシグナル切断点を示す。第１０図及
び第１１図は、本酵素の至適PH及び至適温度を示
すグラフであり、第１０図において、〇−〇は
0.1M酢酸バツフアー、△−△は0.1Mリン酸バツ
フアー、□−□は0.1M炭酸ナトリウムバツフア
ーをそれぞれ表わす。第１２図は、プラスミド
pOS321−CEの構築図、第１３図はそれにより得
られたプラスミドのフイジカルマツプを表わす。
第１４図は、プラスミドpOS3410、同3414、同
3406、同3412の構築図であり、第１５図は、プラ
スミドpOS3410の構築に使用するイ〜ニ４種の
DNAフラグメントを表わす。 イ……合成DNAフラグメント、ロ，ハ……
pOS320起源の250bp及び1.7Kbフラグメント、ニ
……プラスミドpKK223−３、 第１６図は、プラスミドpOS3408の構築図、第１
７図はそれにより得られたプラスミドのフイジカ
ルマツプを表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第４図に示すマルトペンタオース生成酵素遺
   伝子を含むDNA。 ２ 第５図に示す塩基配列、及びアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含む、マルトペンタオース
   生成酵素遺伝子を含むDNA。 ３ 第６図に示す塩基配列、又はアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を含む、マルトペンタオース
   生成酵素遺伝子を含むDNA。 ４ 第８図に示すアミノ酸配列をコードするマル
   トペンタオース生成酵素遺伝子。 ５ 第７図に示す塩基配列で表わされるマルトペ
   ンタオース生成酵素遺伝子。 ６ 第９図に示すアミノ酸配列をコードする塩基
   配列を含む、マルトペンタオース生成酵素遺伝子
   を含むDNA。 ７ 請求項１〜６のいずれか１項に記載のマルト
   ペンタオース生成酵素遺伝子を含むDNAとベク
   ター断片とを結合させてなる第１図、第２図又は
   第３図の制限酵素切断地図で示されることを特徴
   とするフアージ及び／又はプラスミド。 ８ プラスミドが第１３図又は第１７図の制限酵
   素切断地図で示されるpOS321−CE又はpOS3408
   であることを特徴とする請求項７に記載のプラス
   ミド。 ９ 供与体微生物がシユードモナス
   （Pseudomonas）属に属する微生物であることを
   特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の
   DNAないし遺伝子。 １０ 供与体微生物がシユードモナス・エスピー
   （Pseudomonas.sp）KO−8940であることを特徴
   とする請求項９に記載のDNAないし遺伝子。 １１ 請求項７〜８のいずれか１項に記載のフア
   ージ又はプラスミドを宿主微生物に導入してなる
   形質転換微生物。 １２ 形質転換微生物がエシエリヒア・コリ
   （Escherichia coli）であることを特徴とする請
   求項１１に記載の形質転換微生物。 １３ 形質転換微生物がエシエリヒア・コリ
   （Escherichia coli）JM109−pOS321−CE
   （FERMP−11672）又は同JM109−pOS3408
   （FERM Ｐ−11673）であることを特徴とする請
   求項１２に記載の形質転換微生物。 １４ 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の
   形質転換微生物を培養し、培養物からマルトペン
   タオース生成酵素を採取することを特徴とするマ
   ルトペンタオース生成酵素の製造法。 １５ 下記の性質を有することを特徴とする新規
   マルトペンタオース生成酵素： (A) 本酵素の分子量は65000（SDS−ポリアクリル
   アミドスラブゲル電気泳動による）である。 (B) 本酵素の至適PHは6.0である。 (C) 本酵素の至適温度は37〜45℃である。