JPS6251987A - サイクロデキストリン グルカノトランスフエラ−ゼの製造法 - Google Patents
サイクロデキストリン グルカノトランスフエラ−ゼの製造法Info
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- JPS6251987A JPS6251987A JP18985285A JP18985285A JPS6251987A JP S6251987 A JPS6251987 A JP S6251987A JP 18985285 A JP18985285 A JP 18985285A JP 18985285 A JP18985285 A JP 18985285A JP S6251987 A JPS6251987 A JP S6251987A
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- escherichia coli
- phage
- glucanotransferase
- cyclodextrin
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
一般にサイクロデキストリン グルカノトランスフェラ
ーゼ生産菌として、バチルス（ｈユ且皿）属やクレブン
ラ（■吐鉦虹」）属の細菌などが用いられてきた。しか
し、その生産は微量で、かつ不安定であり、また培地中
に含まれるきよう雑物が多く、サイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼの分離精製が困難であった
０本発明者らは、バチルス・マセランス（江虹且旦ｕ江
ユ邸）のサイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼ構造遺伝子をエシェリヒア・コリ（計吐扛且…Ｌ
卯■）内でクローン化することに成功し、この変異株
を培養したところ、安定に短時間でサイクロデキストリ
ン グルカノトランスフェラーゼを生産させることがで
きたものである。本発明は、サイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼを生産するエシェリヒア・コ
リを培養し、培養物からサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼを１１取することをＩＶｍとするサ
イクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製
造法である。
ーゼ生産菌として、バチルス（ｈユ且皿）属やクレブン
ラ（■吐鉦虹」）属の細菌などが用いられてきた。しか
し、その生産は微量で、かつ不安定であり、また培地中
に含まれるきよう雑物が多く、サイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼの分離精製が困難であった
０本発明者らは、バチルス・マセランス（江虹且旦ｕ江
ユ邸）のサイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼ構造遺伝子をエシェリヒア・コリ（計吐扛且…Ｌ
卯■）内でクローン化することに成功し、この変異株
を培養したところ、安定に短時間でサイクロデキストリ
ン グルカノトランスフェラーゼを生産させることがで
きたものである。本発明は、サイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼを生産するエシェリヒア・コ
リを培養し、培養物からサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼを１１取することをＩＶｍとするサ
イクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製
造法である。
本発明に用いるサイクロデキストリン グルカノトラン
スフェラーゼを生産するエシェリヒア・コリは次のよう
にして創製することができる。
スフェラーゼを生産するエシェリヒア・コリは次のよう
にして創製することができる。
サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ遺
伝子の調製は次のようにする。
伝子の調製は次のようにする。
バチルス・マセランスｌＡＭ１２４３株はサイクロデキ
ストリン グルカノトランスフェラーゼを菌体外に分ン
必する細菌として知られている。本菌体から５ａｉｔｏ
、 Ｍｉｕｒａ法（Ｓａｉｔｏ 、 ＩＩ 、 ａｎ
ｄ Ｍｉｕｒａ 。
ストリン グルカノトランスフェラーゼを菌体外に分ン
必する細菌として知られている。本菌体から５ａｉｔｏ
、 Ｍｉｕｒａ法（Ｓａｉｔｏ 、 ＩＩ 、 ａｎ
ｄ Ｍｉｕｒａ 。
Ｋ 、 、 Ｂｉｏｃｈｉｍ 、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、
Ａｃｔａ、 ｕ、 ６１９ 、 （＋９６４） ）
により染色体ＤＮＡを調製する。これを制限酵素５ｉＩ
Ｌ３Ａｌで部分分解し、分解物からシヨ糖京度勾配超遠
心法により約２に１以上の染色体ＤＮＡ断片を分離する
。
Ａｃｔａ、 ｕ、 ６１９ 、 （＋９６４） ）
により染色体ＤＮＡを調製する。これを制限酵素５ｉＩ
Ｌ３Ａｌで部分分解し、分解物からシヨ糖京度勾配超遠
心法により約２に１以上の染色体ＤＮＡ断片を分離する
。
別に、ファージλＬ４７ＤＮＡを制限酵素ＬＬＬＨ＋て
切断し、これに先の染色体ＤＮＡ断片を混合し、更にＴ
４ＤＮＡリガーゼを添加して、連結処理をする。この処
理液を用いてイン ビトロ バツケイジング法（ｌｌｏ
ｒｎ、８．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、６８，２９９．（＋９７９））により入ファージ
粒子を形成し、この人ファージ粒子をエシェリヒア・コ
リーヒ９５の培養菌！！ｌ濁ταに添加して、サイクロ
デキストリン グルカノトランスフェラーゼ生産能を保
有する特殊形質導入ファージを得ろ。得られた特殊形質
導入ファージ粒子より、サイクロデキストリン グルカ
ノトランスフェラーゼ遺伝子を含む入ファージＤＮＡを
調製する。このＤＮＡを制限酵素５ＵＬ３ Ａ ｌで部
分分解し、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ｆｌｉｌ
ＩＩ １切断部分にＴ４リガーゼを用いて結合し、ハ
イブリッドプラスミド混合物を得る。この混合物を用い
てエシェリヒア・コリへＬｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｃｏｈｅ
ｎ法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、６．Ｍ、 ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｊ、８ａｃｔｅｒｉｏ１．。
切断し、これに先の染色体ＤＮＡ断片を混合し、更にＴ
４ＤＮＡリガーゼを添加して、連結処理をする。この処
理液を用いてイン ビトロ バツケイジング法（ｌｌｏ
ｒｎ、８．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、６８，２９９．（＋９７９））により入ファージ
粒子を形成し、この人ファージ粒子をエシェリヒア・コ
リーヒ９５の培養菌！！ｌ濁ταに添加して、サイクロ
デキストリン グルカノトランスフェラーゼ生産能を保
有する特殊形質導入ファージを得ろ。得られた特殊形質
導入ファージ粒子より、サイクロデキストリン グルカ
ノトランスフェラーゼ遺伝子を含む入ファージＤＮＡを
調製する。このＤＮＡを制限酵素５ＵＬ３ Ａ ｌで部
分分解し、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ｆｌｉｌ
ＩＩ １切断部分にＴ４リガーゼを用いて結合し、ハ
イブリッドプラスミド混合物を得る。この混合物を用い
てエシェリヒア・コリへＬｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｃｏｈｅ
ｎ法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、６．Ｍ、 ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｊ、８ａｃｔｅｒｉｏ１．。
［ドー、 １０７２．（＋り７４））により形質転換す
る。形質転１灸株の中からアンピシリン耐性（５０７１
ｇ／ｍｌ）かつサイクロデキストリン グルカノトラン
スフェラーゼ活性のある株を選択する。この菌株を培養
し、培百菌体からプラスミドｐＥＤｓｌを得た。
る。形質転１灸株の中からアンピシリン耐性（５０７１
ｇ／ｍｌ）かつサイクロデキストリン グルカノトラン
スフェラーゼ活性のある株を選択する。この菌株を培養
し、培百菌体からプラスミドｐＥＤｓｌを得た。
プラスミドｐＥＤｓ＋のフィジカルマツプ（制限酵素切
断地図）は第４図に示した通りであり、白ぬきの部分（
よベクターｐＢＲ３２２由来、黒塗りの部分は染色体断
片部分て、二のクローン（ヒされた断片の大ざざは８′
３４．４Ｋｂである。ここに得られろ形質転換体はサイ
クロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを安定
によく生産する便れた変異エシェリヒア・コリである。
断地図）は第４図に示した通りであり、白ぬきの部分（
よベクターｐＢＲ３２２由来、黒塗りの部分は染色体断
片部分て、二のクローン（ヒされた断片の大ざざは８′
３４．４Ｋｂである。ここに得られろ形質転換体はサイ
クロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを安定
によく生産する便れた変異エシェリヒア・コリである。
本菌はエシェリヒア・コリＣ（ｉｏｏ−ｐＥＤｓｌ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７７４）として微工研に寄託されている
。
ＥＲＭ ＢＰ−７７４）として微工研に寄託されている
。
この変異エシェリヒア・コリはサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼの生産性において全く新規
であり、サイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼの工業生産上極めて有用である。
グルカノトランスフェラーゼの生産性において全く新規
であり、サイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼの工業生産上極めて有用である。
本発明においては、変異エシェリヒア・コリが２α体培
養される。培地としては、エシェリヒア・コリの培養に
用いられるものであればいずれてもよいが、炭素源とし
ては澱粉、液化澱粉、グルコース、グリセリン、糖蜜、
廃糖蜜なとがあり、窒累源としては各種蛋白分解物、大
豆粉、肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アンモニウ
ム塩、酵母エキス、コーンスティーフ゛リカーなとがあ
り、その他ビオチンなとの栄面素や微量金属などが適宜
使用される。
養される。培地としては、エシェリヒア・コリの培養に
用いられるものであればいずれてもよいが、炭素源とし
ては澱粉、液化澱粉、グルコース、グリセリン、糖蜜、
廃糖蜜なとがあり、窒累源としては各種蛋白分解物、大
豆粉、肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アンモニウ
ム塩、酵母エキス、コーンスティーフ゛リカーなとがあ
り、その他ビオチンなとの栄面素や微量金属などが適宜
使用される。
培養は３７℃で通気かくはんによって行われる。
８〜１０時間の培養によってサイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼは最大蓄積量を示すのて、培養
液を遠心分離して菌体を得、超音波破砕する。
カノトランスフェラーゼは最大蓄積量を示すのて、培養
液を遠心分離して菌体を得、超音波破砕する。
破砕菌体を遠心分離して除き、得られた上清から、塩析
、透析、イオン交換樹脂、アフィニティクロマトグラフ
処理等一般的酵素精製法によりサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼを単離することができる。
、透析、イオン交換樹脂、アフィニティクロマトグラフ
処理等一般的酵素精製法によりサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼを単離することができる。
次に本発明を実施例及び試験ｆｆ１１により詳しく説明
する。
する。
創製例 変異エシェリヒア・コリの創製バチルス・マセ
ランスｌＡＭ１２４３株をフスマ培地（６％フスマ抽出
ｊｆｆ、０．５％マルト エキストラクト、０．５％イ
ースト エキストラクト、０．５％ポリペプトン、 ０
．０５％塩化カルシウム）で４８時間培養し、遠心分離
にて集菌、洗浄し、得られた菌体から５ａｉｔｏ、Ｍｉ
ｕｒａの方法（Ｓａｉｔｏ、Ｈ，ａｎｄ Ｍｉｕｒａ。
ランスｌＡＭ１２４３株をフスマ培地（６％フスマ抽出
ｊｆｆ、０．５％マルト エキストラクト、０．５％イ
ースト エキストラクト、０．５％ポリペプトン、 ０
．０５％塩化カルシウム）で４８時間培養し、遠心分離
にて集菌、洗浄し、得られた菌体から５ａｉｔｏ、Ｍｉ
ｕｒａの方法（Ｓａｉｔｏ、Ｈ，ａｎｄ Ｍｉｕｒａ。
Ｋ、、８ｉｏｃｔ＋ｉｍ、８ｉｏｐｌ＋ｙｓ、、Ａｃｔ
ａ、１３．６１９．（１９Ｇ４））によって染色体ＤＮ
＾を分難し、これをトリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解
し、制限酵素５ＵＬ３Ａ１ を添加して、３７℃で部分
分解した後、分解物からショ糖密度勾配超遠心法で約２
に１以上の染色体断片を分難、取得した。
ａ、１３．６１９．（１９Ｇ４））によって染色体ＤＮ
＾を分難し、これをトリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解
し、制限酵素５ＵＬ３Ａ１ を添加して、３７℃で部分
分解した後、分解物からショ糖密度勾配超遠心法で約２
に１以上の染色体断片を分難、取得した。
用いたファージベクター人し４７のＤＮＡ概略開裂地図
は第１図に示した通りであり、このファージ入Ｌ４７Ｄ
ＮＡは４０．ＧＫｂで制限酵素ＬＬ旧によって２箇所切
断されろものである。
は第１図に示した通りであり、このファージ入Ｌ４７Ｄ
ＮＡは４０．ＧＫｂで制限酵素ＬＬ旧によって２箇所切
断されろものである。
ＬＩ−ｌｌｌて切断した入Ｌ４７ＤＮＡと前記のバチル
ス・マセランスｌＡＭ＋２４３株から得られた約２Ｋｂ
以上の染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮ、Ａリガーゼを添
加して連結処理した（ Ｗｅｉｓｓ、Ｂ、、５ａｂｌｏ
ｎ、Ａ、Ｊ、、Ｌｉｖｅ、Ｔ、Ｒ。
ス・マセランスｌＡＭ＋２４３株から得られた約２Ｋｂ
以上の染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮ、Ａリガーゼを添
加して連結処理した（ Ｗｅｉｓｓ、Ｂ、、５ａｂｌｏ
ｎ、Ａ、Ｊ、、Ｌｉｖｅ、Ｔ、Ｒ。
、Ｆａｒｅｅｄ、Ｇ、Ｃ，ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２１１．
４５４３．（＋９６８）） 、処理液を、イン ビトロ
バツケイジング キント（宝酒造社製品）に添加して、
イン ビトロ パッケイジジグ法（ｔｌｏｒｎ、Ｂ、、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｉ、２
９９．（１９７９））により当該ＤＮＡをファージ粒子
に導入した。このファージ粒子をエシェリヒア・コリＷ
Ｌ９５の菌体懸濁ンαに添加し、１％可溶性ｎ扮、１．
２％の寒天を含む入培ＩＩ！！（バクトドリブトン１０
８．ＮａＣｌ２．５ｇを水１１に溶解）に添加して、３
７°Ｃて培鳶し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧し
て、ヨウ素反応を８二ざなかったファージをサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼ生産ファージ
として分朗することができた。
ｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２１１．
４５４３．（＋９６８）） 、処理液を、イン ビトロ
バツケイジング キント（宝酒造社製品）に添加して、
イン ビトロ パッケイジジグ法（ｔｌｏｒｎ、Ｂ、、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｉ、２
９９．（１９７９））により当該ＤＮＡをファージ粒子
に導入した。このファージ粒子をエシェリヒア・コリＷ
Ｌ９５の菌体懸濁ンαに添加し、１％可溶性ｎ扮、１．
２％の寒天を含む入培ＩＩ！！（バクトドリブトン１０
８．ＮａＣｌ２．５ｇを水１１に溶解）に添加して、３
７°Ｃて培鳶し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧し
て、ヨウ素反応を８二ざなかったファージをサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼ生産ファージ
として分朗することができた。
得られたサイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼ生産ファージを単離し、これをエシェリヒア・コ
リーＬ６６とともに入培地で３７℃で培養した。培養Ｉ
αを遠心分難して宿主菌体を除き、ポリエチレングリコ
ールを加えてファージ粒子を凝集させたのら、遠心分離
によってファージ粒子を集め、新規なファージを得た。
ラーゼ生産ファージを単離し、これをエシェリヒア・コ
リーＬ６６とともに入培地で３７℃で培養した。培養Ｉ
αを遠心分難して宿主菌体を除き、ポリエチレングリコ
ールを加えてファージ粒子を凝集させたのら、遠心分離
によってファージ粒子を集め、新規なファージを得た。
このファージをλＣＤ２と名づけだ。
このファージ粒子を、５０％ホルムアミドを含むファー
ジ懸濁用紙ｉ打液に対して透析し、入ＣＤ２ファージＤ
ＮＡを得た。ファージ入ＣＤ２ＤＮＡは４５．０にｂの
大きさて、そのフィジカルマツプ（制限酵素切断地図）
を第２図に示す。ここで白ぬきの部分はベクター人し４
７由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分である。各略
記号はすべて制限酵素である。
ジ懸濁用紙ｉ打液に対して透析し、入ＣＤ２ファージＤ
ＮＡを得た。ファージ入ＣＤ２ＤＮＡは４５．０にｂの
大きさて、そのフィジカルマツプ（制限酵素切断地図）
を第２図に示す。ここで白ぬきの部分はベクター人し４
７由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分である。各略
記号はすべて制限酵素である。
このファージλＣＤ２ＤＮＡをＩ！Ｐでラベルし、バチ
ルス・マセランスｌＡＭ１２４３株染色体ＤＮＡ 、エ
シェリヒア・コリ９１９５株染色体Ｄ）ＩＡおよびα−
アミラーゼ高生産株バチルス・ズブチリス（ｈ虹且邸坦
■ユコ） ＮＡ６４染色体ＤＩＩＡのそれぞれのＤＪ−
Ｒ１分解物とサザンハイプリダイゼーション（５ａ１ｔ
ｌ＋ｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、、ｊ
ｌｌ、５０３．（＋９７５））を行ったところ、エシェ
リヒア・コリ、バチルス・ズブチリス染色体ＤＮＡとは
全くハイブリダイズしなかったが、バチルス・マセラン
スｌＡＭ１２４３味の染色体ＤＮＡとは２箇所で特異的
にハイブリダイズしており、クローン化した遺伝子はバ
チルス・マセランスｌＡＭ！２４３株由来であることが
確かめられた。
ルス・マセランスｌＡＭ１２４３株染色体ＤＮＡ 、エ
シェリヒア・コリ９１９５株染色体Ｄ）ＩＡおよびα−
アミラーゼ高生産株バチルス・ズブチリス（ｈ虹且邸坦
■ユコ） ＮＡ６４染色体ＤＩＩＡのそれぞれのＤＪ−
Ｒ１分解物とサザンハイプリダイゼーション（５ａ１ｔ
ｌ＋ｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、、ｊ
ｌｌ、５０３．（＋９７５））を行ったところ、エシェ
リヒア・コリ、バチルス・ズブチリス染色体ＤＮＡとは
全くハイブリダイズしなかったが、バチルス・マセラン
スｌＡＭ１２４３味の染色体ＤＮＡとは２箇所で特異的
にハイブリダイズしており、クローン化した遺伝子はバ
チルス・マセランスｌＡＭ！２４３株由来であることが
確かめられた。
ここに得られた入ＣＤ２ファージＤＮＡをトリス塩酸・
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ緩衝液に溶解し、制限酵素５ｉＬ３ Ａ
ｌを添加し、３７℃で部分分解した。分解物からショ
糖富度勾配超遠心法で約２に１」以上の染色体断片を分
離、取得し、プラスミドｐＢＲ３２２を用いて再クロー
ン化を図った。
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ緩衝液に溶解し、制限酵素５ｉＬ３ Ａ
ｌを添加し、３７℃で部分分解した。分解物からショ
糖富度勾配超遠心法で約２に１」以上の染色体断片を分
離、取得し、プラスミドｐＢＲ３２２を用いて再クロー
ン化を図った。
再クローン化に用いたプラスミドｐＢＲ３２２の概略開
裂地図はｉ３図に示すが、このプラスミドｐＢＲ３２２
は４，４にｂてアンピシリン耐性（Ａｐ’）を有し、制
限！Ｌｖ素Ｉ！ａｍ ＩＩＩによって１箇所切断される
ものである。
裂地図はｉ３図に示すが、このプラスミドｐＢＲ３２２
は４，４にｂてアンピシリン耐性（Ａｐ’）を有し、制
限！Ｌｖ素Ｉ！ａｍ ＩＩＩによって１箇所切断される
ものである。
１ｉＬＩＩｌで１箇所切断したｐＢＲ３２２と前記の入
Ｃ［１２フアージから得られた約２Ｋｂ以上の染色体断
片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して連結処理し
た。この処理液を用い、エシェリヒア・コリＣ６００株
を宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ 、 Ｃｏｈｅｎ法
（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、 ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ
、Ｓ、Ｎ、、Ｊ、８ａｃｔｅｒｉｏ１．、ｉｌｌ、１０
７２．（１９７４））により、当該プラスミドを導入し
た。
Ｃ［１２フアージから得られた約２Ｋｂ以上の染色体断
片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加して連結処理し
た。この処理液を用い、エシェリヒア・コリＣ６００株
を宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ 、 Ｃｏｈｅｎ法
（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、 ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ
、Ｓ、Ｎ、、Ｊ、８ａｃｔｅｒｉｏ１．、ｉｌｌ、１０
７２．（１９７４））により、当該プラスミドを導入し
た。
得られた形質転換処理量体を選択培地である可溶性お粉
１％、アンピシリン５０ノｔ ｇ／ｍｌ 、寒天１．（
ｉ％を含むし培地（バクトドリブトンｌｏｇ’ｓ母エキ
ス５ ｇ 、 ＮａＣ１５ｇを１１の水に溶解）にて３
７℃で培養し、アンピシリン耐性株を得た。このアンピ
シリン耐性株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ 、 １％
可溶性澱粉を含むし培地にて３７℃で２４時間培養し、
培Ｒ液中のサイクロデキストリンの有無をペーパークロ
マトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーによ
って調べた。
１％、アンピシリン５０ノｔ ｇ／ｍｌ 、寒天１．（
ｉ％を含むし培地（バクトドリブトンｌｏｇ’ｓ母エキ
ス５ ｇ 、 ＮａＣ１５ｇを１１の水に溶解）にて３
７℃で培養し、アンピシリン耐性株を得た。このアンピ
シリン耐性株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ 、 １％
可溶性澱粉を含むし培地にて３７℃で２４時間培養し、
培Ｒ液中のサイクロデキストリンの有無をペーパークロ
マトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーによ
って調べた。
ペーパークロマトグラフィーは培養１夜をｎ−ブタノー
ル／ｎ−プロパツール／水（３１５／４）の溶媒系で６
０℃、２回上昇展開を行ったのち、９０％アセトシのヨ
ウ素溶液にペーパークロマトグラムを浸してサイクロデ
キストリンの呈色を検索し、発色したものをサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼ生産１株とし
て分離することができた。
ル／ｎ−プロパツール／水（３１５／４）の溶媒系で６
０℃、２回上昇展開を行ったのち、９０％アセトシのヨ
ウ素溶液にペーパークロマトグラムを浸してサイクロデ
キストリンの呈色を検索し、発色したものをサイクロデ
キストリン グルカノトランスフェラーゼ生産１株とし
て分離することができた。
得られたサイクロデキストリン グルカノトランスフェ
ラーゼ生産１株を単離し、これをアンピシリン５０μｇ
／ｍ ｌを含むし培地にて３７℃で培養し、培養液を遠
心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出
法（Ｑｉｒｎｂｏｉｍ、１１．ｃ、ａｎｄ Ｄｏｌｙ、
Ｊ、。
ラーゼ生産１株を単離し、これをアンピシリン５０μｇ
／ｍ ｌを含むし培地にて３７℃で培養し、培養液を遠
心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出
法（Ｑｉｒｎｂｏｉｍ、１１．ｃ、ａｎｄ Ｄｏｌｙ、
Ｊ、。
Ｎｕｃｌｅｉｃ 、Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７．１５
１３＋（＋９７９））ここよってプラスミドを分離、探
索し、新規なプラスミドを得た。このプラスミドをプラ
スミドｐＥＤｓｌ と名づけだ。
１３＋（＋９７９））ここよってプラスミドを分離、探
索し、新規なプラスミドを得た。このプラスミドをプラ
スミドｐＥＤｓｌ と名づけだ。
プラスミドｐＥＤｓＩは８．８Ｋｂの大きさで、そのフ
ィジカルマツプ（ｖ１限酵素切断地図）を第４図に示す
。ここで白ぬきの部分はベクターｐＢＲ３２２由来て、
黒塗りの部分は染色体断片部分であり、各略記号はすべ
て制限酵素である。
ィジカルマツプ（ｖ１限酵素切断地図）を第４図に示す
。ここで白ぬきの部分はベクターｐＢＲ３２２由来て、
黒塗りの部分は染色体断片部分であり、各略記号はすべ
て制限酵素である。
試験例１ サイクロデキストリン グルカノトランスフ
ェラーゼの生産 アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むし培地を、５００ｍ
ｌた。その間１ｇ養物を１ｍｌずつ採取して、生産さ
れろサイクロデキストリン グルカノトランスフェラー
ゼの活性を測定した。
ェラーゼの生産 アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むし培地を、５００ｍ
ｌた。その間１ｇ養物を１ｍｌずつ採取して、生産さ
れろサイクロデキストリン グルカノトランスフェラー
ゼの活性を測定した。
第５図は、サイクロデキストリン グルカノトランスフ
ェラーゼ活性の経時的変化を示すものである。ここてＡ
はサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
活性、Ｂは苗の生育を示している。
ェラーゼ活性の経時的変化を示すものである。ここてＡ
はサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ
活性、Ｂは苗の生育を示している。
第５図から明らかなように、サイクロデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ活性は培養後８時間で最高値
に達する。
ルカノトランスフェラーゼ活性は培養後８時間で最高値
に達する。
実施例
し培地の組成 バクトドリブトン １０ｇ酵母エキス
５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 水 １１０…Ｉを入
れた５００ｍ ｌ容坂ロフラスコ２本に接種し、３７℃
で一夜振どう培養して、種培養液を得た。
５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 水 １１０…Ｉを入
れた５００ｍ ｌ容坂ロフラスコ２本に接種し、３７℃
で一夜振どう培養して、種培養液を得た。
前記と同じ組成の培地２０１を入れたジャーファ−メン
タ−に種培養液２００ｍ ｌ を添加し、３７℃で１０
時間通気かくはん培養した。得られた培！！液を遠心分
離することにより面体を得、これを５１の２１１ＩＭ酢
酸カルシウムを含むｌｏｍＭ ）リス塩酸緩衝γα（ｐ
Ｈ７，５）に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕
した。
タ−に種培養液２００ｍ ｌ を添加し、３７℃で１０
時間通気かくはん培養した。得られた培！！液を遠心分
離することにより面体を得、これを５１の２１１ＩＭ酢
酸カルシウムを含むｌｏｍＭ ）リス塩酸緩衝γα（ｐ
Ｈ７，５）に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕
した。
破砕菌体を遠心分離によって除き、上溝に５０ｇのトウ
モロコシ澱粉を加え、５℃で一晩かくはんしてサイクロ
デキストリン グルカノトランスフェラーゼを吸着させ
た。ｆＲ粉を２５０１の３３％エタノールで洗浄し、ガ
ラスフィルターで減圧ろかしてエタノール溶液を除いた
。
モロコシ澱粉を加え、５℃で一晩かくはんしてサイクロ
デキストリン グルカノトランスフェラーゼを吸着させ
た。ｆＲ粉を２５０１の３３％エタノールで洗浄し、ガ
ラスフィルターで減圧ろかしてエタノール溶液を除いた
。
澱粉を２５０１の蒸留水に懸濁し５０℃で１５分かくは
んして酵素の脱着を行った。
んして酵素の脱着を行った。
澱粉をろ別し、１ｍＭ塩化カルシウムを含む０゜０５Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セル
ロースカラムを用いてカラムクロマトグラフィーを行っ
た。溶出は同緩衝液を用い、０〜０．５Ｍ食塩の１度勾
配法にて行った。活性の有る両分を集め、コロジオンバ
ッグで１ｍＭ塩化カルシウム溶ｚα中にて透析し、蛋白
濃度３〜４％にまでａ縮した。
酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セル
ロースカラムを用いてカラムクロマトグラフィーを行っ
た。溶出は同緩衝液を用い、０〜０．５Ｍ食塩の１度勾
配法にて行った。活性の有る両分を集め、コロジオンバ
ッグで１ｍＭ塩化カルシウム溶ｚα中にて透析し、蛋白
濃度３〜４％にまでａ縮した。
この濃縮酵素液に１ｍＭ塩化カルシウムを含む飽和硫安
溶ンαを滴下した。約０．１飽和でわずかに白濁したの
で、少量のＩ＋ａＭ塩化カルシウム溶液を加えて透明に
し・、３〜５でて放置した。４週間後：こ結晶をガラス
フィルター上に取り出し、ＩｍＭ塩化カルシウム溶２α
で１九沸した後、結晶を集めてＩＩＢ−塩化カルシウム
溶液中に懸濁して凍結し、精製酵素とした。
溶ンαを滴下した。約０．１飽和でわずかに白濁したの
で、少量のＩ＋ａＭ塩化カルシウム溶液を加えて透明に
し・、３〜５でて放置した。４週間後：こ結晶をガラス
フィルター上に取り出し、ＩｍＭ塩化カルシウム溶２α
で１九沸した後、結晶を集めてＩＩＢ−塩化カルシウム
溶液中に懸濁して凍結し、精製酵素とした。
第１図はファージλＬ４７のフィジカルマツプ（制限酵
素切断地図）、第２図はファージλＣＤ２のフィジカル
マツプ、第３図はプラスミド’ｐＢＲ３２２のフィジカ
ルマツプ、第４図はρＥＤＳ ｌのフィジカルマツプを
それぞれ示している。 第５図は試験例においてサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ活性の経時変化および菌の生育を示
す図である。 第３図 ９１・１益１ ◆ノイクロー７ｔ：Ｖ−ストリン グルカノトランスフ
エサ−匂活性（−＊−ｕｎｉｔｓ／ｍｌＦ 手続（甫正書（自発） 昭和６０年１１月２７Ｌ１
素切断地図）、第２図はファージλＣＤ２のフィジカル
マツプ、第３図はプラスミド’ｐＢＲ３２２のフィジカ
ルマツプ、第４図はρＥＤＳ ｌのフィジカルマツプを
それぞれ示している。 第５図は試験例においてサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ活性の経時変化および菌の生育を示
す図である。 第３図 ９１・１益１ ◆ノイクロー７ｔ：Ｖ−ストリン グルカノトランスフ
エサ−匂活性（−＊−ｕｎｉｔｓ／ｍｌＦ 手続（甫正書（自発） 昭和６０年１１月２７Ｌ１
Claims (1)
- サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを
生産するエシェリヒア・コリを培養し、培養物からサイ
クロデキストリン グルカノトランスフェラーゼを採取
することを特徴とするサイクロデキストリン グルカノ
トランスフェラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60189852A JPH0789912B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60189852A JPH0789912B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6251987A true JPS6251987A (ja) | 1987-03-06 |
| JPH0789912B2 JPH0789912B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16248262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189852A Expired - Lifetime JPH0789912B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | サイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789912B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100637314B1 (ko) * | 2004-11-09 | 2006-10-23 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및이의 생산방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61135589A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-06-23 | Hayashibara Biochem Lab Inc | シクロマルトデキストリン グルカノトランスフエラ−ゼ遺伝子を含む組換えｄｎａとその利用 |
-
1985
- 1985-08-30 JP JP60189852A patent/JPH0789912B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61135589A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-06-23 | Hayashibara Biochem Lab Inc | シクロマルトデキストリン グルカノトランスフエラ−ゼ遺伝子を含む組換えｄｎａとその利用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100637314B1 (ko) * | 2004-11-09 | 2006-10-23 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 초내열성 사이클로덱스트린 글루카노트렌스퍼레이즈 및이의 생산방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0789912B2 (ja) | 1995-10-04 |
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