JPH03219879A - マルトペンタオース生成酵素遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物並びに該微生物を用いるマルトペンタオース生成酵素の製造法およびそれによって得られた新規酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規プラスミドＤＮＡ、該プラスミドＤＮＡ
を保有する微生物、該微生物を用いる蛋白質の製造法、
及びそれによって得られる新規蛋白質に関する。

更に詳細には、本発明は、マルトペンタオース生成酵素
遺伝子情報を担うＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ新規プ
ラスミド、該プラスミドを導入した新規な微生物、該微
生物を用いてマルトペンタオース生成酵素を製造する方
法、並びに、それによって得られる新規マルトペンタオ
ース生成酵素に関するものである。

（従来の技術） マルトペンタオース生成酵素は、１９８６年Ｏｋａｍｏ
ｔ。

等によってシュードモナス、エスピー （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、　ｓｐ）の培養液中に初め
て発見されたものであって、澱粉類からマルトペンタオ
ースを効率よく生成する酵素である（特公昭６ｌ−４９
９５５）。

本酵素を澱粉に作用させて得られるマルトペンタオース
は、アミラーゼ活性測定用試薬として。

臨床試薬、バイオアッセイ用試薬、分析試薬の分野で重
用されるのみでなく、機能性食品素材としても非常に重
要であって食品の分野でも重用されるものである。

したがって、マルトペンタオースの需要は高まり、大量
生産が強く望まれているのが当業界の現状である。

そして当業界における上記ニーズに対応してマルトペン
タオースを大量に製造するには、それを生成する酵素つ
まりマルトペンタオース生成酵素が大量に必要となって
くる。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来の微生物による方法では、シュード
モナス属菌をはじめ各種の微生物をスクリーニングした
けれども、いずれもマルトペンタオース生成酵素の産生
址は低く、業界のニーズには到底応えられないものであ
る。

（問題点を解決するための手段） そこでマルトペンタオース生成酵素の有利な製造方法′
を開発するために各方面から検討を行い、遺伝子工学に
よる方法が最も適当であるとの知見を得た。

そして本発明は、更に研究を行ってなされたものであっ
て、マルトペンタオース生成酵素をコードする遺伝子を
含むＤＮＡ、さらに、マルトペンタオース生成酵素遺伝
子を種々のベクターに組み込んで宿主微生物に導入した
新規組換え体微生物及び新規に創製された新規組換え体
微生物を培養しマルトペンタオース生成酵素を製造する
方法を開発する目的でなされたものである。

本発明者らは、上記の目的を達成するため、マルトペン
タオース生成酵素生産菌より、マルトペンタオース生成
酵素遺伝子をクローン化した。さらに該遺伝子を種々の
ベクターに組み込んで宿主微生物に導入し、得られた組
換え体微生物を培養することによりマルトペンタオース
生成酵素を産生させることに成功し、そしてまた、得ら
れた酵素が従来より知られていた酵素とは異なり新規な
酵素であることも確認し、本発明を完成した。

以下に、本発明を具体的に説明する。

（１）マルトペンタオース生成酵素遺伝子のクロ−ン化 マルトペンタオース生成酵素産生能を有する供与体微生
物よりその微生物のＤＮＡを分離精製した後、例えば、
超音波、制限酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と
、同様にしてベクターを切断して得られたベクター断片
とを、例えば、ＤＮＡリガーゼ等により結合させ、マル
トペンタオース生成酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡを形
成する。

また、マルトペンタオース生成酵素生産能を遺伝子組換
えにより導入した形質転換微生物を供与体微生物として
利用することもできる。

供与体微生物としては、マルトペンタオース生成酵素産
生能を有する微生物が広く使用できる。

そのような微生物としては例えばシュードモナス属細菌
が使用され、具体的にはシュードモナスエスピーＫＯ８
９４０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４５６）等が例示されるが
これのみに限定されるものではない。

供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生物を、例えば
、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる培
養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させるこ
とによって調製することができる。溶菌方法は、例えば
、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素
による処理や超音波処理などが用いられる。また、必要
によりプロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの他の酵素
剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用さ
れる。また凍結融解処理を施すこともある。このように
して得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには、
常法にしたがって、例えばフェノール抽出、除蛋白処理
、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコー
ル沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることに
よって行うことができる。

ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができる。切断後、必要に応
じてホスファターゼやＤＮＡポリメラーゼ等の修飾酵素
が用いられる。また種々のリンカ−やアダプターを用い
ることによりＤＮＡ断片末端の塩基配列を変えることが
できる。

切断されたＤＮＡ断片から、蔗糖密度勾配遠心法や電気
泳動したゲルからの抽出等によって最適な長さの断片の
みが得られる。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るフ
ァージまたはプラスミドが適している。

ファージとしては、既知のものが適宜使用でき、例えば
、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）を宿主微生物とする場合には、λファージやＭ１
３ファージなどが使用出来る。

また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア　コ
リを宿主微生物とする場合には、ρＢＲ３２２、ｐＵｃ
１８やそれらの派生体、例えばｐＢＲ−ＡＮ３などが使
用できる。更に、例えば、エシェリヒア　コリ、バチル
ス　ズブチリスなどの二種以上の宿主微生物で自律的増
殖の可能な、例えば、ｐｉ（Ｙ３００ＰＬＫ、ＹＩｐ５
、ＹＥｐ　１３などのベクターのほか、各種の既知のシ
ャトルベクターを利用することも可能である。

このようなベクターを、先に述べたＤＮＡと同様に制限
酵素などで切断し、ベクター断片を得る。

Ｄ　Ｎ　Ａ断片とベクター断片とを結合させる方法は、
公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例え
ば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングの後、
生体外で適当なりＮＡリガーゼの作用により組換えＤＮ
Ａを作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微
生物に導入して。

生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組換えＤＮＡにする
こともできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであればどのよう
なものでもよい。

宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法は、公知の方
法、例えば、宿主微生物がエシェリヒアコリの場合には
カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｍ。

ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、、　１１９．１０７２゜（１９７４））など
を採用することができる。

λフアージＤＮＡであれば、イン　ビトロ　バッケイジ
ング法（Ｈｏｒｎ、　Ｂ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６８．２９９（１９７９））に
よりλフアージ粒子を形成し、このλフアージ粒子をエ
シェリヒアコリの培養菌懸濁液に添加して、マルトペン
タオース生成酵素生産能を保有する特殊形質導入ファー
ジを得ることができる。

組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、常法によって行い、例えば液体選択培地で培養し、培
養液中のマルトペンタオース生成酵素活性を測定する。

液体選択培地にはベクター上のマーカーによって、最小
培地や、抗生物質添加培地が適宜用いられる。

酵素活性の測定は、培養液に澱粉溶液を加え、４５℃で
保温した後、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロマ
トグラフィーを用いて生成されたマルトペンタオースの
同定や定量が行なわれる。

得られたマルトペンタオース生成酵素生産菌を液体選択
培地にて３７℃で培養し、公知の方法、例えばアルカリ
抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌ
ｙ。

Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ヱ、
　１５１３．　（１９７９））によってプラスミドを得
ることができる。

マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡ
は、上記の方法で、適宜制限酵素で切断し、他のベクタ
ーに組み込んだり、他の宿主に導入することができる。

（２）マルトペンタオース生成酵素の調製マルトペンタ
オース生成酵素は次のようにして調製することができる
。マルトペンタオース生成酵素生産菌、あるいは上記の
方法によってマルトペンタオース生成酵素生産能を獲得
した形質転換微生物を液体培養する。培地としては、該
微生物の通常の培養に用いられるものであればいずれで
もよいが、例えば、炭素源としては澱粉、液化澱粉、グ
ルコース、グリセリン、糖蜜、廃糖蜜などがあり、窒素
源としては各種蛋白分解物、大豆粉、肉エキス、ペプト
ン、尿素、硝酸塩、アンモニウム塩、酵母エキス、コー
ンステイープリカーなどがある。その他ビオチンなどの
栄養素や微量金属などが適宜使用される。

培養後、酵素が菌体内にある場合には、培養液を遠心分
離して菌体を得、超音波や細胞壁溶解酵素等で処理し、
破砕菌体を遠心分離して除き、粗酵素液とする。また、
酵素が培地中にある場合には、培養液を遠心分離して菌
体を除き、以後の精製を行なう。

得られた粗酵素液から、塩析、透析、イオン交換樹脂、
アフィニティクロマトグラフ処理等−船釣酵素精製法に
よりマルトペンタオース生成酵素を単離することができ
る。

このようにして得た精製酵素を用いて、本酵素の性質を
検討した結果、特に分子量が６５　、０００　（ＳＯＳ
−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動）、至適ＰＨ
が６．０、至適温度が３７〜４５℃において特徴的であ
る。

このような性質を有する酵素は既知のマルトペンタオー
ス生成酵素には見当らず、したがって本酵素は従来未知
の新規酵素と認定した。

次に本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１　マルトペンタオース生成酵素遺伝子のクロー
ン化 シュードモナス、エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、
　ｓｐ）ＫＯ−８９４０（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４５６）を
可溶性澱粉を含む液体培地（可溶性澱粉１ｇ、ポリペプ
トン１ｇ、肉エキス０．３ｇ、酵母エキス０．２ｇ、塩
化ナトリウム０．３ｇ、水１００ｍＱ、　ｐＨ７，５）
で４０℃で６時間培養し、遠心分離にて集菌、洗浄し、
得られた菌から５ａｉｔｏ、　Ｎ１ｕｒａの方法（Ｓａ
ｉｔｏ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ、、　Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７２．６１９（１９６
３））によって染色体ＤＮＡを分離し、これをトリス塩
酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素５ａｕ３ＡＩ（
全酒造社製）を添加して、３７℃で部分分解した後１分
解物から蔗糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体
ＤＮＡ断片を分離、取得した。

ベクターにはファージλＬ４７（アマ−ジャム社製）を
用い、　Ｂａａ　ＨＩ（全酒造社製）切断したλＬ４７
　ＤＮＡと前記のシュードモナス、エスピーＫＯ−８９
４０株から得られた約２Ｋｂ以上の染色体ＤＮＡ断片を
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造社製）を添加して
連結処理した（Ｗｅｉｓｓ、　Ｂ、、　５ａｂｌｏｎ、
　Ａ、　Ｊ、、　Ｌｉｖｅ、　Ｔ。

Ｒ，、Ｆａｒｅｅｄ、　Ｇ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｒｉｃｈａ
ｒｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２４３．４５４３（１９６
８））。処理液を、イン　ビトロ　パツケイジング　キ
ット（全酒造社製）に添加してイン　ビトロ　パツケイ
ジフグ法（ｔ（ｏｒｎ、　Ｂ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６８．２９Ｌ（１９７９
））により当該ＤＮＡをファージ粒子に導入した。この
ファージ粒子をエシェリヒア　コリＷＬ９５の菌体懸濁
液に添加し、１％可溶性澱粉、１．２％の寒天を含むλ
培地（バクトドリプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５
ｇ、水１１２）に添加して、３７℃で培養し、出現した
プラーク、ヨウ素反応を起こさなかったファージをマル
トペンタオース生成酵素生産ファージとして分離するこ
とができた。

得られたマルトペンタオース生成酵素生成ファージを単
離し、これをエシェリヒア　コリ糺６６株とともにλ培
地で３７℃で培養した。培養液を遠心分離して宿主菌体
を除き、ポリエチレングリコールを加えてファージ粒子
を凝集させたのち、遠心分離によってファージ粒子を集
め、新規なファージを得た。このファージをλ０５５０
１と名づけだ。

このファージ粒子を、５０％ホルムアミドを含むファー
ジ懸濁用緩衝液に対して透析し、λ０８５０１ファージ
ＤＮＡを得た。ファージλ０３５０１ＤＮＡは４６．Ｏ
Ｋｂの大きさで、そのフィジカルマツプ（制限酵素切断
地図）を第１図に示す。ここで白ぬきの部分はベクター
λＬ４７由来で、斜線の部分は染色体ＤＮＡ断片部分で
ある。各略記号はすべて制限酵素である。

ここに得られたλ０３５０１ファージＤＮＡをトリス塩
酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素Ｎｒｕ　Ｉを添
加し、３７℃で完全分解した。分解物をＡｇａｒｏｓｅ
　ｇｅｌ電気泳動後、３．５Ｋｂの染色体ＤＮＡ断片を
分離、取得し、プラスミドＰＵＣ１８を用いて再クロー
ン化を図った。プラスミドｐＵｃ１ｇ（全酒造社製）は
２．７Ｋｂでアンピシリン耐性（Ａｐｒ）を有し、制限
酵素Ｓｍａ　Ｉによって１箇所切断されるものである。

５ＩｌａＩで１箇所切断したｐＵｃｌｇをアルカリフォ
スファターゼ（全酒造社製）処理した後、前記のλ０８
５０１ファージから得られた３、５Ｋｂの染色体ＤＮＡ
断片を混合し。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを添加して連結処理した。この処
理液を用い、エシェリヒア　コリＪＭ１０９株を宿主と
して、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｃｏｈｅｎ法（Ｌｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｍ。

ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、　１１９．１０７２゜（１９７４））に
より、当該プラスミドを導入した。

上記によって得た３、５Ｋｂの染色体ＤＮＡ断片、つま
りＮｒｕ　Ｉ−Ｎｒｕ　Ｉの３．５Ｋｂ断片のフィジカ
ルマツプは、第３図に示すとおりである。

当該プラスミドを導入して得られた形質転換処理菌体を
選択培地である可溶性澱粉１％、アンピシリン５０μｇ
／ｍＱ、寒天１．５％を含むＬ培地（バクトドリプトン
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１Ω
、ｐＨ７，０）にて３７℃で培養し、アンピシリン耐性
株を得た。このアンピシリン耐性株をアンピシリン５０
μｇ／ｍＱ、１％可溶性澱粉を含むＬ培地にて３７℃で
２４時間培養し、培養液中のマルトペンタオース生成酵
素活性の有無を薄層クロマトグラフィーによって調べた
。

薄膜クロマトグラフィーは培養液をｎ−ブタノール／ｎ
−プロパツール／水（３１５／４）の溶媒系で６０℃５
２回上昇展開を行ったのち、２０％硫酸メタノールを噴
霧してマルトペンタオースの有無を検索し、マルトペン
タオース生成酵素生産株を分離することができた。

得られたマルトペンタオース生成酵素生産菌株を単離し
、これをアンピシリン５０μｇ／ｍＱを含むし培地にて
３７℃で培養し、培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後
、分離菌体からアルカリ抽出法（Ｂｉｒｏｎｂｏｉｍ、
　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　？、　１５１３．　（１９
７９））によってプラスミドを分離し、新規なプラスミ
ドを得た。このプラスミドをプラスミドｐＯ９２０１と
名づけた。

プラスミドｐＯＳ２０１は６．２にｂの大きさで、その
フィジカルマツプを第２図に示す。ここで白ぬきの部分
はベクターｐＬｌｃ１８由来で、斜線の部分は染色体Ｄ
ＮＡ断片部分であり、各略記号はすべて制限酵素である
。

プラスミドｐＯＳ２０１で形質転換されたエシェリヒア
　コリＪＭ１０９−ｐＯＳ２０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９−ｐＯＳ２０１）は工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ
　Ｐ−１０９７３）。

そして、マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含有する
ＮｒｕＩ断片について塩基配列の決定を行って第４図の
結果を得た。そしてその位置からの塩基配列（及び、シ
グナル開始点からは塩基配列から予想されるアミノ酸配
列）については、第５図に示した。

第６図は、マルトペンタオース生成酵素遺伝子周辺のＤ
ＮＡ配列及びアミノ酸配列を図示したものである。図中
、シグナルはメチオニン（−４１の位置）に対置するＡ
ＴＧ（−１２３位置）且っ／又はメチオニン（−２３の
位ＩＩ）に対応するＡＴＧ（−６９の位置）から開始さ
れ、マルトペンタオース生成酵素の構造遺伝子はバリン
（１の位置）に対応するＧＴＧ（ｌの位置）から開始さ
れ、リジン（５９１の位置）に対応するＡＡＧ（１７７
１の位置）で終了する。

第６図からも判るように、マルトペンタオース生成酵素
遺伝子は、ＡＴＧを開始コドンとし、ＴＧＡを終止コド
ンとしている。

第７図及び第８図は、マルトペンタオース生成酵素遺伝
子のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図示したも
のである。

第９図は、シグナルを含んだマルトペンタオース生成酵
素遺伝子のアミノ酸配列を図示したものであって、シグ
ナル切断点は、４１の位置のＡ（アラニン）と、４２の
位置のＶ（バリン）の間と予想される。

上記によって調製した新規プラスミドρ０５２０１ＤＮ
ＡをＸｈｏ　Ｂ宝酒造社製）で切断し、ｏ、７５にｂの
断片を得る。この断片を３２Ｐでラベルし、シュードモ
ナス、エスピーＫＯ−８９４０株染色体ＤＮＡ、エシェ
リヒア　　Ｄ　ＩＪ　ＪＭ１０９株染色体ＤＮＡおよび
λＯ５５’ｏＩ　ＤＮＡのそれぞれのＸｈｏＩ分解物と
サザンハイプリダイゼーション（Ｓａｕｔｈｅｒｎ、　
Ｅ、　Ｍ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

９８、５０３．（１９７５））を行った。エシェリヒア
　コリ染色体ＤＮＡとは全くハイブリダイズしなかった
が、シュードモナス、エスピーに０−８９４０株染色体
ＤＮＡ、λ０３５０１　ＤＮＡには特異的にハイブリダ
イズする０、７５にｂのバンドが見いだされた。このこ
とがらクローン化したＤＮＡはシュードモナス、エスピ
ーに０−８９４０株由来であることが確かめられた。

実施例２　ρ０３３２１−ＣＥの構築 （１）　ｐＯＳ３２０の構築 マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む５ｐｈ１−Ｋ
ｐｕ　Ｉ　　２．　ＩＫｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片をｐＵｃ１
８に連結したプラスミドｐＯＳ２０１（実施例１、第２
図）をｓｐｈ　ｌで切断し突出末端をＭｕｎｇ　Ｂｅａ
ｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅにより平滑化、Ｋｌｅｎｏｖ　ｆ
ｒａｇｍｅｎｔにて修復した後、にｐｎｌで切断しマル
トペンタオース生成酵素遺伝子を含む２．　ＩＫｂＤＮ
Ａ断片を得た。

一方、ｐＢＲ−ＡＮ３　（ｐＢＲ３２２にマルチクロー
ニングサイトを導入したプラスミドベクター）をＢａｍ
Ｈｌで切断、Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔにより突
出末端を平滑化後、Ｋｐｎ　Ｉで切断し、Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ　ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｂ
ＡＰ）処理し、前記のマルトペンタオース生成酵素遺伝
子を含む２．ＩＫｂＤ　Ｎ　Ａ切断とＴ４リガーゼによ
り連結した後、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換
した。

得られたプラスミドｐＯＳ３２０は第１２図に示す通り
、連結部位は、ＢａｍＨＩサイトが再生され、マルトペ
ンタオース生成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片はＢａｍＨ
Ｉ−にｐｎ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆｒａｇｍｅｎｔとして
回収可能となる。

（２）ρ０５３２１−ＣＥの構築 ｐＯＳ３２０をＢａｍＨＩで切断し、突出末端をＨｕｎ
ｇＢｅａｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅで平滑化し、にｌｅｎｏ
ｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔにより修復後、Ｈｉｎｄ　ｍで切
断し、マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含む２．１
）（ｂＤ　Ｎ　Ａ断片を得た。

また、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）をＥｃｏ
ＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇａ＋ｅｎｔによ
り突出末端を平滑化後、Ｈｉｎｄ　ｍで切断しＢＡＰ処
理後、前記のＤＮＡ断片とＴ４リガーゼにより連結し、
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換した。得られた
プラスミドｐＯＳ３２１−ＣＥは第１３図に示す通り連
結部位のＥｃｏＲＩサイトは再生し、　　ｔａｃプロモ
ーターの下流にマルトペンタオース生成酵素遺伝子を含
む２．ＩＫｂＤＮＡ断片が連結された発現プラスミドと
なる。形質転換株としてＪＭ１０９−ｐＯＳ３２１−Ｇ
Ｅ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１６７２）を得た。

実施例３　合成りＮＡを用いるマルトペンタオース生成
酵素遺伝子のｔａｃプロモータへの連結 （１）　ｐＯｓ３４１０の構築 第１５図（イ）に示すような合成りＮＡを設計した。

これは、Ｇ５生成アミラーゼ遺伝子（マルトペンタオー
ス生成酵素遺伝子、Ｇ５　ａｎｙと略記することもある
）の開始コドンＡＴＧから１９塩基のＨａｅ　ＩＩＩＪ
トまでの塩基配列とその５側にＥｃｏＲＩサイトを付加
したものである。さらにρ０３３２０をＨａｅ　ＩＩ、
ＢｃｌＩで消化して得られた２５０ｂｐの断片（ロ）と
、同じ＜　ＢｃｌＩと１（ｉｎｄ　ＩＩＩで消化して得
られる１、７ＫｂのＤＮＡ断片（ハ）をそれぞれ用意し
た。ベクターはｐＫＫ２２３−３（ニ）を用いＥｃｏＲ
Ｉ　、　）ｌｉｎｄｍで切断後ＢＡＰ処理しておいた（
第１４図、第１５図）。

第１４図に示すように上記４種のＤＮＡフラグメント（
イル二）を連結した後、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ旧０９を形
質転換し、Ｇ５生成アミラーゼ活性を有する形質転換体
を選択した。この組換体の保持するｐｌａｓ＋＋ｉｄの
ｊｕｎｃｔｉｏｎ部分の５ａｑｕｅｎｃｅを確認し、Ｐ
Ｏ５３４１０と命名した。

（２）　ＰＯ５３４１４の構築 ＰＯ５３４１０をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ　
ｆｒａｇｍｅｎｔにより突出末端を平滑化し、５ｅｌｆ
　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｌ／た。

このＤＮＡでＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換し
た。得られたプラスミドにおいて、ＥｃｏＲＩ　５ｉｔ
ｅは消失しＶｓｐ　Ｉ　５ｉｔｅが新たに生成した（第
１４図）。このようにして得たプラスミドをＰＯ５３４
１４と命名した。

（３）　ＰＯ８３４０６、ＰＯ３３４１２の構築ＰＯ５
３４１０をＥｃｏＲＩで切断後、　Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ
Ｎｕｃｌｅａｓｅで突出末端を平滑化した。これをＳｅ
ｌｆｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｌ／、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１
０９を形質転換した。これにより得られたプラスミドを
ＰＯ５３４０６と命名した。一方ＥｃｏＲＩ　５ｉｔｅ
を平滑化したＤＮＡにＨｐａ　１リンカ−を導入し、Ｅ
、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換して得たプラスミド
をＰＯ５３４１２と命名した（第１４図）。

実施例４　　ＰＯ５３４０８の構築 第１６図に示すように、ＰＯ５３４１０をＥｃｏＲｌで
切断し、突出部分をＭｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｎｕｃｌｅａ
ｓｅで平滑化、Ｋｌｅｎｏｉｚ　ｆｒａｇｍｅｎｔで修
復した後Ｈｉｎｄ　ｍで切断し、Ｇ５生成アミラーゼ遺
伝子を含む２．ＯＫｂのＤＮＡ断片を得た。ｐＫＫ２３
３−２（ｔａｃ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、　ｏｒｉ：　ｐＢ
Ｒ３２２）をＮｃｏＩで切断し、突出末端をＭｕｎｇ　
Ｂｅａｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅで平滑後、）ｆｉｎｄ　ｍ
で切断しＢＡＰ処理した。両ＤＮＡをｌｉｇａｔｉｏｎ
　Ｌ／、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換しＰＫ
Ｋ２３３−Ｇ５を得た。ｐＫＫ２３３−Ｇ５をＶｓｐ　
Ｉで切断し、ｔａｃプロモーターの一１０領域と６５生
成アミラーゼ遺伝子を含む３．２ｋｂのＤＮＡ断片を得
た。

一方ベクターｐＫＫ２３３−３をＶｓｐ　Ｉで切断し、
ｏｒｉ及びｔａｃプロモーターの一３５領域を含む３．
４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をｌｉｇａｔ
ｉｏｎ　Ｌ／、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換しＰＯ５３４０８を得
た（第１７図）（ＰＯ３３４０８のｊｕｎｃｔｉｏｎ部
分の５ｅｑｕｅｎｃｅはｐＫＫ　２３３−Ｇ５と同じで
ある）。

このようして得た形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ　ＪＭ１０９−ＰＯ３３４０８と命名し、こ
れを工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１１６７３）。

実施例５　マルトペンタオース生成酵素の生産（１）エ
シュリヒア　コリＪＭ　１０９−ｐＯＳ２０１（ＦＥＲ
Ｎ　Ｐ−１０９７３）を、Ａｍｐｉｃｉｒｉｎを含むＬ
液体培地（トリプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、　Ｎ
ａＣｕ　０．５ｇ、　Ａｍｐｉｃｉｒｉｎ５０μｇ／ｍ
１２、水１００ｍ１２、ｐＨ７，０）　　３　ｒｎＱで
３７℃で１２時間培養し、この培養液を種培養とした。

種培養１ｖａＱをアンピシリン、ＩＰＴＧ　（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド）を含むＬ液
体培地（トリプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、　Ｎａ
Ｃｆ１　Ｏ，５ｇ、アンピシリン５０　ｐ　ｇ／ｍＱ、
ＩＰＴＧ　１００＋ｏｎ＋ｏｌｅ、水１００ｍＱ、　ｐ
Ｈ７，０）に接種し、３７°Ｃで２４時間培養後、遠心
分離にて培養上清画分と菌体面分を得た。菌体画分をト
リス塩酸・酢酸カルシウム緩衝液１００ｍＱに懸濁した
後、超音波により菌体を破砕し遠心分離により得た上清
画分と、培養上清画分とを混合し２００ｍＱの粗酵素液
とした。４℃の低温で得られた粗酵液に硫酸アンモニウ
ムを加え、０．２から０．５飽和で沈澱する画分を集め
、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解する。こ
の酵素液を同緩衝液にして一晩透析した。次にＤＥＡＥ
−トヨパール６５０Ｍによるイオン交換クロマトグラフ
ィーおよびトヨパールＨＷ５５Ｓによるゲルろ過クロマ
トグラフィーにより精製し、電気泳動的に単一バンドを
示す標本を得ることができた。さらに、Ａｓａｈｉｐａ
ｋ　ＥＳ−５２ＯＮ　（旭化学工業社製）を用いた高速
液体クロマトグラフィーによる精製を行い、精製酵素を
得た。

このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の性質を検
討し、以下の結果を得た。

（１）作用 本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下のオリゴ
糖を基質にした場合、次のとおりである。

Ｇ８→Ｇ、＋Ｇ。

Ｃ７→Ｇ、＋Ｇ。

Ｇ６→Ｇｓ十０１ Ｇ、→Ｇ３十０２ Ｇ、→Ｇ２十Ｇ２ Ｇ３、Ｇ２：作用しない （但し、Ｇ４ニゲルコース、Ｇ２＝マルトース、Ｇ、：
マルトトリオース、Ｇ４：マルトテトラオース、Ｇ、：
マルトペンタオース、Ｇ６：マルトヘキサオース、Ｃ７
：マルトヘプタオース、Ｇｌｌ：マルトオクタオースを
それぞれ表わす。） （２）基質 本酵素は、アミロース、可溶性澱粉のほか、馬鈴薯、甘
藷、トウモロコシ、モチトウモロコシ、大麦、小麦、米
、タピオカ、サゴなどの各種澱粉に作用して、マルトペ
ンタオースを生成する。

（３）作用至適ｐＨ 反応液組成を以下のとおりとした： 基質（２％の還元した可溶性澱粉液）　０．５＋＋＋＋
１各種緩衝液（０，１Ｍ） （酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液）
　　　　　　　　　　　　０．４ｍＱ酵素液（８ＩＩ／
　ｍＱ）　　　　　　　　　　０．１工Ｑ上記組成液を
４５℃で１５分間反応させて還元力を測定し、最高値を
１００として表わしたときの結果を第１０図に示した。

図から明らかなように、本酵素の至適Ｐ）Ｉは６．０で
ある。

（４）作用至適温度 反応液組成を以下のとおりとした： 基質（２％の還元した可溶性澱粉液）　０．５＋ｎＱＯ
０ＩＮリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　　　　　　０．４
ｍｆｆ酵素液（８ＩＵ／　ｍｆｌ）　　　　　　　　　
Ｏ，１ｍｆｆ上記組成液を２０〜７０℃の各種温度で１
５分間反応させて還元力を測定し、最高値を１００とし
て表わしたときの結果を第１１図に示した。

図から明らかなように、本酵素の至適温度は３７〜４５
℃である。

（５）分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動法によ
って得られた本酵素の分子量は６５，０００である。

以上に示した性質を有する本酵素は、従来知られている
酵素とは全く異なるものであって、マルトペンタオース
を大量に生成する新規な酵素である。

実施例６　マルトペンタオース生成酵素の生産（２）マ
ルトペンタオース生成酵素の生産エシェリヒアコリＪＭ
１０９−ＰＯ５３２１，ＣＥ　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１６
７２）をａｍｐｉｃｉｒｉｎを含むＬ培地３ｍＱで３７
℃で１２時間培養し、この培養液を種培養とした。種培
養１ｍ１２を、アンピシリン、ＩＰＴＧを含むし培地（
トリプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、　ＮａＣ１０，
５ｇ、アンピシリン５０μｇ、ＩＰＴＧ　１００ｍｍｏ
ｌｅ、水１００ｍ１２．ｐｉ１７．０）に接種し、３７
℃２４時間培養後、遠心分離にて培養上清画分と菌体画
分を得た。菌体画分をトリス塩酸・酢酸緩衝液１００ｍ
１２に懸濁した後、超音波により菌体を破砕し遠心分離
により得た上清両分と、培養上清画分とを混合し２００
ｍＮの粗酵素液とした。

この粗酵素液０．１μＱ、　２％可溶性澱粉（Ｍｅｒｃ
ｋ社製）０．５μｕ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）　０．４　ｕ　Ｑを混合し４５℃で１０分間反応さ
せＳｏｍｏｇｙｉｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で還元力を測定し
た。その結果、　２０ＩＵ／ｎ＋９の活性を示した（　
Ｉ　ＩＵは１分間に１μｍｏｌｅのａ−１，４グルコシ
ド結合を切断する酵素活性である）。

実施例７　マルトペンタオース生成酵素の生産（３）マ
ルトペンタオース生成酵素の生産エシェリヒア　コリＪ
Ｍ１０９−ｐＯＳ３４０８（ＦＥＲＮ　Ｐ−１１６７３
）をａｍｐｉｃｉｒｉｎを含むＬ培地３ｍｌで３７℃で
１２時間培養し、この培養液を種培養とした。種培養１
ｍ１２を、アンピシリン、ＩＰＴＧを含むＬ培地（トリ
プトン１ｇ、酵母エキス０．５　ｇ　、　ＮａＣＱｏ、
５　ｇ、アンピシリン５０　μｇ／ｍＱ、ＩＰＴＧ　０
．１ｍＭ、水１００ｍＱ、ｐＨ７，０）に接種し、３７
℃２４時間培養後、遠心分離にて培養上清画分と菌体画
分を得た。菌体画分をトリス塩酸・酢酸緩衝液１００ｍ
Ａに懸濁した後、超音波により菌体を破砕し遠心分離に
より得た上清両分と、培養上清画分とを混合し２００ｍ
Ｑの粗酵素液とした。

この粗酵素液０．１μＱ、２％可溶性澱粉（Ｍｅｒｃｋ
社製）０．５μＱ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５
）　０．４μＱを混合し４５℃で１０分間反応させＳｏ
ｍｏｇｙｉｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で還元力を測定した。そ
の結果、５０ＩＵ／ｍ１２の活性を示した（　Ｉ　ＩＵ
は１分間にｌ　μｍｏｌｅの（！−１．４グルコシド結
合を切断する酵素活性である）。

（発明の効果） 本発明によってはじめてマルトペンタオース生成酵素遺
伝子の構造が解明され、微生物で発現せしめることに成
功した。

その結果、マルトペンタオース生成酵素が大量に産生さ
れることとなった。本発明に係るこの酵素は、活性が高
いのみでな〈従来未知の新規酵素であるという特徴を有
する。したがって本発明によれば、本酵素を利用するこ
とによってマルトペンタオースを大量に製造できること
になる。

マルトペンタオースは現在、α−アミラーゼ活性測定用
基質として診断薬、試薬などへの用途があり１本酵素が
本発明によって安価に生産されることにより１食品をは
じめ各種用途に広く利用することができる。マルトペン
タオースは溶解性に優れ、甘味がなく、ボディ感がある
ので製菓用材料として有用であり、また消化・吸収性が
良いので、幼児、老人、患者用の滋養食としても利用す
ることかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図はファージλ０３５０１のフィジカルマツプ（制
限酵素切断地図）、第２図はプラスミドｐＯＳ２０１の
フィジカルマツプ、第３図はプラスミドｐＯｓ２０１に
挿入されているＮｒｕ　Ｉ−Ｎｒｕ　Ｉ　３．５Ｋｂ断
片のフィジカルマツプをそれぞれ示しているが、第２図
及び第３図における矢印はマルトペンタオース生成アミ
ラーゼのコード領域を示している。 第４図の１ないし３はＮｒｕ　Ｉ−Ｎｒｕ　Ｉ断片のＤ
ＮＡ配列を示したものであり、第５図の１ないし５は第
４図の全ＤＮＡ配列並びに１部のアミノ酸配列（シグナ
ル及び酵素遺伝子）を図示したものである。 第６図の１ないし８はマルトペンタオース生成酵素遺伝
子周辺のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図示したもので
ある。第７図の１ないし２及び第８図は、マルトペンタ
オース生成酵素の構造遺伝子のＤＮＡ配列及びアミノ酸
配列をそれぞれ図示したものである。第９図はシグナル
を含んだマルトペンタオース生成酵素遺伝子のアミノ酸
配列を図示したものであり、図中の矢印は予想されるシ
グナル切断点を示す。 第１０図及び第１１図は、本酵素の至適ｐＨ及び至適温
度を示すグラフであり、第１０図において、〇−〇は０
．１Ｍ酢酸バッファー、Δ−Δは０．１Ｍリン酸バッフ
ァー、ローロは０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファーをそ
れぞれ表わす。 第１２図は、プラスミドｐＯＳ３２１−ＣＥの構築図、
第１３図はそれにより得られたプラスミドのフィジカル
マツプを表わす。 第１４図は、プラスミドＰＯ３３４１０、同３４１４、
同３４０６、同３４１２の構築図であり、第１５図は、
プラスミドｐＯＳ３４１０の構築に使用する（イ）〜（
ニ）４種のＤＮＡフラグメントを表わす。 （イ）合成りＮＡフラグメント （ロ）、（ハ）　ｐＯＳ３２０起源の２５０ｂｐ及び１
．７Ｋｂフラグメント （ニ）プラスミドｐＫＫ２２３−３ 第１６図は、プラスミドｐＯＳ３４０８の構築図、第１
７図はそれにより得られたプラスミドのフィジカルマツ
プを表わす。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）第４図に示すマルトペンタオース生成酵素遺伝子
   を含むＤＮＡ。
2. （２）第５図に示す塩基配列、及びアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を含む、マルトペンタオース生成酵素遺
   伝子を含むＤＮＡ。
3. （３）第６図に示す塩基配列、又はアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を含む、マルトペンタオース生成酵素遺
   伝子を含むＤＮＡ。
4. （４）第８図に示すアミノ酸配列をコードするマルトペ
   ンタオース生成酵素遺伝子。
5. （５）第７図に示す塩基配列で表わされるマルトペンタ
   オース生成酵素遺伝子。
6. （６）第９図に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列
   を含む、マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含むＤＮ
   Ａ。
7. （７）マルトペンタオース生成酵素遺伝子を含むＤＮＡ
   とベクター断片とを結合させてなるファージ及び／又は
   プラスミド。
8. （８）第１図、第２図又は第３図の制限酵素切断地図で
   示されることを特徴とする請求項７に記載のファージ及
   び／又はプラスミド。
9. （９）プラスミドが第１３図又は第１７図の制限酵素切
   断地図で示されるｐＯＳ３２１−ＣＥ又はｐＯＳ３４０
   ８であることを特徴とする請求項７に記載のプラスミド
   。
10. （１０）供与体微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
    ｍｏｎａｓ）属に属する微生物であることを特徴とする
    請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡないし遺伝
    子。
11. （１１）供与体微生物がシュードモナス、エスピー（Ｐ
    ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｓｐ）ＫＯ−８９４０であるこ
    とを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡないし遺伝子
    。
12. （１２）請求項７〜９のいずれか１項に記載のファージ
    又はプラスミドを宿主微生物に導入してなる形質転換微
    生物。
13. （１３）形質転換微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
    ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴とする請
    求項１２に記載の形質転換微生物。
14. （１４）形質転換微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
    ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９−ｐＯＳ３２１
    −ＣＥ（ＦＥＲＭＰ−１１６７２）又は同ＪＨ１０９−
    ｐＯＳ３４０８（ＦＥＲＭＰ−１１６７３）であること
    を特徴とする請求項１３に記載の形質転換微生物。
15. （１５）請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の形質
    転換微生物を培養し、培養物からマルトペンタオース生
    成酵素を採取することを特徴とするマルトペンタオース
    生成酵素の製造法。
16. （１６）下記の性質を有することを特徴とする新規マル
    トペンタオース生成酵素： （Ａ）本酵素の分子量は６５，０００（ＳＤＳ−ポリア
    クリルアミドスラブゲル電気泳動による）である。 （Ｂ）本酵素の至適ｐＨは６．０である （Ｃ）本酵素の至適温度は３７〜４５℃である。