JPH0430275B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 Ｌ−グルタミンは消火器粘膜をつくるムコ蛋白
質の構成成分であるグルコサミンの生成を促す為
に消化器潰瘍の治療薬として広く使用されている
ほか、アミノ酸輸液及び総合アミノ酸製剤の重要
な成分である。本発明はこのＬ−グルタミンを発
酵法で製造する方法を育種技術によつて改良する
ものである。 〔従来の技術〕 発酵法によるＬ−グルタミンの製造法として
は、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属の野生株及びそれらのサルフア剤に耐性を有
する変異株を用いる方法等が知られている。 〔解決しようとする問題点〕 Ｌ−グルタミンの発酵収率及び蓄積を向上させ
ることにより工業的に安価に生産することは、重
要な問題である。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は上記問題点を解決するためになされた
ものであり、従来より知られているブレビバクテ
リウム属及びコリネバクテリウム属に属するＬ−
グルタミン生産能を有する微生物を改良して更に
発酵収率の向上した菌株を見いだすべく研究した
結果、プリンアナログおよび／又はメチオニンス
ルホキサイド（以下MSOと略す。）に耐性を付与
した菌株の中に、従来のＬ−グルタミン生産菌よ
りも高収率でＬ−グルタミンを生産する菌株が存
在することを発見し本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコリ
ネバクテリウム属に属し、プリンアナログ耐性お
よび／又はMSO耐性を有し、且つＬ−グルタミ
ン生産能を有する微生物を液体培地中で培養し、
培地中に生成蓄積したＬ−グルタミンを採取する
ことを特徴とするＬ−グルタミンの製造法に関す
る。 本発明のプリンアナログとしては８−アザグア
ニン、８−アザアデニン、８−アザキサンチン、
６−メルカプトグアニン、２，６−ジアミノプリ
ン、２−フルオロアデニン等であり、これらの少
くとも一種に耐性を有する菌株を本発明に於てプ
リンアナログ耐性菌と言う。 本発明において用いられる微生物はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属に属し、プ
リンアナログ耐性および／又はMSO耐性を有し、
かつＬ−グルタミン生産能を有する変異株であ
る。 本発明の変異株を得るには、下記に示す親株よ
りプリンアナログ耐性および／又はMSO耐性株
を誘導してもよいし、サルフア剤耐性、コバラミ
ン耐性、ビタミンＰ耐性、ケトマロン酸耐性、各
種のアミノ酸要求性を有する各種のＬ−グルタミ
ン生産菌株からプリンアナログ耐性および／又は
MSO耐性株を誘導してもよい。 本変異株の親株となる野生株は、ブレビバクテ
リウム属又はコリネバクテリウム属等のコリネホ
ルムＬ−グルタミン生産菌としても知られている
ものであり、例えば以下のものがある。 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC 14066 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC 13870 これらの親株より本発明の変異株を得る方法
は、Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン処理する等の通常の変異誘導方法が適用
できる。変異処理した菌液から本発明の変異株を
分離する方法はアナログを含む培地で生育するよ
うな菌株を採取することによつて行われる。 本発明に示す変異株の具体的な変異誘導方法と
プリンアナログとして８−アザグアニン（以下８
−AGと略す。）、MSOを使用した場合のこれらア
ナログに対する菌株の生育度の関係を以下に示
す。 〔変異誘導方法〕 ブイヨン寒天スラント上に30℃で24時間生育さ
せたブレビバクテリウム・フラバムATCC 14067
の菌体をＭ／30リン酸緩衝液に懸濁し菌体濃度
10⁹／mlの菌体懸濁液に200μｇ／mlのＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを加え
０℃に20分間保持した。ついで遠心分離して菌体
を集め、Ｍ／30リン酸緩衝液で良く先滌した後、
第１表に示した組成の培地に播菌し、31.5℃で２
〜10日間培養した。

【表】 寒天培地に生育した８−AG耐性株50株の中か
ら、Ｌ−グルタミン生産能の高い菌株としてブレ
ビバクテリウム・フラバムAJ 12210 （FERM
−Ｐ 8123）を得た。一方、上記培地中の８−
AGのかわりにMSO 0.2ｇ／dlを含有した培地を
用いることにより、MSO耐性株50株を得て、そ
の中からＬ−グルタミン生産能の高い菌株として
ブレビバクテリウム・フラバムAJ 12211
（FERM−Ｐ 8124）を得た。ブレビバクテリウ
ム・フラバムAJ 12210 （FERM−Ｐ 8123）
を更に同様な変異条件下にて変異処理を行ない
MSO 0.2ｇ／dl含有の上記培地に播菌・培養す
ることにより、８−AGとMSOに同時に耐性を示
す菌株40株を得て、その中よりＬ−グルタミン生
産能の向上した菌株としてブレビバクテリウム・
フラバムAJ 12212 （FERM−Ｐ 8125）を得
た。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC
13032を親株とした場合についても同様な変異過
程によつて８−AG耐性株としてコリネバクテリ
ウム・グルタミカムAJ 12213 （FERM Ｐ−
8126）、MSO耐性株としてコリネバクテリウム・
グルタミカムAJ 12214 （FERM Ｐ−8127）、
８−AGとMSOに同時に耐性を示す菌株としてコ
リネバクテリウム・グルタミカムAJ 12215
（FERM Ｐ−8128）を得た。 このようにして得られた変異株のアナログ耐性
度を親株と比較した。 グルコース0.5ｇ／dl、尿素0.2ｇ／dl、硫安
0.15ｇ／dl、KH₂PO₄0.3ｇ／dl、K₂HPO₄0.1
ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.01ｇ／dl、CaCl₂・
2H₂O0.1mg／dl、ビオチン100μｇ／、サイアミ
ン塩酸塩100μｇ／、FeSO₄・7H₂O0.002ｇ／
dl、MnSO₄・7H₂O0.002ｇ／dl および第２表
ないし第４表に示した量のアナログを含み、PH
7.0に調節した液体培地に天然培地（ペプトン１
ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、NaCl0.5ｇ／dl、
PH7.0） スラント上で24時間培養した菌体を殺
菌水に懸濁して接種し、24時間培養して生育度を
濁度で測定した。これらの結果を第２ないし第４
表に示した。

【表】

【表】

〔作用〕

このような変異株を培養する際に用いる培地
は、炭素源、窒素源、無機イオン、上記要求性を
満足させるべき物質及び必要に応じビタミン等そ
の他の有機微量栄養素を含有する通常の培地であ
る。 炭素源としてはグルコール、シュクロース等の
炭水化物、エタノール或いはメタノール等のアル
コール類、酢酸、フマル酸等の有機酸等が、窒素
源としてはアンモニア水、アンモニアガス、アン
モニウム塩等が好適である。無機イオンとしては
カリイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイ
オン、リン酸イオンその他が必要に応じ適宜培地
に添加される。 培養は好気的条件が望ましく、培養の間培地の
PHを４ないし８に温度を25℃ないし37℃に調節し
つつ行えばより好ましい結果が得られる。かくし
て１ないし７日間も培養すれば培地中に著量のＬ
−グルタミンが生成蓄積される。培養液よりＬ−
グルタミンを採取する方法はイオン交換樹脂によ
る方法等通常の方法で採取できる。 以下実施例にて説明する。 実施例 １ 第５表の組成からなる水溶液培地を小型ガラス
製ジヤーフアーメンターに300ml宛分注し、常法
により殺菌した後、あらかじめ30℃で24時間ブイ
ヨンスラント上で生育させたところの第６表に示
した各種菌株を接種した。 次いでそのPHをアンモニアガスで6.5に維持し
ながら31.5℃に1200rpm、通気毎分1/4容にて30
時間培養した。 第 ５ 表 グルコース 10％ 硫酸アンモニウム １％ リン酸第一カリ 0.25％ 硫酸マグネシウム 0.04％ 硫酸第一鉄 0.001％ サイアミン塩酸塩 350γ／ ビオチン 5γ／ 味液（登録商標）（PH7.0） 0.5ml／dl 発酵終了液中に生成蓄積されたＬ−グルタミン
の量を第６表に示した。

【表】

【表】 ブレビバクテリウム・フラバムAJ 12212
（FERM−Ｐ 8125）を使用した発酵終了液１
から遠心分離によつて菌体を除去して上清液を
得、これからイオン交換樹脂をもちいる常法にし
たがつてＬ−グルタミンを分離、精製を行ないＬ
−グルタミンの結晶21.5ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属に属しプリンアナログ耐性および／又はメチ
   オニンスルホキサイド耐性を有し、且つＬ−グル
   タミン生産能を有する微生物を液体培地で培養
   し、培地中に生成蓄積したＬ−グルタミンを採取
   することを特徴とするＬ−グルタミンの製造法。