JPH0561920B2 - - Google Patents
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Description
本発明はサンドイツチハイブリブイゼーシヨン
法または溶液（solution）ハイブリダイゼーシヨ
ン法を用いたある核酸分子の定量法、とくに遺伝
子および／またはそれに対応するメツセンジヤー
RNA分子の増幅の程度の定量法、およびそれに
用いる試薬に関する。 ゲノム中の個々の遺伝子のコピー数は通常一定
である。あるばあいには半数体ゲノムあたり１つ
の遺伝子のみ存在し、他のばあいではいくつか存
在することもある。ある状況下ではコピー数は変
化することができる。ある遺伝子の増幅は、たと
えば、がん腫の発生と関連づけられることが見出
されている。また、医薬製剤
（pharmaceuticals）や金属などのような外的因
子がある遺伝子を増幅させることも知られてい
る。病気の発生にとつては、がん遺伝子のように
遺伝子の不完全なまたは高められた発現レベル、
すなわち細胞中のメツセンジヤーRNAの量が非
常に重要である。 ある遺伝的病気または他の障害は、ある染色体
の数が増加することに起因するものであるが、遺
伝的病気の中には１つの劣性遺伝子の重複によつ
てのみ生じるものもある。そのような例のすべて
においては、存在する染色体または遺伝子の数を
測定することが重要である。 あるDNA分子の数、たとえば一定の遺伝子の
増幅の程度は、現在のとろこ、検討されるべく抽
出されたDNAを制限酵素を用いて消化すること
によつて、およびアガロースゲル電気泳動法によ
り長さにしたがつてヌクレオチド断片を分離する
ことによつて測定されている。つぎに、一本鎖
DNAは、ニトロセルロースフイルターに移され
固定され、そこで検討されるべき遺伝子またはプ
ローブとしてその遺伝子の一部を用いてハイブリ
ダイゼーシヨンが行なわれる。その結果はオート
ラジオグラフイーによつてえられる（サザン
（Southern）の「ジヤーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジオー（J.Mol.Biol.）、98巻、503
〜517頁（1975）」参照）。各々の並列して行なつ
た分析による細胞中のDNAの量は同じである。 ハイブリダイゼーシヨンバンド
（hybridization bands）の強度、すなわちシグナ
ル（signals）を比較し、テストサンプル中の検
討下の遺伝子のコピー数間の比が推定される。こ
の方法はおおよその結果を与えるにすぎない。同
様に、RNAが、ノーザン−プロツテイング法又
はドツト−プロツテイング法を用いて測定され
る。これらの方法は、定量的に非常に不正確なも
のである（トーマス（Thamas）の、「メソツ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methodsin
Enzymol）100巻、255〜266頁（1983）」参照）。 サザンプロツテイングおよびノーザンプロツテ
イングのような知られた方法はその役を果すには
時間がかかり、困難なものである。それらはおお
よそその結果を与えるにすぎないので、細胞のよ
うな一定のユニツトあたりのある核酸分子数を知
ることが重要であるばあいにはそれらの診断値
（diagnostic value）は疑わしいものである。 米国特許第4486539号および英国特許出願第
GB2169403号明細書に記載されたサンドイツチ
ハイブリダイゼーシヨン法または溶液ハイブリダ
イゼーシヨン法は定量的である（ヴイルタネン
（Virtanen）らの、「ランセント（Lancet）１巻、
381〜383ページ（1983）」参照）。さらに、本発明
の方法においては、コピー数が一定であり細胞、
核、リボソームまたは染色体のような一定のユニ
ツトあたりの関連した核酸分子数の測定を可能に
する標準核酸を必要とする。 本発明の目的は、現在用いられている方法より
時間がかからず簡便な核酸分子の正確かつ迅速な
定量方法を提供することにある。本発明は、メツ
センジヤーRNAの発現レベルの測定と同様にが
んおよび出産前の診断（prenatal diagnostics）
に、遺伝子を増幅させる因子の検出およびたとえ
ば薬剤耐性の発達を示すために用いることができ
る。 本発明においては少なくとの２つの測定が必要
である。１つはいくつかのコピーで存在している
かもしれない核酸分子、すなわち被験核酸を測定
する。他の１つは好都合にも一定数で存在してい
る構成（constitutive）核酸分子、すなわち標準
核酸を測定する。本発明による方法において、核
酸分子は10〜12個のヌクレオチドを有するあるヌ
クレオチド配列または数千個のヌクレヲチドを含
有する遺伝子を示す。また、それはメツセンジャ
ーRNAまたは単一遺伝子すなわちアムプリコー
ン（amplicone）よりかなり長くヌクレオチド配
列をも意味しうる。 被験核酸および標準核酸の測定は、たとえば米
国特許第4486539号明細書に記載されている他の
点で標準のサンドイツチハイブリダイゼーシヨン
法または英国特許出願第GB2169403号明細書に
記載されている溶液ハイブリダイゼーシヨン法を
用いて行なわれる。本発明はまた、少なくとも１
つの被験プローブペアー（pair）および、少なく
とも１つの標準プローブペアー、すなわち少なく
とも４つのプローブ、からなる核酸試薬を含有す
る試薬に関する。このような試薬は試薬キツト
（reagent kit）として用いるのが好ましい。 本発明の方法に用いる試薬またはプローブは、
組換えDNA技術を用いて、被験核酸および標準
核酸に充分に相同な核酸から調製される。また充
分に相同な核酸は、合成的および半合成的に調製
することができる。 被験核酸および標準核酸は細胞から直接に単離
され、種々のハイブリダイゼーシヨン技術によつ
て同定されてよい。しかしながら、そのような被
験核酸および標準核酸は商業的にかつ種々の遺伝
子バンク（gene banks）から入手することが可
能である。被験核酸および標準核酸はDNAまた
はRNAのいずれでもよい。 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法に適し
たプローブペアーは、組換えDNA技術によつて
被験核酸および標準核酸に充分に相同な核酸から
調製される。適当な制限酵素によつて関連する核
酸を消化し、互いに比較的接近して位置するえら
れた制限酵素断片の少なくとも２つを少なくとも
２つの適当なベクターにクローン化する。その断
片の１つは、目的の核酸で形成されたハイブリツ
ドの検出のためのプローブであり（以下、「デテ
クタープローブ」（detector probe）と称す）、適
当な検出しうる標識、たとえば125Iまたは32P、
で標識し、他の１つは、目的の核酸の固定のため
のプローブであり（以下、「キヤプチヤリングプ
ローブ」（capturing probe）と称す）、適当な担
体、たとえはニトロセルロースフイルター、に固
定する（affixed）か、またはアフイニテイーペ
アー（affinity pair）の相補的成分のような他の
物質によつてハイブリダイゼーシヨン混合物から
えられたハイブリツドの分離を可能にする物質を
キヤプチヤリングプローブに固定する。プローブ
ペアーはデテクタープローブおよびキヤプチヤリ
ングプローブからなる。 被験プローブペアーおよび標準プローブペアー
は、被験プローブペアーおよび標準プローブペア
ーの両方がDNAあるいはRNAであるか、被験プ
ローブペアーがDNAであつて標準プローブベア
ーがRNAであるかまたはその逆である適当な試
薬として組み合わせることできる。したがつてハ
イブリダイゼーシヨンを行なう前のサンプルの前
処理（pretreatment）および二次処理（further
treatment）およびハイブリダイゼーシヨンの条
件は、測定テストに用いたプローブペアーに従う
べきである。 本発明の方法は、細胞ホモジエネートから直接
的に核酸分子数を測定するのにとくに適してい
る。もちろん本発明の方法は精製されたまたは純
粋な核酸の測定にも用いることができる。しかし
ながら、本発明の方法を行なう前に、核酸サンプ
ルのもつとも適当な前処理が選択されるべきであ
る。 本発明の方法を用いて、DNAおよびRNAの両
方の測定を行なうことが可能である。デオキシリ
ボ核酸は必要であれば一本鎖をうるために変性さ
せる。ハイブリダイゼーシヨンテストを妨げる可
能性のある一本鎖メツセンジヤーRNA分子は、
たとえばアルカリ煮沸によつて加水分解すること
ができる。また、二本鎖デオキシリボ核酸は
RNA測定を妨害しないので、サンプルはリボ核
酸の測定に関しては変性されない。もちろん、デ
オキシリボヌクレアーゼでDNAを分解すること、
またはDNAを化学的かまたは機械的に変化させ
てDNAがハイブリダイゼーシヨン反応に関与し
えないように変えることが可能である。したがつ
てDNAおよびRNAの測定に関しては、サンプル
の二次処理のための適当な方法を選択しなければ
ならないか、あるいはこの二次処理を省略しても
よい。二次処理のための適当な方法の選択は、も
ちろん、核酸サンプルの前処理に用いた方法に左
右される。核酸サンプルの前処理および二次処理
のための多数の方法が文献に記載されており、そ
れらを用いたそれぞれのばあいにもつとも適当な
方法を選ぶことができる。 被験核酸および標準核酸の両方がDNAかまた
はRNAであるばあいの測定は、サンプルをその
まま用いて行なうことができる。被験核酸が
DNAであり標準核酸がRNAであるかまたはその
逆であるばあいの測定は、二次処理のための異な
る方法が必要であるので、DNAを含有する溶液
とRNAを含有する溶液にサンプルを分離して
別々に行なわなければならない。サンプルはもち
ろん、たとえ被験核酸および標準核酸が同じ核酸
タイプであるばあいにも分離されてもよい。 ハイブリダイゼーシヨンテスト自体は、分離さ
れていないサンプル溶液を少なくとも１つの被験
プローブペアーと１つの標準プローブペアーとに
同時に接触させることによつて行なわれる。サン
プル溶液が分離されているばあいには、そのサン
プル溶液は少なくとも１つの被験プローブペアー
と少なくとも１つの標準プローブペアーとに別々
に接触される。そのようなばあいには、被験核酸
の量は１つの反応容器内で測定され、標準核酸の
量は他の容器内で測定される。 サンプルが分割されているかいないかにかかわ
らず、ハイブリダイゼーシヨンはそれぞれのばあ
いにおいてもつとも有利な条件および時間で行な
われる。いつたん反応が起これば、えられる被験
ハイブリツドおよび標準ハイブリツドは担体によ
つてハイブリダイゼーシヨン混合液から分離され
洗浄されるか、またはアフイニテイーペアーの相
補的メンバーのような単離剤によつて分離され
る。被験ハイブリツドおよび標準ハイブリツドに
付加された標識は測定され、その結果は標準曲線
と比較される。このようにして検討されるべき核
酸分子の数は選ばれたユニツトあたりで測定する
ことができる。 本発明の方法はとくにがんのある種の型の検出
において実用的な診断上の意義がある。小細胞肺
がん腫（small cell lung carcinoma）におい
て、ｃ−myc遺伝子はしばしば増幅され、その発
現レベルは正常組織よりかなり高くなつている。
神経芽細胞腫の場合はＮ−myc遺伝子が増幅され
る。 本発明の方法はまた、ある薬剤の変異原作用も
しくは発がん作用または薬剤耐性の発生を説明す
るために用いることができる。選択の外的圧力が
ある種の遺伝子の発現を高めることになることが
知られている。がんの治療において、がん細胞は
遺伝子を増幅させることによつて投与された薬剤
に対する抵抗性をあらわし、その遺伝子の発現産
物は薬剤を不活化する。そのようなばあいの１つ
がジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR）に対す
る遺伝子の増幅を誘導するメソトレキセートであ
る。他の例としてはカドミウムの影響下でのメタ
ロチオニン（metallothionine）に対する遺伝子
の増幅がある。 遺伝子の発現レベルは細胞の表現型および機能
の見地から重要である。遺伝子の発現レベルは、
メツセンジヤーRNAによつてコードされた蛋白
質の量と相互関係があるメツセンジヤーRNAの
量を測定することによつて調べることができる。
がん遺伝子の転写生成物によつて究極的にどのよ
うに発現されるかが決定される。 がん遺伝子の発現レベルは細胞型、分化レベル
および細胞の発達期（phase）によつて左右され
変化する。たとえば、胎児の発育のある段階で
は、ｃ−mycがん遺伝子は迅速にコピーされる
が、他の段階ではたいへんゆつくりとコピーされ
る。遺伝子の発現レベルは増幅なしに著しく増加
するかもしれないが、増幅の程度はしばしば遺伝
子の発現レベルと相関がある。そのようなばあい
には、がん遺伝子の役割はコピーの数よりむしろ
その発現レベルを測定することによつてもつとも
よく決定される。いくつかのばあいには、メツセ
ンジヤーRNAの定量は遺伝子生成物自体の定量
より簡便で便利である。そのような例としてはｃ
−mycガン遺伝子、熱によつて容易に凝固する不
安定な蛋白質をあげることができる。 本発明の方法は、ダウン症候群のような数字上
の染色体異常を確認するために用いることもでき
る。また、出産前の診断においては、胎児に欠陥
があるかどうか、すなわちある劣性遺伝子に対し
て同形（homozygous）であるかどうかの決定を
することも可能である。 つぎに本発明の定量法およびそれに用いる核酸
試薬を実施例を用いてさらに詳しく説明するが、
本発明はかかる実施例のみに限定されるものでは
ない。 実施例 １ 増幅されたがん遺伝子の定量 (a) 核酸試薬およびその調製 (1) 標準プローブ （細胞標準核酸） ｃ−Ki−ras遺伝子はすべてのヒト細胞に存
在する。サンドイツチハイブリダイゼーシヨンの
ためのプローブペアーは、ｃ−Ki−ras遺伝子
のHind断片をサブクローン化し長さ3.8kbを測
定することによつて調製した。制限酵素地図はチ
ヤング（chang）らによつて「プロシーデイング
ス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サインス（PNAS）79巻、4848〜4852頁（1982）」
に記載されている。該断片は、たとえばプラスミ
ドpBR322（ATCC 41032）にクローン化して入
手可能であり、たとえばアメリカ・タイプ・カル
チヤー・コレシクシヨン（ATCC）からうること
ができる。 （細胞標準核酸の二次処理） 前記記載のpBR322クローンを制限酵素Bgl
およびHindで処理し、えられた断片をアガロ
ースゲルから単離した。互いに近接して位置する
精製された断片を、デテクタープローブおよびキ
ヤプチヤリングローブー調製用として２つの適当
なベクターにサブクローン化した。 （標準デテクタープローブ） 長さが役1.1kbのBgl−Bgl断片をプラスミ
ドpBR322のBamH制限酵素部位にサブクロー
ン化し、125で標識されたdCTPを用いてニツ
クトランスレーシヨンによつて標識した。 （標準チヤプチヤリングプローブ） Bgl−Hind断片役0.5kbをM13mp10および
M13mp11フアージベクターの制限酵素BgmH
およびHindの制限酵素部位間に挿入し、つい
でそれを150ngDNA／直径１cmにニトロセルロ
ースフイルターの固定した。 (2) 被験プローブ （被験核酸） サンドイツチハイブリダイゼーシヨンのための
プローブペアーを、たとえばATCCからうること
ができる（ATCC41010）クローン化ｃ−myc遺
伝子から調製した。その遺伝子の制限酵素地図は
ワツト（Watt）らの、「プロシーデイングス・オ
ブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス80巻、6307〜6311頁（1983）」に記載されて
いる。 （被験核酸の二次処理） 前記ｃ−myc遺伝子を制限酵素Hind、Xba
およびPstで処理し、その断片をアガロース
ゲルから単離し、精製し、デテクタープローブお
よびキヤプチヤリングプローブを調製するために
適当なベクターにサブクローン化した。 （被験デテクタープローブ） 前記ｃ−myc遺伝子のHind−Xba制限酵
素断片3.7kbの一本鎖テール（tails）をDNAポリ
メラーゼによつて二本鎖にした。Hindリンカ
ーを、えられた平滑末端DNA断片にT4−DNA
−リガーゼを用いて挿入した。フエノール抽出を
行なつたあと、DNAを制限酵素Hindで処理し
た。ついで、そのDNA断片を制限酵素Hindの
制限酵素部位でプラスミドpBR322にクローン化
し、125で標識されたdCTPを用いてニツクト
ランスレーシヨンによつて標識した。 （被験キヤプチヤリングプローブ） ｃ−myc遺伝子のXba−Pst断片1.1kbを
M13mp10およびM13mp11フアージクローニング
ベクターの制限酵素XbaおよびPstの制限酵
素部位間にクローン化し、ついでそれを
150ngDNA／直径１cmでニトロセルロースフイ
ルターに固定した。 (b) 標準曲線の測定 標準曲線の測定に用いたサンプルはｃ−myc遺
伝子のアルカリ変性pBR322クローンからなつて
いた。前記被験プローブを加えたサンドイツチハ
イブリダイゼーシヨン溶液は４×SSC、１×デン
ハルト液、ニシン精液（herring sperm）
DNA200μｇ／mlおよび0.2％SDSからなつてい
た。ハイブリダイゼーシヨンを65℃で17〜19時間
行ない、ついでそのフイルターを50℃で洗浄容液
（0.1×SSCおよび0.2％SDS）中で洗浄した。つぎ
にサンドイツチハイブリツドに付加された標識を
ガンマカウンター中で計測した。えられた標準曲
線を第１表に示す。
法または溶液（solution）ハイブリダイゼーシヨ
ン法を用いたある核酸分子の定量法、とくに遺伝
子および／またはそれに対応するメツセンジヤー
RNA分子の増幅の程度の定量法、およびそれに
用いる試薬に関する。 ゲノム中の個々の遺伝子のコピー数は通常一定
である。あるばあいには半数体ゲノムあたり１つ
の遺伝子のみ存在し、他のばあいではいくつか存
在することもある。ある状況下ではコピー数は変
化することができる。ある遺伝子の増幅は、たと
えば、がん腫の発生と関連づけられることが見出
されている。また、医薬製剤
（pharmaceuticals）や金属などのような外的因
子がある遺伝子を増幅させることも知られてい
る。病気の発生にとつては、がん遺伝子のように
遺伝子の不完全なまたは高められた発現レベル、
すなわち細胞中のメツセンジヤーRNAの量が非
常に重要である。 ある遺伝的病気または他の障害は、ある染色体
の数が増加することに起因するものであるが、遺
伝的病気の中には１つの劣性遺伝子の重複によつ
てのみ生じるものもある。そのような例のすべて
においては、存在する染色体または遺伝子の数を
測定することが重要である。 あるDNA分子の数、たとえば一定の遺伝子の
増幅の程度は、現在のとろこ、検討されるべく抽
出されたDNAを制限酵素を用いて消化すること
によつて、およびアガロースゲル電気泳動法によ
り長さにしたがつてヌクレオチド断片を分離する
ことによつて測定されている。つぎに、一本鎖
DNAは、ニトロセルロースフイルターに移され
固定され、そこで検討されるべき遺伝子またはプ
ローブとしてその遺伝子の一部を用いてハイブリ
ダイゼーシヨンが行なわれる。その結果はオート
ラジオグラフイーによつてえられる（サザン
（Southern）の「ジヤーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジオー（J.Mol.Biol.）、98巻、503
〜517頁（1975）」参照）。各々の並列して行なつ
た分析による細胞中のDNAの量は同じである。 ハイブリダイゼーシヨンバンド
（hybridization bands）の強度、すなわちシグナ
ル（signals）を比較し、テストサンプル中の検
討下の遺伝子のコピー数間の比が推定される。こ
の方法はおおよその結果を与えるにすぎない。同
様に、RNAが、ノーザン−プロツテイング法又
はドツト−プロツテイング法を用いて測定され
る。これらの方法は、定量的に非常に不正確なも
のである（トーマス（Thamas）の、「メソツ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methodsin
Enzymol）100巻、255〜266頁（1983）」参照）。 サザンプロツテイングおよびノーザンプロツテ
イングのような知られた方法はその役を果すには
時間がかかり、困難なものである。それらはおお
よそその結果を与えるにすぎないので、細胞のよ
うな一定のユニツトあたりのある核酸分子数を知
ることが重要であるばあいにはそれらの診断値
（diagnostic value）は疑わしいものである。 米国特許第4486539号および英国特許出願第
GB2169403号明細書に記載されたサンドイツチ
ハイブリダイゼーシヨン法または溶液ハイブリダ
イゼーシヨン法は定量的である（ヴイルタネン
（Virtanen）らの、「ランセント（Lancet）１巻、
381〜383ページ（1983）」参照）。さらに、本発明
の方法においては、コピー数が一定であり細胞、
核、リボソームまたは染色体のような一定のユニ
ツトあたりの関連した核酸分子数の測定を可能に
する標準核酸を必要とする。 本発明の目的は、現在用いられている方法より
時間がかからず簡便な核酸分子の正確かつ迅速な
定量方法を提供することにある。本発明は、メツ
センジヤーRNAの発現レベルの測定と同様にが
んおよび出産前の診断（prenatal diagnostics）
に、遺伝子を増幅させる因子の検出およびたとえ
ば薬剤耐性の発達を示すために用いることができ
る。 本発明においては少なくとの２つの測定が必要
である。１つはいくつかのコピーで存在している
かもしれない核酸分子、すなわち被験核酸を測定
する。他の１つは好都合にも一定数で存在してい
る構成（constitutive）核酸分子、すなわち標準
核酸を測定する。本発明による方法において、核
酸分子は10〜12個のヌクレオチドを有するあるヌ
クレオチド配列または数千個のヌクレヲチドを含
有する遺伝子を示す。また、それはメツセンジャ
ーRNAまたは単一遺伝子すなわちアムプリコー
ン（amplicone）よりかなり長くヌクレオチド配
列をも意味しうる。 被験核酸および標準核酸の測定は、たとえば米
国特許第4486539号明細書に記載されている他の
点で標準のサンドイツチハイブリダイゼーシヨン
法または英国特許出願第GB2169403号明細書に
記載されている溶液ハイブリダイゼーシヨン法を
用いて行なわれる。本発明はまた、少なくとも１
つの被験プローブペアー（pair）および、少なく
とも１つの標準プローブペアー、すなわち少なく
とも４つのプローブ、からなる核酸試薬を含有す
る試薬に関する。このような試薬は試薬キツト
（reagent kit）として用いるのが好ましい。 本発明の方法に用いる試薬またはプローブは、
組換えDNA技術を用いて、被験核酸および標準
核酸に充分に相同な核酸から調製される。また充
分に相同な核酸は、合成的および半合成的に調製
することができる。 被験核酸および標準核酸は細胞から直接に単離
され、種々のハイブリダイゼーシヨン技術によつ
て同定されてよい。しかしながら、そのような被
験核酸および標準核酸は商業的にかつ種々の遺伝
子バンク（gene banks）から入手することが可
能である。被験核酸および標準核酸はDNAまた
はRNAのいずれでもよい。 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法に適し
たプローブペアーは、組換えDNA技術によつて
被験核酸および標準核酸に充分に相同な核酸から
調製される。適当な制限酵素によつて関連する核
酸を消化し、互いに比較的接近して位置するえら
れた制限酵素断片の少なくとも２つを少なくとも
２つの適当なベクターにクローン化する。その断
片の１つは、目的の核酸で形成されたハイブリツ
ドの検出のためのプローブであり（以下、「デテ
クタープローブ」（detector probe）と称す）、適
当な検出しうる標識、たとえば125Iまたは32P、
で標識し、他の１つは、目的の核酸の固定のため
のプローブであり（以下、「キヤプチヤリングプ
ローブ」（capturing probe）と称す）、適当な担
体、たとえはニトロセルロースフイルター、に固
定する（affixed）か、またはアフイニテイーペ
アー（affinity pair）の相補的成分のような他の
物質によつてハイブリダイゼーシヨン混合物から
えられたハイブリツドの分離を可能にする物質を
キヤプチヤリングプローブに固定する。プローブ
ペアーはデテクタープローブおよびキヤプチヤリ
ングプローブからなる。 被験プローブペアーおよび標準プローブペアー
は、被験プローブペアーおよび標準プローブペア
ーの両方がDNAあるいはRNAであるか、被験プ
ローブペアーがDNAであつて標準プローブベア
ーがRNAであるかまたはその逆である適当な試
薬として組み合わせることできる。したがつてハ
イブリダイゼーシヨンを行なう前のサンプルの前
処理（pretreatment）および二次処理（further
treatment）およびハイブリダイゼーシヨンの条
件は、測定テストに用いたプローブペアーに従う
べきである。 本発明の方法は、細胞ホモジエネートから直接
的に核酸分子数を測定するのにとくに適してい
る。もちろん本発明の方法は精製されたまたは純
粋な核酸の測定にも用いることができる。しかし
ながら、本発明の方法を行なう前に、核酸サンプ
ルのもつとも適当な前処理が選択されるべきであ
る。 本発明の方法を用いて、DNAおよびRNAの両
方の測定を行なうことが可能である。デオキシリ
ボ核酸は必要であれば一本鎖をうるために変性さ
せる。ハイブリダイゼーシヨンテストを妨げる可
能性のある一本鎖メツセンジヤーRNA分子は、
たとえばアルカリ煮沸によつて加水分解すること
ができる。また、二本鎖デオキシリボ核酸は
RNA測定を妨害しないので、サンプルはリボ核
酸の測定に関しては変性されない。もちろん、デ
オキシリボヌクレアーゼでDNAを分解すること、
またはDNAを化学的かまたは機械的に変化させ
てDNAがハイブリダイゼーシヨン反応に関与し
えないように変えることが可能である。したがつ
てDNAおよびRNAの測定に関しては、サンプル
の二次処理のための適当な方法を選択しなければ
ならないか、あるいはこの二次処理を省略しても
よい。二次処理のための適当な方法の選択は、も
ちろん、核酸サンプルの前処理に用いた方法に左
右される。核酸サンプルの前処理および二次処理
のための多数の方法が文献に記載されており、そ
れらを用いたそれぞれのばあいにもつとも適当な
方法を選ぶことができる。 被験核酸および標準核酸の両方がDNAかまた
はRNAであるばあいの測定は、サンプルをその
まま用いて行なうことができる。被験核酸が
DNAであり標準核酸がRNAであるかまたはその
逆であるばあいの測定は、二次処理のための異な
る方法が必要であるので、DNAを含有する溶液
とRNAを含有する溶液にサンプルを分離して
別々に行なわなければならない。サンプルはもち
ろん、たとえ被験核酸および標準核酸が同じ核酸
タイプであるばあいにも分離されてもよい。 ハイブリダイゼーシヨンテスト自体は、分離さ
れていないサンプル溶液を少なくとも１つの被験
プローブペアーと１つの標準プローブペアーとに
同時に接触させることによつて行なわれる。サン
プル溶液が分離されているばあいには、そのサン
プル溶液は少なくとも１つの被験プローブペアー
と少なくとも１つの標準プローブペアーとに別々
に接触される。そのようなばあいには、被験核酸
の量は１つの反応容器内で測定され、標準核酸の
量は他の容器内で測定される。 サンプルが分割されているかいないかにかかわ
らず、ハイブリダイゼーシヨンはそれぞれのばあ
いにおいてもつとも有利な条件および時間で行な
われる。いつたん反応が起これば、えられる被験
ハイブリツドおよび標準ハイブリツドは担体によ
つてハイブリダイゼーシヨン混合液から分離され
洗浄されるか、またはアフイニテイーペアーの相
補的メンバーのような単離剤によつて分離され
る。被験ハイブリツドおよび標準ハイブリツドに
付加された標識は測定され、その結果は標準曲線
と比較される。このようにして検討されるべき核
酸分子の数は選ばれたユニツトあたりで測定する
ことができる。 本発明の方法はとくにがんのある種の型の検出
において実用的な診断上の意義がある。小細胞肺
がん腫（small cell lung carcinoma）におい
て、ｃ−myc遺伝子はしばしば増幅され、その発
現レベルは正常組織よりかなり高くなつている。
神経芽細胞腫の場合はＮ−myc遺伝子が増幅され
る。 本発明の方法はまた、ある薬剤の変異原作用も
しくは発がん作用または薬剤耐性の発生を説明す
るために用いることができる。選択の外的圧力が
ある種の遺伝子の発現を高めることになることが
知られている。がんの治療において、がん細胞は
遺伝子を増幅させることによつて投与された薬剤
に対する抵抗性をあらわし、その遺伝子の発現産
物は薬剤を不活化する。そのようなばあいの１つ
がジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR）に対す
る遺伝子の増幅を誘導するメソトレキセートであ
る。他の例としてはカドミウムの影響下でのメタ
ロチオニン（metallothionine）に対する遺伝子
の増幅がある。 遺伝子の発現レベルは細胞の表現型および機能
の見地から重要である。遺伝子の発現レベルは、
メツセンジヤーRNAによつてコードされた蛋白
質の量と相互関係があるメツセンジヤーRNAの
量を測定することによつて調べることができる。
がん遺伝子の転写生成物によつて究極的にどのよ
うに発現されるかが決定される。 がん遺伝子の発現レベルは細胞型、分化レベル
および細胞の発達期（phase）によつて左右され
変化する。たとえば、胎児の発育のある段階で
は、ｃ−mycがん遺伝子は迅速にコピーされる
が、他の段階ではたいへんゆつくりとコピーされ
る。遺伝子の発現レベルは増幅なしに著しく増加
するかもしれないが、増幅の程度はしばしば遺伝
子の発現レベルと相関がある。そのようなばあい
には、がん遺伝子の役割はコピーの数よりむしろ
その発現レベルを測定することによつてもつとも
よく決定される。いくつかのばあいには、メツセ
ンジヤーRNAの定量は遺伝子生成物自体の定量
より簡便で便利である。そのような例としてはｃ
−mycガン遺伝子、熱によつて容易に凝固する不
安定な蛋白質をあげることができる。 本発明の方法は、ダウン症候群のような数字上
の染色体異常を確認するために用いることもでき
る。また、出産前の診断においては、胎児に欠陥
があるかどうか、すなわちある劣性遺伝子に対し
て同形（homozygous）であるかどうかの決定を
することも可能である。 つぎに本発明の定量法およびそれに用いる核酸
試薬を実施例を用いてさらに詳しく説明するが、
本発明はかかる実施例のみに限定されるものでは
ない。 実施例 １ 増幅されたがん遺伝子の定量 (a) 核酸試薬およびその調製 (1) 標準プローブ （細胞標準核酸） ｃ−Ki−ras遺伝子はすべてのヒト細胞に存
在する。サンドイツチハイブリダイゼーシヨンの
ためのプローブペアーは、ｃ−Ki−ras遺伝子
のHind断片をサブクローン化し長さ3.8kbを測
定することによつて調製した。制限酵素地図はチ
ヤング（chang）らによつて「プロシーデイング
ス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サインス（PNAS）79巻、4848〜4852頁（1982）」
に記載されている。該断片は、たとえばプラスミ
ドpBR322（ATCC 41032）にクローン化して入
手可能であり、たとえばアメリカ・タイプ・カル
チヤー・コレシクシヨン（ATCC）からうること
ができる。 （細胞標準核酸の二次処理） 前記記載のpBR322クローンを制限酵素Bgl
およびHindで処理し、えられた断片をアガロ
ースゲルから単離した。互いに近接して位置する
精製された断片を、デテクタープローブおよびキ
ヤプチヤリングローブー調製用として２つの適当
なベクターにサブクローン化した。 （標準デテクタープローブ） 長さが役1.1kbのBgl−Bgl断片をプラスミ
ドpBR322のBamH制限酵素部位にサブクロー
ン化し、125で標識されたdCTPを用いてニツ
クトランスレーシヨンによつて標識した。 （標準チヤプチヤリングプローブ） Bgl−Hind断片役0.5kbをM13mp10および
M13mp11フアージベクターの制限酵素BgmH
およびHindの制限酵素部位間に挿入し、つい
でそれを150ngDNA／直径１cmにニトロセルロ
ースフイルターの固定した。 (2) 被験プローブ （被験核酸） サンドイツチハイブリダイゼーシヨンのための
プローブペアーを、たとえばATCCからうること
ができる（ATCC41010）クローン化ｃ−myc遺
伝子から調製した。その遺伝子の制限酵素地図は
ワツト（Watt）らの、「プロシーデイングス・オ
ブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス80巻、6307〜6311頁（1983）」に記載されて
いる。 （被験核酸の二次処理） 前記ｃ−myc遺伝子を制限酵素Hind、Xba
およびPstで処理し、その断片をアガロース
ゲルから単離し、精製し、デテクタープローブお
よびキヤプチヤリングプローブを調製するために
適当なベクターにサブクローン化した。 （被験デテクタープローブ） 前記ｃ−myc遺伝子のHind−Xba制限酵
素断片3.7kbの一本鎖テール（tails）をDNAポリ
メラーゼによつて二本鎖にした。Hindリンカ
ーを、えられた平滑末端DNA断片にT4−DNA
−リガーゼを用いて挿入した。フエノール抽出を
行なつたあと、DNAを制限酵素Hindで処理し
た。ついで、そのDNA断片を制限酵素Hindの
制限酵素部位でプラスミドpBR322にクローン化
し、125で標識されたdCTPを用いてニツクト
ランスレーシヨンによつて標識した。 （被験キヤプチヤリングプローブ） ｃ−myc遺伝子のXba−Pst断片1.1kbを
M13mp10およびM13mp11フアージクローニング
ベクターの制限酵素XbaおよびPstの制限酵
素部位間にクローン化し、ついでそれを
150ngDNA／直径１cmでニトロセルロースフイ
ルターに固定した。 (b) 標準曲線の測定 標準曲線の測定に用いたサンプルはｃ−myc遺
伝子のアルカリ変性pBR322クローンからなつて
いた。前記被験プローブを加えたサンドイツチハ
イブリダイゼーシヨン溶液は４×SSC、１×デン
ハルト液、ニシン精液（herring sperm）
DNA200μｇ／mlおよび0.2％SDSからなつてい
た。ハイブリダイゼーシヨンを65℃で17〜19時間
行ない、ついでそのフイルターを50℃で洗浄容液
（0.1×SSCおよび0.2％SDS）中で洗浄した。つぎ
にサンドイツチハイブリツドに付加された標識を
ガンマカウンター中で計測した。えられた標準曲
線を第１表に示す。
【表】
(c) 遺伝子数の測定
サンプルは(1)のヒトの胎盤由来の細胞、および
(2)たとえばATCCからえられる（ATCC−
CCC220）Colo320細胞を用いた。DNAを両方の
サンプルから単離し、アルカリ煮沸によつて変性
された同量の細胞DNAを、サンプルとしてテス
トに供した。アルカリ変性はサンプル中に存在す
るあらゆるRNAを加水分解した。 テストはｃ−mycフイルターおよびｃ−Ki−
rasフイルターと各サンプルについて標準DNA
および被験DNAの両方を測定することを可能に
する２つの標識した試薬を各サンプルに添加する
ことによつて行つた。ｃ−Ki−rasの測定に基
づいて、各サンプルは同量のDNAを含有するこ
とが見出され、Colo320の細胞におけるｃ−myc
遺伝子は正常な状態におけるよりも約16〜20倍高
いコピー数で存在すると推定されうる。その結果
を第２表に示す。
(2)たとえばATCCからえられる（ATCC−
CCC220）Colo320細胞を用いた。DNAを両方の
サンプルから単離し、アルカリ煮沸によつて変性
された同量の細胞DNAを、サンプルとしてテス
トに供した。アルカリ変性はサンプル中に存在す
るあらゆるRNAを加水分解した。 テストはｃ−mycフイルターおよびｃ−Ki−
rasフイルターと各サンプルについて標準DNA
および被験DNAの両方を測定することを可能に
する２つの標識した試薬を各サンプルに添加する
ことによつて行つた。ｃ−Ki−rasの測定に基
づいて、各サンプルは同量のDNAを含有するこ
とが見出され、Colo320の細胞におけるｃ−myc
遺伝子は正常な状態におけるよりも約16〜20倍高
いコピー数で存在すると推定されうる。その結果
を第２表に示す。
【表】
(注) ＊：ブランクフイルターからの読み取り
値はおのおのの読み取り値から減じた。
実施例 ２ 増殖された遺伝子の定量 (a) 核酸試薬およびその調製 (1) 標準プローブ （細胞標準核酸） 対照核酸はマウス中のメタロチオニンのプロモ
ーター領域、すなわちMT遺伝子DNAは直近上
流に存在する。MT遺伝子の構造は、パブラキス
（Pavlakis）およびハマー（Hamer）の、「プロ
シーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス、80巻、397〜401頁、
（1983）年」に記載されている。参照核酸断片は、
たとえはベクターpBPV−MMneo（432−12）
（ATCC37224）にクローン化して利用可能であ
り、たとえばATCCからうることができる。 （細胞標準核酸の二次処理） 前記MT遺伝子を、プラスミドpAT153中にサ
ブクローン化するために制限酵素Kpn，Bgl
およびEcoRで処理した。Kpnテールをリン
カーでHindテールに変換した。 （標準デテクタープローブ） メタロチオニン遺伝子のプロモーター領域の上
流に位置するEcoR−Kpn−（Hind）約
1.2kb断片を制限酵素EcoRおよびHindの制
限酵素部位間でプラスミドpAT153にクローン化
し、ついで32Pで標識されたヌクレオシドトリホ
スフエートを用いてニツクトランスレーシヨンに
よつて標識した。 （標準キヤプチヤリングプローブ） メタロチオニン遺伝子のプロモーター領域およ
びその上流領域からなるKpn−Bgl断片
0.8kbを制限酵素KpnおよびBamHの制限酵
素部位間でフアージベクターM13mp18および
M13mp19にクローン化し、ついでニトロセルロ
ースフイルターに固定した。 (2) 被験プローブ （被験核酸） サンドイツチハイブリダイゼーシヨンテストの
ためのプローブペアーを市販のプラスミド
pMTVdhfr（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Bethesda Research Laboratories）社製、
製品番号5369SS）を用いて調製した。該プラス
ミドの構造は、リー（Lee）らの「ネーチヤー
（nature）294巻、228〜232頁（1981）」に記載さ
れている。 （被験核酸の二次処理） ジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR）遺伝子
のcDNAを含有するプラスミドpMTVdhfnを制
限酵素HindおよびBglで処理した。 （被験デテクタープローブ） プラスミドpMTVdhfrのDHFR遺伝子をコー
ドする領域に対応するHind−Bgl断片0.75kb
を制限酵素HindおよびBamHの制限酵素部
位間プラスミドベクターpAT153中に挿入し、つ
いでそれを32Pで標識されたヌクレオシドトリホ
スフエートを用いたニツクトランスレーシヨンす
ることによつて標識した。 （被験キヤプチヤリングプローブ） プラスミドpMTVdhfrのMMTV遺伝子領域か
ら採られたHind断片1.4kbをM13mp18および
M13mp19フアージベクター中にクローン化し、
ついでそれを150ngDNA／直径１cmでニトロセ
ルロースフイルターに固定した。 (b) 標準曲線の測定 テスト用のサンプルはプラスミドpMTVdhfr
からの精製DNAであつた。テスト自体は、計測
のために液体シンチレーシヨウンカウンターを用
いたほかは実施例１(b)に記載されたようにして行
なつた。えられた標準曲線を第３表に示す。
値はおのおのの読み取り値から減じた。
実施例 ２ 増殖された遺伝子の定量 (a) 核酸試薬およびその調製 (1) 標準プローブ （細胞標準核酸） 対照核酸はマウス中のメタロチオニンのプロモ
ーター領域、すなわちMT遺伝子DNAは直近上
流に存在する。MT遺伝子の構造は、パブラキス
（Pavlakis）およびハマー（Hamer）の、「プロ
シーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス、80巻、397〜401頁、
（1983）年」に記載されている。参照核酸断片は、
たとえはベクターpBPV−MMneo（432−12）
（ATCC37224）にクローン化して利用可能であ
り、たとえばATCCからうることができる。 （細胞標準核酸の二次処理） 前記MT遺伝子を、プラスミドpAT153中にサ
ブクローン化するために制限酵素Kpn，Bgl
およびEcoRで処理した。Kpnテールをリン
カーでHindテールに変換した。 （標準デテクタープローブ） メタロチオニン遺伝子のプロモーター領域の上
流に位置するEcoR−Kpn−（Hind）約
1.2kb断片を制限酵素EcoRおよびHindの制
限酵素部位間でプラスミドpAT153にクローン化
し、ついで32Pで標識されたヌクレオシドトリホ
スフエートを用いてニツクトランスレーシヨンに
よつて標識した。 （標準キヤプチヤリングプローブ） メタロチオニン遺伝子のプロモーター領域およ
びその上流領域からなるKpn−Bgl断片
0.8kbを制限酵素KpnおよびBamHの制限酵
素部位間でフアージベクターM13mp18および
M13mp19にクローン化し、ついでニトロセルロ
ースフイルターに固定した。 (2) 被験プローブ （被験核酸） サンドイツチハイブリダイゼーシヨンテストの
ためのプローブペアーを市販のプラスミド
pMTVdhfr（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Bethesda Research Laboratories）社製、
製品番号5369SS）を用いて調製した。該プラス
ミドの構造は、リー（Lee）らの「ネーチヤー
（nature）294巻、228〜232頁（1981）」に記載さ
れている。 （被験核酸の二次処理） ジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR）遺伝子
のcDNAを含有するプラスミドpMTVdhfnを制
限酵素HindおよびBglで処理した。 （被験デテクタープローブ） プラスミドpMTVdhfrのDHFR遺伝子をコー
ドする領域に対応するHind−Bgl断片0.75kb
を制限酵素HindおよびBamHの制限酵素部
位間プラスミドベクターpAT153中に挿入し、つ
いでそれを32Pで標識されたヌクレオシドトリホ
スフエートを用いたニツクトランスレーシヨンす
ることによつて標識した。 （被験キヤプチヤリングプローブ） プラスミドpMTVdhfrのMMTV遺伝子領域か
ら採られたHind断片1.4kbをM13mp18および
M13mp19フアージベクター中にクローン化し、
ついでそれを150ngDNA／直径１cmでニトロセ
ルロースフイルターに固定した。 (b) 標準曲線の測定 テスト用のサンプルはプラスミドpMTVdhfr
からの精製DNAであつた。テスト自体は、計測
のために液体シンチレーシヨウンカウンターを用
いたほかは実施例１(b)に記載されたようにして行
なつた。えられた標準曲線を第３表に示す。
【表】
(c) 遺伝子数の測定
DHFR遺伝子のmRNA対応する種々の量の
cDNAにトランスフエクシヨンされたものであつ
て、ATCCから入手可能なマウス繊維芽細胞
NIH3T3由来の株化細胞（ATCC CRL1658）を
細胞培養プレートで培養し、サンプルとして用い
た。その細胞をドデシル硫酸ナトリウムを用いて
溶解し、ついでそのDNAを注射器から皮下注射
針を通してしぼり出すことによつて切断した。約
106個の細胞に相当するサンプル250μをホモジ
エネートから採り、これにNaOH50μを添加し
た。サンプルを煮沸し、酢酸およびハイブリダイ
ゼーシヨン混合液で中和した。その全量は0.5ml
であつた。前記プローブすべてを同時に加え、い
わゆるブランクフイルターを基礎対照
（background control）として加えた。計測のた
めに液体シンチレーシヨンカウンターを用いたほ
かは実施例１(b)と同様にしてハイブリダイゼーシ
ヨン、洗浄および標識計測を行なつた。その結果
を第４表に示す。
cDNAにトランスフエクシヨンされたものであつ
て、ATCCから入手可能なマウス繊維芽細胞
NIH3T3由来の株化細胞（ATCC CRL1658）を
細胞培養プレートで培養し、サンプルとして用い
た。その細胞をドデシル硫酸ナトリウムを用いて
溶解し、ついでそのDNAを注射器から皮下注射
針を通してしぼり出すことによつて切断した。約
106個の細胞に相当するサンプル250μをホモジ
エネートから採り、これにNaOH50μを添加し
た。サンプルを煮沸し、酢酸およびハイブリダイ
ゼーシヨン混合液で中和した。その全量は0.5ml
であつた。前記プローブすべてを同時に加え、い
わゆるブランクフイルターを基礎対照
（background control）として加えた。計測のた
めに液体シンチレーシヨンカウンターを用いたほ
かは実施例１(b)と同様にしてハイブリダイゼーシ
ヨン、洗浄および標識計測を行なつた。その結果
を第４表に示す。
【表】
(注) ＊：おのおのの読み取り値はブランクフイルタ
ーの読み取り値を減じたものである。
MT遺伝子は、サンプルに存在する細胞数を測
定する内部マーカー（internal marker）であ
る。えられた結果は、このテストにおいて106個
の細胞数が165＋20cpmのMT特異的シグナルを
与えたことを示している。 DHFR試薬はDHFR−cDNAの量を測定する。
細胞の数はMT特異的シグナルから推定された。
このように、種々の株化細胞におけるDHFR−
cDNAコピー数の測定は第４表に示すように可能
である。 実施例 ３ メツセンジヤーRNAの定量 実施例２に記載した被験プローブを用いて、
DHFR−cDNA由来のmRNAの量を測定するこ
とも可能である。プラスミドpMTVdhfrの構造
は、DHFR遺伝子の転写がMMTVプロモーター
で始まるようなものである。生じるメツセンジヤ
ーは長さが約1.0kbである。このうち、約0.25kb
はプロモーターMMTV領域由来のものであり、
その残りはDHFR−cDNAからのものである
（リーらの「ネイチヤー、294巻、228〜232頁
（1981）」参照）。 (1) 標準プローブ 細胞標準核酸、標準デテクタープローブおよび
標準キヤプチヤリングプローブは実施例２に記載
したのと同様であつた。 (2) 被験プローブ 被験核酸、被験デテクタープローブおよび被験
キヤプチヤリングプローブは実施例２に記載した
のと同様であつた。 (b) 標準曲線の測定 インビトロ転写によつて調製されたジヒドロ葉
酸リダクターゼに対応するメツセンジヤーRNA
からなるサンプルを標準曲線測定に用いた。その
転写に必要とされるDNAをプラスミド
pMTVdhfrのMMTVプロモーターのHind断
片1.4kbおよびHind−Bgl断片（DHFR−
cDNA）0.75kbを互いに隣接させて制限酵素
HindおよびBamHの制限酵素部位間でプラ
スミドpSP64中にサブクローン化することによつ
て調製した。サンプルRNAを0.2％SDS水溶液に
蓄えた。サンドイツチハイブリダイゼーシヨンテ
ストを、変性は行なわなかつたほかは実施例１(b)
および実施例２(b)に記載したようにして行なつ
た。えられた標準曲線を第５表に示す。
ーの読み取り値を減じたものである。
MT遺伝子は、サンプルに存在する細胞数を測
定する内部マーカー（internal marker）であ
る。えられた結果は、このテストにおいて106個
の細胞数が165＋20cpmのMT特異的シグナルを
与えたことを示している。 DHFR試薬はDHFR−cDNAの量を測定する。
細胞の数はMT特異的シグナルから推定された。
このように、種々の株化細胞におけるDHFR−
cDNAコピー数の測定は第４表に示すように可能
である。 実施例 ３ メツセンジヤーRNAの定量 実施例２に記載した被験プローブを用いて、
DHFR−cDNA由来のmRNAの量を測定するこ
とも可能である。プラスミドpMTVdhfrの構造
は、DHFR遺伝子の転写がMMTVプロモーター
で始まるようなものである。生じるメツセンジヤ
ーは長さが約1.0kbである。このうち、約0.25kb
はプロモーターMMTV領域由来のものであり、
その残りはDHFR−cDNAからのものである
（リーらの「ネイチヤー、294巻、228〜232頁
（1981）」参照）。 (1) 標準プローブ 細胞標準核酸、標準デテクタープローブおよび
標準キヤプチヤリングプローブは実施例２に記載
したのと同様であつた。 (2) 被験プローブ 被験核酸、被験デテクタープローブおよび被験
キヤプチヤリングプローブは実施例２に記載した
のと同様であつた。 (b) 標準曲線の測定 インビトロ転写によつて調製されたジヒドロ葉
酸リダクターゼに対応するメツセンジヤーRNA
からなるサンプルを標準曲線測定に用いた。その
転写に必要とされるDNAをプラスミド
pMTVdhfrのMMTVプロモーターのHind断
片1.4kbおよびHind−Bgl断片（DHFR−
cDNA）0.75kbを互いに隣接させて制限酵素
HindおよびBamHの制限酵素部位間でプラ
スミドpSP64中にサブクローン化することによつ
て調製した。サンプルRNAを0.2％SDS水溶液に
蓄えた。サンドイツチハイブリダイゼーシヨンテ
ストを、変性は行なわなかつたほかは実施例１(b)
および実施例２(b)に記載したようにして行なつ
た。えられた標準曲線を第５表に示す。
【表】
(c) メツセンジヤーRNA分子数の測定
DHFR遺伝子に対応するメツセンジヤーRNA
分子の数を実施例２に記載した株化細胞から測定
した。 細胞をドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶解
し、そのDNAを注射器から細い皮下注射針を通
してしぼり出すことによつて切断した。約５×
106個の細胞に相当するホモジエネートのサンプ
ル250μを採つた。ついでホモジエネートを変
性することなく、サンドイツチハイブリダイゼー
シヨンテストに供した。サンドイツチハイブリダ
イゼーシヨンはDHFRプローブのみをハイブリ
ダイゼーシヨン溶液に添加したほかは、実施例２
(c)および実施例１(b)に記載したのと同様に起つ
た。ホモジエネート250μの並列して行なつた
テストサンプルにおいて、細胞数をMTプローブ
を用いて、実施例２(c)に記載したようにして測定
した。その結果第６表を示す。
分子の数を実施例２に記載した株化細胞から測定
した。 細胞をドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶解
し、そのDNAを注射器から細い皮下注射針を通
してしぼり出すことによつて切断した。約５×
106個の細胞に相当するホモジエネートのサンプ
ル250μを採つた。ついでホモジエネートを変
性することなく、サンドイツチハイブリダイゼー
シヨンテストに供した。サンドイツチハイブリダ
イゼーシヨンはDHFRプローブのみをハイブリ
ダイゼーシヨン溶液に添加したほかは、実施例２
(c)および実施例１(b)に記載したのと同様に起つ
た。ホモジエネート250μの並列して行なつた
テストサンプルにおいて、細胞数をMTプローブ
を用いて、実施例２(c)に記載したようにして測定
した。その結果第６表を示す。
【表】
(注)：おのおのの読み取り値はブランクフイルターの
読み取り値を減じたものである。
その結果は株化細胞がDHFR遺伝子から１
細胞あたり約100個のメツセンジヤーRNA分子を
産生し、株化細胞がDHFR遺伝子から１細胞
あたり約500個のメツセンジヤーRNA分子を産生
したことを示していた。 実施例 ４ 溶液ハイブリダイゼーシヨンによる増幅さた遺
伝子の定量 (a) 核酸試薬およびその調製 (1) 標準プローブ 細胞標準核酸、標準デテクタープローブおよび
標準キヤプチヤリングプローブは実施例２と同様
のものを用いた。プラスミドpAT153のEcoR
−Kpn−（Hind）断片1.2kbを、ニツクトラ
ンスレーシヨンにより125で標識したデオキシ
シチジンで標識した。M13mp18およびM13mp19
フアージベクターのKpn−Bgl断片0.8kbを、
フオトプローブTM（photoprobeTM）試薬（ベクタ
ー・ラボラトリーズ（Vector Laboratories）社
製、カルフオルニア（CA）、USA、製品番号SP
−1000）を用いビオチンで修飾した。 (2) 被験プローブ 試験核酸、被験デテクタープローブおよび被験
キヤプチヤリングプローブは実施例２と同様のも
のを用いた。プラスミドpAT153のHind−Bal
断片0.75kbを125で標識したデオキシシチジ
ンで標識した。M13mp18およびM13mp19フアー
ジベクターのHind断片1.4kbを前記フオトプロ
ーブTMを用いてビオチン化（biotinylated）した。 (b) 標準曲線の決定 知られた量の細胞を用いて細胞標準曲線を作成
し、その曲線からMT−遺伝子を認識する標準プ
ローブを用いてハイブリダイゼーシヨンシグナル
を測定した。プラスミドpMTVdhfrおよびこの
プラスミドを認識する被験プローブを用いて被験
核酸標準曲線を作成した。0.6M NaCl、20mM
リン酸バツフアー（PH7.5）、1mM EDTAおよび
４％ポリエチレングリコール（PEG6000）から
なる溶液200μ中で70℃中で１，５時間ハイブ
リダイゼーシヨンを行なつた。反応後、ストレプ
トアビシン−アガロース（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ社製、メリーランド、USA、製
品番号5942SA）50μおよび1M NaCl、10mM
リン酸ナトリウム（PH7.5）および1mM EDTA
を最終容量500μまで添加した。ハイブリツド
をストレプトアビジン−アガロース上で37℃で15
分間集めた。アガロースを37℃の1M NaCl緩衝
液で５分間で１度、つぎに55℃の15mM NaCl、
1.5mMクエン酸ナトリウムで２分間で２度洗浄
した。ガンマカウンター中でアガロースを測定す
ることによつて結合したハイブリツドの量を測定
した（シベネン（Syvａ¨nen）らの「ヌクレイツ
ク・アシツズ・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）」14巻、5037〜5048頁（1986）参照）。結果
を第７表および第８表に示す。
読み取り値を減じたものである。
その結果は株化細胞がDHFR遺伝子から１
細胞あたり約100個のメツセンジヤーRNA分子を
産生し、株化細胞がDHFR遺伝子から１細胞
あたり約500個のメツセンジヤーRNA分子を産生
したことを示していた。 実施例 ４ 溶液ハイブリダイゼーシヨンによる増幅さた遺
伝子の定量 (a) 核酸試薬およびその調製 (1) 標準プローブ 細胞標準核酸、標準デテクタープローブおよび
標準キヤプチヤリングプローブは実施例２と同様
のものを用いた。プラスミドpAT153のEcoR
−Kpn−（Hind）断片1.2kbを、ニツクトラ
ンスレーシヨンにより125で標識したデオキシ
シチジンで標識した。M13mp18およびM13mp19
フアージベクターのKpn−Bgl断片0.8kbを、
フオトプローブTM（photoprobeTM）試薬（ベクタ
ー・ラボラトリーズ（Vector Laboratories）社
製、カルフオルニア（CA）、USA、製品番号SP
−1000）を用いビオチンで修飾した。 (2) 被験プローブ 試験核酸、被験デテクタープローブおよび被験
キヤプチヤリングプローブは実施例２と同様のも
のを用いた。プラスミドpAT153のHind−Bal
断片0.75kbを125で標識したデオキシシチジ
ンで標識した。M13mp18およびM13mp19フアー
ジベクターのHind断片1.4kbを前記フオトプロ
ーブTMを用いてビオチン化（biotinylated）した。 (b) 標準曲線の決定 知られた量の細胞を用いて細胞標準曲線を作成
し、その曲線からMT−遺伝子を認識する標準プ
ローブを用いてハイブリダイゼーシヨンシグナル
を測定した。プラスミドpMTVdhfrおよびこの
プラスミドを認識する被験プローブを用いて被験
核酸標準曲線を作成した。0.6M NaCl、20mM
リン酸バツフアー（PH7.5）、1mM EDTAおよび
４％ポリエチレングリコール（PEG6000）から
なる溶液200μ中で70℃中で１，５時間ハイブ
リダイゼーシヨンを行なつた。反応後、ストレプ
トアビシン−アガロース（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ社製、メリーランド、USA、製
品番号5942SA）50μおよび1M NaCl、10mM
リン酸ナトリウム（PH7.5）および1mM EDTA
を最終容量500μまで添加した。ハイブリツド
をストレプトアビジン−アガロース上で37℃で15
分間集めた。アガロースを37℃の1M NaCl緩衝
液で５分間で１度、つぎに55℃の15mM NaCl、
1.5mMクエン酸ナトリウムで２分間で２度洗浄
した。ガンマカウンター中でアガロースを測定す
ることによつて結合したハイブリツドの量を測定
した（シベネン（Syvａ¨nen）らの「ヌクレイツ
ク・アシツズ・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）」14巻、5037〜5048頁（1986）参照）。結果
を第７表および第８表に示す。
【表】
【表】
(c) 遺伝子数の測定
およそ２×106細胞に相当するサンプルあたり
の容量が125μであつたほかは、同様の方法に
したがつて実施例２に記載した株化細胞のサンプ
ルを処理した。細胞数および被験核酸分子数の測
定を、細胞サンプル、適当なデテクタープローブ
およびキヤプチヤリングプローブ、およびハイブ
リダイゼーシヨン混合物の成分を最終容量200μ
まで添加することによつて別々のバイアル中で
行なつた。細胞標準DNAまたは細胞被験DNAを
用いない対照アツセイも行なつた。ハイブリダイ
ゼーシヨン、ハイブリツドの収集、洗浄および測
定を実施例４(b)に記載したようにして行なつた。
実施例４(b)に記載したように平行して作成された
標準曲線から結果を読みとつた。えられた結果を
第９表に示す。
の容量が125μであつたほかは、同様の方法に
したがつて実施例２に記載した株化細胞のサンプ
ルを処理した。細胞数および被験核酸分子数の測
定を、細胞サンプル、適当なデテクタープローブ
およびキヤプチヤリングプローブ、およびハイブ
リダイゼーシヨン混合物の成分を最終容量200μ
まで添加することによつて別々のバイアル中で
行なつた。細胞標準DNAまたは細胞被験DNAを
用いない対照アツセイも行なつた。ハイブリダイ
ゼーシヨン、ハイブリツドの収集、洗浄および測
定を実施例４(b)に記載したようにして行なつた。
実施例４(b)に記載したように平行して作成された
標準曲線から結果を読みとつた。えられた結果を
第９表に示す。
【表】
(注) ＊：細胞標準または細胞被験核酸を用いない対
照アツセイからの値は減じてある。
照アツセイからの値は減じてある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ユニツト中にいくつかのコピーで存在する可
能性のある被験核酸分子数を該ユニツト中に好都
合にも一定数で存在する選ばれた標準核酸分子数
と比較することによつて測定するサンドイツチハ
イブリダイゼーシヨンまたは溶液ハイブリダイゼ
ーシヨンによる核酸分子の定量法であつて、 (a) 核酸を含有するサンプルが、該核酸がハイブ
リダイゼーシヨン反応を行ないえない形態で初
めから存在するばあいには、ハイブリダイゼー
シヨン反応を行うことが可能な形態となるよう
に、または該核酸がハイブリダイゼーシヨン反
応を妨ぐ可能性があるばあいには、ハイブリダ
イゼーシヨン反応を妨げない形態となるよう
に、処理され、 (b) 該核酸が、いくつかのコピーで存在する可能
性のある被験核酸分子に充分に相同な１つの被
験プローブペアー、および好都合にも一定数で
存在する核酸分子に充分に相同な１つの標準プ
ローブペアーの少なくとも２つのペアーの核酸
とハイブリダイズされ、該プローブペアーが、
標識されたデテクタープローブおよび適当な担
体に固定されているかえられたハイブリツドの
単離を可能にする物質に固定されているキヤプ
チヤリングプローブからなり、 (c) ハイブリダイゼーシヨン反応が行なわれたの
ち、被験ハイブリツドおよび標準ハイブリツド
が必要なばあいには分離され、デテクタープロ
ーブに付加された該標識が測定され、一定のユ
ニツトあたりの核酸分子数が、被験核酸数と標
準核酸数とを比較することによつてえられるこ
とを特徴とするサンドイツチハイブリダイゼー
シヨンまたは溶液ハイブリダイゼーシヨンによ
る核酸分子の定量法。 ２ 被験核酸および標準核酸がデオキシリボ核酸
である特許請求の範囲第１項記載の定量法。 ３ 被験核酸がリボ核酸であり標準核酸がデオキ
シリボ核酸である特許請求の範囲第１項記載の定
量法。 ４ 被験核酸および標準核酸がリボ核酸である特
許請求の範囲第１項記載の定量法。 ５ 被験核酸がデオキシリボ核酸であり標準核酸
がリボ核酸である特許請求の範囲第１項記載の定
量法。 ６ ヒトｃ−Ki−ras遺伝子のHind断片の
Bgl−Bgl断片1.1kbからなる組み換えプラス
ミドであつて、該Hind断片がプラスミド
pBR322中にクローン化されており該Bgl−Bgl
断片がプラスミドpBR322の制限酵素BamH
の制限酵素部位中にサブクローン化されたもので
ある標準プローブペアーのデテクタープローブ、
およびヒトｃ−Ki−ras遺伝子のHind断片の
Bgl−Hind断片0.5kbからなる組み換えフア
ージであつて、該Hind断片がプラスミド
pBR322中にクローン化されており該Bgl−
Hind断片がM13mp10およびM13mp11フアー
ジベクターの制限酵素BamHおよびHindの
制限酵素部位間にサブクローン化されたものであ
る標準プローブペアーのキヤプチヤリングプロー
ブが、個々にまたは被験プローブペアーととも
に、分離されていないかまたは必要なときには分
離された核酸サンプルと接触させられる特許請求
の範囲第１項、第２項または第３項記載の定量
法。 ７ マウスメタロチオニン遺伝子のプロモーター
領域の上流からのEcoRI−KpnI（Hind）断片
1.2kbからなる組み換えプラスミドであつて、該
断片がプラスミドpAT153の制限酵素EcoRお
よびHindの制限酵素部位間にサブクローン化
されたものである標準プローブペアーのデテクタ
ープローブ、およびメタロチオニン遺伝子のプロ
モーター領域およびその上流領域からのKpn−
Bgl断片0.8kbからなる組み換えフアージであ
つて、該断片がM13mp18およびM13mp19フアー
ジベクターの制限酵素KpnおよびBamHの
制限酵素部位間にサブクローン化されたものであ
る標準プローブペアーのキヤプチヤリングプロー
ブが、個々にまたは被験プローブペアーととも
に、分離されていないかまたは必要なときには分
離された核酸サンプルと接触させられる特許請求
の範囲第１項、第２項または第３項記載の定量
法。 ８ ｃ−mycがん遺伝子の増幅の程度および／ま
たは該遺伝子に対応するメツセンジヤーRNA分
子の数を測定するために、ｃ−myc遺伝子の
Hind−Xba断片3.7kbからなる組み換えプラ
スミドであつて、該断片がプラスミドpBR322の
制限酵素Hindの制限酵素部位にサブクローン
化されたものである被験プローブペアーのデテク
タープローブ、およびｃ−myc遺伝子のXba−
Pst断片1.1kbからなる組み換えフアージであつ
て、該断片がM13mp10およびM13mp11フアージ
ベクターの制限酵素XbaおよびPatの制限酵
素部位間にサブクローン化されたものである被験
プローブペアーのキヤプチヤリングプローブが、
個々にまたは標準プローブペアーとともに、分割
されていないかまたは必要なときには分割された
核酸サンプルと接触させられる特許請求の範囲第
１項、第２項、第５項、第６項または第７項記載
の定量法。 ９ ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはDHFR遺
伝子の増幅の程度および／または該遺伝子に対応
するメツセンジヤーRNA分子の数を測定するた
めに、プラスミドpMTVdhfrのDHFR遺伝子を
コードするHind−Bgl断片0.75kbからなる組
み換えプラスミドであつて、該断片がプラスミド
ベクターpAT153の制限酵素Hindおよび
BamHの制限酵素部位間にサブクローン化さ
れたものである被験プローブペアーのデテクター
プローブ、およびプラスミドpMTVdhfrの
MMTV遺伝子領域のHind断片1.4kbからなる
組み換えフアージであつて、該断片がM13mp18
およびM13mp19フアージベクターの制限酵素
Hindの制限酵素部位間にサブクローン化され
たものである被験プローブペアーのキヤプチヤリ
ングプローブが、個々にまたは標準プローブペア
ーとともに、分割されていないかまたは必要なと
きには分割された核酸サンプルと接触させられる
特許請求の範囲第１項、第２項、第５項、第６項
または第７項記載の定量法。 １０ 少なくとも１つの被験プローブペアーおよ
び少なくとも１つの標準プローブペアーを含有
し、該被験プローブペアーおよび該標準プローブ
ペアーの両方のデテクタープローブが適当な標識
で標識されており、該被験プローブペアーおよび
該標準プローブペアーの両方のキヤプチヤリング
プローブが適当な担体に固定されているかまたは
サンドイツチハイブリツドの単離を可能にする物
質が該キヤプチヤリングプローブに固定されてい
ることを特徴とする核酸分子の定量のための試
薬。 １１ ｃ−mycがん遺伝子の増幅の程度および／
または該遺伝子に対応するメツセンジヤーRNA
分子の数の測定に用いる被験プローブペアーのデ
テクタープローブがｃ−myc遺伝子のHind−
Xba制限酵素断片3.7kbからなる組み換えプラ
スミドであり、該断片がプラスミドpBR322の制
限酵素Hindの制限酵素部位にサブクローン化
されており、被験プローブペアーのキヤプチヤリ
ングプローブが該ｃ−myc遺伝子のXba−Pst
断片1.1kbからなる組み換えフアージであり、
該断片がM13mp10およびM13mp11フアージベク
ターの制限酵素XbaおよびPatの制限酵素部
位間にサブクローン化されており、標準プローブ
ペアーのデテクタープローブがヒトｃ−Ki−ras
遺伝子のHind断片のBgl−Bgl断片
1.1kbであり、該Hind断片がプラスミド
pBR322にクローン化されており、該Bgl−Bgl
断片がプラスミドpBR322の制限酵素BamH
の制限酵素部位にサブクローン化されており、標
準プローブペアーのキヤプチヤリングプローブが
該ｃ−Ki−ras遺伝子のHind断片のBgl−
Hind断片0.5kbからなる組み換えフアージであ
り、該Hind断片が該ｃ−Ki−ras遺伝子のプ
ラスミドpBR322にサブクローン化されており、
該Bgl−Hind断片がM13mp10および
M13mp11フアージベクターの制限酵素BamH
およびHindの制限酵素部位間のサブクローン
化されている特許請求の範囲第１０項記載の試
薬。 １２ ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはDHFR
遺伝子の増幅の程度および／または該遺伝子に対
応するメツセンジヤーRNA分子の数を測定に用
いる被験プローブペアーのデテクタープローブが
プラスミドpMTVdhfrのDHFR遺伝子をコード
するHind−Bgl断片0.75kbからなる組み換え
プラスミドであり、該断片がプラスミドベクター
pAT153の制限酵素HindおよびBamHの制
限酵素部位にサブクローン化されており、被験プ
ローブペアーのキヤプチヤリングプローブがプラ
スミドpMTVdhfrのMMTV遺伝子領域のHind
断片1.4kbからなる組み換えフアージであり、
該断片がM13mp18およびM13mp19フアージベク
ターの制限酵素Hindの制限酵素部位にサブク
ローン化されており、標準プローブペアーのデテ
クタープローブがマウスメタロチオニン遺伝子の
プロモーター領域の上流からのEcoR−Kpn
断片1.2kbからなる組み換えプラスミドであり、
該断片がプラスミドpAT153の制限酵素EcoR
およびHindの制限酵素部位間にサブクローン
化されており、標準プローブペアーのキヤプチヤ
リングプローブがプロモーター領域およびその上
流領域によつて形成されたメタロチオニン遺伝子
のKpn−Bgl断片0.8kbからなる組み換えフ
アージであり、該断片がM13mp18および
M13mp19フアージベクターの制限酵素Kpnお
よびBamHの制限酵素部位間にサブクローン
化されている特許請求の範囲第１０項記載の試
薬。
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