JPH07509361A - 遺伝子検出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 這仏子検辺之２土ム 発明Ω分野 本発明は、その存在がすなわち、その生物の存在を示すポリヌクレオチドを探査 針（プローブ）とすることによって、生物試料中の生物の存在もしくは特定のグ ループの生物群を検出する方法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含 む生物試料中の、他の感染性の作用物質（ａｇｅｎｔｓ）又は生物学的成分を検 出する方法に関する。

光列Ω背景 現在では、被験者の感染が疑われる場合の感染生物又は感染作用物質の同定は、 通常、被験者からの生物学的試料を培養して決定される。例えば、もし被験者の 肺がキャンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌＭｃａｎｓ）で感染して いることが疑われるなら、痰のサンプルが培養される。一定時間のインキュベー ションの後、培養物を観察して、真菌の感染を示す十分な数の真菌が増殖してお れば、真菌（真菌か否かは形態学的特徴から同定される）の感染と同定される。

しかし、この診断確認の方法は重大な欠陥をもっている。例えば、生物学的試料 は生物が検出できる程度に十分な時間培養されることが必要である。またこの方 法は、いろいろな生物を同定できるように訓練されたテクニシャンによってその 培養物は観察される必要がある。それゆえ、生物や感染作用物質、あるいは一群 の生物や感染作用物質を迅速、特異的に同定できる分析方法が大いに望まれてい る。これを実行し、説明するための多大な訓練も必要ない方法ならば、もっと有 益であろう。

生物学的試料−そこには、成分としてポリヌクレオチドが含まれているかポリヌ クレオチドが含まれていることが示唆される試料−中に存在する他の生物学的成 分を同定する改良法もまた、必要とされている。細胞もしくは組織試料中のポリ ヌクレオチドを検出する現在の方法、例えばノーザン・プロット法のような方法 は、比較的多量の出発物質が必要である。ノーザン・プロット法は、特異的遺伝 子を検出する広く受け入れられた方法であり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、ら、　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、第２版、　ｐｐ、７．３９−７．５２）　（以下、「モレキュラー・クローニ ング」と略す）　、ｊｕｎがん遺伝子のような細胞成分の検出に利用されてきて いる（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、Ａｃａｄｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ、　ｖｏｌ、　８７：５６６３−５６６６（１９９０j：０ｕｒ ｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ｖ ｏｌ、　８８：６６１３−６６１７（１９９１））、この方@では、 ｍＲＮＡは組織や細胞培養物がら、例えば、アガロースゲル電気泳動によって最 初に精製される。電気泳動につづいて、ｍＲＮＡはメンプラン上に移され、オー トグラフィーで陽性バンドを同定するために放射能をもつプローブとハイブリダ イズされる。しかしながら、細胞−その細胞からｍＲＮＡが抽出される−が少量 の遺伝物質しかもっていない場合には、この方法は、その特異的な遺伝子もしく は遺伝子産物に対応するシグナルを同定するほど十分に感度は高くない。

また、リバースＰＣＲ（ｒモレキュラ町クローニング」で議論されている）は、 異なる組織又は細胞からの幅広い種々の遺伝子を検出する場合も用いることがで きる。この方法では、ｍＲＮＡは逆転写酵素を用いて最初にｃＤＮＡに変換され 、次いで−揃いのプライマー（センス及びアンチセンスプライマー）を用いるＰ ＣＲで特異的な遺伝子断片が増幅される。増幅された遺伝子は、アガロースゲル 電気泳動によって見ることができる。

要約 本発明は、生物試料中の生物、感染性の作用物質（ａｇｅｎｔｓ）又は生物学的 成分の存在を検出する改良法を提供する。この方法では、ポリヌクレオチドプロ ーブは生物試料中の分析対象のポリヌクレオチド−これは生物、感染性の作用物 質又は生物学的成分に含まれ、あるいは生物、感染性の作用物質又は生物学的成 分の存在を示すものである−にハイブリダイズされる。分析対象のポリヌクレオ チドがごく少量しか得られない場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ポリメラーゼ・ チェイン・リアクション：ＰＣＲ）を用いる別の方法が使用される。更に加えて 、本発明は本発明で使用するポリヌクレオチドプローブとプライマー、及びその ポリヌクレオチドプローブとプライマーを取り込んだキットを提供する。

一つの実施態様では、本発明はポリヌクレオチドを含む生物試料中の特定の生物 、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体中の生物学的成分の存在を検出す る方法を含む。この方法は試料中の分析対象のポリヌクレオチド−このポリヌク レオチドは生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を示すのである−の 検出を伴うもので、次のステップを含む。

（ａ）第１ポリヌクレオチドプローブを同定（決定）する；ここで、第１ポリヌ クレオチドプローブのヌクレオチド配列は分析対象のポリヌクレオチドに含まれ る第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に十分に相補的であり、第１ポリ ヌクレオチドプローブは分析対象のポリヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列に ハイブリダイズでき、その分析対象のポリヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列 は特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に特異的である。

（ｂ）固体支持体へ第１ポリヌクレオチドプローブを固定化する：（Ｃ）試料中 の分析対象のポリヌクレオチドと第１ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイ ズさせる； （ｄ）第２ポリヌクレオチドプローブを同定する：ここで、第２ポリヌクレオチ ドプローブのヌクレオチド配列は分析対象のポリヌクレオチドに含まれる第２ポ リヌクレオチドのヌクレオチド配列に十分に相補的であり、第２ポリヌクレオチ ドプローブは分析対象のポリヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列にハイブリダ イズでき、その分析対象のポリヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列は特定の生 物、感染性の作用物質又は生物学的成分を含む多（の生物、感染性の作用物質又 は生物学的成分に共通である。

（ｅ）第１ポリヌクレオチドプローブカ仏イブリダイズした分析対象ポリヌクレ オチドに、第２ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる；そして、（ ｆ）固体支持体上の第２ポリヌクレオチドプローブの存在を検出することによっ て試料中の、特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を決定する 。

別の実施態様では、生物試料中の細胞もしくは生物中のある生物、感染性の作用 物質又は生物学的成分の存在を検出する本発明は、次のステップを含む。

（ａ）第１ポリヌクレオチドプローブを固体支持体に固定する；ここでは、第１ ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列はその生物、感染性の作用物質又 は生物学的成分中の分析対象ポリヌクレオチドに含まれる第１ヌクレオチド配列 に十分に相補的であり、その第１ポリヌクレオチドプローブはその生物、感染性 の作用物質又は生物学的成分中の分析対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 にハイブリダイズできる。

（ｂ）試料中に存在するポリヌクレオチドを第１ポリヌクレオチドプローブと接 触させる； （ｃ）分析対象ポリヌクレオチドが試料中に存在すれば、試料中の分析対象ポリ ヌクレオチドを第１ポリヌクレオチドプローブにｌゾブリダイズさせる；（ｄ） 試料からの分析対象ポリヌクレオチドが第１ポリヌクレオチドプローブにハイブ リダイズしているならば、その第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズ している分析対象ポリヌクレオチドに第２ポリヌクレオチドプローブを接触させ る；ここで、第２ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、その生物、 感染性の作用物質又は生物学的成分の分析対象ポリヌクレオチドに含まれる第２ ヌクレオチド配列に十分に相補的で、第２ポリヌクレオチドプローブは第２ヌク レオチド配列にハイブリダイズできる。

（ｅ）分析対象ポリヌクレオチドが第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダ イズしているなら、第１ポリヌクレオチドプローブがハイブリダイズしている分 析対象ポリヌクレオチドに、第２ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさ せる； （ｆ）第１ポリヌクレオチドプローブにノゾブリダイズした分析対象ポリヌクレ オチドの、そのポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドプ ローブの存在を検出することによって、試料中の生物、感染性の作用物質又は生 物学的成分の存在を定量する： この方法においては、第２ポリヌクレオチドプローブは第４ポリヌクレオチドプ ローブのＴｍと同じか低いことが好ましい。また、第１ポリヌクレオチドプロー ブは約４８℃から約６０℃の範囲内のＴｍであることが好ましい。分析対象ポリ ヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列は、−の実施態様においては多くの生物、 感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に共通なものとする ことができる。また、分析対象ポリヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列は、特 定の生物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に特異的 なものとすることもできる。

分析対象ポリヌクレオチドの第２ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配線 においては、分析対象ポリヌクレオチドの第２ポリヌクレオチドプローブのヌク レオチド配列は、特定の生物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生 物学的成分に特異的なヌクレオチド配列とすることができる。更に、第２ポリヌ クレオチドプローブは好ましくは標識が結合される。この技術分野で知られてむ ポリヌクレオチド標識、のいずれも用いることができる。標識として核酸染料が 用いられるときは、染料にはエチジウムブロマイド、ｙｏｙｏ−１、又はｔ。

ｔｏ−１などが含まれる。標識が発光性の物質である場合は、標識はそれから発 生する光の量を測定することによって、有利に検出できる。標識から発生する光 の量を測定するとき、光はフィルムに感光させ記録させたのち、デンシトメータ ーを用いて測定できる。更に好ましい実施態様においては、標識はアルカリホス ファターゼを含むもので、その標識は標識プローブにアトフォス（ＡＴＴＯＰＨ Ｏ３）を加えて検出され、そして生じた蛍光はフルオリメーターを用いて測定さ れる。

多くのウェルをもつマイクロタイタープレートのような固体支持体が、本発明を 遂行する上で使用できる。そのウェルの各々には、特異的ポリヌクレオチドプロ ーブが固定されていることが好ましい。マイクロタイタープレートに固定できる 第１ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡを含むことが有利で、更には第１及び 第２のいずれのポリヌクレオチドプローブもＤＮＡを含むことがなお有利である 。

本発明方法の更に好ましいステップは、試料中の分析対象ポリヌクレオチドを第 １ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせたのち固体支持体を洗浄する ステップを伴うことである。この方法では、゛ポリヌクレオチドプローブにアニ ールされなかった生物試料が実質的には全て固体支持体から除かれる。なお、こ の方法の別のステップは、第２ポリヌクレオチドプローブを分析対象ポリヌクレ オチド−それ自身には、第１ポリヌクレオチドプローブがハイブリダイズしてい る−にハイブリダイズさせたのち固体支持体を洗浄するステップを含む。そのよ うな洗浄ののち、分析対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズしていない第２ポ リヌクレオチドプローブは全て固体支持体から実質的に除かれる。この方法にお ける分析対象ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミックＤＮＡか ら成る群から選ぶことができる。

本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチドを含む生物試料中の細胞、感染性の 作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分の存在を検出する方法であり 、次のステップを含む。

（ａ）第１及び第２ポリヌクレオチドプローブを同定する；ここで、第１ポリヌ クレオチドプローブのヌクレオチド配列は、その生物、感染性の作用物質又は生 物学的成分の分析対象ポリヌクレオチドに含まれる第１ポリヌクレオチドのヌク レオチド配列に十分に相補的であり、第１ポリヌクレオチドプローブはその生物 、感染性の作用物質又は生物学的成分の分析対象ポリヌクレオチドの第１ヌクレ オチド配列にハイブリダイズでき、そしてそこでは、第２ポリヌクレオチドプロ ーブのヌクレオチド配列はその生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の分析 対象ポリヌクレオチドに含まれる第２ヌクレオチド配列に十分に相補的であって 、第２ポリヌクレオチドプローブは第２ヌクレオチド配列にハイブリダイズでき 、その第２ヌクレオチド配列は多（の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分 に共通である。

（ｂ）固体支持体へ第１ポリヌクレオチドプローブを固定化する；（Ｃ）試料中 に存在するポリヌクレオチドを第１ポリヌクレオチドプローブに接触させる： （ｄ）分析対象ポリヌクレオチドが試料中に存在すれば、試料中の分析対象ポリ ヌクレオチドを第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる；（ｅ） 試料からの分析対象ポリヌクレオチドが第１ポリヌクレオチドプローブとハイブ リダイズしているならば、第１ポリヌクレオチドプローブがハイブリダイズした 分析対象ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させる； （ｆ）分析対象ポリヌクレオチドが第１ポリヌクレオチドプローブでハイブリダ イズされているならば、第１ポリヌクレオチドプローブがハイブリダイズしてい る分析対象ポリヌクレオチドに、第２ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイ ズさせる； （ｇ）「第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズした分析対象ポリヌク レオチドプローブ」にハイブリダイズしている第２ポリヌクレオチドの存在を検 出することにより、生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を決定する この実施態様において、同定のステップは好適には、コンピュータプログラムの 使用を含むことができ、それは好ましくは、第１ポリヌクレオチドプローブを同 定するＨ−ｓｉｔｅモデル（Ｈサイトモデル）の使用である。第１ポリヌクレオ チドプローブを同定するＨサイトモデルの使用は次のステップを含む：第１ヌク レオチドプローブの最小融解温度及びその生物に特異的なヌクレオチド配列を特 定する； 任意の核形成部位における塩基対の数に関して最小値を定める核形成しきい値を 特定する； 第１ヌクレオチドプローブについての融解温度（Ｔｍ）及び全ての可能な／）イ ブリダイゼーション点におけるその生物に特異的な配列を決定する；及び最高の Ｔｍ値を有するヌクレオチドプローブを選択する。

Ｈサイトモデルを使用するとき、融解温度は好ましくは次の式で決定できる；Ｔ ｍ　−８１，５−１６，６（ｌｏｇ　［Ｎａｌ　）−０，６３％（ホルムアミド ）　÷　０．４１（％（Ｇ　＋　Ｃ））−６００／Ｎ。

ここでｌｏｇ　［Ｎａ］はナトリウム濃度の対数であり、０．０６３％（ホルム アミド）はホルムアミドの濃度、％（Ｇ　＋　Ｃ）はマツチ（対合）したＧＣ塩 基対のパーセント、Ｎはプローブの長さである。

この方法において、第２ポリヌクレオチドプローブもＨサイトモデルを利用する コンピュータを用いて同定することができる。Ｈサイトモデルを用いて第２ポリ ヌクレオチドプローブを同定するには、好ましくは次のステップを伴う：第２ヌ クレオチドプローブの最小融解温度及びその生物に特異的なヌクレオチド配列を 特定する； 任意の核形成部位における塩基対の数に関して最小値を定める核形成しきい値を 特定する； 第２ヌクレオチドプローブについての融解温度（Ｔ＋ａ）及び全ての可能なハイ ブリダイゼーション点におけるその生物に特異的な配列を決定する；及び最低の Ｔｍ値を有し適当な長さのヌクレオチドプローブを選択する。

第２ポリヌクレオチドの融解温度は、同様にして次の式で決定できる；Ｔｍ　＝ 　８１．５　−　１６．６（ｌｏｇ　［Ｎａｌ　）−０，６３％（ホルムアミド ）　＋　０．４１（％（Ｇ　＋　Ｃ））−６００／m。

ここでｌｏｇ　［Ｎａ］はナトリウム濃度の対数であり、０．０６３％（ホルム アミド）はホルムアミドの濃度、％（Ｇ＋のはマツチ（対合）したに塩基対のパ ーセント、Ｎはプローブの長さである。

この方法において、第２ポリヌクレオチドプローブは第１ポリヌクレオチドプロ ーブのＴｍと同じかそれよりも低いと有利である。第１ポリヌクレオチドプロー ブはまた、約４８℃から約６０℃までの範囲であることが好ましい。分析対象ポ リヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列は、一つの実施態様においては多くの生 物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に共通なものと することもできる。また反対に、分析対象ポリヌクレオチドの第１ヌクレオチド 配列は、特定の生物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成 分に特異的なものとすることもできる。

分析対象ポリヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列は、この実施態様においては 多くの生物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に共通 な配列を有するものとするができる。また別の実施態様では、分析対象ポリヌク レオチドの第２ヌクレオチド配列は、特定の生物、感染性の作用物質又は、細胞 もしくは生物体の生物学的成分に特異的な配列を有するものとするもできる。

更に、有利には標識が第２ポリヌクレオチドプローブに結合される。この技術分 野で知られている数多くの、例えば、放射活性物、酵素、酵素基質、特異結合部 分、特異結合部分の結合パートナ−、ビオチン、アビジン、核酸染料、あるいは 蛍光物質を含むポリヌクレオチド標識、のいずれも用いることができる。標識と して核酸染料が用いられるときは、染料にはエチジウムブロマイド、ｙｏｙｏ− １、あるいはｔｏｔｏ−１が含まれる。標識が発光性の物質である場合は、標識 はそれから発生する光の量を測定することによって、有利に検出できる。標識か ら発生する光の量を測定するとき、光はフィルムに感光させ記録させたのち、デ ンシトメーターを用いて測定できる。更に好ましい実施態様においては、標識は アルカリホスファターゼを含むもので、その標識は標識プローブにアトフォス（ ＡＴＴＯＰＨＯＳ）を加えて検出され、そして生じた蛍光はフルオリメーターを 用いて測定される。

多くのウェルをもつマイクロタイタープレートのような固体支持体が、本発明を 遂行する上で使用できる。ウェルの各々には、特異的ポリヌクレオチドプローブ が固定されていることが好ましい。マイクロタイタープレートに固定できる第１ ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡを含むことが有利で、更には第１及び第２ のいずれのポリヌクレオチドプローブも、ＤＮＡを含むことがなお有利である。

本発明方法の更に好ましいステップは、試料中の分析対象ポリヌクレオチドを第 １ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせたのち固体支持体を洗浄する ステップを伴うことである。この方法では、ポリヌクレオチドプローブにアニー ルされなかった生物試料は全て固体支持体から実質的に除かれる。なお、この方 法の別のステップは、第２ポリヌクレオチドプローブを分析対象ポリヌクレオチ ド−それ自身には、第１ポリヌクレオチドプローブカかイブリダイズしている− にハイブリダイズさせたのち固体支持体を洗浄するステップを含む。そのような 洗浄ののち、分析対象ポリヌクレオチドに／’％−（ブリダイズしていない第２ ポリヌクレオチドプローブは全て、固体支持体から実質的に除かれる。この方法 における分析対象ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミツクＤＮ Ａから成る群から選ぶことができる。

本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチドを含有する生物試料中の生物、感染 性の作用物質、又は細胞もしくは生物体の生物学的成分の存在を同定するための 固体支持体−ポリヌクレオチド構造物を含むものである。この構造物は固体支持 体とそれに固定化された第１ポリヌクレオチドプローブを含み、その第１ポリヌ クレオチドプローブは、生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に特異的な第 １ヌクレオチド配列に相補的な配列を有する。この構造物はまた、第１ヌクレオ チド配列を含む細胞、生物又は感染性の作用物質からの分析対象ポリヌクレオチ ド−この分析対象ポリヌクレオチドは第１ヌクレオチド配列において第１ポリヌ クレオチドプローブにハイブリダイズしている−を含む。この構造物は同様に第 ２ポリヌクレオチドプローブ、好ましくは標識を持つ第２ポリヌクレオチドプロ ーブを含み、その第２ポリヌクレオチドプローブは細胞、生物又は感染性の作用 物質からの分析対象ポリヌクレオチドに存在する第２ヌクレオチド配列に相補的 であって、その分析対象ポリヌクレオチドは第１ポリヌクレオチドプローブとハ イブリダイズし、第２ポリヌクレオチドプローブは第２ヌクレオチド配列におい て分析対象ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。

上記方法の標識は、好ましくは放射活性物、酵素、酵素基質、特異結合部分、特 異結合部分の結合パートナ−、ビオチン、アビジン、核酸染料、及び蛍光物質か ら成る群から選ばれる。更に固体支持体−ポリヌクレオチド構造物は多くの生物 、感染性の作用物質、又は細胞もしくは生物の生物学的成分に含まれるポリヌク レオチドに共通の第２ポリヌクレオチドプローブをもっていると更に有利である 。更に別の好ましい実施態様では、第１及び第２ポリヌクレオチドプローブは遺 伝子配列のデータソースを利用するオリゴヌクレオチドプローブ設計のコンピュ ータシステムを使用することにより決定できる。なお上記方法の固体支持体−ポ リヌクレオチド構造物は、更に好ましくはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミックＤ ＮＡから成る群から選ばれるポリヌクレオチドをもっている。

本発明の別の実施態様は、生物試料中の生物、感染性の作用物質、又は細胞もし くは生物の生物学的成分の存在を同定するためのキットで、以下のものを含む特 異的ポリヌクレオチドプローブ／この特異的ポリヌクレオチドプローブは、検出 しようとする特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の分析対象ポリヌ クレオチドに特異的な第１ヌクレオチド配列に相補的もしくは相同的である生物 、感染性の作用物質又は生物学的成分の分析対象ポリヌクレオチドの第２ヌクレ オチド配列に相補的もしくは相同的な共通ポリヌクレオチドプローブ／この共通 ポリヌクレオチドプローブは数多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分 に含まれているポリヌクレオチドに相補的である。

更に、上記キットはポリヌクレオチドが固定化された固体支持体をもっていると 有利である。上記キットは特異的ポリヌクレオチドプローブが固定化された固体 支持体であるとなお更に好ましい。上記キットは多くの特異的ポリヌクレオチド プローブが固定化された固体支持体で、そのプローブ（類）の各々が種々の生物 、感染性の作用物質又は生物学的成分にそれぞれ特異的なプローブであると、更 にもっと好ましい。キットの固体支持体は多くのウェルをもち、それぞれの特異 的ポリヌクレオチドプローブは異なったウェルに固定化されており、緩衝液はプ ローブとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適したものであり、ポリ ヌクレオチドはｍＲＮＡ５ｒＲＮＡ及びゲノミックＤＮＡから成る群から選ばれ ていると最も好ましい。

同様に、上記キットの第２ポリヌクレオチドプローブは、好ましくは放射活性物 、酵素、酵素基質、特異結合部分、特異結合部分の結合パートナ−、ビオチン、 アビジン、核酸染料、及び蛍光物質から成る群から選ばれる標識をもつことがで きる。更に、上記キットは特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に特 異的である配列に相補的もしくは相同な、第１プライマーを含む特異的ポリヌク レオチドプローブをもつことができ、更に加えてそのキットは、種々の生物、感 染性の作用物質又は生物学的成分に特異的な配列に相補的もしくは相同な、特異 的第２プライマーをもつことができる。

上記キットがＰＣＲに使用されるように設計されるとき、以下のものの一つもし くは二つ以上が必要となる：ｄＮＴＰ類、逆転写酵素、ポリメラーゼ、それに逆 転写酵素もしくはポリメラーゼを用いてプライマーにｄＮＴＰ類を加える際に好 適な緩衝液。更に、そのキットは５０℃以上の温度で相当のポリメラーゼ活性を 保持するＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。

なお、別の実施態様において本発明方法は、ポリヌクレオチドを含む生物試料に おける、一つ又は二つ以上の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を 検出する手段を含み、そこでは少な（ともポリヌクレオチドの一つは、一つもし くは二つ以上の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を表し、またそ れらの少量の存在を示す。この方法はＰＣＲを利用し、以下のステップを用いる 。

（ａ）ポリヌクレオチドを含有する生物試料を取得する；（ｂ）その試料を、数 多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共通のヌクレオチド配列に相 補的な配列をもつ第１プライマーに接触させる；（ｃ）第１プライマーに相補的 な、試料中の分析対象ポリヌクレオチド（そのような分析対象ポリヌクレオチド が存在すればであるカリに第１プライマーをハイブリダイズさせる： （ｄ）第４プライマーを伸長させる。このとき、第１プライマーを含む相補的ヌ クレオチド鎖と分析対象ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド鎖とを含む二本鎖 ポリヌクレオチドが生じる； （ｅ）相補的ヌクレオチド鎖に含まれる配列に相補的な第２ポリヌクレオチドプ ライマーに、試料を接触させる。

（ｆ）相補的ヌクレオチド鎖に第２プライマーをハイブリダイズさせる。

（ｇ）第２プライマーを伸長させて、分析対象ポリヌクレオチドに相同なヌクレ オチド鎖を形成させる； （ｈ）試料に第３及び第４ポリヌクレオチドプライマーを接触させる。ここで、 第３及び第４プライマーは、相同的ヌクレオチド鎖及び相補的ヌクレオチド鎖に 各々相補する配列をもっていて、第３プライマーは、その存在が決定されるべき 数多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共通な配列に相補する配列 をもち、かつ、第３プライマーの配列は第１プライマーの配列とは異なる。

（ｉ）第３及び第４プライマーを相補的ヌクレオチド鎖及び相同的ヌクレオチド 鎖にハイブリダイズさせる； （Ｄ第３及び第４プライマーを伸長させ、二本鎖ポリヌクレオチドを生じさせる 。そして （ｋ）第１、第２、第３又は第４プライマーの増幅物を検出することによって、 試料中の一つ又は二つ以上の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を 決定する。

この方法で、第２プライマーは、その存在が決定されるべき数多（の生物、感染 性の作用物質又は生物学的成分に共通のヌクレオチド配列とすることができる。

この方法では、伸長・増幅のステップはプライマーがＲＮＡに結合されるとき逆 転写酵素と共に行うことができ、一方、結合ポリヌクレオチドがＤＮＡであると きはＤＮＡポリメラーゼと共に行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼが使用さ れる場合は、そのＤＮＡポリメラーゼは５０℃以上においても相当のポリメラー ゼ活性を保持していることが好ましい。本発明法では、第１及び第２プライマー のヌクレオチド配列はコンピュータの助けで決定することができ、更に好ましく はＨサイトモデルを用いて決定することができる。

また、ポリヌクレオチドを含む生物試料−そこにおける少な（とも一種類のポリ ヌクレオチドは−又はそれ以上の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存 在を表す−における−又はそれ以上の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分 の存在を検出する別の方法は、次のステップを含む：ポリヌクレオチドを含む生 物試料を取得し：試料に、数多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に 共通のヌクレオチド配列に相補する第１プライマーを接触させ１試料中に存在す る分析対象ポリヌクレオチドに、そのような第１プライマーに相補的な分析対象 ポリヌクレオチドが存在すればであるが、第１プライマーをハイブリダイズさせ ； 第１プライマーを伸長させ、第１プライマーを含む相補的ヌクレオチド鎖と分析 対象ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列とをもつ二本鎖ポリヌクレオ チドを生成させ； その試料に、相補的ヌクレオチド鎖に含まれる配列に相補的な第２ポリヌクレオ チドプライマーを接触させ： 相補的ヌクレオチド鎖に第２プライマーをハイブリダイズさせ、第２プライマー を伸長させて分析対象ポリヌクレオチドに相同なヌクレオチド鎖を形成させ、 その試料に、相同なヌクレオチド鎖に相補する配列をもつ第３ポリヌクレオチド プライマー−この第３プライマーはその存在の有無を決定するべき特定の生物、 感染性の作用物質又は生物学的成分に特異的に存在する配列に相補するヌクレオ チド配列をもっている−を接触させ； 相同なヌクレオチド鎖に第３プライマーをハイブリダイズさせ；第３プライマー を伸長させ、 二本鎖ポリヌクレオチドを生成させ； 伸長させた第３プライマーの少なくとも一つを検出することによって、試料中の 特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を決定する。

この方法では、伸長及びハイブリダイゼーションのステップは何回も繰り返して 行なわれることが好ましい。特に伸長のステップは、プライマーがＲＮＡに結合 される場合に逆転写酵素と共に行なわれ、他方、結合されるポリヌクレオチドが ＤＮＡである場合はＤＮＡポリメラーゼが用いられる。このようなりＮＡポリメ ラーゼは５０℃以上の温度で相当なポリメラーゼ活性を持っていることが好まし い。

本発明においては、第１及び第２プライマーのヌクレオチド配列はコンピュータ の助けを借りる方法で決定できる。そのときコンピュータの助けを借りる方法は 、好ましくは、Ｈサイトモデルを用いる第１及び第２ヌクレオチドプライマー配 列決定法による。この方法において第２プライマーは、その存在を決定するべき 数多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共通なヌクレオチド配列を もっているものとすることができる。また第３プライマーは、好ましくは、標識 を含むもので、そのため検出ステップはこの標識されたプライマーの伸長を含む 。用いられる標識は放射活性物、酵素、酵素基質、特異結合部分、特異結合部分 の結合パートナ−、ビオチン、アビジン、核酸染料、及び蛍光物質を含む群から 選ぶことができる。

また、ポリヌクレオチドを含む生物試料−そこにおける少なくとも一種類のポリ ヌクレオチドの存在は、生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在又はそ れが少量でも存在することを示す−における特定の生物、感染性の作用物質又は 生物学的成分の存在を検出する別の方法は、次のステップを含む：（ａ）ポリヌ クレオチドを含有する生物試料を取得する；（ｂ）その試料に、特定の生物、感 染性の作用物質又は生物学的成分に特異的なヌクレオチド配列に相補的な配列を もつ第１プライマーを接触させる；（ｃ）第１プライマーに相補する、試料中の 試料ポリヌクレオチド（そのような試料ポリヌクレオチドが存在すればであるカ リに、第１プライマーをハイブリダイズさせる； （ｄ）第１プライマーを伸長させる。このとき、第１プライマーを含む相補的ヌ クレオチド鎖と試料ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド鎖とを含む二本鎖ポリ ヌクレオチドが生じる； （ｅ）その試料に、相補的ヌクレオチド鎖に含まれる配列に相補的な第２ポリヌ クレオチドプライマーを接触させる：（ｆ）相補的ヌクレオチド鎖に第２プライ マーをハイブリダイズさせる；（ｇ）第２プライマーを伸長させて、試料ポリヌ クレオチドに相同なヌクレオチド鎖を形成させる； （ｈ）第１又は第２プライマーの少な（とも一つの増幅物を検出することによっ て、試料中の特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を決定する 。

以上述べた方法によって我々は、使用可能な数多くの、例えば、配列同定装置に より同定されたところの、ｊｕｎがん遺伝子、Ｇ蛋白、βレセプター、あるいは サブスタンスＰレセプターを検出するプライマーを含む有用な数多くのプローブ 及びプライマーを見出すことができた。我々が本発明方法においてプローブ又は プライマーとして使用可能な配列として見つけたものは、配列番号４７３．６０ ０．６１５．６２２．７３０．７４７．７４８．４８８．５１３．６３０．６３ ９．７２８．７２９．７３３．７３４．７３９．７４０．７４１．７４２．７４ ３．７４４．７５９．７５８．７５１．５５３．６７０．７５２．７５３．５６ ５．６７８．６８６．７５４．５７７．６９７．７０４．７５５．７５６．７３ ２．６４２．６５２．７５７．５９３．７１０．７２１．５２８．７３Ｌ７４９ 及び７５０の配列である。

Ｚ血Ω商里を説吸 図１は、本発明方法の一つの実施態様における模式的説明図である。

図１ａは、ＳＤＳ及びＥＤＴＡ含有のｍＲＮＡ調製物へ及ぼす種々のＲＮａｓｅ インヒビターの影響を示すゲルの写真である。

図１ｂは、ＹＯＹＯ−１蛍光と固定化オリゴヌクレオチドの量の関係を示すグラ フである。

図１ｃは、ＹＯＹＯ−１分析のタイムコースを示すグラフである。

図１ｄは、ＹＯＹＯ−１濃度とその応答量を示すグラフである。

図１ｅは、固定化オリゴヌクレオチドの定量化に基礎を置＜ＹＯＹＯ−１染色の 再現性を示す棒グラフである。

図２は、種々の真菌において同定される共通及び特異的配列の模式的説明図であ る。

図３は、ＰＣＲ法が用いられたときの本発明法の一実施態様を示す模式的説明図 である。

図４は、ｊｕｎがん遺伝子サブタイプのｊｕｎ−ＤＳｃ−ｊｕｎ及びｊｕｎ−Ｂ が、配列番号７２８及び配列番号７２９を用いて増幅されたときの結果を示すゲ ルの写真である。

図５は、クローン化されたラットＧ蛋白サブタイプのＧ　ｌ−ｌ５Ｇ＋−＊、Ｇ 、−ｓ、ＧＳ及びＱｏが、配列番号５２８及び配列番号７３１を用いて増幅され たときの結果を示すゲルの写真である。

図６は、本発明で用いられるマイクロタイタープレートの一例を示す模式的説明 図である。

図７は、５つのＧ蛋白の配列の各々をプローブとして用いたサザーンプロットの 結果を示すゲルの写真である。

図７Ａ−７Ｃは、ｊｕｎがん遺伝子の特異なサブタイプを検出するために配列番 号４７０．４８８及び７３０が用いられた場合の実験結果を示すグラフである。

図８は、ＰＣＲプライマーとしてＧ２及びＧ４を用いて増幅された５つのＧ蛋白 オリゴヌクレオチドの異なる量（十記号の数で表した）を含む試料のゲル、並び に５つのＧ蛋白の配列のそれぞれを用いたサザーンプロットを示す。

図９は、５つの異なるＧ蛋白プライマーを用いて増幅されたラットの下垂体（Ｐ ）、腎臓（Ｋ）及び膵臓（１）からのλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーのゲルを 示す。

図１０は、ＰＣＲプライマーとしてＧ２及びＧ４を用いて増幅されたヒトＩＭ９ 及びＪｕｒｋａ　を細胞のｃＤＮＡからの５００塩基対（ｂｐ）ＤＮＡのゲルを 示す。

図１１は、本発明の設計を総括するコンピュータシステムの簡略ブロックダイア グラムを示す。

図１２Ａ−１２Ｃは、本発明の主たるオリゴプローブ・デザイン・ステーション 対話（ダイアログ）ウィンドーのディスプレー・スクリーンを示す。

図１３Ａと１３Ｂは、プログラムと発明の配列及び構造を図示する本発明総括の フローチャートである。

図１４は、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉのプローブ選択ダイアグラムを示すディスプレ ー・スクリーンである。

図１５は、ブロープインフォ及びマツチインフォラインド−を示すディスプレー ・スクリーンである。

図１６は、プローブエディツトウィンドーを示すディスプレー・スクリーンであ る。

図１６Ａ及び１６Ｂは、プローブエディツトアウトプットファイルの印刷である 。

図１７は、本発明のミスマツチモデルの、配列及び構造を含む総括ｋｊｉｆｆプ ログラムのフローチャートである。

図１８Ａ及び１８Ｂは、本発明のに−ｄｉｆｆモデュールのフローチャートであ る。

図１９は、本発明のハッシングモデュールのフローチャートである。

図２０は、本発明のトランモデュールのフローチャートである。

図２１は、本発明のｌｅｔＪｉｇモデュールのフローチャートである。

図２２は、本発明のアップデートモデュールのフローチャートである。

図２３Ａ及び２３Ｂは、本発明のアセンブリモデュールのフローチャートである 。

図２４Ａ及び２４Ｂは、本発明の５ｅｑｌｏａｄモデユールのフローチャートで ある。

図２５Ａ及び２５Ｂは、本発明のｒｅａｄｌモデュールのフローチャートである 。

図２６は、本発明のｄｉｇ−１ｅｔモデユールのフローチャートである。

図２７Ａ及び２７Ｂは、本発明の（Ｌｃｏｌｏｕｒモデュールのフローチャート である。

図２８は、本発明のｂｉｔ、、−ｅｘｔモデュールのフローチャートである。

図２９は、本発明のｃｏｌｏｕｒモデュールのフローチャートである。

図３０は、本発明のミスマツチモデル・プログラムのアウトプットを含む試料フ ァイルの印刷の第１ページである。

図３１は、本発明において前処理されたプレバレージョンファイルの作製をカバ ーする、ＨサイトモデルのステージＩのフローチャートである。

図３２は、目的の配列のプレバレージョンをカバーする、Ｈサイトモデルのステ ージＩＩのフローチャートである。

図３３Ａ−３３Ｄは、ＭＰＳＤデータの計算をカバーする、Ｈサイトモデルのス テージＩＩＩのフローチャートである。

図３４Ａは、ミスマツチモデル・プログラムのアウトプットを含む試料ファイル の印刷の第１ページである。

図３４Ｂは、Ｈサイトモデル・プログラムのアウトプットを含む試料ファイルの 印刷の第１ページである。

図３５は、　Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉのプローブ選択ダイアグラム（ＭＰＳＤ）の 作製に用いるプロセシングのフローチャートである。

図３６は、マツチインフォラインド−の作製に用いるプロセシングのフローチャ ートである。

図３７は、試料標的スピーシズファイルの印刷である。

図３８Ａ−３８Ｃは、試料プレバレージョンファイルの印刷である。

光酉の詳栂な脱型 ポリヌクレオチドを含む試料中の生物、感染性の作用物質又は他の生物学的成分 を検出する本方法は、従来の診断技術よりも、早さ、使用の容易さ及び正確さに おいて進歩を遂げている。例えば、従来の方法を用いて生物試料中の生物を正確 に同定するために要する時間は、そのような生物を培養するために必要な時間− 何時間から何日も−が必要であった。そのような方法では、種々の疾患原因菌を 識別できるように訓練されたテクニシャンが生物試料培養物を検査することも必 要であった。一方、本方法では、特殊な訓練を受けることなく、誰でも実行でき る。本方法ではまた、生物試料培養物検査時のテクニシャンの誤同定による過失 のおそれなしに、特異的生物も、あるいは真菌属や細菌属のような一群の生物も 、同定できる。ウィルスのような感染性の作用物質もまた検出できる。

本方法は、ポリヌクレオチドを含んでいるか、あるいはその存在がポリヌクレオ チドによって示される他の生物学的成分を検出するための、改善された方法も含 む。生物試料は、ｊ叩がん遺伝子やＧ蛋白のｍＲＮＡのような生物学的成分に特 異的なオリゴヌクレオチドで探査（ｐｒｏｂｅ）することができる。本願におい て「生物学的成分」とは、ｍＲＮＡ、　ｒＲＮＡ、ゲノミックＤＮＡのようなポ リヌクレオチドを含む細胞もしくは生物の成分を意味する。ポリヌクレオチドを 含んでいない成分であっても、その存在がその細胞もしくはその生物中でポリヌ クレオチドの存在によって示唆される場合もこれに含まれ、そこではポリヌクレ オチドの検出はその生物学的成分の存在の表れである。その生物学的成分に特異 的な他のプローブ、又はその生物学的成分と他の生物学的成分に共通な他のプロ ーブは、生物学的成分への特異的プローブの結合を検出するためにも使用されう る。また、生物試料は分析の感度を上げるため、遺伝子配列に関連する多くのポ リヌクレオチドに結合可能なオリゴヌクレオチドで探査されることもできる。本 発明のこれら及び他の概観を、以下に更に詳細に記述する。

■、　配及ジ特選配列 我々は、真菌の一つの種（ｓｐｅｃｉｅｓ）もしくは属（ｇｅｎｕｓ）にユニー クで、本発明で使用可能な多くの特異的ヌクレオチド配列を見つけた。これらの 配列は、配列番号８１．１０４．１３１．１３３．１５４．１５６．１７６．１ ９９．２６７．２９０．３１２．３３５．３６４〜３７６、及び３９１〜３９２ である。表Ｖから表ＸＶＩを参照のこと。これらの特異配列と他の種（ｓｐｅｃ ｉｅｓ）又は属（ｇｅｎｅｒａ）に対応する配列とが比較されている。

配列番号２２７及び２５０は、ある株（ｓｔｒａｉｎｓ）のＣ，アルビカンス（ ａｌｂｉｃａｎｓ）に特異的な配列である。しかし、同じ種の他の株で報告され た配列はそのｒＲＮＡにおける配列で、配列番号２２６及び２４９でそれぞれ見 られるように、少し違いがある。したがって、これらの特殊な配列は、本発明の 特異配列を用いるのに比べ好ましくない。しかしこれらの配列は、試料中のＣ， ａｌｂｉｃａｎｓのその特殊な株を同定するためには有用でありうる。

我々はまた、いくつかの真菌の種及び属のｒＲＮＡに共通して存在する多くの共 通配列を見つけた。これらの配列は、配列番号１から８０までである。表１から ４を参照すれば、これらの配列は、示された全ての種で共通であることが分かる であろう。

更に、我々は、特殊なＧ蛋白サブタイプに特異的な配列を見つけたばかりでなく 、ラットとヒトの多くのＧ蛋白の配列に共通な配列を見つけた。そのような配列 を含んでいるオリゴヌクレオチドは、そのような配列をごく少量しか含まない試 料中でその配列の存在を同定する際に、プローブ又はプライマーとして有用であ る。後に更に詳細に議論されるように、本発明の配列を含むオリゴヌクレオチド は生物試料中のＧ蛋白配列をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で検出するときのプ ライマーとして用いることができる。

ヒトとマウスで同定されたいくつかの異なったｊｕｎがん遺伝子に共通な配列が 、同様に同定された。そのような配列は、生物試料中のｊ叩がん遺伝子配列の存 在を同定する際にＰＣＲプライマーとして用いることができる。本発明法におい て有用な他の配列は以下に記述される。

有利なことに、共通なものであろうと特異的なものであろうと、これらのプロー ブは、相補鎖とアニールさせたとき全てほぼ等しい融解温度（Ｔａ＋）をもつよ うに設計されていることである。したがって、これらの配列のアニールを必要と する種々の操作は全て同じ条件で実施できることである。この技術分野における 相当の知識を有する技術者（当業者）ならば、対応するより高いか又はより低い Ｔｍをもつ、より長い配列又はより短い配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手できる 全配列を参照して、取得できる。ここで、ゴｍ”の語は一本鎖ポリヌクレオチド に関連して使用されているが、この語は相補鎖とアニールさせたときの一本鎖の 融解温度を意味する。

当業者に知られているように、ポリヌクレオチド鎖のＴｍは次式を使って、決定 できる。

（ａ）　Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−６５０／Ｌ（ここで、Ｇはヌ クレオチド鎖のグアニン残基の数、Ｃはヌクレオチド鎖のシトシン残基の数、及 びＬはポリヌクレオチドの全長（塩基数）である。）（ｂ）　（Ｔｍ）ｕａ−（ Ｔｍ）ｕ＋＝１８．５１ｏｇｌｏｕ２／ｕ＋（ここで、ｕｌ及びｕｌは２つの溶 液のイオン強度である。）；そして（ｃ）二本鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマツチ塩 基対の数が１％増加するにつれ１℃下がる。

本発明の好ましい実施態様では、同じＴｍをもつ多くのプローブは、一つ又は複 数の固体支持体に固定される。同じＴｍをもつプローブが使用されると、そのよ うなプローブは同じ温度条件を要求するので同一条件でハイブリダイズさせるこ とができる。このとき、特異的プローブは４８℃と６０℃の間のＴｍであること が望ましい。同じか上記範囲のＴｍをもつ他のプローブは、先に述べた式と所定 の実験の遂行により、決定することができる。

本願において「特異配列（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｅｎｃｅ）　Ｊなる用語は 、たとえ他の方法で特異的であるとされていなくとも、その生物又は感染性作用 物質にのみ特異的に存在する核酸配列、すなわち、特異的生物もしくは感染性作 用物質の存在の結果としてその生物試料中にのみ存在する核酸配列を意味する。

「特異配列」は、ｊｕｎがん遺伝子のサブタイプのｍＲＮＡのような特定の種類 の生物学的成分に存在する配列も意味する。もちろん、特異配列に相補的な配列 も又特異的であると言える。「相補的」なる用語は、ここでは、アデニンがチミ ンやチミンと等価に反応するウラシルのようなヌクレオチドによって置換された ポリヌクレオチド配列、及びチミン（又はウラシル）がアデニン又はアデニンと 等価に反応するヌクレオチドによって置換されたヌクレオチド配列を意味する。

そのような相補的な分子では、グアニン残基はシトシン又はシトシンと等価なヌ クレオチド分子によって置換されるであろうし、シトシン残基はグアニン又はそ れと等価なヌクレオチドによって置換されるであろう。

本願では、「相同な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）　Ｊなる用語は、同じヌクレオチ ド又は等価なヌクレオチドを、別のヌクレオチドと同じ順序に含む配列をもつポ リヌクレオチドを意味する。例えば、第１ポリヌクレオチドと同じヌクレオチド 配列をもつ第２ポリヌクレオチド−但し、そこではウラシル残基はチミン残基で 置換されている−は、第１ポリヌクレオチドに相同である。この技術分野で知ら れた他の等価なヌクレオチド置換もまた含まれる。

本発明方法における有用な配列は、この技術分野で知られているあらゆる方法で 決定することができる。そのような配列は、あとで詳述するようにコンピュータ ・プログラムで同定′することが望ましい。したがって、ここでディスカスされ ている配列は本発明でうまく作用する配列の例にしかすぎず、これだけが使用で きる配列ではない。

Ｉｌ、真菌の分析 本発明方法の一つの例は、生物試料中のある特定な種の真菌を検出することを伴 う。我々は、ある特定な種の真菌の存在は試料のリポソームＲＮＡをその特定な 種の真菌に特異的な配列で探査すること（ｐｒｏｂｉｎｇ）によって決定されう ることを見つけた。探査されるべき特異的真菌を含む一群の真菌に見出される配 列に相補的な配列をもつプローブは、真菌の特異的種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を検出 するために使用できる。生物試料中に含まれる他の生物、感染性の作用物質及び 生物学的成分は、本法を用いて検出されうることを当業者は認識するであろう。

生物試料中に存在する他の種類の、ｍＲＮＡやゲノミックＤＮＡを含む核酸もま た探査（ｐｒｏｂｅ）されうることを当業者は同様に認識するであろう。

本願の実施例において、多くの種の真菌の各々は唯一の種の真菌に特異的なリポ ソームＲＮＡ配列をもっていることが見つけられた。生物試料中の特定の種の真 菌の存在は、特定の種の真菌のリポソームＲＮＡにのみ見出されるリポソームＲ ＮＡの配列をめて試料を探査することによって検出できる。多くの種の真菌に見 出される特異的リポソームＲＮＡ配列は、比較的早い速度で変異を拾う領域で起 こりやすい。したがって、多くの種の真菌はこの領域で異なるヌクレオチド配列 をもっているようである。リポソームＲＮＡは発現されないけれども、この領域 はゲノミックＤＮＡの発現されない領域−この領域は発現領域よりも比較的早い 速度で変異を拾っている−に類似しているであろう。

更にまた、多くの種の真菌は全ての種の真菌に共通なリポソームＲＮＡ配列をも っていることが見出された。したがって、生物試料中のどんな種の真菌の存在も そのような共通の配列をめて試料を探査することによって決定できる。もし真菌 が、特異配列及び共通配列の両方を含んでいるなら、そのような共通配列での探 査が特異的リポソームＲＮＡ配列に一個又は複数個の変異を含むいろいろな種の 真菌の存在を検出するために使用できる。共通配列の存在はまた、共通配列をも つポリヌクレオチドの検出を助けるために、その配列に標識プローブをアニール することによっても利用されつる。

あるグループの種の病原性をもっ真菌において、別々の２つのリポソームＲＮＡ 配列が、それぞれの種で同定された。このグループは以下の種の真菌を含む：ニ ューモシスティス　カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）　 、アスペルギルス　フマガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍａｇａｔｕｓ ）　、アスペルギルス　フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔ ｕｓ）　、クリプトコツカス　ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コツシディオデス　イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄ ｅｓ　１ｍｍ１ｔｉｓ）　、プラストマイセス　デルマティティディス（Ｂｌａ ｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）　、及びキャンディダアルビカ ンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　、キャンディダ　トロピカリス（ Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を含むキャンディダ群の多くの種。この グループの真菌種のリポソームＲＮＡのジエンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番 号は下記の表１に示す。

表１ ＦｕｎａＩＳｌｅＳ　受玉番号 アスペルギルスフマガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍａｇａｔｕｓ）　 Ｍ５５６２６アスペルギルスフマガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍａｇ ａｔｕｓ）　Ｍ６０３００（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉ ｓ）キャンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　Ｍ６０ ３０２キャンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　Ｘ５ ３４９７キヤンデイダギリエルモンデイ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉＬｌｉｅｒｍ ｏｄｉｉ）　Ｍ６０３０４キャンディダグラプラタ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｌａｂ ｒａｔａ）　Ｘ５１８３１キヤンデイダケフイル（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｅｆｙｒ ）　Ｍ６０３０３キャンディダクルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ）　Ｍ ５５５２８キャンディダクルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ）　Ｍ６０３ ０５キャンディダルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ　１ｕｓｉｔａｎｉａｅ）　Ｍ５ ５５２６キヤンデイダルシター！−（Ｃａｎｄｉｄａ　１ｕｓｉｔａｎｉａｅ） 　Ｍ６０３０６キヤンデイダパラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉ ｌｏｓｉｓ）　Ｍ６０３０７キヤンデイダ　トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔ ｒｏｐｉｃａｌｉｓ）　Ｍ５５５２７キヤンデイダ　トロピカリス（Ｃａｎｄｉ ｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）　Ｍ６０３０８キャンディダヴイスワナチイ（Ｃ ａｎｄｉｄａ　ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）　Ｍ６０３０９ニューモシスティスカ リニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）　Ｘ１２７０８コツシデ イオデスイミテイス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ　１ｍｍ１ｔｉｓ）　Ｍ５５６２ ７クリプトコツカスネオフオルマンス　Ｍ５５６２５（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）真菌分析を含む本発明の実施において、「特異配列 」の用語は一つの種の真菌に特異的なリポソームＲＮＡの配列を表すのに使用さ れている。そのような配列はその真菌に特異的であり、他のどんな真菌種のリポ ソームＲＮＡにも見つからないものである。その配列はまた、試験された細胞で 見つけられた他のどんなＲＮＡ配列とも異なっている。そのような特異配列の一 つに相補的な配列をもつプローブは、したがって、真菌の特定種のリポソームＲ ＮＡ又はそのようなリポソームＲＮＡに相同なポリヌクレオチドとのみアニール するであろう。

上述した特異配列を含む病原性真菌のグループでは、リポソームＲＮＡの４つの 共通配列が同定された。この「共通配列」は、生物の特定の属（ｇｅｎｕｓ）又 は族（ｆａｍｉｌｙ）に共通な配列であるように、一群の生物に共通な配列であ る。ここで「共通」の用語は、例えば、ｊｕｎがん遺伝子の種々のサブタイプに 共通に存在する配列のように、一群の感染性の作用物質又は生物学的成分に共有 されている配列を意味する。図１に示されるように、表１に掲げられた真菌グル ープの２つの共通配列は、特異配列の５°側に存在し、他の２個は特異配列の３ ′側に存在する。

更に、本発明の一つの実施態様においては、このグループの真菌種のリポソーム ＲＮＡの特異配列の３′側に存在する共通配列に相補的なプライマーは、特異配 列を含む種のリポソームＲＮＡの部分に相補的なポリヌクレオチド、好ましくは ｃＤＮＡ鎖を作り出すために用いられる。特異配列の５°側に存在する共通配列 の一つに相同なプローブは、ある真菌種のリポソームＲＮＡに相補する鎖にアニ ールされ、次いで、特定の真菌に特異的な配列の少なくとも一つを含む真菌リポ ソームＲＮＡ鎖に相同なポリヌクレオチド鎖をつくり出すため、伸長される。

本発明の真菌検出法の別の局面は、下記の実施例で詳述する。

ＩＩｌ、生物試料中取得 本発明の方法により検出すべき生物、感染性の作用物質、又は細胞もしくは生物 の生物学的成分を取得するために、そのような生物、感染性の作用物質又は生物 学的成分が潜んでいると疑われる生物又は組織が同定（１ｄｅｎｔｉｆｙ）され る。この同定は当業者により知られた方法ですることができる。感染性の作用物 質又は他の生物をもっていることが疑われる生物は、好ましくはヒトであり、そ の同定は、そのような生物又は感染性の作用物質の存在の兆候をヒトで観察する 医師によってなされる。例えば、肺炎に侵され抗バクテリア物質に応答しなくな っているＡＩＤＳと診断された患者は、医師によって真菌ニューモジステイス・ カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）の感染が可能性ありと して同定される。

また、ある医学的条件の兆候や、ある生物又は作用物質の感染を明白には示して いない宿主からの生物試料も試験可能である。例えば、食べ物や真菌の増殖の兆 候が観察されないＡＩＤＳ患者の組織は、真菌の存在有無の試験に供される。

この場合は、真菌の存在の明白な兆候が欠けている試料であろうとなかろうと、 どんな試料であっても試験可能である。もしそのような生物試料で真菌が実際に 見つかれば、そのときは適当なアクションがとられるであろう。

試験される生物試料は、この技術分野で知られているあらゆる手段によっても取 得できる。例えばＡＩＤＳ患者が、ニューモジステイス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍ ｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）によって起こされた小腸血漿ニューモニエの 感染が疑われるなら、痰の試料は患者の肺から採ることができる。痰は患者に咳 き込ませ肺から得た痰をコツプにとって、取得できる。また、痰の試料は、気管 支を滅菌綿で掻き取ったり、この技術分野で知られた他の方法で取得できる。真 菌の存在が疑われる他のどんな生物試料も同様に適当な方法で取得できる。

ｉｖ、生物試料偽謂１ 次に、生物試料中に存在するＲＮＡ及び／又はＤＮＡが探査されうるように生物 試料が調製される。真菌が探査の対象である場合、試料中に存在する全ての真菌 のリポソームＲＮＡは、本発明の方法に一致させて探査されることができる。

存在する真菌細胞のリポソームＲＮＡを探査するため、真菌細胞は先ず、溶解さ せなければならない。対象のＲＮＡ又はＤＮＡを含む真菌細胞又は他の細胞の溶 解は、「モレキュラー　クローニング」に記載された方法を含む、この技術分野 で知られた多くの方法のどんな方法によっても遂行できる。

一つの実施態様では、固体支持体と接触させる前に細胞は溶解される。この方法 は、例えば、固体支持体がニトロセルロース・フィルターである場合のように、 溶解細胞を保持するようには設計されていない支持体である場合に用いられる。

この方法では、細胞はそれが溶解された後に固体支持体と接触させられる。

細胞の溶解には種々のテクニックが用いられる。例えば、真菌のリポソームＲＮ Ａが探査されるときは、リポソームＲＮＡをリポソーム蛋白から分離する技術が 望まれる。実施例１は、リポソームＲＮＡを取得するのに有益と信じる一つのテ クニックと思うので、ここに示す。しかし、リポソームＲＮＡを取得するテクニ ックはよく知られている。ＤＮＡ及び他の種類のＲＮＡを取得するテクニックも またこの技術分野の技術者に良く知られている。したがって、実施例１のテクニ ックは必ずしもリポソームＲＮＡ含有試料取得の好ましい方法ではない。実施例 １はここで述べられている他の実施例の全てと同様に本発明のある局面を単に説 明するために提供される。ともあれ、ここで述べられている実施例は本発明を制 限する意図ではない。

実施例１ 生・　の　の 生物試料に存在する細胞は、１０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ） （ｐＨ８，０）　、０．２Ｍ　ＮａＣｌ、０．　５％ドデシル硫酸ナトリウム（ ＳＤＳ）、５００単位／ｍ１ＲＮアーゼインヒビター、１０ｍＭバナジルリポヌ クレオシルコンプレックス、及び２００μｇ／ｌ　プロティナーゼＫを含む溶液 （以下、溶解用緩衝液という。）で処理され、溶解させることができる。

細胞溶解後、得られる細胞溶解液のＮａＣ１濃度をｏ、ｓＭに調整する。

Ｖ、　画体支持体 好ましい実施態様では、固体支持体は生物試料を含むことができ、また生物試料 中の細胞を溶解するために使用する試薬類に対し抵抗性がある。試料は、固体支 持体中で溶解させることができる。しかし、そのような固体支持体の使用は、試 料が溶解操作をすることなく得られ、あるいは別の容器で溶解されているならば 、必ずしも必要ではない。多くの処理に抵抗性をもつ固体支持体の例は、抵抗性 のプラスチックでできたマイクロタイターウェル又はプレートである。

固体支持体はこの技術分野で知られた他の、例えば、メンブランフィルタ−、ビ ーズ、又はポリヌクレオチドが固定された固体支持体等の、固体支持体のいずれ も使用できる。固体支持体は、ポリヌクレオチドプローブを固定化できる物質で できていることが好ましい。固定化は共有結合、又はこの技術分野で知られてい る種々の相互作用による結合を介して行なわれる。その表面にカルボキシ又はア ミノ基を含む、ポリスチレンのようなプラスチック材料は、本発明の固体支持体 として好適である。その理由は、そのような材料は、高価ではなく、製造が容易 で、本発明において使用する生物試料の細胞溶解試薬に対して抵抗性があるから である。例えば、その表面にカルボキシをもつ住人ベークライト製造のスミロン マイクロタイタープレートＭＳ−３７９６Ｆは、好ましく使用できる。表面にア ミノ基をもつ、例えば、スミロンマイクロタイタープレートＭＳ−３７９６のよ うなプラスチックプレートもまた使用できる。

Ｖｌ、　の　、１ポ１　し　゛プローブ生物試料中の細胞が溶解された後は、そ の細胞に含まれるＲＮＡ及び／又はＤＮＡは実質的には溶液中に解放され、換言 すれば、それは探査されるために利用可能な状態になったということである。も し、生物試料が固体支持体中で溶解されなかったら、次に細胞溶解液を固体支持 体に接触させる。固体支持体には先ず、生物試料中の特定の生物、感染性の作用 物質又は細胞又は生物の生物学的成分のＲＮＡおよび／又はＤＮＡの特異配列に 相補的な配列を含む第１ポリヌクレオチドプローブが固定化される。また他の実 施態様では、そのような生物、感染性の作用物質又は生物学的成分のグループが 同定するべ請求められている場合は、第１ポリヌクレオチドプローブは多くの生 物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共通な配列を含むこともできる。それ ゆえ、細胞溶解液に存在するＲＮＡ及び／又はＤＮＡが固体支持体に接触すると 、それは第１ポリヌクレオチドプローブと接触することとなる。

第１ポリヌクレオチドプローブはオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）よりもオリ ゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）であることが好ましい。なぜならば、Ｄ ＮＡはＲＮＡよりも安定だからである。ポリヌクレオチドプローブにおけるヌク レオチドの数は、制限されるものではない。しかし、オリゴデオキシヌクレオチ ドが特異的ポリヌクレオチドプローブとして用いられるなら、オリゴデオキシヌ クレオチドの好ましい長さは１５〜１００ヌクレオチドである。１００ヌクレオ チドよりも大きい長さは本発明の範囲内で使用できる。しかし、多くのポリヌク レオチド自動合成装置は長さ１００ヌクレオチドを限界とするので、１００又は それ以下の長さが好ましい。より大きい配列は、１００ヌクレオチドよりも小さ な２つの配列を結合させて得られる。

一つの実施態様では、第１のポリヌクレオチドプローブは次の配列に相補的なオ リゴヌクレオチドである。すなわち、配列番号８１．１０４．１３１〜１３３、 １５４〜１５６．１７６．１９９．２６７．２９０．３１２．３３５．３６４〜 ３７６、又は３９１〜３９２゜これらの配列は、配列表及び表Ｖ−Ｘｌｌに示し たように、種々の真菌の病原性種のリポソームＲＮＡに特異的である。

実施例２は、生物試料におけるニューモシスティスカリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙ ｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ）の存在の決定に有用な一つの特定のプローブを示すた めに提供される。

実施例２ ・１１ポ１ヌ　し　゛プローブの ニューモシスティスカリニイ（ＰｎｅｕｎｌｏＣｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ） 中のリポソームＲＮＡの配列に特異的な第１ポリヌクレオチドプローブが調製さ れる。このプローブはメンロパーク（Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ）のアプラ イド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ）社で製造されたＤＮＡ合成装置で合成される。このプローブは 次の配列、すなわち、 ５°　−ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣ−３’　（配列番号８１）（Ａ はアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、及びＣはシトシンである。）をもつポ リヌクレオチドに相補的である。

Ｖｌｌ、　・７１ポ１　し　゛プローブのポリヌクレオチドを固体支持体に固定 化するいろいろな方法、例えば、共有結合に因る方法、イオン的結合に因る方法 、あるいは物理吸収法等が、この技術分野で知られている。本発明のある実施態 様では、第１ポリヌクレオチドプローブのようなポリヌクレオチドは、その表面 にカルボキシル残基、アミン残基、又はヒドロキシル残基のような官能基をもつ マイクロタイターウェルに固定化される。

それゆえ、固体支持体へ第１ポリヌクレオチドプローブを固定化する操作におい て、固体支持体は官能基を発現し、そしてポリヌクレオチドの５°末端はその官 能基に共有結合で結合される。これら官能基へのポリヌクレオチドの種々の共有 結合方法はいずれも使用できる。好ましい、よく知られた方法は、マレイミド法 やカルボジイミド法を含んでいる。

マレイミド法では、マレイミド基を含む物質とスルフヒドリル（ＳＨ）残基を含 む別の物質との反応を伴う。この方法では特異的ポリヌクレオチドプローブの５ °末端は、ポリヌクレオチドの５゛末端とマレイミド化合物との反応によって、 固体支持体に固定される。好適なマレイミド化合物はスルホスクシンイミジル− ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ −Ｓ　Ｍ　ＣＣ：　ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）である。

ＳＨ残基は、アミノ基を持つ支持体とスクシンイミジル−３−アセチルチオアセ テート（ＳＡＴＡ）との間の反応、それに続くヒドロキシルアミン（ＮＨ＊ＯＨ ）を使う脱アセチル化によって支持体に供給される。スルホ−ＳＭＣＣおよび５ ＡＴＡは、Ｐｉｅｒｃｅ社を含む他の各種販売元から容易に入手可能である。結 果として得られた支持体上のＳＨ基は、次いでポリヌクレオチドの５°末端のマ レイミド基と反応してポリヌクレオチド−固定化支持体を形成する。

マレイミド法を採用して経験した一つの問題は、プレート上のｓ昧は、ポリヌク レオチドの５°末端でアミノ基と反応するだけではなく、プリン塩基、アデニン 及びグアニン上の第一級アミノ基とも反応するということである。ポリヌクレオ チドがそれぞれの５゛末端で固定化されることを保証するため、固定化に先だっ てそのポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドとを対（ベア）にしてプリ ン塩基上のアミノ基を保護することができる。固定化の後、相補的なポリヌクレ オチドは、例えば、加熱のような変性によって、−木調プローブが支持体に固定 されたままで、取り除かれる。

ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化する別の方法は、カルボジイミド法であ る。この方法は、カルボジイミド化合物を使い、アミノ基とカルボキシル残基を 含む物質との反応を含んでいる。カルボジイミド化合物の例としては、ｌ−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以後、ＥＤＣ と呼ぶ）がある。この反応は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（以後、ス ルホ−ＮＨ８（ｓｕｌｆｏ−ＮＨ５）と呼ぶ）によって高めることができる。Ｅ ＤＣ及びスルホ−ＮＨＳの両方ともＰｉｅｒｃｅ社を含む他の有名販売元から入 手可能である。

ポリヌクレオチドを支持体に固定させるための好ましいカルボジイミド法の実施 に当たっては、カルボキシル残基が固定されている支持体を使う。支持体にＥＤ Ｃを接触させる前に、ＥＤＣはスルホ−ＮＨＳとの反応によって活性化される。

この活性化されたＥＤＣは表面結合のカルボキシル残基を含む支持体と反応する 。次いでこれをそれぞれの５°末端にアミノ基を持つポリヌクレオチドと反応さ せて、ポリヌクレオチド固定化支持体を得る。

第１ポリヌクレオチドプローブがそれぞれの５゛末端で固定化されることを保証 するため、固定化に先だってヌクレオチドを相補的なポリヌクレオチドとハイブ リダイズさせることにより、プローブ（アデニル、グアニル及びシトシル基）上 の第一級アミノ基を保護することができる。固定化の後、相補的なポリヌクレオ チドは、次いで加熱のような変性によって、−木調プローブが支持体に固定され たままで、取り除かれる。固体支持体上の活性化されたアミノまたはカルボキシ ル残基の非特異性結合を防止するため、特異的ポリヌクレオチドプローブが既に 固定されている固体支持体は、第一級アミン化合物、好ましくはグリシンで処理 される。

実施例３は、当分野の技術者への指針として、固体支持体へのプローブのほんの 一つの固定化方法を提供するものである。当業者は、前記方法も含めプローブを 固定化する種々の方法が使用できることを認識するであろう。

実施例３ カルボジイミド゛による　１ポリヌ　レオチドプローブの　への化 ＥＤＣ及びスルホ−ＮＨＳ（ピアース社、ル）をＤＥＰＣ処理水でそれぞれ、２ ０ｍＭ及び１０Ｍに溶解した。次いで、それぞれの等容量を混合し、ＥＤＣ／ス ルホ−ＮＨ３溶液を調製した。特異的ヌクレオチドプローブをＤＥＰＣ処理水で １μｇ／μｌの濃度に溶かし、次いでこれをＥＤＣ／スルホ−ＮＨ８溶液で１： ２５（容量比）に薄めた。

このプローブ溶液５０μｌを、その表面にカルボキシル基をもっていることで知 られるマイクロタイタープレート（ＭＳ−３７９６Ｆ、住人ベークライト、日本 ）に加えた。室温で一晩、インキュベートしたのち、反応液を吸引で除いた。

ＶＩＴＩ　第１ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション好ましい実 施態様では、ポリヌクレオチドを含む細胞溶解液又は他の試料は、次いで固体支 持体に固定された特異的第１ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。しかし 、本発明によれば実施される特定の分析の目的によっては、第１ポリヌクレオチ ドプローブは共通プローブとすることもできる。ハイブリダイゼーションは細胞 溶解液と第１ポリヌクレオチドプローブを当業者が知っているように、多くの因 子に依存する温度でインキュベートすることにより行なわれる。これらの因子は 、相補的ヌクレオチド配列の長さ、相補的ヌクレオチド配列におけるグアニン及 びシトシン塩基の全塩基に対する比率（ＧＣ含量）、緩衝液中のＮａｃｌ濃度、 相補的ヌクレオチド配列における塩基のミスマツチ数、及びヌクレオチドの型を 含む。本発明の好ましい形態では、次式が好ましいインキュベーション温度（Ｔ 　１ｎｃ）の計算に用いられる。

Ｔｉｎｃ＝１６．６ｘｌｏｇ（Ｍ）＋０．４１（ＧＣ）＋８１．５−６７５／ｎ −１５（℃）上記の式で、Ｍは液中のＮａＣ１の濃度、■は闇含量（％）、ｎは ヌクレオチド配列の長さくハイブリダイズするヌクレオチドの数）である。保温 時間はまた「モレキュラー・クローニング」のマニュアルに記載されている方法 によっても決めることができる。

インキュベーションの時間は、好ましくは１時間から１夜までで、好ましくはイ ンキュベーション中はサンプルを静かに振盪させること。インキュベーションは 好ましくは適当な緩衝液中で行う。マニアテイス処方に記載されたノザンプロッ トまたはドツトプロット法でＲＮＡとＤＮＡをハイブリダイズさせる際に使った 緩衝液と同じ緩衝液を使うことができる。緩衝液は、好ましくはＲＮａｓｅで汚 染されないような方法で調製する。もし多少のＲＮａｓｅ汚染がある場合、その 活性ができるだけ低くなるよう制御すること。

実施例４は、試料中のリポソームＲＮＡを固定化プローブにハイプリダイズさせ る一つの方法を提供する。

実施例４ 配列番号８１に相補的な配列をもつ第１ポリヌクレオチドプローブ結合のマイク ロタイターウェルに、０．５ＭＮａＣｌ含有の溶解用緩衝液２５０μｍを加え、 ウェルを４５℃で１時間インキュベートし、そのウェルからＲＮａｓｅを除去す る。ウェルから吸引で緩衝液を除き、生物試料を含む溶解用緩衝液５０μｌをそ れぞれのウェルに加える。この溶液を３９℃で１時間インキュベートしくＴＯ＋ ＝５４℃）、ハイブリダイズさせ、次いでゆっ（りと２０−３０分かけて冷やす 。

ＲＮＡを含む試料の探査を伴う本発明では、又はＲＮＡの分解を防ぐことが望ま れるどんな操作においても、存在するりボヌクレアーゼ（ＲＮａ５ｅ）の活性を 阻害することが望ましい。このＲＮａ５ｅインヒビターの一つは、バナジルリボ ヌクレオサイドコンプレックス（ＶＲＣ）（ベセスダリサーチラボラトリー、ゲ テルスバーグ、ＭＤ）である。ＶＲＣは細胞分画やＲＮＡの調製に有用であると 報告されていて、それはＲＮＡのフェノール抽出もエタノール沈殿も妨害しない ことが示されている。更に加えて、ＶＲＣは細胞の他の細胞質成分に影響しない 。それゆえ、ＶＲＣは多くの実験操作において理想的なＲＮａｓｅインヒビター である。

しかしながら、ＶＲＣでＲＮａｓｅを阻害する従来技術は、分子生物学の分野で 慣用されるＥＤＴＡ及びＳＤＳを含む緩衝液系では使用禁忌ということを教えて いた。この禁忌の理由は、コンプレックスがこの緩衝液の存在で解離し、ＲＮａ ｓｅ阻害作用が損失されるからと信じられていた。事実、ＢＲＬのＶＲＣ製品の 付属説明書には、溶液からＲＮＡをエタノール抽出する前に、５−１０倍（モル 比で）の過剰のＥＤＴＡをＶＲＣ含有のＲＮＡ溶液に加えることを勧めている。

ＥＤＴＡとＳＤＳを含む慣用の緩衝液とともに、ＶＲＣを使用することは見かけ 上、不可能とされていたことが、ＲＮａｓｅインヒビターとしてＶＲＣを利用す ることの主な障害となっていた。

しかし、我々はＳＤＳ及び／又はＥＤＴＡの存在下においてもＶＲＣは事実、有 効なＲＮａｓｅインヒビターであることを見つけた。したがって、ＶＲＣは、以 前は有効ではないと思われていた、ＥＤＴＡ又はＳＤＳが存在する緩衝液系を使 用する分析で使うことができる。ＶＲＣは、ＲＮＡを処理する時またはその他の 各種の分子生物学的技術を使う時に通常使用されるＳＤｓ及びＥＤＴＡの濃度で 効果的なＲＮａｓｅ阻害剤である。例えば、約１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液中 でＶＲＣは効率よ（ＲＮａｓｅを阻害することを我々は見出している。また、Ｖ ＲＣは０．５％のＳＤＳ溶液で効果があることを見つけており、２％、好ましく は１％までの範囲にある液に有効であろうと信じられている。勿論、ＶＲＣはＥ ＤＴＡとＳＤＳとを含むその他の溶液で使用することも可能である。

ＶＲＣは、プロティナーゼにと併用するとき特に有力なＲＮａｓｅ阻害剤である ことも我々は見つけている。プロティナーゼにもＢＲＬから入手できる。図１ａ のゲルに示すように、Ｕ９３７細胞（ヒトのマクロファージ細胞系）から採った ｍＲＮＡはＶＲＣとプロティナーゼにとの組み合わせによってＲＮａｓｅ分解か ら保護された。このゲルのレーン１は、ＶＲＣ，プロティナーゼＫ及びＲＮａｓ ｉｎを含んだ細胞調製物から得たｍＲＮＡを示し、一方、レーン２は、ＶＲＣと プロティナーゼＸを含んだ細胞調製物から得た吐ＮＡを示す。ＲＮａｓｉｎはマ ディソン、Ｗ！のプロメガ−Ｐｒｏｍｅｇａ−社から市販されている。

レーンｌおよび２における明瞭なバンド１０はレーン７に示されたバンドと一致 し、これにはＵ９３７細胞のＲＮａｓｅを含まない調製で得られる純粋なりロー ンｃＤＮＡが含まれており、このことがらｍＲＮＡは、レーンｌおよび２の調製 で実質的なｍＲＮＡの分解に遭わなかったことが示される。

レーン１および２をレーン３から６と比べれば、プロティナーゼにと組合せられ た場合、ＶＲＣは上記のＵ９３７細胞からのｍＲＮＡの調製において、プロテイ ナーゼにのみ（レーン４）の場合、プロティナーゼにとＲＮａｓｉｎとの併用（ レーン３）の場合、または「ファーストトラックＪ　（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ 　ｏｆ　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　Ｃａより入手できる）と命名されて市販されてい るＲＮａｓｅ阻害調製物（レーン５）のどれよりも、はるかに広範囲にＲＮａｓ ｅを阻害していることが解る。レーン３−５のどれにも、分解されたｍＲＮＡを 意味する明瞭なバンド１０が表われていない。逆に、レーン４　（プロティナー ゼにのみ）及びレーン５（ファーストトラック）は分解されたｍＲＮＡについて レーン６（阻害剤無し）のバンド２０と同様の度合を示す。また図１ａに示され たゲルも、レーン２　（ＶＲＣとプロティナーゼＫ）では、レーン４（プロティ ナーゼにのみ）またはレーン３（プロティナーゼにとＲＮａｓｅ）よりｍＲＮＡ の分解が少ないことから、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳの緩衝液（［ ９３７細胞調製に使われる緩衝液）でのＶＲＣの有効性を示している。

本発明方法で使用される水からＲＮａｓｅ活性を除くため、水はジエチルピロカ ーボネート（ＤＥＰＣ）で処理することが好ましい。好ましいＤＥＰＣ処理は、 水に０６１％ＤＥＰＣを加え、３７℃で一晩放置したのち、オートクレーブ中で 滅菌する。ＤＥＰＣはこのオートクレーブで不活性化されるので、本発明方法の 酵素プロセスを妨害しない。

もし水が他の方法で滅菌されるなら、水中のＤＥＰＣはこの分野で知られた他の 方法によって不活性化することができる。

ＩＸ、回体文待体凶洗浄 ハイブリダイゼーションに続いて、生物試料のハイブリダイズしなかった部分は 、好ましくは固体支持体から分離され、第１ポリヌクレオチドプローブにアニー ルしなかった実質的には生物試料の全てが固体支持体から除去される。もし固体 支持体が、例えば、マイクロタイターウェルで、第１ポリヌクレオチドプローブ がウェルの壁又は底に固定化されているなら、ハイブリダイズしなかった細胞溶 解液はウェルから細胞溶解液を流しだしたり吸引することで除くことができる。

ウェル自身は、溶解用緩衝液のような洗浄液をウェルの壁に注ぎ、次にこれを吸 引して除くことにより、洗浄又はリンスすることができる。洗浄液はポリヌクレ オチドプローブにハイブリダイズしたポリヌクレオチドを少しも外さないように 溶液塩濃度及び他のパラメータが管理されているなら、この分野で知られた洗浄 液のいずれも使用できる。

Ｘ、ｌボ１ヌ　レオ　゛プローブの　びバイブ１　ゼーシ　ン固体支持体を洗浄 すると、次いで固定化第１ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズしている ＲＮＡ又はＤＮＡのポリヌクレオチド鎖−そのようなポリヌクレオチド鎖が細胞 溶解液に存在すればであるが−に、第２ポリヌクレオチドプローブを接触させる 。接触とノゾブリダイゼションのステップは、上記した第１ポリヌクレオチドプ ローブでの方法と同様に、あるいはこの分野で知られている他の方法によって実 行される。

好ましい実施態様としては、第２ポリヌクレオチドプローブは、生物、感染性の 作用物質又は生物学的成分のグループのＲＮＡ及び／又はＤＮＡに共通の配列に 相補的なポリヌクレオチド配列を含む。例えば、ある特定の生物が探査され、そ の生物が真菌であるなら、第２プローブは探査されるべき真菌を含む多くの種類 の真菌に共通の配列を含む。もしウィルスのような感染性の作用物質が分析対象 であるなら、第２プローブは多くの関連ウィルスに共通の配列を含むことができ る。この方法では、同一の第２ポリヌクレオチドプローブが、一群の生物、感染 性の作用物質又は生物学的成分のどのＲＮＡ及び／又はＤＮＡにもハイブリダイ ズできる。更に好ましい実施態様としては、第２の共通プローブは、第１の特異 的プローブと同じかそれ以下のＴｍであることで、そうすれば、第２プローブの ハイブリダイゼーションは第１プローブのハイブリダイゼーションに用いた条件 と同じ条件で実行できる。

本発明の実施には、多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を分 析するために、多（の特異的プローブの使用が望まれる。何故なら、そのとき同 一の第２プローブは、一群の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分のどのＲ ＮＡ及び／又はＤＮＡともアニールされつるからである。この実施態様における 共通ポリヌクレオチドプローブはまた、多くの特異的プローブが多くの生物又は 作用物質の存在を検出するために使用される測定試薬キットに有利に含ませるこ とができる。

第２ポリヌクレオチドプローブは、また、試料中の同定されるべき特定の生物、 感染性の作用物質又は生物学的成分のポリヌクレオチドに特異的な第２配列を含 むこともできる。この第２の配列は、第１ポリヌクレオチドプローブに相補的な 配列とは異なる、特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に特異な第２ の配列に相補的な配列である。

Ｘｌ、標識 第２ポリヌクレオチドプローブは、第１プローブにハイブリダイズしたＲＮＡ及 び／又はＤＮＡの検出を容易にするため、好ましくは標識される。そのプローブ に結合させるとき、ポリヌクレオチドプローブを標識できる種々の化学物質が使 用できる。例えば、ラジオアイソトープの３２　ｐ　、　３　Ｓ　ＳＳ３　Ｈ及 び′２５１のような種々の放射活性物。酵素又は酵素基質も、第２ポリヌクレオ チドプローブを標識するために結合されうる。適当な酵素としては、アルカリホ スファターゼ、ルシフェラーゼ及びパーオキシダーゼを含む。

標識は呈色又は放射活性を与える標識が好ましい。用いられる他の標識は、ビオ チン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニンのような化学物質を含む 。フルオレセインのような色による好ましい実施態様では、標識は、放射活性物 質の使用に伴う健康障害や廃棄の問題を避けることができるので、特に好ましい 。好ましい実施態様においては、ビオチンがヌクレオチドプローブに結合され、 引き続いてストレプトアビジンのようなアビジン−それにはアルカリホスファタ ーゼのような酵素が結合している−が続く。その酵素の存在が種々の、例えば、 フルオリメトリーで検出可能な蛍光性マーカを与えるアトフォス（ＡＴＴＯＰＨ Ｏ８）のような基質によって検出される。

核酸はまた、核酸染料でこれを染色することによっても「標識」できる。比較的 多量の核酸が存在するときはエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）がそのような核 酸の存在を同定するのに使うことができる。しがし、更に高感度の染料が好まし い。

感度の高い染料には、モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ ）社（カリフォルニア）から入手できるＰＯＰＯＳＢＯＢＯｌｙｏｙｏ及びＴＯ ＴＯのようなシアニン核酸染料が含まれる。これらの染料は例えば、サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Σ：８８５（１９９２）に記述がある。

本発明において使用できる特に好ましい染料は、より短波長型を含むもので、Ｔ ＯＴＯ−１及びＹＯＹＯ−１があり、更に好ましくは、ＹＯＹＯ−１である。

４ピコグラムのＤＮＡがトランスイルミネータ又は手動のＵＶランプで照射する と、可視の蛍光によって検出できる。このようにして、これらの染料は、特に容 易で、かつ感度の高い核酸同定方法を提供する。

我々は、ここでディスカスされるようにウェルに不溶化されたオリゴヌクレオチ ドを染色するＹＯＹＯ−１の能力を試験した。先ず、ウェルに種々の既知量のオ リゴヌクレオチドを不溶化し、その後洗浄して不溶化されなかったオリゴヌクレ オチドを洗って除いた。次いで、ＹＯＹＯ−１の水１０００倍希釈液を加えた。

次いで、これを洗浄することなく直接的にフルオリメータを使用した。オリゴヌ クレオチドのピコモルとの関係を図１ｂに丸記号で示した。我々はまた、ＴＯＴ Ｏ−１で染色された固定化オリゴヌクレオチドを１ｏ分間インキュベートし、洗 浄し、水を加え、フルオリメータで測定した。洗浄した場合の結果を図１ｂの黒 丸で示し、洗浄しない場合は白丸で示した。洗浄は染色の強さに殆ど影響を与え ず、また染色の強さはオリゴヌクレオチドの量に関係していることが分がる。

我々はまた、ＹＯＹＯ−１染色のタイムコースを１時間以上かけて試験した。

プレートにオリゴヌクレオチドを全く固定化していない対照試験も行なった。オ リボタクレオチド固定化プレートは図１０において白丸で示し、対照は黒丸で示 した。図１０から、最初の急激な立上り（スパイク）の後、比較的安定な染色が 観察される。

我々は、更にウェルに固定されるオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド量を 一定としたときのＹＯＹＯ−１の添加量レスポンス（図１ｄにおいて開いた円で 示す。）を、オリゴヌクレオチドがない場合を対照（図１ｄにおいて閉じた円で 示す。）として、試験した。オリゴヌクレオチド固定化ウェルとオリゴヌクレオ チドが固定化されていないウェルを用いたときの差は図１ｄにおいて三角形で示 す。希釈率が１０−４〜１０−３の範囲で鋭い増加が見られる。

我々はまた、オリゴヌクレオチド固定化ウェルと非固定化ウェルの両ウェルの染 色の再現性を試験した。実験を５回繰り返し、図１ｅにオリゴヌクレオチド固定 化ウェル（＋）と非固定化ウェル（−）のデータを示した。データはそれぞれの 実験で実質的に同じであることが分かるであろう。

図１ｂ−１ｅに示したデータがら、ＹＯＹＯ−１はオリゴヌクレオチドの存在量 を表す染色試薬として信頼高い指標であることを示している。

当技術分野で知られている他の標識もまた使用できる。例えば、その部分に結合 するパートナ−に対して特異結合する試薬も使用できる。例えば、抗体のような 結合試薬はマーカーで標識され、そして抗原のような結合パートナ−に第２ポリ ヌクレオチドプローブ上で結合されることができる。作用物質（アゴニスト）と その受容体もこの技術分野で知られているように用いることができる。第２ポリ ヌクレオチドプローブに結合されたノルエピネフリン受容体のような受容体は、 その受容体に対する標識アゴニスト、この場合はノルエピネフリンを添加するこ とによって検出できる。

実施例５は、ｒＲＮＡの存在を同定する標識共通ポリヌクレオチドプローブを用 いる一方法を示すものである。

実施例　５ ・、２ヌ　レオチ゛プローブの　：　びバイブ１　イゼーシ　ン第２ポリヌクレ オチドプローブは、実施例１で調製したオリゴヌクレオチドで、次ノ配列＋　５ −ＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧ−３°（配列番号ｌ）に相補的な配列 を含む。

この配列は、多くの真菌種のリポソームＲＮＡ−それには実施例１の特異的ポリ ヌクレオチドプローブが相補するリポソームＲＮＡも含まれる−に相補的である 。

この第２ヌクレオチドプローブはフルオレセインでプローブの３゛又は５゛末端 が標識される。３゛末端は、ターミナルトランスフェラーゼ及びＦＩＴＣ−ｄＵ ＴＰを用いて標識される。また、５゛末端は、ＦＩＴＣとの化学反応で標識され る。０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む溶解用緩衝液５０μｌ及びフルオレセインが結合 した第２ポリヌクレオチドプローブの溶液１μ】がそれぞれのウェルに加えられ 、３９℃で１時間インキュベートされ、その抜栓々に冷却する（２０−３０分以 上）。

Ｘ１１．　′″　」こ　′（ノー　、　の　ｍ　の第２ポリヌクレオチドプロー ブが、生物試料に存在する生物、感染性の作用物質、生物学的成分のＲＮＡ及び ／又はＤＮＡにハイブリダイズしたのち、第２プローブを含む溶液は実質止金て が固体支持体から吸引又は他の適当な方法で除かれ、そして固体支持体はハイブ リダイズしなかった第２ポリヌクレオチドプローブを除くため、再び洗浄される 。検出すべき特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在は、探査さ れる生物、感染性の作用物質又は生物学的成分のＲＮＡ及び／又はＤＮＡ鎖−そ れ自身は第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズしている−を介し固体 支持体に固定化された第２ポリヌクレオチドプローブの存在を検出することによ り最終的に決定される。もし第２ポリヌクレオチドプローブが検出されれば、こ の生物試料は試験対象のＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含むことを示し、したがって 、その生物試料は探査対象の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分をもって いることを示す。

本発明の一つの実施態様では、生物試料を試験するとき陰性対照実験が行なわれ る。対照実験は、その生物試料を試験するときと同じステップ及び同じ材料を用 いて本発明方法を実行することによりなされる。ただし、対照実験では固体支持 体に第１ポリヌクレオチドは結合されていない。

本発明方法を実行する場合は、陽性対照実験も好ましくは実施する。陽性対照実 験は、その生物試料を試験するときと同じ材料で同じステップを用いて本発明方 法を実行することによりなされる。ただし、対照実験では固体支持体に、探査さ れるべき一群の生物、感染性の作用物質、生物学的成分のＲＮＡ及び／又はＤＮ Ａに共通の配列を含む第１ポリヌクレオチドが結合されている。例えば、もしあ る真菌種が探査されているなら、陽性対照の固体支持体に固定化される第１ポリ ヌクレオチドプローブは、その種が一員である真菌の属に共通の配列をもっこと ができる。このようにして、もし真菌の属の中のある種が生物試料に存在すれば 、陽性対照を含め固体支持体は試料中の真菌の存在を示す。

実施例　５ａ ・　の”ｕｎがん゛　−のサブ　イブのロサブタイプ特異的プローブを用いてｊ ｕｎがん遺伝子のサブタイプを同定するため、ｊｕｎがん遺伝子・サブタイプの ｊｕｎ−Ｂ、ｃ−ｊｕｎ及びｊｕｎ−Ｄ（Ｂ−１２５８（配列番号７３０）、Ｃ ２１４７（配列番号４７０）、及ヒ）ｌＵＭＤ９６５（配列８号４８８））　ノ 一つに特異的なオリゴヌクレオチドの１０ｐモル（２μｌ）を、プラスチック製 マイクロタイタープレート（Ｎｏ、　３４９０．コースタ社製、ケンブリッジ、 ＭＡ）のウェル３個にそれぞれ加え、２５ｍＭ　ＥＤＣ（ピアース社製、ロック フォード、ＩＬ）と共に３７℃で一晩混合した。オリゴヌクレオチド−ＥＤＣ溶 液をウェルから除いたのち、ウェルそれぞれに１０ｍＭグリシン溶液を加え、３ ７℃で２時間インキュベートした。

それぞれのウェルを水２００μｍで６回洗い、使用するまで４℃で保管した。

Ｊｕｎ−ＢＳＣ−ｊｕｎ及びｊｕｎ−Ｄ？ウスｊｕｎがん遺伝子のｃＤＮＡ（ビ オチン化）のそれぞれ約１ｍｇ／ｍｌ含有溶液（反応用緩衝液：１０ｍＭトリス 、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ　ＮａＣＪ）約５０ａｌをマイク ロタイタープレートの３個のウェルにそれぞれ採った。３７℃で２時間インキュ ベートしたのち、ウェルを反応用緩衝液で３回洗浄した。アルカリホスファター ゼ結合ストレプトアビジン（クロンチック社製、パロアルト、ＣＡ）を反応用緩 衝液でｌ：１０００に希釈し、その５０μｍをそれぞれのウェルに加え、室温で 更に３０分インキュベートした。反応緩衝液でウェルを更に３回洗浄したのち、 アトフォス（ＪＢＬ社製、サンルイスオビスポ、ＣＡ）をそれぞれのウェルに加 え、室温で１０分間インキュベートした。それぞれのウェルの蛍光を、励起のた めのフィルター設定が４８５ｎｍ、発光波長が５９０ｎｍで、サイトフルオール ２３００（ミリボア社製、べ・ラドフォード、ＭＡ）により測定した。図７ａ− ７ｃに示したように、それぞれのサブタイプ特異的オリゴヌクレオチドは対応す るマウスｊｕｎがん遺伝子とのみハイブリダイズした。また、サブタイプ間でク ロス反応は殆ど見られなかった。それゆえ、これらのプローブは、ｊｕｎがん遺 伝子のサブタイプの一つに特異的であるといえる。

Ｘ１１１．　・　こ　１６　感　の　′　よｌ　・　の−特定の生物又は作用物 質からの生物試料におけるＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量、あるいは特定の生物学 的成分の存在を示唆するＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量は、本発明方法に従って固 体支持体に供されたのち、その固体支持体に固定された第２ポリヌクレオチドプ ローブの量を測定することによって分析される。生物又ζま感染性の作用物質を 試験するとき、試料中のＲＮＡ及び／又はＤＮＡの量（ま、試料中に含まれる生 物又は感染性の作用物質のおおよその数を与え、したがって、試料が罹患生物で あるならば感染程度のおおよその評価を与える。

固体支持体に結合した第２ポリヌクレオチドプローブの量を測定するため（こ、 第２ポリヌクレオチド上の標識の物理量又は化学量あるいは活性が測定される。

この技術分野で知られた、第２ポリヌクレオチドプローブ上の標識の測定技術の 多くが使用でき、標識の性質に応じてその技術が使われる。そのような技術とし ては、緩衝液の光学密度、緩衝液の発光強度、又は固定化第２ポリヌクレオチド プローブによる放射能の測定等が含まれる。標識それ自身はこの指標を提供でき 、あるいは標識に結合する他の化合物もしくは標識を触媒する他の化合物を要求 する。標識を検出する他のメカニズムとしては、標識と化学的に反応できる化合 物の使用、着色性標識の検出、発光の検出、放射能の測定又は標識の触媒能力等 力（ある。

ある測定技術においては、第２ポリヌクレオチドの標識はビオチンである。この 標識の存在は、それと酵素パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼとの反応 によって検出できる。これらの酵素は、アビジンやストレプトアビジンとの結合 によって、ビオチンに特異的に向けられる。この酵素の存在は、次いで適当な基 質を加え、検出可能な着色性又は発光性の反応へ導（ことによって検出される。

アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンは、市販品が容易に入手できる 。

アルカリホスファターゼの基質の一つはアダマンチル−１，２−ジオキセタンリ ン酸（ＡＭＰＰＤ）である。アルカリホスファターゼと反応すると、ＡＭＰＰＤ は波長４４７ｎｍで発光する。この光はこの技術分野で良く知られた方法で測定 できる。アルカリホスファターゼの更に好ましい発光性基質はアトフォスである 。

アルカリホスファターゼとＡＭＰＰＤの反応においては、５−Ｎ−テトラデカノ イルーアミノーフルオロセインのようなエンハンサ−が加えられる。５−Ｎ−テ トラデカノイルーアミノーフルオロセインは、波長４７７ｎｍの光を更に容易に 検出可能な波長５３０ｎｍの光に変換できる。

他の標識は、ジゴキシゲニンのような抗原や抗体である。抗原は、それに対して 向けられた抗体に結合する能力によって検出できる。第２ポリヌクレオチドプロ ーブを標識するために用いられる抗原又は抗体は、蛋白結合能力によって検出で きる。抗体それ自身は直接、′２５Ｉのような放射活性物で標識でき、あるいは 放射活性物で標識された蛋白を結合させて標識できる。その放射活性物は次いで 、この技術分野でよく知られた方法、例えば、Ｘ線フィルムや放射能カウンター を用いた方法で検出できる。

標識検出に関してよく知られている技法には、カラー発色反応で出現する標識の 分光光度計による検出がある。例えば、蛍光性色素を放出するフルオレセインは 標識として用いられ、その色素の強度は標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ した標識量を測定するため使用できる。そのような発色性反応の使用は、本発明 方法では放射活性標識物の使用よりも好ましい。何故なら、放射活性物の使用に 伴う問題が避けられるからである。

その他の技法としては、Ｘ線フィルムまたはインスタントカメラを使う光放射反 応の検出である。放射反応は暗室においてＸ線フィルムまたはインスタントカメ ラに記録される。放射反応で露光されるＸ線フィルムへはプロット（しみ）とし て記録され、このプロットの濃淡が濃度計で測定される。もしポラロイドのよう なインスタントカメラを使うときは、その画像をスキャナで読みとり、コンピュ ータでプロットの位置を決め、図形分析のソフトウェアを使ってプロットの濃淡 を測定する。

本発明の一つの実施態様の例は、図２に示されている。この図に示されるように 、ヒト患者からの生物試料の収集及び溶解に続いて、検出されるべき真菌種のｒ ＲＮＡ力かイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに続いて、検出される べきｒ　ＲＮＡ　２２鎖の特異配列２４が第１ポリヌクレオチドプローブ２６上 の相補的配列２８とアニールされる。

試料のハイブリダイズしなかった部分の実質的に全てを除去したのち、第２ポリ ヌクレオチドプローブ３４がリポソームＲＮＡの鎖に異なった配列３０−この配 列は多くの真菌種共通の配列であることが好ましい−でハイブリダイズされる。

この図では第２プローブもまた、第１プローブ２６、第２プローブ３４、リポソ ームＲＮＡ２２鎖及び固体支持体によって形成される複合体の検出を助けるプロ ーブ結合標識３６を含む。

実施例６は、標識共通ポリヌクレオチドプローブを用いる特定の真菌種のｒＲＮ Ａ量を測定する一方法を示す。

実施例　６ 、ニされた　２ヌ　レオチドプローブの化　・　の１ｊ実施例５で記述したノゾ ブリダイゼーションに従って、ハイブリダイゼーション溶液（標識第２ポリヌク レオチドプローブを含む溶解用緩衝液）を吸引で除き、マイクロタイタープレー トを新鮮な溶解用緩衝液２５０μｍで一度洗う。０．０５９６　（ｗ／　ｖ　） ツイーン２０．５００ｍＭ塩化ナトリウム及び１００ｍＭ）リス塩酸を含有する ブロッキングバッファーをそれぞれのウェルに加え、非特異的結合を少なくする ため室温で５分間インキュベートする。これらの溶液は吸引で除く。

次いで、試験対象の真菌種のリポソームＲＮＡに結合した第２ポリヌクレオチド プローブ上の蛍光が、その種の真菌が生物試料中に存在するかどうかを決定する ため肉眼的に検出される。マイクロタイタープレートに結合した蛍光の量を分光 光度計又は蛍光光度計で測定することによって、試料中に存在する真菌のおおよ その量が測定される。

ＸＩＶ、　・　のｌ゛　のＤＮＡ　よＲＮＡ　ＪのＰＣＲ１我々はまた、試料中 の微量の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の検出に特に有用な別の操作 法を見出した。この方法は、試料中の生物学的成分あるいは生物もしくは感染性 作用物質がもっているＲＮＡ及び／又はＤＮＡ鎖に相補的及び／又は相同的ポリ ヌクレオチド鎖の多重コピーをつくり出すポリメラーゼ鎖増幅反応（ＰＣＲ）を 利用するものである。

図３に示される本発明の実施態様の一例において、生物試料が先ず前記の方法で 得られる。この試料は、生物、感染性の作用物質又は試料中に存在する生物学的 成分をもっている細胞のＲＮＡ及び／又はＤＮＡが探査されうるように、溶解さ れる。次いで、溶解試料は第１ポリヌクレオチドプライマー４２と接触させる。

このプライマー４２は、試料中の検出されるべき生物、感染性の作用物質又は生 物学的成分のポリヌクレオチドに含まれる配列に相補的である。プライマー４２ は、次いで、それに相補的な分析対象ポリヌクレオチド４０に接触させ、そのポ リヌクレオチドにハイブリダイズさせる。プライマー４２のハイブリダイゼーシ ョンは、ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション又はアニーリング に関連して先に記述した方法と同様にして行なわれうる。

プライマー４２に相補的な配列は、例えば、ある種の真菌のリポソームＲＮＡの ような、生物のＤＮＡ又はＲＮＡに特異的な配列である。そのような配列はまた 、がん遺伝子配列のような感染性の作用物質又は生物学的成分に特異的な配列を 含むことができる。しかし、別の実施態様ではプライマー４２はそのような特異 的配列の３°に存在する配列に相補的で、そのためプライマー４２は特異的配列 を含む鎖にアニールされるとき、特異配列の５′に位置する。このようにして、 プライマー４２が伸長されるにつれ特異配列に相補的な配列が取り込まれる。

更に別の実施態様では、プライマー４２は、生物、感染性の作用物質又は生物学 的成分のグループに共通の配列−多くの真菌種に共通する配列−に相補的である 。別の例では、プライマー４２は、多くのｊｕｎサブタイプのような、関連の生 物学的成分に共通である。したがって、この実施態様では、第１ポリヌクレオチ ドプライマー４２は共通ＰＣＲプライマーと呼ぶことができる。

共通ＰＣＲプライマー４２が試料中に存在する分析対象ポリヌクレオチド４０に アニールされたのち、このプライマーは４つのヌクレオチド三リン酸及びポリメ ラーゼ酵素を用いて伸長される。この際、ｃＤＮＡを含み、試料中の分析対象ポ リヌクレオチドに相補的な配列をもっている相補的ヌクレオチド鎖４１を含む２ 本鎖ポリヌクレオチドがつくり出される。探査されるヌクレオチド配列がＲＮＡ の形で含まれているなら、ｒＲＮＡに相補的なｃＤＮＡがっくり出されるように 、ポリメラーゼは逆転写酵素で、ヌクレオチド三リン酸はデオキシヌクレオチド 三リン酸（ｄＮＴＰ’　Ｓ）が好ましい。更に分析対象ポリヌクレオチド４０に プライマー４２を再アニーリングしそのプライマーを伸長させることによって、 増幅のサイクルが完成される。この技術分野の人々には明らかであるように、第 １ポリヌクレオチドプライマー４２は特定の生物、感染性の作用物質又は生物学 的成分に特異的な配列をもつこともできる。

第１プライマー４２は好ましくはデオキシヌクレオチドを用いて伸ばされて、試 料中のＲＮＡ又はＤＮＡ鎖に相補的なｃＤＮＡ鎖４１を形成する。ｃＤＮＡ４１ を用い、そのｃＤＮＡ鎖４１に新しく合成された相補的ヌクレオチド鎖４１に相 補的な第２ポリヌクレオチドプライマー４４をハイブリダイズさせることによっ て、増幅もまた行うことができる。したがって、この第２プライマー４４は、分 析対象ポリヌクレオチド４０の一部に相同である。この第２プライマー４４は、 好ましくは、多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分のＲＮＡ又はＤＮ Ａに共通で、それには第１ポリヌクレオチドプライマーが相補する配列とは異な る配列を含むことができる。このようにして、好ましい実施態様では第２プライ マー４４は第２の共通のＰＣＲプライマーであり、多（の生物、感染性の作用物 質又は生物学的成分のＲＮＡ及び／又はＤＮＡはそれと共に増幅されつる。増幅 は、第２プライマー４４を伸長させ試料中の分析対象ポリヌクレオチド４０の少 なくとも一部に相同なｃＤＮＡ鎖をつ（って完成する。この増幅ステップは、好 ましくは更なる第２プライマー４４と共に、また何度も繰り返される。

この後半の増幅サイクルは、好ましくは、４つのｄＮＴＰ’ｓをＤＮＡポリメラ ーゼと組み合わせて用いる。そうすると、増幅のあいだに一つは生物試料中に存 在する分析対象ポリヌクレオチド４ｏに相同なｃＤＮＡ鎖、他の一つはその相同 なｃＤＮＡ４３に相補的なｃＤＮＡ鎖、を含む２本鎖ＤＮＡが生じる。試料に存 在するＲＮＡ及び／又はＤＮＡに相同なｃＤＮＡの適当量を後半の検出用につく るため、好ましくは、約２０〜４ｏサイクルのＤＮＡ合成がなされる。そのよう なｃＤＮＡの合成にＤＮＡポリメラーゼが使われる。このポリメラーゼはＴａｑ ポリメラーゼのように、５０℃以上の温度でがなりのポリメラーゼ活性をもっこ とが好ましい。この増幅工程に続いて、別の増幅工程が好ましくは行なわれる。

この第２のＰＣＲ工程においては、第３ポリヌクレオチドプライマーが用いられ 、また必要であれば第４のプライマーも使用できる。これらのプライマーの一つ 又は二つは、特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の特異配列に相補 的な配列を含むことが望ましく、この場合、そのようなプライマーは特異的プラ イマーと呼ばれる。しかし、一群の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の 存在を同定し又は定量しようと望むなら、第３又は第４のプライマーは多くの生 物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共通の配列に相補又は相同な配列を含 むことができる。生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に特異的な配列を含 む第３及び／又は第４のプライマーを用いてＰＣＲが行なわれるとき、試験対象 の特定の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分のＲＮＡ及び／又はＤＮＡが 生物試料中に少量でも存在すれば、増幅が有意な量で起こるであろうし、初めの 増幅はそのようなＲＮＡ及び／又はＤＮＡに対応するｃＤＮＡを生じるであろう 。

生物、感染性の作用物質又は生物学的成分のＲＮＡ及び／又はＤＮＡに含まれる 配列の増幅は、当業者が知るようにいくつかの方法で検出できる。例えば、共通 又は特異プライマーが標識され、伸長されたポリヌクレオチドにおける標識の存 在が検出されうる。例えば、図３に示すように標識４５がプライマー４４に結合 され、それが伸長されて相同なポリヌクレオチド４３を生じる。

特異的な生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の検出を望むならば、相同な ポリヌクレオチド鎮４３は、本発明の他の実施例と同じようにして、特定の生物 、感染性の作用物質又は生物学的成分に特異的な配列に相補的な配列で、固体支 持体４７に固定化されている特異的ポリヌクレオチドプローブ４６上の配列４８ に接触させ、ハイブリダイズさせる。これに引き続いて、ハイブリダイズしなか った部分の試料は固体支持体４７から好ましくは洗われ、固体支持体４７に固定 化された標識の相同ポリヌクレオチド４３が検出される。また、相同なポリヌク レオチド４３が標識されていないなら、固体支持体４７の洗浄に続いて、標識を もった第２ポリヌクレオチドプローブ（図に示されていない）が相同なポリヌク レオチド４３にハイブリダイズさせることができる。これはまた続いて洗浄され ることができる。ノゾブリダイズしなかった第２プローブを固体支持体から洗浄 したのち、標識第２プローブは種々の技法を用いて、検出される。相同なポリヌ クレオチドはもちろん、それが固定化ポリヌクレオチドプローブ４６にハイブリ ダイズしているときにのみ、検出されるであろう。

当業者で認識されているように、相補ｃＤＮＡ鎖４１は相同ポリヌクレオチド４ ３よりむしろ固体支持体に固定化されたポリヌクレオチドおプローブ４６にアニ ールされる。この方法では、プライマー４４よりむしろプライマー４２が標識さ れる。鎖４１は上述のように直接検出されるか、鎖４１に標識ポリヌクレオチド をハイブリダイズさせて検出される。

実施例７は試料中の少量の真菌Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉを同 定する一方法を例示する。

実施例　７ ノ゛　で　るリポソームＲＮＡのＰＣＲによる真菌Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　 ｃａｒｉｎｉｉによる肺炎が疑われる患者からの痰を先ず、溶解用緩衝液で溶か し、その試料の全量と溶解用緩衝液５０μｍを混ぜる。この混合液を、共通プロ ーブ（配列番号１）が固定化されたマイクロタイタープレートのウェルに加え、 混合液とプローブを接触させる。共通プローブは、Ｐ、　ｃａｒｉｎｉｉを含む 多（の真菌種のリポソームＲＮＡの共通配列に相補的なポリヌクレオチドである 。このプローブに相補的なＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉのリポソ ームＲＮＡ上の配列は、そのリポソームＲＮＡの特異的配列（配列番号８１）の ３′に位置している。

この共通プローブは、この混合物をウェル中、３９℃で１時間インキュベートし 、次いでこの混合物を２０−３０分かけて冷却することによって、試料中の真菌 リポソームＲＮＡにハイブリダイズさせることができる。リポソームＲＮＡにこ の共通プローブをアニールさせたのち、プローブは逆転写酵素で伸長され、リポ ソームＲＮＡに相補的な配列をもつｃＤＮＡ鎖が生じる。相補鎖は、混合物を９ ４℃で１−２分加熱することによってリポソームＲＮＡから融解される。このプ ロセスは、相補鎖の数を増やすため、数回繰り返される。

リポソームＲＮＡからの相補鎖の変性に続いて、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃ ａｒｉｎｉｉ特異的なリポソームＲＮＡ配列に相同な第２プライマーがその混合 物に加えられる。４つのｄＮＴＰ’ｓ及び５０℃以上でも活性を有するＤＮＡポ リメラーゼがその混合物に加えられる。混合物は次いで第２プライマーのＴｍ以 下の温度で、しかしながらプライマーの特異結合が充分保証される温度、この場 合は約５０℃で、加熱される。第２プライマーが伸長するのに充分な時間、すな わち約１−２分をおいたのち、混合物は９４℃で１−２分加熱され、新しく合成 された試料中のリポソームＲＮＡ相同鎖を相補鎖から解離させる。このプロセス は、２０−４０分間繰り返され、必要ならばプライマーが添加される。

この増幅の工程に引き続き、２つの標識特異的プライマーが混合物に加えられる 。一つは相補鎖上の特異配列に相補的なプライマー、他の一つは相同鏡上の配列 に相補的なプライマーである。相補鎖及び相同鎖にそのプライマーをアニールさ せたのち、これらのプライマーは上述の第２プライマーの場合と同様にしてポリ メラーゼで伸ばされ、そののち、鎖はその混合物の温度を９４℃まで１−２分間 上げることによって解離される。このプロセスも、２０−４０分間繰り返される 。

最後の増幅工程ののち、その合成の鋳型から新しく合成された鎖を解離させるた め、混合物は加熱され、その後３７℃末で冷却され、混合物中に存在する鎖をマ イクロタイターウェルに固定化された特異的プローブにアニールさせるため、室 温で１時間インキュベートされる。このプローブはＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　 ｃａｒｉｎｉｉのリポソームＲＮＡ上の特異的配列に相補的で、この真菌のリポ ソームＲＮＡにも、更にこのリポソームＲＮＡに相同な合成配列にもアニールす る。

混合物中のポリヌクレオチド鎖が特異的プローブとノゾブリダイズすると、混合 物中のハイブリダイズしなかった部分は吸引により除かれる。マイクロタイタ− プレートの壁は溶解用緩衝液で洗って、非特異的結合のヌクレオチド鎖をウェル から除く。特異的クライマーに結合された標識は、次に生物試料中のＰｎｅｕｍ ｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉの存在を検出するため、検出される。もし標識 が検出されれば、生物試料はこの真菌を含むことを意味する。

ＸＶ、■Ωに里プ乏イヱニ 我々は、本発明で使用するい（つかのプローブとプライマーを同定した。特に、 ヒト及び他の動物種におけるｊｕｎがん遺伝子及びＧ蛋白のみではなく、更にサ ブスタンスＰ及びβ受容体を検出する配列を同定した。このようなプライマーの デザイン及び使用を以下に記述する。

Ａ、　ｕｎがん遺−クラ　マー ｊｕｎのような、がん遺伝子のあるものは外部刺激で刺激されて増殖するとき最 も急速に発現する。それ故、ｊｕｎがん遺伝子発現のレベルを検出または定量す ることは、細胞のマイトジェン（分裂促進）活性に対する良好なマーカーである 。

ｊｕｎがん遺伝子は、Ｍａｋｉ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ、　８４：２８４８−９１５２）によって最初に報告され、現在、ｊ ｕｎがん遺伝子は少なくとも３つのサブタイプ、すなわち、Ｊｕｎ−Ｂ、　ｃ− ｊｕｎ及びｊｕｎ−Ｄが知られている。しかし、これらの３つのｊｕｎサブタイ プは、細胞増殖にどのように関係しているのか、未だ明らかになってはいない。

そこで、マイトジェン（分裂促進）活性を検出するためには、細胞増殖における ３つの遺伝子を全て分析する必要がある。更に、ハツカネズミもまた３つの異な ったｊｕｎがん遺伝子サブタイプをもっていることが分かったが、これら３つの サブタイプのヌクレオチド配列は、ヒト細胞に存在するサブタイプとは異なって いる（Ｒｙｄｅｒ　Ｋ、、　Ｎａｔｈａｎｓ　Ｄ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５：８４６４−８４６７A　１９８８ Ｒｙｄｅｒ　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ　８５：１４８７−１４９１．１９８W；　Ｈａｔｔｏｒ ｉ　Ｋ。

ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８５：９１４８−９１５２．１９８８：　５ｃｈｕｅｔｔｅ@Ｊ、　、　ｅｔ　 ａＬ、　。

Ｃｅ１ｌ、　５９：９８７−９９７．１９８９）。

ヒト及びネズミのｊｕｎがん遺伝子を検出するセンス及びアンチセンスのプライ マーをデザインするため、以下の点を考慮して配列をデザインした：（ａ）３つ のｊｕｎ遺伝子のサブタイプに共通のヌクレオチド配列であって、それらの間の ミスマツチは最高で４塩基；（ｂ）ヒト及びネズミに共通のヌクレオチド配列で あって、それらの間のミスマツチは最高で４塩基； （ｃ）　３’末端から少なくとも５塩基は、これらの３サブタイプの間で且つヒ トとネズミの間で何のミスマツチもなく　１００％同一である；（ｄ）センス及 びアンチセンスの両プライマーでその長さが１７から５０のヌクレオチド配列； （ｅ）センスプライマーとアンチセンスプライマーとの間のＴｍの差が２℃以内 である； （ｆ）センスプライマーかアンチセンスプライマーセンスのどちらかで４塩基を 越える長さをもつ相補的構造を持たない；（ｇ）センスプライマーとアンチセン スプライマーセンスとの間で４塩基を越える長さをもつ相補性構造を持たない； （ｈ）センス及びアンチセンスの両プライマーがコーディング配列のエリアに存 在する； （ｉ）被増幅ＤＮＡの長さが２００塩基を越える；及び（ｊ）３つのｊｕｎ遺伝 子のサブタイプの間での増幅遺伝子のヌクレオチド配列の相同性は８０％を上回 らない。

上に示した条件を満たすＤＮＡフラグメント（センス及びアンチセンスの両プラ イマー）が検討され、そして幾つかの候補オリゴヌクレオチドが合成された。こ の指標によく適合する一組のプライマーは、センスプライマー５°−ＣＣＣＴＧ ＡＡＧＧＡＧＧＡ闇α；ＣＡＧＡＣ〜３′（配列番号７３３）とアンチセンスプ ライマー５’　−ＣＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴｒＧＡＧＣＴＧ−３ ′　（配列番号７３４）”Ｃ’あった。コノセンスプライマー（配列番号７３３ ）とい（つかのｊｕｎ遺伝子サブタイプのホモロジーを表２に示す。

表２ ５’−ＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣ−３’表２で示されたセ ンスプライマーの配列番号７３３に代わるものとして、５’　−ＸＣＣＣＴＧＡ ＡＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣ−３’　（配列番号７４０）もまたｊｕｎが ん遺伝子の検出用のプライマーとして使用できる。この配列では、Ｘは第一級ア ミン残基を示し、制限エンドヌクレアーゼにより認識されるヌクレオチド配列又 はＲＮＡプロモータ配列を示す。ＰＣＲプライマーの５゛末端への制限酵素部位 の取付は増幅遺伝子のクローニングに有用であり、また５′末端へのＲＮＡプロ モータ配列の取付はＲＮＡ転写及びＲＮＡ転写に基づく増幅に有用で、このこと は当業者には知られている。ＲＮＡプロモータは、好ましくＴ７、ＳＦ３又はＴ ３ＲＮＡプロモータ配列である。５゛末端への第一級アミンの取付はまた、カッ プリング反応に有用で、このときプライマーは標識化合物に取り付けることもで きるし、あるいは第一級アミン基を介して固体支持体に取り付けることもできる 。アンチセンスアナログの５’　−ＸＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡ ＧＡＣ−３’　（配列番号７４０）もまた、異なったｊｕｎ遺伝子サブタイプの 探査に用いることができる。ここで、Ｘは第一級アミン残基を示し、制限エンド ヌクレアーゼにより認識されるヌクレオチド配列又はＲＮＡプロモータ配列を示 す。

本発明でセンスプライマー及びアンチセンスプライマー用のＤＮＡフラグメント はＤＮＡ合成機を使って容易に合成できる。これらの合成オリゴヌクレオチドは 高速液体クロマトグラフィー又はゲル電気泳動で精製できる。

分析対象の試験物質は、通常、細胞又は組織からの総ＲＮＡ又は精製ｒｒ＋ＲＮ Ａである。望まれれば、細胞や組織は前処理なく自然の状態で試験することがで きる。薬の試験の場合、薬は先ず試験管内で細胞又は組織に投与される。薬は実 験動物にいくつかの方法で投与され（静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、経口、 腹くう内注射）、そののち動物から細胞や組織がとられる。

総ＲＮＡ又はｍＲＮＡは、例えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに記述 されているような標準的な方法やインヴイトロゲン社（サンジエゴ）からのファ ストトラック（ＦａｓｔＴｒａｃｋ）のような市販品キットを使用して、精製で きる。いずれの場合も、ＲＮ＾含有溶液にＲＮａｓｅが少しでも混入してこない ように研究者の手はビニル手袋で保護されていなければならず、また実験に用い る器械は素手では触ってはならない。実験で使用されるガラス容器はいずれも使 用前に約２５０℃で少なくとも４時間熱処理すべきである。さらに、この操作で 用いる水は３７℃で一晩インキユベートしオートクレーブした０、１％ジエチル カーボネートとするべきである。

ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡは、）Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇの 記述にあるようにして逆転写酵素を用いてなされる。そのようなｃＤＮＡが生じ ると、センスプライマー、アンチセンスプライマー、４つの型のデオキシヌクレ オチド（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、Ｔａｑポリメラー ゼ、無機塩類及び他の必要物質と共に混合され、サーマルサイクラ−（Ｐｅｒｋ ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）中でＰＣＲ反応が行なわれる。

この方法で増幅された遺伝子を分析するため電気泳動を用いることは適当である 。遺伝子の増幅後、電気泳動をアガロースゲル中で行ない、ＤＮＡはエチジウム ブロマイドで染色される。増幅したＤＮＡのバンドは、蛍光のもとで見ることが できる。ＤＮＡのバンドを写真にとり、その写真をスキャンし、これをストラタ スキャン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）のような市販の器械で 分析し、それぞれのＤＮＡの強度を定量することもできる。更にアガロースゲル 電気泳動後、増幅遺伝子をメンプランに移しとり、メンプラン上のプロット（し み）に標識プローブをハイブリダイズさせ、Ｓ２ｐや化学発光物質のような標識 シグナルをポラロイドフィルムやＸ線フィルムに曝すことにとって、特異的ｊ叩 遺伝子のサブタイプを検出できる（すなわち、サザーンプロットを行なうこと。

）。

本発明の方法で検出できる他のポリヌクレオチドの場合と同じように、いろいろ なｊｕｎ配列がＰＣＲ法のセンス又はアンチセンスプライマー、あるいはここに あるようなりＮＡやＲＮＡの検出用のプローブとして供されることができる。

いろいろなｊｕｎがん遺伝子に共通、又は特定の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に特異的 な配列を同定する方法は下に述べられる。同定方法の好ましい実施態様では、コ ンピュータプログラムがその配列の同定に用いられる。そのようなプログラムの 使用によって、我々は数多くの共通又は特異的なプライマーとプローブを同定し てきた。

表ＸＶＩＩ　〜ＸＸＩＩ、及び表ＸＸＸ−ＸＸＸＩＩ＋、：種々ノセンス配列、 すなわち、生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に見出される配列に相同も しくはほとんど相同な配列−これらの配列はコンピュータプログラムの使用によ り、ｊ叩遺伝子のプローブ及びプライマーとして有用なものであると同定された 配列−が挙げられている。

これらの表に挙げられている配列は全て、本発明のＰＣＲ法の範囲内で有用であ る。相補的なアンチセンス配列はまた、発明の一局面ではプローブ及び／又はＰ ＣＲプライマーの両方に有用である。当業者に知られているように、標的配列に 類似してはいるが同じではない共通プローブに対しては、プローブが特定の標的 配列とハイブリダイズするように、あるいはハイブリダイズしないように、厳密 さの条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）を変動（すなわち、 温度や塩濃度を変化させること）させることができる。それゆえ、表に示された センス配列又はアンチセンス配列にハイブリダイズできる配列は本発明の範囲内 である。ｊ叩遺伝子の別のプローブは次のものを含む。

′の　ｕｎｉ　−プローブ ５”　−ＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧ−３°　（配列番号７ ４１）特異ｎプ且ニブ Ｂタイプ：５°−ＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧ−３’　（配列番号７４ ５）Ｃタイプ：５’　−ＧＡＧＣＡＴＧＴＴＧＧＣＣＧＴＧＧ−３’　（配列番 号７４６）ヒトＤタイプ：　５’　−ＧＡＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴ−３ ’　（配列番号７４７）マウスＤタイプ５−ＧＣＣＴＧＴｒＣＴＧＧＣｍＴＧＡ ＧＧＧ−３’　（配列番号７４８）実施例８ ＤＮＡフラ　メン　センス１び　ン　センスブー　マー　のムマウスの°ｕｎ＜ ん′　−ローンの 配列番号７２Ｂ（Ｓ９４３−２）及び配列番号７２９（ＡＳ１１３２−２）を３ ８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムズ社）で合成した。水酸 化アンモニウムで５５℃で一晩処理したのち、合成オリゴヌクレオチドをスピー ドバック（Ｓａｖａｎｔ　Ｃｏ、　）で乾燥し、それぞれのオリゴヌクレオチド の濃度を水で１Ｍｇ／＋＋１となるように調整した。このオリゴヌクレオチドを 使用するまで一２０℃で保存した。

この３つのタイプのマウスのｊｕｎクローン（ｊｕｎ−Ｂ、ｃ−ｊｕｎ・又はｊ ｕｎ−Ｄ、ＡＴＣＣから入手）　ｌμｌ　（約１０ｎｇ含有）をそれぞれ反応用 試験管に採った。それぞれに、センスプライマー（配列番号７２８）１μ１１ア ンチセンスプライマー（配列番号７２９）１　ｕ　Ｉ　、ＰＣＲ用１０Ｘバッフ ｙ　−（Ｐｒｏｍｅｇａ）　５　Ｂ　＋　、　２５ｍＭ塩化マグネシウム１μｍ 、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物４μｌ、及びＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ０．５μｍを加え、混合し、水を加え全量を５０μｍとした。それぞれの試験管 に２滴の鉱油を加え、サーマルサイクラ−４８０型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ）中でＰＣＲ反応を行なった。反応混合物を５５℃で１０分間加熱 したのち、ＰＣＲを次のサイクルで３０回行なった＝５５℃で１．５分のアニー リング、７２℃で４分の伸長、及び９５℃で１．５分の変性。

ＰＣＲの後、試料１０μｍをＩＯＸローディングバッファー（０，２５％ブロモ フェノールブルー、０．２５％キシレンシアツールＦＦ及び１５％フィコール、 ４００型）１μｌと混合し、５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド含有１．５％ア ガロース上で電気泳動を行なった。電気泳動後、増幅されたＤＮＡバンドをＵＶ で可視化させた。

図４に示すように、クローンｊｕｎ−Ｂ、ｃ−ｊｕｎ１及びｊｕｎ−Ｄは配列番 号７２８と配列番号７２９を用いて増幅され、増幅ＤＮＡの単一バンドがいずれ の場合も２７０ｂｐで観察された。このことは、上記−セットのプライマーが３ つの型のマウスのｊｕｎ−Ｂ、ｃ−ｊｕｎ、及びｊｕｎ−Ｄを全て認識し、増幅 できることを示している。

実施例　９ ヒトの　のｕｎ遺−の　に　ＥＧＦＩ　の以下に、ｊｕｎがん遺伝子のｍＲＮＡ 産生を刺激するＥＧＦ使用の効果を記述する。

（１）　ＥＧＦこ　ヒ　の１ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）４０ｍｌをヘパリン処理したヒトの血液２０ｍ １に加え、混合する。このサンプル各１０ｍ１をＩｓｏＬｙｍｐｈ　３　ｍｌに 重層し、それから４００　Ｘｇで３０分間遠心分離する。そのペレットをＰＢＳ で３回洗浄した後、ＰＢＳ　３　ｍｌに再懸濁する。

次いで、このサンプル各１ｍｌを３本のチューブ（Ｎｏ、　１−Ｎｏ、　３）に 入れる。ＰＢＳ　１　ｍｌをコントロールとして４番目のチューブに入れる。４ 本のチューブ全てを３７℃で１０分間保温し、次いで、ＥＧＦ　（上皮成長因子 −Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）を最終濃度が３０　ｎｇ ／ｍｌになるようにＮｏ、　１のチューブに入れる。１５分後、同じ方法でＥＧ ＦをＮＯ１２のチューブに入れ、さらに５分間保温する。５分後、４本のチュー ブ全てからＲＮＡを同時に抽出する。このようにして、ヒトの白血球のＥＧＦに よる前処理時間はＮ０９１について２０分、Ｎｏ、２について５分、Ｎｏ、３に ついて０分となる。

（２）細胞か３２渭状０迫門 上記の４本のチューブを取り出し、小型遠心機により１０秒間遠心分離する。上 清を捨て、下記の溶解緩衝液をペレットに加え、混合した後、これを４５℃、３ ０分間インキュベートする。

溶解緩衝液の内容 ｔｏ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０ ０，５％ＳＤＳ　（無菌フィルターによりバクテリア除去）０、２　Ｍ　ＮａＣ Ｉ ＤＥＰＣ処理水 ＲＮＡ阻害剤５００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌバナジル複合体１０ｍＭ プロテイナーゼＫ　２００　μｇ／ｍ１（３）畦臥Ω精玉 ５　Ｍ　ＮａＣ１を上記細胞溶解物に加えて最終濃度を０．５Ｍにした後、オリ ゴ（ｄＴ）セルロース（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、　）を加え、室温で３０ 分間反応させる。次いで、そのセルロースを結合緩衝液（２０ｍＭ）すＸ−ＨＣ ｌ、　ｐＨ７，Ｌ　１　ｍＭ　ＥＤＴん０．５　Ｍ　ＮａＣ１）で５回洗浄した 後、ＤＥＰＣ処理水０．３５ｍ１を加え、ｍＲＮＡを固相から溶離する。次ぎに 、２Ｍの酢酸ナトリウム０．３５μｍおよびその容積の２．５倍のエタノールを 加え、ドライアイスで２０分間冷却した後、１５．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心 分離する。ペレットを７５％エタノールで一度洗浄した後、乾燥し、次いでＤＥ ＰＣ処理水ｌＯμｍに溶解する。

（４）伏臥の合成 ５０ｍＭ）リス−■ＣＬ（ｐＨ８，３）、　７５　ｍＭ　ＫＣＬ、　３　ｍＭ塩 化マグネシウム、１０ｍＭＤＴＴ。

０．５　ｍＭ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ） 、　５０　μｇ／ｍｌオリゴ（ｄＴ）プライマー及び１０、０００　ｕｎｉｔｓ ／ｍｌ逆転写酵素を、上記で得られたｍＲＮＡ　１０　、ｃｚｌに加えて全容積 を２０μｍとし、これを３７℃で１時間反応させる。反応後、フェノール：クロ ロホルム：イソアミルアルコールの混合液２０μｍを加え、ドライアイスで２０ 分間冷却してｃＤＮＡを沈澱させる。１０．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離後 、ペレットを７５％エタノールで一度洗浄する。次いで、乾燥後、これをオート クレーブされた水２０μｍに溶解し、−２０℃で保管する。

（５）潟 ｊｕｎ遺伝子増幅のためのセンスプライマー（配列番号７３３）及びアンチセン スプライマー（配列番号７４０Ｘ１ｍｇ／ｍｌ）の各ｔμｔにｃＤＮＡ２μｌを 加える。これを５０　ｍＭ　ＫＣＩと混合した後、１ｏｆｆ１Ｍトリスー■Ｃ１ （ｐＨ８，４）、　２．０　ｍＭ塩化マグネシウム、ゼラチンｔｏｏ　μｇ／ｍ ｌ、および０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰ、　Ｔａｑポリメラーゼ２．５　ｕｎｉｔｓ を加える（最終容積：５０ｍ１）。反応混合物を９５℃で１０分間加熱後、ＰＣ Ｒを次のサイクルで３０回行う：５５℃−１．５分間アニール、７２℃−４分間 伸長、及び９５℃−１，５分間変性。

（６）アガロースゲル電気泳動 ＰＣＲ完了後、反応溶液ｌＯμｍを取り、実施例１に記載の方法で電気泳動を行 う。

その結果によれば、ＥＧＦ処理しなかった白血球（即ち、Ｎｏ、　３のチューブ で処理時間ゼロのサンプル）においては、約２７０　ｂｐサイズの位置で増幅Ｄ ＮＡが最少バンドを有することが見出された。しかし、増幅ＤＮＡバンドは５分 後に増大し、その後、２０分以内に基底レベルに戻ったことが観察された。

実施例　１０ ヒトの　のｕｎ遺−に　るＰＨＡｌ　のＥＧＦの代わりに、ＰＨＡ　（最終濃度 、ｌＯμｇ）を利用し、前処理時間を０分、５分、１５分、及び３０分に設定し た。その他の手順は実施例２のそれらと同一とした。結果として、１５分でなさ れたＰＨＡ前処理により増幅ＤＮＡのバンドは約２７０　ｂｐの位置で最大とな るが、（時間経過）後にこのバンドは減少することが観察された。

Ｂ、Ｇ蛋白配列検出用プライマー ホルモンや神経伝達物質の細胞表面受容体は、細胞内へテロ三量体（α、β及び γサブユニットから成る）のＧＴＰ結合蛋白（Ｇ蛋白）と連繋していることが知 られている。一旦、受容体が特異的リガンドで活性化されると、受容体と結合し たＧ蛋白はアデニルサイクレース、ホスフォリパーゼＣあるいはイオンチャンネ ルのような細胞内の第２次エフェクター系へシグナルを伝達する。

Ｇ蛋白は疾患の種々の状態に伴っていると信じられている。例えば、Ｇｓ蛋白の 遺伝的欠陥は遺伝的骨萎縮症の分子基礎である。先端肥大症患者の下垂体腫瘍は 、変異Ｇｓ蛋白を含むことが示された。Ｇ蛋白は、侵入性及び転移性のメラノー マ細胞にも伴う。ストレプトゾシンで誘導したラットの実験糖尿病モデルは、種 々のＧα蛋白のサブクラスのｍＲＮＡの水準が対照の正常ラットに比べ有意に変 わりでいることを示唆している。更に、ブタのアテローマ性動脈硬化症の冠状動 脈において、百日咳のトキシン感受性Ｇ蛋白の細胞機能が有意に損なわれている ことが示され、一方、そう病患者の白血球におけるＧ蛋白機能は過作用的（ｈｙ ｐｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であることが示されている。しかし、現在入手可 能な免疫学的検出法（ウェスターンプロット）やｍＲＮＡ検出法（ノーザーンプ ロット）は、感度が高くなく多くの細胞材料を必要とし、そのような疾患のＧ蛋 白の役割の研究を困難故、最近の試みはノザンプロット分析に焦点を絞り、異な った種の様々な組織または細胞からＧ蛋白特異的ｍＲＮＡを同定している。しが し、ノザンプロットでは、大量の出発細胞材料に加えて、経験を積んだ取扱いと ＲＮａｓｅ汚染がらの防御が必要である。

これらの従来法とは対照的に、ＰＣＲ法はより便利であり且つ実用上有用である 。

何故なら、材料はノザンプロット分析より少なくてよく、且つ高い感度を有して いるからである。しかし、出発材料でＤＮＡまたはｍＲＮＡの量を定量すること はＰＣＲでは困難である。

我々は、５つの異なったＧ蛋白のαサブユニットの間に、２つの高度に保存され たオリゴヌクレオチド配列の、すなわち、ＰＣＲとして使用できる配列番号５２ ８及び配列番号７３１の配列を同定した。これらの配列は、同じＰＣＲ条件で、 ラットＧ蛋白クローンと種々のヒト組織課等のｃＤＮＡの混合物から得られたＧ 蛋白を含む全てのＧ蛋白サブクラスの配列を増幅できる。面白いことに、本発明 の新しいＧ蛋白ＰＣＲプライマーを使って得られた最終的ＰＣＲ産物は、出発材 料に存在するＧα蛋白のサブクラスの各々の相対的組成を反映している。これは 多分、５つの異なったＧα蛋白のｍＲＮＡが、同一のＰＣＲ条件下で一組のＰＣ Ｒプライマーにより同様の割合で増幅されるからであろう。もしＧα蛋白のサブ クラスの各々の既知の混合物が、図６に示すように未知のテストサンプルと一緒 に分析されるなら、Ｇα蛋白の相対的組成はかなり正確に決めることができる。

それ故、本方法は種々の組織または細胞のＧ蛋白の性格付けには理想的である。

本発明のプライマーによるＰＣＨの実行は、また疾病検出時の臨床および診断上 の分析にも有用である６Ｇ蛋白異常は遺伝性疾患、がん、糖尿病の型、及びその 他の疾病に関連しているので、Ｇ蛋白検出・定量用のＰＣＲプライマーはこれら の疾病の検出、それらの進行具合の分析に使うことができる。

我々は、本発明のＰＣＲプライマー（配列番号５２８及び配列番号７３１）を用 いて、Ｇ、−１、Ｇ＋−２、Ｇ＋−ｓ、Ｇ、及びＧｏを同定してきた。最近のク ローニングは、Ｇ蛋白のもつと多（のサブクラスを同定しているが、これらの新 たに同定されたＧ蛋白ｃＤＮＡは全て、他の既知Ｇ蛋白とある程度の相同性を示 した。したがって、本発明のプライマーは同様にこれらのサブクラスを増幅でき るであろうし、また本ＰＣＲ技法はこれらの新規Ｇ蛋白に適用されるであろうと 期待される。そのうえ、このＰＣＲ法は同様に特定のＧ蛋白遺伝子のクローニン グに利用できる。

我々は、ＰＣＲプライマーとして２つの２２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドＧｚ（ 配列番号５２８）及びＧ、（配列番号７３１）を設計した。下の表３に示すよう に、これらのオリゴヌクレオチドには、５つの異なったＧαα蛋白ＤＮＡの間で 十分保存されている配列が含まれ、これらの配列当たりのミスマツチの塩基はわ ずかにＯ−４である。

Ｇ２−センス及びＧじアンチセンス配列の３′末端で４塩基にミスマツチ対は全 く見られなかった。更に、Ｇ２およびＧ４は一列に３塩基対以上の自己相補的配 列を持っていない（データ示さず）。Ｇ２およびＧ４が全てのＧα蛋白に共通で あるのが、あるいは他の無関係な配列には共通でないのかを分析するため、酸０ 馳口ｋにある哺乳類の全配列に対してＧ２およびＧ４配列の相同性探索（ＤＮＡ ＳＩＳ）が実施された。その結果、Ｇ２およびＧ４は全てのＧα蛋白および様々 な種のロドプシンに共通であるが、他の無関係な配列とは相同性の少ないことが 分かった（データ示さず）。

表３　Ｇ蛋白αサブユニットの異なる５つのｃＤＮＡ間の２つの一致オリゴヌク レオチド（Ｇ２およびＧｄコンセンサス配列（ミスマツチの数） Ｇｏ　ＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧ’ｒＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡ（０）　４７９　ＴＧ ＴＴＴＧＡｃＧＴｔＧＧｇＧＧＣＣＡＧｃＧ（４）ＰＣＲは、先ず３７℃から６ ５℃の範囲の異なるアニール温度で、ヒトのＩＬ−６０細胞のλｇτ１０ライブ ラリーを使って行なわれた。その結果、ＰＣＲ産物は４５℃及び５５℃において のみ約５００　ｂｐのサイズで見られており（データ示さず）、このサイズは理 論値（５７６−５２４ｂｐ）　（上の表４参照）と類似していた。そこで、ＰＣ Ｉ反応は全てこの後、アニール温度４５℃で処理した。

図５に示すように、クローンラットのＧａ蛋白ｃＤＮＡ（Ｇｉ−１，Ｇ１−２． 　Ｇ１−３．ＧｓおよびＧｏ）は、臭化エチジウムで染色された１、２％のアガ ロースゲルで約５００　ｂｐＯサイズを持つ同じ一組のＰＣＲプラクラーＣＧ！ およびＧ、）を使って首尾よく増幅された。コンピュータ分析（ＤＮＡＳＩＳ） によれば、増幅ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列は５つのＧα蛋白の間で相同性が 少なく、その類似性の割合は７６．８％から４７．６％の範囲であった。

このことは、ＰＣＢ増幅後は、たとえ産生されたＰＣＲ産物サイズが５つのＧα 蛋白の中で非常にＭ似していても、Ｇα蛋白の各成分はサザンプロット法によっ て同定できることを示している。それ故、他のＰＣＲは、サブクラス特異的ビオ チンプローブを調製するため、ｄＴＴＰの３０％がビオチン結合ｄ［７７Ｐで置 換された条件下で行なわれた。サザン膜は、次いでこれらのビオチン−ＰＣＲ産 物により探査された。図５に示すように、これらのビオチン−ＰＣＲプローブは 、洗浄温度６５℃で各Ｇα蛋白のサブクラスに十分特異的であった。穏やかな条 件での（Ｌｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）洗浄で、これらのプローブはＧα蛋白の 別のサブクラスと交差ハイブリダイズした（データ示さず）。

Ｇ２およびＧ４の配列を使うことにより、Ｇα蛋白ｃｃＤＮＡ全てのサブクラス は、同量のＧ１−１．　Ｇ１−２．　Ｇ１−３．　ＧｓおよびＧｏがテストサン プル（図６、レーン４．５．１０）中に存在しているときはＰＣＨによって増幅 された。しかし、もしＧαα蛋白ＤＮＡの全ての濃度が高ければ、いはそれほど 増幅されないが（図６、レーン１ｏ）、これは多分ＧＯと０４との間のミスマツ チ数が０４と６２配列間のその他のものより多いがらであろう。存在する１つま たは２つのＧαα蛋白ＤＮＡが他のものより少量であるならば、増幅ｃＤＮＡの 量はｃＤＮＡの出発濃度と相対的に相関するであろう（図６、レーンｌ。

２、３．８．９）。更に、５つのＧαα蛋白ＤＮＡの１つがその他のもののｃＤ ＮＡより多いときならば、Ｇ蛋白の遺伝子はその他のものより多く増幅されるで あろう（図６、レーン７）。

このＰＣＲ法を使えば、Ｇα蛋白遺伝子はクローンｃＤＮＡがらのみならず種々 のラットのｃＤＮＡからも増幅される（図７）。ラット下垂体腺由来のλＺＡＰ 　ｃＤＮＡライブラリー及びラット腎臓ＫＮＰＫ細胞由来のｃＤＮＡにおいては 、Ｇｏは、Ｇｓ、　Ｇ１−２及びＧｉ−３より豊富で、Ｇ１−１は検出できなか った（図７、レーン１１２）。ラットの腸のλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーは もっと多くのＧ１−２、Ｇ１−３、及びＧｓと釦を含んでいた（図７、レーン３ ）。

配列分析によれば、ラットのＧ１−１．　Ｇ１−２．　Ｇ１−３．　Ｇｓおよび 面配列の増幅のＰＣＲ産物は、ヒトのＧ蛋白ｃＤＮＡに高い相同性を示した（下 の表４参照）。更に、図８に示すように、一対の６２と６４プライマーを用いた ＰＣＨによって、ヒトの１Ｍ９及びＪｕｒ）ｃａｔ細胞のｃＤＮ＾ＤＮＡ５００ 　ｂｐ　ＤＮＡが増幅された。ラットのｃＤＮＡとは違って（図７）、１Ｍ９及 びＪｕｒｋａｔ細胞の両方にはＧα蛋白の全てのサブクラスが含まれていた（図 ８）。しかし、Ｇ１−３は１Ｍ９細胞に比較的豊富にあり、一方、ＧｓおよびＧ ｏは１Ｍ９細胞よりＪｕｒｋａｔ細胞に豊富であった（図８）。

表４　ラット及びヒトＧ蛋白間のＰＣＲ産物ヌクレオチド配列の類似性長さくｂ ｐ） ラット　ヒト　ミスマツチ　類似性％ Ｇ１−１　４７６　４７６　６２　８７．０％Ｇ１−２　４７９　４７９　４４ 　９０．８％Ｇ１−３　４７６　４７６　４０　９１．６％Ｇｓ　５２４　４Ｂ ２　５２　８９．２％Ｇｏ　４７９　４７９　３９　９１．９％実施例１０は、 本発明の別の一組のＰＣＲプライマーであるＧ２−３及びＧ４−Ａｓを用いた、 Ｇ蛋白の増幅及び検出法について記述する。

実施例　１０ ＰＣＲプライマーによるＧ　の 材料 ラットのＧプロティンαサブユニット（Ｇｉ−１，Ｇ１−２．　Ｇ１−３．　Ｇ ｓおよびＧｏ）は、Ｄｒ。

Ｒ，Ｒ，Ｒｅｅｄ　（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖ、　、　ＭＤ）よ り提供を受けた。ラットの下垂体および大腸のλＺＡＰライブラリーは、Ｄｒ、 　Ｄ、Ｇ、Ｐａｙａｎ　（Ｕｎｉｖ、　Ｃａ１ｉｆ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓ ｃｏ）より提供を受けた。Ｋｉｒｓｔｅｎのネズミ肉腫ウィルス（ｍｕｒｉｎｅ 　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ）でトランスフオームされたラット腎臓細胞（Ｋ ＮＲＫ）、ヒトの１１９　Ｂ−リンパ球及びヒトのＪｕｒｋａｔＴ−リンパ球は 、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕｔｌｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍcか ら得た。細胞培養用培地、５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、　Ｃ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）、　ＰＣＲ用試薬類（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍ ａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ　）、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ 　Ｈｅｉｇｈｔ、　ＩＬ）、Ｇ■獅Pｕｓ、　Ｌｕ ｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎ ｄｉａｒｉａｐｏＬｉｓ　ＩＮ）、ＦａｓｔＴｒａｃｋ（Ｉ獅魔奄狽窒盾■■■ Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ）、ヒトのＨＬ−６０細胞のλｇｔｌＯライブラリ ー、ビオチン−ｄＬｒｒＰ、アルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジン （ＣＬｏｎｔｅｃｈ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、Ｃａ）、　ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）用試薬類は指定供給元がら入手した 。ソノ他の薬品はＳｉｇｍａ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から購入した。

縄胞権養 ＫＲＮＫ細胞はダルベツコ改変イーグル培地（１０％のウシ胎児血清、１００　 Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）で３７℃ 、５％炭酸ガス／９５％空気の条件下で生育させた。細胞は、１日おきに培地を 交換し、０．０２％ＥＤＴＡを含有するＱイオン−靭イオンを含まない生理食塩 水中で０．１％トリプシンにより７０−９０％の集密度（コンフルエンス状態の ７０−９０％）で継代した。１Ｍ９およびＪｕｒｋａｔ細胞は１０％の仔つシ胎 仔血清を含有するＲＰＭｌ　１６４Ｇ中で生育させた。細胞の生育力はトリパン ブルー排除により評価して９０％以上であった。

プ乏ヱヱニΩ設計 Ｇａ　７”　ｏティン（Ｄラットクｏ　−ン（Ｇｉ−１（ＲＡＴＢＰＧＴＰＢ） 、　ＧＬ−２（ＲＡＴＢＰＧＴＰ＆）、　Ｇ１−３（ＲＡＴＢＰＧＴＧ）、　Ｇ ｓ（ＲＡＴＢＰＧＴＰＤ）およびＧＯ（ＲＡＴＢＰＧＴＰＣ））は、ＧｅｎＢａ ｎｋリリース６５．０（ＨＩＢｌｌｏ、　Ｈｉｔａｃｈｉ　Ａｍｅｒｉｃａ、　 Ｂｒ１ｓｂａｎｅ、　ＣＡ）から検索した。次いで、これらのクローンの間のヌ クレオチド配列の類似性を多重アライメントプログラム（ＤＮＡＳＩＳ、■１ｔ ａｃｈ１）によって分析した。我々はこれらの内で十分に保存されている７つの エリアを初めに特定済みである。これらの保存されたヌクレオチド配列は、次い で、その他の類似配列を特定するためＧｅｎＢａｎｋにある全ての哺乳類の配列 と対照して分析された。設計されたオリゴヌクレオチド（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ 、ネ）は、Ｇｅｎｏｓｙｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｏｏｄｌａｎ ｄｓ、　ＴＸ）によって合成され、それを１００　ｐｇ／ｍｌの割合で水に懸濁 した。

鋳型ＤＮＡ　１μｍをｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ各１ｍＭ 、各ＰＣＲプライマー１μｍ、２５−ＭｇＣｂ　１μｍ、ＰＣＲ緩衝液５μｍ、 及びＴａｑポリメラーゼ（１８）０．５μｍと混合した。次いでＰＣＲは、ＤＮ Ａサーマノはイクル装ｒ！ｌ（ｍｏｄｅｌ　４８０．　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ ｒ　Ｃｅｔｕｓ、　ＮｏｒｗａＬｋ。

ＣＴ）でアニール温度（５５℃−６５℃の範囲で１，５分間）、伸長（７２℃、 ４分間）および変性（９５℃、１．５分間）の３０サイクルの処理により行われ た。別の実験で、ビオチン標識プローブを作製するため、ｄＴＴＰの３０％をビ オチン−ｄＵＴＰと置換した。

ｉヅンブ旦ユ上 １．２％アガロースの電気泳動によってＰＣＲ産物を分離し、臭化エチジウム（ １９）で染色した。次いで、ゲルを０．２５　Ｎ　ＥＣＬ中で３０分間脱プリン 化し、１．５　Ｍ　ＮａＣＬを含有する０、　５　Ｎ　ＮａＯＨで３０分間変性 した。次いで、ゲルを、１．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有する１、　０Ｍのトリス、 ｐＨ７，６で３０分間中和した。次いで、ゲルを１０　ｘ　５ＳＰＨに１０分間 浸したナイロン膜（ＭａｇｎａＧｒａｐｈ、　ＭＳｌ、　Ｗｅｓｔｂｏｒｏ、　 Ｍ＾）上に置き、７５ｍｍＨｇの陽圧で６０分間かけて膜上に転写した（Ｐｏｓ ｉｂＬｏｔ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）。次０で 、ゲルカ）らのＤＮＡは１２０　ｍｊｏｕｌｅｓのＵＶ光（Ｓｔｒａｔａｌｉｎ ｋｅｒ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により膜と架橋結合させ、それから５％のブ ロッキング試薬（ＥＣＬ）及び０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有するハイブリダイゼ ーション緩衝液を用いて４０℃で１時間以上インキュベートした。次いで、熱変 性されたビオチン標識ＰＣＲプローブを加え、／Ｘイブリダイゼーションを一晩 継続した。

膜を４同各１５分間、４４−６５℃の一次洗浄緩衝液ｃｏ、ｓｘ　５ＳＰＥ、　 ３６　ｗ／ｖ％尿素、０．４ｗ／Ｖ％５ＤＳ）を用いて洗浄し、続いて室温で２ 回５分間二次洗浄緩衝液（２Ｘ　５ＳＰＥ）を用いて洗浄し、それからブロッキ ング緩衝液（Ｇｅｎｉｕｓ）を用いて室温で少なくとも３時間インキュベートし た。次いで、アルカリ性ホスフオターゼ標識ストレプトアビジン（希釈比：１： ５，０００）を加え、さらに３０−６０分間室温でインキュベーションを続けた 。膜は４回１５分間、緩衝液Ａ　（１００ｍＭ　トリス、　ｐＨ７，５，１５０ ｍＭＮａｃｌ）を使って室温で洗浄し、更に１回２分間緩衝液Ｃ（１００ｍＭ　 トリス、ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＮａＣＬ、　５０　ｍＭ　ＭｇＣｈ）で洗浄 し、それからＬｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３０に約１−２分浸した。次いで、膜を透 明フィルムで包み、化学ルミネ・ノセンス信号をＸ線フィルム（ＸＡＲ−５，Ｋ ｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）に１０分から１時間露光させた。

ｍＲＮＡの　びｃＤＮＡのム 細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、溶解緩衝液（ＦａｓｔＴｒａｃｋ） 中でホモジナイズし、次いで、４５℃で１時間インキュベートしてＲＮａｓｅ活 性を除いた。。

ＮａＣ１の濃度を０．５Ｍに調節し、オリゴ（ｄＴ）セルロース錠を溶解緩衝液 に加えた。

次いで、室温で更に４０分間インキュベーションを続けた。オリゴ（ｄＴ）セル ロースを、結合緩衝液で４回洗浄した後、結合したｍＲＮＡ＠ＤＥＰＣ処理水で 溶離させた。−ＮＡの濃度を分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ、　Ｕ−２０００，Ｉ ｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）を使い０Ｄｔｓｏで測定した。

ｃＤＮＡの第−鎖を、５０ａｌｌリス、ｐＨ８，３，７５ｍＭ　ＫＣＩ、　３　 ｉｌｌ　ＭｇＣ１ｇ、　１０　ｍＭ　ＤＴｒ。

ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、及びｄＴｒＰ各９．５ｍＭ、プライマーと しテノポリ（ｄＴ）、及び逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）の存在下、３ ７℃で１時間、鋳型ｍＲＮＡから合成した。次いで、ｃＤＮＡの第二鎖を、２５ ｍＭ１−リスｐｌ（７，５，１００ｍｌｌ　ＫＣＩ、　５　ｍＶ　ＭｇＣ１ｘ、 　１０　ｍＭ　（ＮＨ４）ＩＳＯ，、０，１５ｍＭ　β−ＮＡＤ＋、　ｄＡｒｌ ’、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、及びｄＴｒＰ各２５０μＭＳ１．２　ｍＭ　ＤＴ ｒ、　６５Ｕ／ｍｌ　ＤＮＡリガーゼ、　２５０　Ｕ／ｍｌ　ＤＮＡポリメラー ゼ及び１３　Ｕ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）を含む同じ チューブで２時間１６℃で合成した。合成されたｃＤＮＡは、次いで同容積のフ ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一度抽出 し、エタノールで沈澱させ、そして水中で再懸濁した。

厘像去示 ポラロイドフィルム及びＸ線フィルムに記録したデータは、信号対雑音比最適化 のＳｔｒａｔａｓｃａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により走査し、次いで、デス クトップ出版ソフトウェア（ＰａｇｅＭａｋｅｒ、　Ａｌｄｕｓ、　５ｅａｔｔ ｌｅ、ＷＡ）で編集した。図５に示すように、配列番号５２８と配列番号７３１ の組合せは、Ｇ蛋白αサブユニットの全部を増幅できる。

種々の配列は、ここに記載したように、ＰＣＲ法に使うセンスまたはアンチセン スプライマーとして、またはｍＲＮＡの検出用プローブとして役立ちうることは 当業者にと９で明らかであろう。種々のＧ蛋白に共通な配列又は特定の種に特異 的な配列を同定する方法を以降に説明する。この同定法の好ましい実施態様にお いては、コンピュータプログラムを用いて配列を同定する。そのようなプログラ ムを使うことにより、我々は多数の共通及び特異的な、プライマー及びプローブ を同定してきた。表ＸＸＩＩＩ　−ＸＸＩＸ及び表ＸＸＸＩＩＩ　−ＸＸＸＶＩ Ｉに示されるように、Ｇ蛋白のプローブ及びプライマーとして有用な種々のセン ス配列が、そのようなプログラムの使用を通して同定される。

これらの表に掲げられた全ての配列は、この発明のＰＣＲ法に関連する範囲内で 有用である。相補的なアンチセンス配列もこの発明の一定の状況においては有用 である。当業者には知られるように、標的配列とは類似しているが全（同じでは ない共通のプローブでは、そうしたプローブが特定の標的配列とハイブリダイズ するか、又はノゾブリダイズできないような厳しい条件を（例えば、温度及び塩 濃度の変化によって）変更することができる。また、この発明の範囲に含まれる ものとしては、掲げられたセンス配列かまたはそれらのアンチセンスの片方と同 じ配列の何れかとハイブリダイズできる配列である。

Ｇ蛋白用の別のプローブにはまた、下記のものが包含される：共通Ｑ房比ばズ臣 ニブ ５’　−ＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡ−３’　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯニア４９）５’　−ＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＧＣＴ− ３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５０）、プローブ　ヒ　びう・・　 Ｇ１−１　５’　−ＧＴｒＴｒＣＡＣＴＣＴＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣ− ３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５１）Ｇｉ−２５’　−ＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴ ＣＴＧＣＡＧＧＴｒＧＣ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５２）５’　−ＡＴ ＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア ５３）Ｇｉ−３５°　−ＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＣＧＡＡＧＡ−３’　 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５４）Ｇｓ　５°　−ＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＣ ＡＴＡＧＡＡＴＴ−３°　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５５）５°　−ＴｒＣＡＴ ＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５６） Ｇｏ５°　−ＣＧＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧ−３°　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯニア５７）Ｃ１の生　・　るプライマー 生物学的成分を検出するプライマーもしくはプローブの別の例は、サブスタンス ＰのｍＲＮＡに特異的な配列である。サブスタンスＰは、痛みの受容体経路に関 連する神経で表現される神経伝達物質である。我々は、配列５’−ＴＧＧＴＡＣ ＧＣｍＣＴＣＡＴＡＡＧＴＣＣ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５８）が、サブ スタンスＰに非常に特異的であることを見出した。

別の探査される生物学的成分は、β受容体のｍＲＮＡである。β受容体（よ、ヒ ト神経組織に分布する蛋白である。特に、β２受容体の異常は喘息と密接に関係 することが分かっている。そこで、β２容体ｍＲＮＡの測定は、患者の病気生理 学を決定するのに使用できるし、抗喘息薬の有効性を評価するのにも使用できる であろう。我々は、配列 ５’　−ＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＣＡＣＡＧＣＡ−３’　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯニア５９）が、β電（たっｔこ１つのミスマツチ）、β！（ミスマ・ソ チなし）及びβｓ（２つのミスマツチ）を含む多くのヒトβ受容体サブタイプに 共通であることを見出した。

したがって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア５９は、これらβ受容体サブタイプの３つ を全部探査するのに使用できる。

ＸＶｌ、　Ｐ　ＣＲプーイマー　びプローブのμこの発明の方法に使用されるプ ローブ及びＰＣＲプライマーは関連技術で知られている何れの方法においても同 定可能である。しかし、好ましくはそうしたプローブ及びプライマーはコンピュ ータにより同定されることである。我々は、そうしたプローブ及びプライマーに 用いられる配列を同定するための新しいコンピュータシステムを開発した。この システムは、極めて正確なオリゴヌクレオチドプローブ及びＰＣＲプライマーの 計算・設計がユーザに可能となる自動システムである。

この発明のソフトウェアは、ＩＢＭ　互換パーソナルコンピュータでのマイクロ ソフトウィンドウズ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｗｉｎｄｏｗｓ　）の下で実行され る。この発明により、研究者は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋデータベ ースに基づいてオリゴヌクレオチドプローブを設計することが可能となる。更に この発明により、ユーザ選択の標的遺伝子配列に関して特異性または共通性を有 するプローブの検討が可能となる。

プローブとＤＮＡまたはｍＲＮＡの標的配列との間のハイブリダイゼーション強 度はハイブリダイゼーション強度モデルを通して推定可能となる。定量的には、 ハイブリダイゼーション強度は融解温度（Ｔｍ）で与えられる。

ハイブリダイゼーション強度モデルを推定するための２つのモデルはこの発明に よって支持される：１）ミスマツチモデル（Ｍｉｓｍａｔｃｈモデル）及び２） 　Ｈサイトモデル（■−５ｉｔｅモデル）。何れの場合においても、ユーザは各 プローブに関する次の計算、それに続いて表示及び解析に利用される結果を選択 することができる：■）配列、融解温度（Ｔｍ）及びヘアピン特性（ヘアピンは 、それ自体と相同なヌクレオチド配列であり同一プローブの他の部位と）１イブ リダイズするプローブの一部と「折り重ね」られる）：２）調製混合物の範囲内 の他の種とのハイブリダイゼーション；及び３）最強ハイブリダイゼーションの 座（部位）とＴｗｏ次いで、発明の計算結果は、標的ｍＲＮＡと作成しているプ ローブ配列との間の可能な全てのハイブリダイゼーションを図示するミツノ１シ （Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ）プローブ選択ダイアグラム（ＭＰＳＤ）上に表示され る。

主要なオリゴプローブ設計ステーションのダイアログウィンドウ（対話ウィンド ウ）によってプログラムにおける全てのユーザ定義可能設定が制御される。ユー ザにはこのウィンドウで多（のオプションが提供される。ファイル−Ｆｉｌｅ− オプションによって、ユーザは、印刷、カラー印刷、選択プローブ保存及びプロ グラム終了を実行すること力呵能となる。プリバレージョン（Ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎ）　・オプションによって、ユーザは、プリバレージョン（ＰＲＰ）ファ イルの公開及び作成を実行すること力呵能となる。モデル（Ｍｏｄｅｌｓ）オプ ションによって、ユーザは、現在オリゴプローブ設計ステーションに支援されて いる２つのハイブリダイゼーシヨンモデル・ｌ）Ｈサイトモデル及び２）ミスマ ・ソチモデルから選択することができる。

もし、Ｈサイトモデルを選択すれば、各プローブに対する融解温度及び核形成し きい値を設定することができる。核形成しきい値は核形成サイト（正確に一致す るサブ配列）からなる塩基対の数である。もしユーザがミスマ・ソチモデルオプ ションを選択すれば、プローブ長さ及びミスマ・ソチ数（Ｎ）が設定される。

主スヱＪ±天ｆ匹 ミスマツチモデルは、ＧｅｎＢａｎｋのような情報源からの配列のデータベース 情報を利用してＤＮＡ及びｍＲＮＡを設計する際に用いられるものである。この モデルでは、ハイブリダイゼーション強度は、プローブとその標的との間の塩基 対ミスマツチ数にのみ関連する。一般的に、パラメータ設定時ユーザが許すミス マ・ソチ数が多ければ多いほど、より多くのプローブが同定されることになる。

ミスマ・ソチモデルは、候補プローブのＧＣ含量を考慮しないので、プローブの 結合強度につＬ）での計算は無い。

ミスマツチモデルに採用されている基本技術は、ノトンシングと連続シードフィ ルトレージョン（濾過）法である。ハツシングには、記録の対称的グループ分け をするため一組のデータの記録に対しアルゴリズムを適用することが含まれる。

データベースのような指標付きデータセットを使う時は、ハツシングは記録キー を記録の保存・検索のだめの指標値に変換するプロセスとなる。ミスマツチモデ ルは、本質的にはＤＮＡ及びｍＲＮＡの配列間の正確な及び不正確なマツチング を決めるための高速プロセスであり、ミツハシプローブ選択ダイアグラム（ＭＰ ＳＤ）を支援する。

ミスマツチモデルに使用されるアルゴリズムは、Ｗａｔｅｒｍａｎ−Ｐｅｖｚｎ ｅｒのアルゴリズム（ＷＰＡＬＧ）を基礎にしており、これはコンピュータによ るプローブ選択プロセスである。Ｈｕｍｅ及び５ｕｎｄａＹ　（１９９１，Ｒｅ ｆ、４）、　Ｌａｎｄａｕ等（１９８６−１９９０，Ｒｅｆｓ、　６，７．８） 。

Ｇｒｏｓｓｉ及びＬｕｃｃｉｏ　（１９８９，Ｒｅｆ、３）参照。

この発明の実行においてミスマツチモデルを立上げる３つの主要なプログラムが ある。最初のものは、”ｋ　ｄｉｆｆ”と発明者が命名したものである。ＷＰＡ ＬＧはｋ　ｄｉｆｆを使って、２つの配列間で線上かｋに等しい数のミスマツチ 数（ｋはユーザ指定）を有する１以上かまたは１に等しい長さく長さもユーザ指 定）を持つマツチの全位置を見つけている。もしも候補オリゴヌクレオチドプロ ーブがこれによくマツチしなければ、それは固有であると考えられる。ｋ　ｄｉ ｆｆはハツシング及び連続シードろ過法を使用し、ＧｅｎＢａｎｋ及びその他の 同様のファイルフォーマットを有するデータベースを探索することによって相同 性が検索される。連続シードろ過法によって以前に行われていた技術よりはるか に効果的な探索が可能となる。

シードは、最悪ケースのシナリオにおいて最長の正確なマツチと等しい長さを持 つ部分配列であるとこの発明では定義される。例えば、ユーザが２以下のミスマ ツチ（ｋ）を以って１８というプローブ長（１）を選択すると想定しよう。もし ２つのミスマツチを有するマツチがあれば、６に等しい長さの完全にマツチング する部分配列が存在するはずである。シード長が決定されると、ミスマツチモデ ルによって、そのシード長（この例では、シード長は６になる）をもつ全ての部 分文字列が考察され、６と等しい長さをもつ完全にマツチした塩基対の配列が見 つけられ、次にこの部分配列がユーザ選択のプローブ長に等しい長さく即ち、こ の例では１８）の配列まで伸びるかどうかを調べることが考察される。もしそう なら、候補プローブはユーザの基準を満足していると見なされてきた。

シードサイズが大きい場合（即ち、特有のヌクレオチドの長鎖）、プログラムに よって、比較的大量のメモリがハツシュテーブルに割り当てられることになる。

この発明には、ＧｅｎＢａｎｋの各記入項目にメモリを割当て（アロケーション ）し直す代わりに、プログラムの始めに一度だけＧｅｎＢａｎｋの登録（ｅｎｔ ｒｙ）項目に対してメモリ割当ができるオプションがある。これによってＧｅｎ Ｂａｎｋに対する登録時間がファクター２と同じ大きさまで短縮されるが、しか し前もって最大のＧｅｎＢａｎｋ登録項目サイズをユーザが知っていな１すれば ならない。

プローブは、もしそれがデータベースまたはファイルで探索された標的配列とに 以下のミスマツチならハイブリダイズすると見なされる。ミスマツチモデルの全 ての対応パラメータに対する的中拡張時間（ｈｉｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｔｉ ｍｅ）は、最小プローブ長（１）が２４にセットされ且つ最大ミスマツチ数が４ にセットされた一つの場合を除いては、３５秒より短いことが実験で確認されて いる。この状況は、ハイブリダイゼーション条件か弱すぎるため、実際の遺伝子 位置決定の実験にはほとんど使われないであろう。

■丈イ上天ｉ匹 この発明の具体例では、第二のハイブリダイゼーション強度モデルは、Ｈサイト モデルと呼ばれる。Ｈサイトモデルの一つの局面では、ヌクレオチド結合強度を 解析するため実験式の一般化が行われている。このモデル状況が構築される基本 的式は次の通りである： Ｔｍ　＝　８１．５　−　１６．６（ｌｏｇ　［Ｎａコ　−０，６３％（ホルム アミド）　＋　０．４１（％（Ｇ＋Ｃ））−６００／Ｎ。

ここで、ｌｏｇ　［Ｎａ］はナトリウム濃度を表す対数であり、％（Ｇ＋Ｃ）は Ｇ−Ｃ相補的なマツチ塩基対の比であり、Ｎはプローブ長である。この式は、融 解温度はプローブ長とパーセント表示のＧＣ含量の両方の関数であるという事実 に関連している。この基本式は、ミスマツチの存在を計数できるようこの発明で 改良された。ミスマツチについての各パーセントで融解温度が平均１．２５°（ ＡＴミスマツチについては２℃、闇ミスマツチについては４℃）まで下げられた 。しかしこの式は近似である。実際の融解温度は、特に、短いプローブまたは比 較的多くのミスマツチがあるプローブに対しては、この近似とはもしかすると異 なるかも知れない。

Ｈサイトモデルにおけるハイブリダイゼーション強度は次のファクターのそれぞ れに関連する：ｌ）結合領域；２）ミスマツチの形式（ＧＣまたはＡＴ置換）； ３）プローブ長；４）結合領域のＧＣ含量；および５）”核形成部位“の存在（ 正確なマツチをもつ部分配列）。各配列でのミスマツチの形式及び結合部位のじ 含量は、候補プローブの結合強度の一因となる。各プローブでの結合強度はそれ によって決められ、ユーザにとって最適プローブを選ぶことができるようになる 。

Ｈサイトモデルが根本的に仮定しているのは、結合領域と呼ばれるプローブと標 的が対になった部分配列によって結合強度はほとんど決められる、ということで ある。部分配列の結合領域にＡＴ対よりＧｅ対が多く含まれるなら、ＡとＴの塩 基（二重結合）に比較して、ＧとＣの塩基間の水素結合（三重結合）の数がより 多くなるため、結合強度はより高（なることになる。故に、釦の多いプローブは より高い融解温度を有し、またそれにともなって、より強力なハイブリダイゼー ションを形成する。

Ｈサイトモデルにおいては、そのプログラムによって、標的遺伝子とのミスマツ チも無く理想的に最適プローブが決定される。しかしこのモデルでは、候補プロ ーブは、配列が■リッチの場合、より多くのＡＴミスマツチを有するはずである 。

特定の配列におけるＡＴミスマツチの許容量は、この発明のプログラムにおいて は一致しないエリアに関してプローブにペナルティ−を科すことなしに一致する プローブと標的の部分配列部位を主として考察することにより決定される。もし ミスマツチが結合領域の一方か両方の端に存在する場合、塩基対を作ることにつ いての総合的安定度に関しては影響は少ない。結合領域の中心に位置するミスマ ツチは、プローブの結合強度を著しくて低下させるので有害である。

融解温度について上に引用された式は、結合領域の範囲内で適用される。プロー ブ長はパーセンテージを計算するのに使われるが、この式のその他の全てのパラ メータは結合領域だけに適用される。Ｈサイトは更に核形成部位の存在を仮定し ている。この核形成部位の長さはユーザによって設定可能である。典型的には８ −１Ｏの塩基対の値が使われる。Ｈサイトモデルを完了するため、結合領域は、 一つは存在すると仮定される（さもなければＴｍ＝０）核形成部位を包含する全 ての部位の中で融解温度を最高にするように選択される。

ハイブリダイゼーション強度は、一般には正の結合エネルギーを与えるマツチと 一般には負の結合エネルギーを与えるミスマツチとを有する多重部分配列寄与の 総和としてモデル化されるということにおいて、Ｈサイトモデルはミスマツチモ デルより複雑である。使用される正確な結合エネルギーは、マツチまたはミスマ ツチにのみ依存する。この発明の現行バージョンでは、これらの係数は明らかに ユーザ選択可能形式ではなく、むしろＩｔａｋｕｒａ等（１９８４，Ｒｅｆ、５ ）、　ＢｏｓｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ　（１９６２，Ｒｅｆ、２）、　Ｂ ｅｎｎｅｒ等（１９７３，Ｒｅｆ、Ｉ）、及び５ｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５，Ｒ ｅｆ、@１３）に よって開発されたハイブリダイゼーション強度の式に最も適合するよう選択され るとはいえ、これらの係数はユーザによって規定することもできる。

Ｈサイトモデルの独特の局面は、ハイブリダイゼーション強度が候補プローブと 結合位置との間の最適結合領域で決まるということである。結合領域はハイブリ ダイゼーション部位と呼ばれ、全体のハイブリダイゼーション強度が最高になる よう選択され、その結果、結合領域外のミスマツチは推定ハイブリダイゼーショ ン強度を減することはない。Ｈサイトモデルのその他い（つかの独特の特徴には 、それがＲＮＡの方に、特にＤＮＡというよりはｃＤＮＡの方により強く方向付 けられているという事実、及び作成（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）及び環境変数全 般について制御できるという事実が包含される。

ＲＮＡ及びｃＤＮＡに関して強調されるので、ユーザは、所望のプローブが得ら れるようゲノム配列全てを分類せざるを得ないというより、遺伝子のコード領域 に集中できることになる。環境及び作成変数全般にわたって強化されたユーザ制 御によって、彼または彼女が行っている如何なる実験とも対応する研究室の条件 をより精密にシミュレートすることがユーザに可能となる。更に、この発明の手 段によって、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのいくつかの予備的前処理が行われｃ ＤＮＡを区分し選別する。これはキーワード（この場合はＣＤ５）を各々のＧｅ ｎＢａｎｋ記録で捜しだし、これによってイントロンを包含する配列はどれも排 除することによって行われる。

ミツハシプローブ選択ダイアグラム（ＭＳＰＤ）　（図１４）は、ミスマツチお よびＨサイトモデルによって設計されたプローブの結果を可視化する独特の方法 であり、この発明の主要な特徴である。それは候補オリゴヌクレオチドプローブ 及び調製中の標的配列の全てとの全ハイブリダイゼーションの図式表示である。

遺伝子配列データベース及び標的ｍＲＮＡの配列が与えられれば、ＭＰＳＤは候 補プローブおよびそれらのハイブリダイゼーション強度の全てをデータベースか らの全ての配列とともに図式的に表示する。この手段では、各融解温度は赤（Ｔ ｍ：最高）から青（Ｔｍ：最低）までの別々のカラーで表示される。ＭＰＳＤに よって、ユーザは、全ての候補プローブについて種々の温度における誤ハイブリ ダイゼーションの数及びそれらの誤ハイブリダイゼーションの原因を（座−Ｌｏ ｃｉ−及び配列の比較で）可視することができる。座は特定の部位（ｓｉｔｅ） または場所（ｐｌａｃｅ）でよく、遺伝子学的概念では、座は対立遺伝子で占め られているかも知れない一対の染色体の相同部分の何れかである。次いで、これ らのプローブは、生きた組織中の特定プロティンの前駆体の存在を調べるために 使うことができる。この発明で設計されたオリゴヌクレオチドプローブは医学上 の診断キットとして、ＤＮＡの同定、及びヒトの代謝経路の有望な連続モニタリ ングとして使用できる。このコンピユータ化設計ツールであるこの手段は、ＩＢ Ｍ　互換パーソナルコンピュータ（ＰＣ’ｓ）に関するＭｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｗ ｉｎｄｏｗｓＴＩ″ｖ、３．１　（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ；Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｗａｓｈｉ獅■狽盾獅■ より製作）の下で実行される。

この発明のＨサイトモデルは、選択されたプローブ、及び可視化し解析し且つこ の発明で設計された候補プローブの中から選択する独創的且つ独特の手段につい て多（の情報を提供するということにおいて固有である。候補プローブは、艶ｎ Ｂａｎｋデータベースのようなデータベースに収集されたｍＲＮＡまたはＤＮＡ 配列のいくつかの既知の組み合わせに関連したそれらの結合特性に関してＨサイ トモデルを使って解析される。第一段階には、与えられた標的の一部または全部 の座で候補プローブを選択することが含まれる。次ぎに、融解温度モデルが選択 され、そして各候補プローブが作り出すであろう誤ハイブリダイゼーションが幾 つあり、それぞれの融解温度が何度になるかについて配慮が払われる。最後に、 可視化し、解析し且つ候補プローブの中から選択する独特のツールセットによる 結果が研究者に提示される。

この発明は、現在使われている方法より高速で且つはるかに精度が高い。それは 、最も特異的かつ特有の配列のみならず、共通の配列も見つけ得る唯一の方法で あるという理由から独特の方法である。さらにこれによって、ユーザは候補プロ ーブについて多種類の解析を実行でき、加えて、種々の方法でこれらのプローブ を標的配列と、及び相互に比較することができるようになる。

それ故、研究者が特異的及び共通の両オリゴヌクレオチドプローブを設計できる 実用的でユーザに優しいシステムを提供すること、且つこれを比較的短時間で現 行よりはるかに精密に達成することがこの発明の目的である。

本発明は、図１１に最もよ（示された形態で使用される。ここでは、この発明の 組合せは、ＩＢＭ互換パーソナルコンピュータからなり、この発明に特有のソフ トウェアを実行し、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びその他の関連データベース に見られるファイルフォーマットで配布されているデータベースにアクセスする 機能を有する。

限定されない限り、ここで用いられている全ての技術的及び科学的用語は、この 発明が属する分野における通常の技術を有する者に共通に理解されているものと 同じ意義を有する。ここに記載されている方法及び材料に類似または等価である ものの何れも実用上またはこの発明の試験に使用することができるが、好ましい 方法及び材料をここに示す。以下に述べるすべての出版物はここに参考として取 り入れる。

この発明を操作できる好ましいコンピュータソフトウェアは、少なくとも次の仕 様を有するシステムについて包含する（図１１）：ｌ）総合的にＩＡ、ＩＢ、及 びＩＣと記号付けされたもので、コプロセッサ８０４８６付き、３３　Ｍｈｚ以 上の高速ランのＩＢ証　互換パーソナルコンピュータ（ＰＣ）　；　２）　８１ ８以上のＲＡＭ、　ＩＡ；３）少なくとも２００　ＭＢ、好ましくはｌ　ＧＢの 記憶領域を有するハードデスク、ＩＢ；４）読み取り可能フォマットで本発明の 出力を表示するに十分なサイズのグラフィック機能を有し好ましくは解像度１０ ２４　Ｘ　７６８を有するＶＧＡカラーモニタ；　５）　５８０１１Ｂ　ＣＤ　 ＲＯＭ　ｄｒｉｖｅ　５　（図１１のＩＢは、一般に、このＰＣに包含された内 部記憶システムと参照されるもので、左上から時計回りに、フロッピー装置２台 、及びハードデスク）。この発明のソフトウェアは、好ましくはＭｉｃｒｏｓｏ ｆｔ　Ｗｉｎｄｏｗｓ”のインターフェースを有するため、ユーザもマウス２ま たは他の形式のポインティング・デバイスを必要とすることになる。

この発明の好ましい実施態様には、レーザプリンタ３および／またはカラープロ ッタ４も含まれる。この発明では、ユーザがＧｅｎＢａｎｋのデータベース８の （色々な数の遺伝子配列を含む）　ＣＤ　ＲＯＭバージョンにアクセス手段を持 たないときは、（内部または外部式でもよい）モデムが必要である。モデムを使 えば、情報及び取扱い説明は、電話線を通してＧｅｎＢａｎｋデータベース８と やりとりされる。もし、ＣＤ　ＲＯＭ　ｄｒｉｖｅ　５を使えば、ＧｅｎＢａｎ ｋデータベース（またはその特定部分）が多数のＣＤに記憶される。

コンピュータシステムは、好ましくは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＷｉｎｄｏｗｓＴ Ｍバージョン３゜１が動（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　のＤＯＳ／＜−ジョン５．０オ ペレーティングシステムを少なくとも有すること。この発明における好ましい実 施態様では、そのプログラムは全てＢｏｒｌａｎｄ　Ｃｏ（Ｂｏｒｌａｎｄ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ：　５ｃｏｔｔｓ　Ｖａｌｌｅｙ、　ＣＡ ）のコンピュー^ 言語で書かれた。銘記すべきは、その後続いて開発されたコンピュータ記憶シス テム及び言語は、この発明を利用するために応用することができること、及びそ の逆もあるということである。

この発明のコンピュータプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋかまたは同様のファイル フォーマットを有するデータベースに記憶されたＤＮＡＳｍＲＮＡおよびｃＤＮ Ａにユーザがアクセスできるよう設計されている。ＧｅｎＢａｎｋは、レコード で構成された分散型フラットファイルデータベースで、各レコードには種々の分 野がＡＳＣＩＩファイルフォーマットで包含されている。記憶されたデータベー スそれ自体配布されており、その大多数のユーザにさえよく知られているように データベース管理システム（ＤＢＭＳ）は一つもない。ライン形式フォーマット と呼ばれる一つの一般的フオーマットは、分散型データベース及びＧｅｎＢａｎ ｋの全内部保持記録の両方ともに使用される。全てのデータとシステムファイル およびＧｅｎＢａｎｋ用索引は、ライン形式フォーマットでテキストファイルに 保持される。主要なＧｅｎＢａｎｋデータベースは現在、多数のファイルまたは 分割の形で分散されており、その各々は特殊な種の（または、少なくとも現に知 られており、順番に配列されて公に利用されている位の量の）ゲノムの典型を示 している。ＧｅｎＢａｎｋは核酸配列のコレクション並びに関連する書誌的及び 生物学上の注釈を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤ配布のうちのリリース７２． ０（６／９２）は、合計で９千２百万を超えるヌクレオチドとともに７１．００ ０を超える座−１ｏｃｔ−を包含している。ＧｅｎＢａｎｋは、Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ、　ＭＤのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　Ｉｎｆ盾■ ＩｋＩｔｉｏｎ、　Ｍａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｅｃｉｎ ｇｅと共同して、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡのＩｎｔｅＬｌｉＧｅｎ ｅｔｉｃｓにより配布されている。

１、第１ゴブロープ−ンスーーシ　ンの　！ａ、一般理論 この発明の意図は、ＤＮＡの配列間の正確および不正確なマツチングを実行する ための１つ以上の高速プロセッサを提供して下に議論するミツハシプローブ選択 ダイアグラム（ＭＰＳＤ）、及び関連する図形解析ツールによる他の解析を支援 することにある。候補オリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡＳｍＲＮＡまたはｃ ＤＮＡの標的部分配列との間のハイブリダイゼーション強度は、ハイブリダイゼ ーション強度モデルによって見積もることができる。定量的には、ハイブリダイ ゼーション強度は融解温度（Ｔｍ）で与えられる。現在は、次の２つの７ゾブリ ダイゼ一シヨン強度がこの発明で支援されている・ ｌ）ミスマツチモデル及び２）Ｈサイトモデル。

主要オリゴプローブ・デザインステーション・ダイアログウィンドウ（図１２） は、すべてのユーザ定義可能な設定を制御する。このウィンドウは５つのオプシ ョンを提供するメニューバーを有する。ｌ）ファイル１０　；２）プリバレージ ョン８０：３）モデル：４）実験９０：及び５）ヘルプ。ファイル１０のオプシ ョンによって、ユーザは、印刷、カラー印刷、選択プローブ保存及びプログラム 終了を実行することが可能となる。プリバレージョン−Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ −・オプションによって、ユーザは、プリバレージョン（ＰＲＰ）ファイルのオ ープン及び作成を実行することが可能となる。

モデル＝Ｍｏｄｅｌｓ−オプションによって、ユーザは、現在オリゴプローブ設 計ステーションに支援されている２つのハイブリダイゼーションモデル：１）Ｈ サイトモデル７１及び２）ミスマツチモデル７５から選択することができる。も しユーザがＨサイトモデル７１オプションを選択するなら、図１２の左側メニュ ーが表示され、ユーザは次のモデルパラメータを設定する：１）設計中のプロー ブに対する融解温度Ｔｍ　７２　（即ち、ユーザがシミュレートすることを望ん でいる特定の実験または条件に対応する融解温度）：及び２）核形成しきい値７ ３（即ち、核形成部位を構成する塩基対の数）。もしユーザがＨサイトモデル７ ５オプションを選択するなら、図１２の右側メニューが表示され、ユーザは次の モデルパラメータを設定する：ｌ）プローブ長７６（即ち、考慮されているプロ ーブ中の塩基対の数）；及び２）ミスマツチＮ７７（即ち、ハイブリダイゼーシ ョンを構成するミスマツチの最大数）。ユーザが要求する計算は、Ｈサイトモデ ルでは、もし、しきい値７３の設定が減らされれば比較的時間がかかるが、もし 、ミスマツチの数Ｋ　７７が増やされれば、ミスマツチモデルの方がより時間が かかる。

加えて、両モデルのオプションに関連して、ユーザは、それを対象にプローブが 設計されつつある標的種ＩＩのＤＮＡまたはｍＲＮＡ及びプリバレージョン１２ 、ハイブリダイゼーションの計算に使われる全配列のファイル、を選択する。標 的種ファイルの例を図３７　（ｈｕｍｂｊｕｎｘ、ｃｄｓ）に、一方、プリバレ ージョン・ファイルの例を図３８　（ｊｕｎｍｉｘ、　５ｅｑ）に示す。これら の入力の各々は標準ＤＯＳフォーマットでのファイル名と拡張子によって表示さ れる。標的種とプリバレージョンフィールドでは、ファイルフォーマットはＧｅ ｎＢａｎｋのフォーマットに従い、そのフィールドの各々はデフォルトファイル 拡張子を有する。”ＯＫ”ボタン９１　（図１２０）を押せば処理を開始し、一 方、“Ｃａｎｃｅｌ”ボタンによりその処理を停止する。

実験９０オプシヨン及びヘルプ５０オプシヨンは拡張オプションであるが発明の 現在の実行にはまだ利用できない。

Ｃ１処理 図１３Ａはオリゴプローブ設計ステーションプログラム全体のフローチャートで あり、シーケンスと構造を説明している。一般的に、オリゴプローブ設計ステー ションの主または”制御”プログラムは、全体の保守及び制御機能を実行するも のである。図１３Ａ及び１３Ｂに説明するように、このプログラムは入城変数を 規定するなど総合的ハウスキーピング（段取り）機能を履行する。ユーザに優し いインタフェース５３は、ユーザ入力手続き５５、ファイル５７またはデータベ ース５９へのアクセス手続き、ユーザ選択のモデルプログラム６２または６３の 呼出し、およびユーザ選択の報告６５または表示６７．６９．７１及び７３の要 点を実行する。これらの各要点は、ユーザのセットアツプ及び制御入力の項目を 包含する入力手続きを除き、後節でより詳細に議論する。

ｄ、出力 の数を示すグラフが表示される。好ましい実施態様では、そのグラフはカラーコ 定義される。現プローブについてのより詳細な情報は、下で議論されるＰｒｏｂ ｅｌｎｆｏおよびＭａｔｃｈｌｎｆｏウィンドウに与えられる。マウスボタン２ をカーソル１２５の所で１回クリックすれば現プローブが選択され、マウスボタ ン２を２回クリックすれば現プローブが外される。スクリーンを横切ってカーソ ルを移動させれば表示が変わり現在のカーソル位置の下では候補プローブが表さ れる。

ＭＰＳＤのＸ−軸１１０（図１４）は、与えられたｍＲＮＡの配列に沿う候補プ ローブのスタート位置を示す。ユーザはその表示を左または右に”スライド”さ せて別のプローブのスタート位置を表示させることもできる。ＭＰＳＤのＹ−軸 １１５は、プログラムで計算されるプローブ特性を表示する。

）’−−ユーオプシａン１１６．１１７．１１８．１１９及び１２０ハ、ＭＰｓ Ｄニセットサレテいル間サイトまたはミスマツチ）及びそのパラメータを特定す ることができる。

つ（図１２）の一部である。

共通であることを示している。最適プローブが表示されるＭＰＳＤ図形表示上の エリｉｉ、ＰｒｏｂｅＩｎｆＯ′よびＭａｔｃｈｌｎｆｏウィンドウＰｒｏｂｅ ｌｎｆｏ　（プローブ情報）およびＭａｔｃｈｌｎｆｏ　（７ッチ情報）ウィン ドウ（図１５）によって、現在の候補プローブについての詳細な情報が表示され る。ウィンドウの上方部分はＰｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウであり、下方部分は ＭａｔｃｈＩｎｆｏウィンドウである。Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウは次の形 式の情報を表示する：標的座−ｔａｒｇｅｔ　１ｏｃｕｓ−（即ち、ユーザがそ れからプローブを捜しているｍＲＮＡ、　ｃＤＮＡまたはＤＮＡ）は１３１で表 示され、一方、ハイブリダイゼーションに使われるプリバレージョンは１３２で 表示される。図２４に示す例では、標的座１３１は■ＵＭＢＪＩＪＮＸ、　ＣＤ Ｓ、と命名されたファイルであり、これはサブディレクトリＭル＾Ｎのｄｒｉｖ ｅ　Ｆに位置しているものとして示されテイル。プリバレーシＢ　ン−ｐｒｅｐ ａｒａｔｉｏｎ−１３２は川ＮＭＩＸ、　ＰＲＰ、と命名されたファイルとして 示されており、これもサブディレクトリＭＩＬＡＮのｄｒｉｖｅ　Ｆにあるもの として示されている。この実施例における川ＮＭＩＸ、　ＰＲＰプリバレージョ ンはヒトとマウスの用Ｎ遺伝子座の混合物である。

現在の且つ最適のプローブのスタート位置を１３５で示す。現在の候補オリゴヌ クレオチドプローブは１３６で定義され、２１塩基の長さを持つものとして１３ ７で掲げられている。標的とハイブリダイズさせ′られたプローブ１３６につい ての融解温度を縦欄１４０に示す。最適プローブについての融解温度は１３８で ６１．７℃として与えられる。

Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウ（図２４）には、１３９でプローブのヘアピン特 性も示されている。示された例では、Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏウィンドウも最悪ヘア ピンに含まれた４塩基対が存在すること、及びその最悪ヘアピンの長さはｌであ ることを示している（図１５゜１３９参照）。Ｍａｔｃｈｌｎｆｏウィンドウの 一部は、プリバレージョンファイル内での現在のプローブと種とのハイブリダイ ゼーションのリストをハイブリダイゼーション座とハイブリダイゼーション温度 とを含めて表示する。ハイブリダイゼーションは融解温度に関して減少していく 順に記録される。表示は、それによって／＼イブリダイゼーションが生じる遺伝 子座、その産肉での位置、およびハイブリダイゼーションの配列を示す。

Ｍａｔｃｈｌｎｆｏウィンドウの一部には、候補プローブが高い結合強度で完全 にノゾプリダイズしているように１５０で示される。これは、標的ＤＮＡ自体が この場合データベースに表わされるので、標的プローブはそれ自体とハイブリダ イズする（完全ハイブリダイゼーション）と１５０で見られるからである。プリ バレージョン１３２がらの各ハイブリダイゼーションの遺伝子座は縦欄１４１に 表示され、一方、各ハイブリダイゼーションのスタート位置は縦欄１４２に与え られる。計算されたハイブリダイゼーションは１４５で示される。

ｉｉｉ、ＰｒｏｂｅｓＥｄｉｔウィン′つＰｒｏｂｅｓＥｄｉｔ　（プローブ編 集）ウィンドウ（図１６）は、オリゴプローブ設計ステーションのテキストファ イル出力の便利な編集と注釈のために設けられたテキスト編集ウィンドウである 。それはまた、ＭＰＳＤ　（図１４）から選択されたプローブを、マウスボタン ２のクリックによって累算するのに使われる。標準のテキスト編集機能はＰｒｏ ｂｅｓＥｄｉｔウィンドウの範囲内で利用できる。ユーザはこのウィンドウで選 択されたプローブを累算しく例えば、１５５参照）、続いてそれらをファイルに 保存できる（そのファイルは”ｐｒｂ”１５６というファイル拡張子を伴うプリ バレージョン配列の名称を持つか、またはユーザによって選ばれた別のファイル 名になるかも知れない）。このファイルの例を図１６Ａ及び１６Ｂに示す。

ｉｖ、種至Ｑ里力 この発明の本実施例においても、どちらのモデルをユーザが選択したかによって 一般に”ｔｅｓｔ、ｏｕｔ”及び”ｔｅｓｔｙ、　ｏｕｔ”と命名された２つの 出力ファイルが創られる。

最初のファイル”ｔｅｓｔ、　ｏｕｔ”は、ミスマツチモデル及びＨサイトモデ ルの両方で創られる。このファイルは、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉプローブ選択ダイ アグラム（ＭＰＳＤ）のテクスチュア表示である。それによって、プローブは位 置、長さ、デルタＴｍ、　５ｃｒｅｅｎｓＮ及び実際のプローブ配列（即ち、ヌ クレオチド）にまで細分化される。ミスマツチモデルによって創られたこのファ イルの例を図３０に、およびＨサイトモデルによって創られた例を図３４ａに示 す。第二のファイル“ｔｅｓｔｌ、　ｏｕｔ”は、Ｈサイトモデルのみで創られ る。このファイルは、ＰｒｏｂｅＩｎｆｏ及びＭａｔｃｈｌｎｆｏウィンドウの テクスチュア表示であって、全てのハイブリダイゼーションをそれらの遺伝子座 、スタート位置、融解温度、及び可能なその他のハイブリダイゼーションの形で 表す。

このファイルの一部分の例（Ｈサイトモデルによって創られた合計で１９０ペー ジの内からｌＯページ分）を図３４ｂに示す。

２、ミスマ・・　モデルプロ　−ムの１１１ａ、概説 この発明においては、ハイブリダイゼーション強度モデルの一つをミスマツチモ デルと呼ぶ（このモデルの選択については図１２参照）。このモデルの基本的操 作には、先に定義したが以下にさらに詳細に記載するように、ハツシングと連続 シードろ適法が包含される。ミスマツチモデルの要素は、ヌクレオチド配列間で の正確な及び不正確なマツチングを行わせるための高速処理であり、ミツハシプ ローブ選択ダイアグラム（ＭＰＳＤ）を支援する。この発明に含まれるミスマツ チモデルの現在の実行には多くのモジュールがあり、その内の最も重要なものを 図１７のフローチャートに及びさらに詳細には図１８から２８に示す。図２８の フローチャートに示されている主要なに−ｄ　ｉｆｆモジュールは、ミスマツチ モデルの包括的な制御を規定する構造プログラムであり、異なった諸機能を実行 する種々のサブモジュールが要求される。

ｂ、入力 このモデルに対するユーザ選択入力変数は、最小プローブ長７６（一般には、１ ８から３０である）及びミスマツチの最大数７７（一般には、１から５である） である。

これらの入力は、主オリゴプローブ設計ステーション・ダイアログウィンドウで （図１２ｃ）ユーザにより入力されるものである。

Ｃ１処理（プロセシング） ｉ、　ｋ　ｄｉｆｆプログラム この方法により実施される処理の前に定義しなければならないいくつかの技術用 語を説明する。ハツシュテーブルは本質的にデータの配列即ちデータ表である。

関連リストは、関連したエントリ（登録）の鎖であり且つ他のエントリ構造に対 するポインタを包含する古典的データ構造である。関連リスト中のエントリは、 配列中に含まれる要素にあることだが、メモリに順番に記憶しなければならない ことはない。通常、そのリストと関連するリストに対するポインタがあり、これ は、しばしば最初に設定されてリストのスタート点を指示する。リストに対する ポインタは、リスト中のエントリを通して順番に配列するために有用である。空 白ポインタ（即ち、ゼロの値を持つポインタ）はリストの終了点を定めるの用い られる。

図１７および１８のフローチャートが示すように、一般プロセスの各ステップ及 びこのモデルの実行機能は次のように要約できるニステップ１：先ず、ハツシュ 表及び照会（ｑｕｅｒｙ）　（図１７、ハツシングモジュール２２２）の関連リ ストを作る。

ステップ２：次に、検索に使えるＧｅｎＢａｎｋエントリ（図１７、アセンブリ モジュール２３０）のある間にニ ステップ２ａ：ユーザ指定の長さを持つ現在のＧｅｎＢａｎｋエントリ（登録） 配列（図１７．５ｅｑｌｏａｄモジユール　２３２）、またはユーザによって選 ばれたリストから現在の配列（図１７、リードｌモジュール　２３４）を読みと る。

ステップ２ｂ：最初の位置（即ち、ヌクレオチド）から最後の位置（即ち、ヌク レオチド）までの配列の各位置に対する現在の配列に関して（ループ繰り返しで １回位置の数を増やすこと）（図１７、（Ｌｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２） 。

ステップ２ｃ：変数ｄｎａ−ｈａｓｈを現在の配列の現在の位置のハツシュに等 しく設定する。（図１７、（Ｌｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２）。

ステップ２ｄ：　ｄｎａ　ｈａｓｈに関連したリストの終了点ではない間（図１ ７、（ＬＣＯＩｏｕｒモジュール２４２）。

ステップ２ｅ：関連リストのｄｎａ　ｈａｓｈの現在の位置に等しくｑｕｅｒｙ 」銘を設定する（図１７、（Ｌｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２）そしてステッ プ２ｆ：座標（ｑｕｅｒｙ−ｐｏｓ、　ｃｌｎａ　ｐｏｓ）でヒツト（的中）を 拡張する（図１７、ｈｉｔ　ｅｘｔモジュール　２４４）。

ステップ２ｇ：拡張された現在のヒツトにに−ｍｉｓｍａｔｃｈが存在するなら （図１７、ｃｏｌｏｕｒモジュール　２４６）　、それからステップ２ｈ：現在 のヒツトを印刷しく図１７、（Ｌｃｏｌｏｕｒモジュール　２４２）、そしてス テップ２から繰り返す。

Ｅ°小ループステップ２ｄ）に基づいて実行される。”ヒツト“は、現在の拡張 ヒツトにｋ　ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓがあれば印刷されるだけである。

図１８から２８では、この発明の現在の実施例の各々についての機能が説明され 、それらの全ては上記記述に一般化され且つ要約された。主要な″３ｄｉｆｆ″ モジュールの概略を説明する図１８により、このモジュールは、本来、プログラ ム編成と方向のモジュールであって、加えて、ルーチンの”ハウスキーピング機 能、例えば、変数及びハツシュテーブルを定義し、ユーザ選択の遺伝子ファイル がオープンかどうかをチェックし２５２、必要な識別情報をＧｅｎＢａｎｋから 抽出し２５３、そしてユーザ入力の有効化２５４を実行する、ことが示されてい る。このモジュールはまた遺伝子配列に対してメモリの１回割当てを実行し、ヒ ツト情報、ハツシング、ハイブリダイゼーション及び頻度長プロフィール（ｆｒ ｅｑｕｅｎｃｙ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ）に関してメモリを割当て、 そしてディスプレイに出力する２５５　＆　２５６゜”ｋ−ｄｉｆｆ”モジュー ルはまた、ハツシング機能の準備に当たり、ハツシュテーブル、それと関連した ハツシングリスト及び他の種々の変数２５７を初期化即ち“ゼロアウト“する。

加えて、このモジュールは、ハツシュ表２５８を作成し、配列を抽出しそして配 列長２５９を見つける。

”ｋ　ｄｉｆｆ”モジュールによって実行されるもっとも重要な機能の一つは、 シード（即ち、核（カーネル）　−ｋｅｒｎｅｌ−またはｋ　ｔｕｐｌｅ）サイ ズを決めることである。このことは、変数ｋ　ｔｕｐｌｅを（ｍｉｎ　ｐｒｏｂ ｅ　ｌｅｎｇｔｈ　−ｍａｘ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　＃）／（ｍａｘ　ｍｉｓｍａ ｔｃｈ　＋　＃　＋　１）に等しく設定することにより実行される（図１８．２ ６５）。次に、もし上述の処理の剰余がゼロに等しくなければ２６６、変数ｋ　 ｔｕｐｌｅの値を１つだけ増やす２６７゜得られた値はシードのサイズである。

次いで、そのモジュールは照会２６８を読みとりそして同定の目的のためにｔｏ ｃｕｓ　＜座）名２６９をコピーする（用語座の定義は明細書中ですでに与えら れている）。

”ｋ　ｄｉｆｆ”モジュール（図１８）はまた、”アセンブリ”モジュール２６ ０を呼出し結果をファイル２６１ａに書き込み、その結果２６１ｂを作図しく下 に議論）、ヘアピン特性（即ち、塩基対の数及び最悪ヘアピンの長さ）及び各候 補プローブ２６３に対する融解温度（Ｔｍ）を計算し、そしてその結果をファイ ル２６４に保存する。

スクリーン図形は、その結果の値を画素に変換し、画素配列をファイルし、そし て画素配列にバイナリ検索を実行することによって作図される２６１ｂ、次ぎに 、プローブ位置当たりの画素数が与えられ且つユーザにとってどの機能（即ち、 ３つのミスマツチ・マツチ数−ｍｉｓｍａｔｃｈ　ｍａｔｃｈ　ｎｕｍｂｅｒｓ ）に興味があるがが与えられれば、そのプログラムによって（ｐｉｘｅｌｓＰｅ ｒＰｏｓｉｔｉｏｎＮ−１）の値でその値が補間され、そして図形描画のため画 素値の配列が計算される。これらの値は続いてＭＰＳＤで作図される。

“ハツシング（ｈａｓｈｉｎｇ）”モジュール（図１９）は照会のハツシングを 実行する。

換言すれば、それはハツシュテーブル及び同じハツシュと関連した照会位置のリ ストを作成する。変数ｈａｓｈ　ｔａｂｌｅ　［ｉ］は照会でのハツシュｉの最 初の発生位置と等しい。もしｉが照会に現れないなら、ｈａｓｈ　ｔａｂｌｅ　 ［ｉ］はゼロに設定される。

”ｔｒａｎ−モジュール（図２０）は”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール２７１に呼 び込まれ、ｋ−ｔｕｐｌｅ（核またはシード）サイズの配列のハツシングを実行 する。もし、ｋ　ｔｕｐｌｅが存在すれば（即ち、その長さがゼロより大きい） 、変数ｕｎｓはｕｎｓ”ＡＬＦ＋ｐ２９１に等しく設定される。変数ｐは、被検 ヌクレオチドを表す”ｌｅｔ　ｄｉｇ“モジュール（図２１）によって戻された 数字を表す。ＡＬＦはこの実行において設定される常数であり４に等しい。次い で、照会ポインタは増やされ、一方、ｋ　ｔｕｐｌｅ　（そのシード）のサイズ は減らされる２９２ｏ続いてごｔｒａｎ”モジュールは変数ｃｕｒｒｅｎｔ−ｈ ａｓｈ　２９３を”―ｓｈｉｎｇ”モジュールに戻す（図１９）。

”ｌｅｔ−ｄｉｇ”モジュール（図２１）は、”ｔｒａｎ“モジュール２９１に 呼ばれ、プログラム処理がより容易になるよう、ＧｅｎＢａｎｋでキャラクタ″ Ａ”ごＴ”ご１１”ごＧ”及び”ｃ″で表されるヌクレオチドとユーザ照会を数 字に変換する。このモジュールは、”ａ”と”人”を”０”に３０１、”ｔ”Ｊ Ｔ”ごｕ”及び１Ｕ“を”ドに３０２、”ｇ”と”Ｇ”を”２”に３０３及び” Ｃ”と”Ｃ”を“３”に変換する３０５゜もし変換されるキャラクタが上記で記 録されたそれらの何れとも一致しなければ、モジュールは″−ド３０５に戻る。

”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール（図１９）は、それから、移動ウィンドウでハツ シュを更新する”ｕＩ）ｄａｔｅ”モジュール２７２（図２２）を呼び込む（即 ち、それは旧ハツシュを”ドだけシフトして新ハツシュを形成する）。ｐｏｗｅ ｒｊで分割されたｏｌｄ　ｈａｓｈが計算され３１１（モジュール操作）、剰余 にＡＬＦ３１２（即ち、４）を掛け、次いで、ヌクレオチドを表している数字を その結果に加える３１３゜次いで、”ｕｐｄａｔｅ”モジュールはその結果３１ ４を”ｈａｓｈｉｎｇ−モジュール（図１９）に戻す。

もし現在のハツシュが照会で既に発生しているなら、そのプログラムは現在のハ ツシュ２７３に関する関連リストの終端を探索し、現在のハツシュ２７３に関す る関連リストの終端を記録する。もし現在のハツシュが照会で未だ発生していな いなら、プログラムはそのハツシュをハツシュテーブルに入れる２７５゜得られ たハツシュテーブル及び関連リストは、次いで”ｋ−ｄｉｆｆ”モジュール（図 １８）　２５６に戻される。

”ａｓｓｅｍｂｌｙ“モジュール（図２３）はＧｅｎＢａｎｋから配列を抽出し 、ヒツト配置及び拡張機能を実行する。このモジュールは、もしユーザがマツチ を配置するためにデータベースを使えるよう既に選択しているなら、”ｋ　ｄｉ ｆｆ”モジュール（図１８）２６０に呼ばれる。”ａｓｓｅｍｂｌｙ″モジュー ル（図２３）の出力によって、ユーザは、検索されたデータベースの区域にはヒ ツト数■３２３で概略長さ５３２２のエントリ数Ｅ３２１が含まれていることを 知らされる。さらにプログラムによってユーザは、考慮された１−ｔｕｐｌｅｓ の数はＴに等しいことを知る。エントリヘッドラインも印刷される３２６゜　” ５ｅｑｌｏａｄ“モジュール（図２４）は、照会ハツシュテーブル及び関連リス トが”ｈａｓｈｉｎｇ”モジュール（図１９）によって作成されてしまうと”ｋ −ｄｉｆｆ”モジュール（図１８）　２５９に呼ばれる。”５ｅｑｌｏａｄ”モ ジュール（図２４）は、ＧｅｎＢａｎｋファイルの終端が到達したかどうかを調 べるためにチェックし３２７、もしまだなら、ヘッドライン３２８におけるＬＯ ＣＵＳで記録が見つかるまで探索する。次に、同定の目的のためＬＯＣＵＳ名が 抽出され３２９、そしてプログラムは記録の中に０ＲＩＧＩＮフイールドを検索 する。次いで、プログラムはＧｅｎＢａｎｋから現在の配列３３３を抽出し、各 配列に関し２つのパスを実行する。第一は、配列の長さを決め３３２、そして各 配列にメモリを割当てることであり３３３、第二のパスは、割り当てられたメモ リにその配列を読取ることである３３４゜抽出されている配列は、ＤＮＡヌクレ オチドかプロティン・ヌクレオチドを含んでいるので、”５ｅｑｌｏａｄ”モジ ュールはキャラクタ”Ａ”、ゴ、“Ｕ”、”Ｇ”及び”Ｃ”を認識することがで きる。塩基”Ａ”、ゴ、”Ｇ″及び”Ｃ”はＤＮＡ配列に使われ、一方、塩基” Ａ“、”Ｕ”、”Ｇ”及び”Ｃ″はＲＮＡおよびｍＲＮＡの配列に使用される。

抽出された配列は、次いでその配列に含まれるヌクレオチドの種類に応じて配置 され３３５、処理が繰り返される。配列の終端が到着すると、”５ｅｑｌｏａｄ ”モジュールは配列の長さ３３６を”３ｄｉｆｆ”モジュール（図１８）に戻す 。

もしユーザがマツチを配置するためにデータベースというよりはむしろ１つ以上 のファイルを使えるよう既に選択しているなら、”５ｅｑｌｏａｄ”モジュール （図２４）よりむしろ“ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図２５）が”ｋ−ｄｉｆｆ ”モジュール（図１８）に呼ばれる。

”ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図２５）はユーザ指定の照会ファイル３４１から 配列を読取り、メモリを割り当てる３４２゜このモジュールはまた照会の長さを 決め３４３、配列同定情報を抽出し３４４、配列の長さを決め３４５、“ｌｅｔ −ｄｉｇ”モジュール（図２１）を呼び出すことにより各ヌクレオチドを数字に 変換し３４６、”ｄｉｇ−Ｌｅｔ”モジュール（図２６）を呼び出すことにより 照会ハツシュテーブルを作成し３４７、全てが読み込まれたらファイル３４８を 閉じる。

まず最初に、”ｒｅａｄ　ｌ”モジュール（図２５）は照会３４２にスペースを 割り当てる。

これを実行するため、”ｃｋａｌＬｏｃ”モジュール（図２５）が３４２で呼ば れる。このモジュールは、スペースを割当て、そしてこの割当が成功したかどう かく即ち、十分なメモリがあるか、またはプログラムがメモリを越えてランして いないか）をチェックする。スペース割当後、”ｒｅａｄ　Ｌ”モジュール（図 ２５）は、ユーザ指定のファイル３４９をオープンしく”ｃｋｏｐｅｎ”モジュ ール（図２５）は３４９で呼ばれ照会ファイルが首尾よくオープンできることを 保証する３４９）　、照会の長さを決め３４３、ヘッドラインのＬＯＣＵＳで記 録を位置指定し、同定の目的のためにＬＯＣＵＳ名３４４を抽出し、０ＲＩＧＩ Ｎフイールドを記録に位置指定し、それからファイル３４１から照会配列を読み とる。次ぎに、配列の長さが決められ３４５、メモリが配列に割り当てられ３４ ２、その配列が照会ファイル３５０に読み取られる。もし文字列が予め見つかっ ていれば、処理は３４４に戻る。そうでなければ、照会ファイルの各キャラクタ がメモリに読み取られる３５０゜ キャラクタはごｌｅｔ　ｄｉｇ”モジュール（図２１）を使って、有効数字が見 つけられるまで数字３４６に変換され、続いて数字をキャラクタ”Ａ”３７１１ ゴ３７１、“Ｇ”３７３、”Ｃ”３７４及びデフォルトとして”Ｘ”３７５によ って表されるヌクレオチドに変換する”ｄｉｇｊｅｔ”モジュール（図２６）を 使って、照会を包含するハツシュテーブルが設定される。もしファイルの終端が 到達していないなら、処理は３４４に戻る。もし、していれば、ファイルは閉じ られ３４８、照会は３４７で”ｒｅａｄ　１”モジュール（図２５）に戻る。

”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール、図１７（図２３．３２５）は、現在の配列が ＧｅｎＢａｎｋから抽出されてしまった後、”ａｓｓｅｍｂｌｙ”モジュール（ 図２３）に呼ばれる。”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図２７）は、それが照 会とデータベースまたはファイル配列間の比較を行うということにおいて、ミス マツチモデルの中心的機能を果たしている。もしモジュールによって、長い（即 ち、ｍ１ｎＪｉｔ　ｌｅｎｇｔｈより大きい）拡張ヒツトの存在が見いだされる なら、それは”ドを”ａｓｓｅｍｂｌｙ”モジュール（図２４）に戻す。さもな ければ、”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図２７）は０“に戻る。

”（ＬｃｏＬｏｕｒ”モジュール（図２７）では、全てのＤＮＡの位置は次の方 法で解析される。

先ず、全部のＤＮＡ配列は、各位置がゼロに等しいかどうか（即ち、それは空（ カラ）であるか、または配列が完成しているかどうか）を調査するため解析され る３９１０もしゼロに等しくなければ３９３、”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール （図３０）は、ｋ−ｔｕｐｌｅｓのハツシングを実行する上述の”ｔｒａｎ”モ ジュール（図２０）を呼ぶ。“ｔｒａｎ”モジュール（図２０）は他のモジュー ルを呼ぶ：それらのモジュールは、プログラムによる処理がより容易になるよう 、キャラクタで表されているヌクレオチドを数字に変換し、続いて移動ウィンド ウによってそのハツシュを更新する。もしその位置がゼロなら、ｏｌｄ　ｈａｓ ｈ　３９０の１シフトの後、”ｕｐｄａｔｅ”モジュール（図２２）を呼ぶこと によりｃｕｒｒｅｎｔ　ｈａｓｈの位置をｎｅｗ−ｈａｓに設定する。

もしｃｕｒｒｅｎｔ　ｈａｓｈ位置でのヌクレオチドがゼロに等しいなら、処理 は３９１に戻る。

そうでないなら、照会位置は、現在のハツシュ位置−１でのヌクレオチドと等し くなるよう設定される。次に、“（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図２７）は、 ハツシュテーブルの中にｃｕｒｒｅｎｊｈａｓｈを捜す。もし現在のｋ　ｔｕｐ ｌｅが照会３９５と一致しなければ、次のｋｊｕｐｌｅが考慮され３９５、処理 は３９１に戻る。もし現在のに−ｔｕｐｌｅが照会と一致すれば、プログラムは 、”ｈｉｔ　ｅｘｔ”モジュール（図２８）を呼んでヒツトの（即ち、マツチの ）近辺３９６をチェックしてヒツトが弱いかどうかを決める。発明者は次のこと を発見している：即ち、もしモジュール”ｈｉｔ　ｅｘｔ“に関するコードが、 ＣＰＵのパラメータ転送機構２５９を利用する別のモジュールであるよりむしろ モジュール”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”内に含まれるなら、時間が節約できる。

”ｈｉｔ　ｅｘｔ”モジュール（図２８）は、ヒツト近傍の現在の照会位置を決 め４２１、ヒツト近傍にある現在のＤＮＡの位置を決め４２２、そして不一致位 置（即ち、ｍｉｓｍａｔｃｈｌｏｃａｔｉｏｎ−ａｈｅａｄ　４２３．　ｍｉｓ ｍａｔｃｈ　１ｏｃａｔｉｏｎ−ｂｅｈｉｎｄ　４２３及び核マツチ配置）のリ ストを作成する。もしもヒツトが弱いなら４２４、”ｂｉｔ−ｅｘｔ“モジュー ル（図２８）は”０”から”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図２７）に戻る。

もしヒツトが４２５を包含する機会があれば、そのモジュールは”ｌ”から”（ ＬｃｏＬｏｕｒ“モジュール（図２７）に戻る。もしｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｌｏｃ ａｔｉｏｎ−ａｈｅａｄ　−ｍｉｓｍａｔｃｈ−１ｏｃａｔｉｏｎ−ｂｅｈｉｎ ｄがｗｉｎ−ｈｉｔ−１ｅｎｇｔ■謔闡■ きいなら、ヒツトは包含する機会があり、それ故、弱いとは考えられない。もし そうでないなら、短いヒツトで弱すぎる。

もし”ｂｉｔ−ｅｘｔ”モジュール（図２８）が”（Ｌｃｏｌｏｕｒ”モジュー ル（図２７）にヒツトは弱くないと通知すれば、”（Ｌｃｏｌｏｕｒ“モジュー ルは、現在のヒツトは十分長いかどうかを３９８、”ｃｏｌｏｕｒ”モジュール （図２９）を呼び出して決める。”ｃｏｌｏｕｒ“モジュール（図２９）は、ｐ ｏｓ　ｑｕｅｒｙで開始し且ツｍｉｓｍａｔｃｈ−ｉｏｃａｔｉｏｎ−ａｈｅａ ａとｍｉｓｍａｔｃｈする。このモジュールに使用される変数が定義された後、 変数ｉｓｗＪｒｉｎｔ　（これはヒツト長を表示するスイッチである）はゼロに 初期化される４３０゜ｃｕｒＪｅｎｇｔｈは、次いで拡張ヒツトの長さに等しく 設定される４３１（ｍｉｓｍａｔｃｈ−Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｂｅｈｉｎｄ　［ｉ ］＋　ｍｉｓｍａｔｃｈ−１ｏｃａｔｉｏｎ　ａｈｅａｄ　［ｊコー１）。次ぎ に、もしｃｕｒ−１ｅｎｇｔｈがｗｉｎ−ｈｉｔ−１ｅｎｇｈより大きいかまた は等しいなら４３２（即ち、最小と考えられるプローブサイズ）、ヒツトは長い と考えられ、そしてｉｓｗＪｒｉｎｔは２に等しく設定される４３３゜ｉｓｗ　 ｐｒｉｎｔの値は、次いで”ＣＬｃｏｌｏｕｒ”モジュール（図２７）に戻され る４３４゜もし拡張ヒツトの長さがｍｉｎ−ｈｉｔ−１ｅｎｇｔｈより長ければ 、ヒツトは長いと考えられる３９９゜さもな（ば、ヒツトは短いと考えられる。

もしヒツトが短ければ、現在のヒツトに対してはこれ以上何も実行されず、モジ ュールは再開する。一方、もしヒツトが長いと考えられれば３９９、“（Ｌｃｏ ｌｏｕｒ”モジュール（図２７）は現在の拡張ヒツトを印刷する４００゜現在の 拡張ヒツトはＡＳＣＩ　Ｉで印刷され、バイナリファイルで印刷され、またはメ モリファイルに印刷される。次いで、”ｑ−ｃｏＬｏｕｒ”モジュール（図２７ ）は、その関連リストの終端が到達するまで繰り返す。

ｄ、　出力 ３ｄｉｆｆプログラムの出力は、拡張ヒツトの数とｋ　ｍｉｓｍａｔｃｈのヒツ ト位置（図３０参照）を包含するバイナリファイルであるか、または出力がファ イルに書き込まれないでメモリに保持されるかのどちらでもよい。より詳細には セクション１−（ｄ）（ｉｖ）参照。

３、　Ｈモールのプロ　−ムの９０ ａ、概説 この発明では、第二のハイブリダイゼーション強度モデルはＨサイトモデルと呼 ばれる（このモデルのユーザ選択については図１２参照）。Ｈサイトモデルに用 いられる式は、融解温度Ｔｍはプローブ長とパーセントで表した（社）含量の関 数であるという事実を表現している。この基本式は、ミスマツチの存在を説明で きるようこの発明で改善された。ミスマツチの各パーセントは、平均で１．２５ ℃だけ融解温度を下げる（ＡＴの不一致で２℃及び（社）の不一致で４℃）。

加えて、この発明の実行は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに関していくつかの予 備的処理を履行してｃＤＮ人配列配列類分けし選択する。これは各ＧｅｎＢａｎ ｋ記録にあるキーワード（この場合ＣＤ５）を置いて行われる。

この発明に包含されるＨサイトモデルの本実施態様には多くのモジュールがある 。Ｈサイトモデルに含まれる処理の各々のステップは以降により十分に説明され ており、詳細フローチャートが添付されている。

ｂ、入力 １）Ｈサイトモデルについて２つの基本的ユーザ選択入力がある（図１２参照） ：設計中のプローブに対する融解温度Ｔｍ　２２　（即ち、ユーザがシミュレー トすることを望んでいる特定の実験または条件に対応する融解温度）；及び２） 核形成しきい値２３（即ち、核形成部位を構成する塩基対の数）。ユーザはまた 下記項目を選択する必要がある：ｌ）プローブが設計されようとしている標的種 １１の遺伝子配列（ＤＮＡ、　ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）　；２）それによりハ イブリダイゼーションが計算される全配列のプリバレージョン１２　；　３）プ ローブ出カフアイル１３゜下に述べるようにプリバレージョン・ファイルは最も 重要である。

ｃ、Ｈサイトモデルのプログラムの構成この発明のＨサイトモデルのプログラム の実行は、多数のモジュールを包含する５つのファイルに分類される。主要ファ イルは、そのコンパイル解除バージョンにおいて発明者により“ｄｓ、　Ｃｐｐ ”と指定されている。このファイルは、全オリゴプローブ設計ステーションの発 明に対して包括的制御を提供するものである。それは６つのセクションに分割さ れている。セクション０は全体の変数を定義し且つ取り扱う。セクション１は、 全般的な変数の規定と初期化（配列及びメモリブロックを含む）を制御する。そ れはまたユーザ入力選択のためのバッファを読取りおよび書込み、多重バッファ を構築する。

セクション２は、種々の“５ｎｉｐｐｅｔ“変数を設定・初期化しく用語５ｎｉ ｐｐｅｔの完全な定義については下のセクションを参照）、塩基対の特質を９６ 塩基対の長さの表現に且つＡＳＣＩＩ塩基対鎖塩基交鎖し、そして５ｎｉｐｐｅ ｔを比較するといった配列ファイル処理を行う。このセクションはまた配列のフ ォーマットファイルを読取り、塩基対を読取り、配列の同定情報（例えば、０Ｒ ＩＧＩＮ及びｔ、ｏｃｕｓ）をチェック・抽出し、そして数字から始まる配列を 取り除くこともする。

セクション３は、プリバレージョンファイルの取扱いを含んでいる。このセクシ ョンは上述のＰＲＰに関する前処理を行う。また、５ｎｉｐｐｅｔフアイルを合 併・区分けし、ＰＲＰファイルを作り、それを種類別に分け、その分類された５ ｎｉｐｐｅｔを出力する。次に、このセクションはＰＲＰファイル全体を通して 流れる。

セクション４は、Ｈサイトモデルの処理に関する本質的コードを包含する（以降 で議論される、詳細については図３１−３３参照）。ストリーム（流れ）が設定 され、次いでＲＩＢＩの比較がハイブリダイゼーションについて実行される（Ｒ ＩＢＩの探索技術の定義についてはファイル”ｒｉｂｉ、　ｃｐｐ“参照）。次 ぎに、プローブが生成され、結合強度が融解温度に変換され、そしてハイブリダ イゼーション（ハイブリダイゼーション強度を含む）が計算・記憶される。最後 に、その他のＨサイトの計算が実行される。

セクション５は、診断ファイル及びユーザ・ファイルの出力（ｔｅｓｔ、　ｏｕ ｔ、　ｔｅｓｔｌ。

ｏｕｔ、及びｔｅｓｔ２、ｏｕｔファイル）を書式化し且つ提供することに関連 している。このセクションはまた作図機能（特に、ＭＰＳＤダイアグラム）を扱 う。加えて、このセクションはＨサイトモデルの候補プローブに関するヘアピン 特性を計算する。

”ｄｓ、　ｈ”と指定された第二のＨサイトモデルのファイルはデータ変数及び 構造を規定する。このファイルのセクションｌは遺伝子のデータ構造（メモリブ ロックと配列、およびファイル入出力を含む）に関連する。セクション２は、配 列、プローブ及びハイブリダイゼーションに関連して用いられる変数と構造を規 定する。セクション３は、プロトコル（すなわち、機能原型、作図等）に関連し た変数と構造を規定する。

”ｆｕｎｃｄｏｃ、　ｔｘｔ“と指定された三番目のＨサイトモデルのファイル は、このＨサイトモデルプログラムの実行に関する非常に詳細な文書を包含する 。多数の変数及び構造も規定される。プログラムの流れはこのファイルにはっき りと示される。

”ｒｉｂｉ、　ｈ”と指定された四番目のＨサイトモデルのファイルは配列の比 較を扱う。

”ｒｉｂｉ、　ｃｐｐ”と指定された四番目で且つ最後のＨサイトモデルのファ イルは、内部のＢ−Ｔｒｅｅの指標付けを実行する。赤−黒白部バイナリインデ ックスーＲｅｄ−ＢｌａｃｋＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｂｉｎａｒｙ　Ｉｎｄｅｘ（Ｒ ＩＢＩ）−検索の定義は、このファイルに見られる。定義には次の項目について も含まれる二概念適合セット、インデックス、バイナリ・ツリー、内部バイナリ インデックス、経路、及びレッド−ブラック・ツリー。実行ノートもこのファイ ルに含まれる。

ｄ、　処理 この発明のＨサイトモデルの実行は、３段階で行われる。先ず、発明では、配列 のデータベースから得られる全ての関連情報を包含するプリバレージョン（ＰＲ Ｐ）ファイルが作成される。これは上述の前処理段階である。次に、プログラム によって標的が準備される。最後に、発明によって、ＰＲＰファイルと標的配列 を利用してＭＰＳＤが計算されプローブが見つけ出される。

１、才　プリパレーシ　ンフ　イルの 図３１、ステップ１ニブログラムは、先ず、メモリに読込むため配列のデータベ ースをオープンする４６１．４６２゜ステップ２：次に、４６２で配列の塩基対 が読込まれるにつれ、”５ｎｉｐｐｅｔ“が遺伝子座情報と共にディスクに記憶 される４６３゜”５ｎｉｐｐｅｔ”はプリバレージョン配列のうちの長さが固定 された部分配列である。５ｎｉｐｐｅｔの目的は、ユーザがプリバレージョン配 列の小部分をその周辺の塩基対と共に検討できるようにすることである。この発 明の実行において５ｎｉｐ〆ｔは９６塩基対の長さである（配列の末端と先端近 くにある５ｎｉｐｐｅｔを除く−ここでは塩基対が他の部分より少ないはずであ る）。５ｎｉｐｐｅｔの“起源”は４０の位置である。配列の先端近くでとられ た５口１ｐｐｅｔについては、最初の４０塩基対のい（つかは不確定である。配 列の末端近くでとられた５ｎｉｐｐｅｔについては、最後の５５塩基対のいくつ かは不確定である。

５ｎｉｐｐｅｔはプリバレージョンファイル（ＰＲＰ）に分類順に（４０位置で 始まる辞書式順序で）配列される。この発明では、用語”辞書式順序”は、アル ファベット、数字または英数字のような前もって選択された順序を意味する。空 間を保存するため、５ｎｉｐｐｅｔはプリバレージョン配列の４番目の位置毎に 取り出されるだけである。

ステップ３：　５ｎｉｐｐｅｔは、”スクリーン”を通過する配列について迅速 に検索できるよう合併分類されている４６４（以降で議論）。ステップ４：合併 されたファイルは５ｎｉｐｐｅｔの出所に関する識別名については決まっていな い４６５゜これはハイブリダイゼーションが起こる遺伝子座を同定するため行わ れる。

ｉｉ、標的の調製 図３２、ステップｌ：標的配列ファイルがオープンされ、メモリに読み込まれる ４７２゜標的ｍＲＮ＾の各位置に関しては、そのスタート位置で定義されたプロ ーブはその位置で始まる最も短い部分配列であって、そのハイブリダイゼーショ ン強度はユーザ指定の融解温度Ｔｍより大きい。代表的には、プローブは１８か ら５０の長さである。ステップ２：”スクリーン”について４つのファイルが作 成され４７３．４７４．４７５゜その各々は１塩基対づつシフトされるもので、 釦１ｐｐｅｔは４塩基対毎に取り出されるという事実に対応する。スクリーンは 、ユーザによって定義されたスクリーニングしきい値と等しい長さの標的ｍＲＮ Ａの部分配列である。次いで、スクリーンは索引が付けられ４７６、メモリに分 類される４７７゜ｉｉｉ、　ＭＰ則ｆニク少肚算 図３３、ステッ、プ３：このステップはプロセスの心臓部である。ステップ３ａ ＝プログラムは次の５項目を同期して流れ、それらを順番に検討する：　５ｎｉ ｐｐｅｔフアイル及びスクリーンの４リスト４８１−４８４゜ステップ３ｂ：各 ５口１ｐｐｅｔはスクリーンと比較される４８５゜ステップ３Ｃ：　もし５ｎｉ ｐｐｅｔが一致しなければ、後のどちらかの流れが進められ４８６、そしてステ ップ３ｂが繰り返される。もし５ｎｉｐｐｅｔが一致していれば、ステップ４が 実行される。

ステップ４：もし５ｎｉｐｐｅｔ及び一致スクリーンがステップ３ｂで見つかっ ていれば４８７．５ｎｉｐｐｅｔを含む配列とスクリーンを含む全てのプローブ との間の結合のハイブリダイゼーション強度は計算される（ステップ５参照）。

プローブを含む最初のマツチスクリーンに対してのみこれを行うことによって二 重計数は防がれる。各塩基対は検討され、数値による結合強度が指定される。訂 対は比較的低い融解温度Ｔｍを有するので、ＡＴ対はに対よりも低い結合強度が 指定されよう。この処理はさらに詳しく下のステップ５ｂで説明する。

ステップ５：　配列とそれを含む全てのプローブとの間のハイブリダイゼーショ ン強度は、ダイナミック・プログラミングプロセスを使って計算される。そのプ ロセスはつぎの通りであるニステップ５ａ：与えられたスクリーンを含むがその 他のスクリーンはどれも含まない第一プローブであって、より早い位置がらスタ ートし、またその配列と一致する第一プローブの位置で始める。これは二重計数 は防ぐために行われる。２つの実行総和は維持される：ａ）結合強度（これは、 もし配列とプローブがすべての塩基対に対して現在の位置の右方向に正確に一致 するものとすれば生ずるであろうハイブリダイゼーション強度を表す）、及びｂ ）非結合強度（最大限に結合する領域の強度を表す）。ステップ５ｂ：各々の新 しい塩基対で、変数ｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈは、もし配列とプローブが一致 し且つ一致した塩基対が闇なら７１だけ増やされ４８９、もしマツチした塩基対 がＡＴなら３０だけ増やし４９ｏ（即ち、この数は最初の数７１の約４２．２５ ％である）、もしマツチがないなら７４．５だけ減らす４８８（即ち、この数は 最初の数７１より約５％大きい）。ステップ５ｃ：もし現在の結合強度（ｂｏｕ ｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈ）が現在の非結合強度（ｕｎｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈ ）を越えるなら４９１（これは元はゼロに初期化された）、新しい結合領域が見 つかっており、ｕｎｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈはｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈ に等しくなるよう設定される４９２゜ステップ５ｄ：もし現在のｂｏｕｎｄＳｔ ｒｅｎｇｔｈが負なら、ｂｏｕｎｄＳｔｒｅｎｇｔｈをゼロにリセットする。ス テップ５ｅ：　もし現在の位置がプローブの末端にあるなら、その結果（ハイブ リダイゼーション強度）はそのプローブについて記録される。ステップ５ｆ：も し現在の位置がスクリーンを含む最後のプローブの末端にあるなら、プロセスは 停止する。

ステップ６：記録は各候補プローブに関しマツチの数と融解温度、及び最良の２ ０候補の配置について優先順位付き待ち行列を使って保持される（ハイブリダイ ゼーション強度の数値による順序の逆）４９４゜ステップ７：数値”スコア”は 、各ブリバレージョン配列について、各一致に関する量のｅｘｐ（これはΣｅ− Ｔ　ｓと表現可能）を記録することにより保持され４９５、ここでＴｍは”完全 な”マツチ、プローブそれ自身に関する融解温度である。換言すれば、プローブ はそれ自身の標的と”完全に”ハイブリダイズする。

ステップ８：ヘアピンは、先ず相補的なプローブを計算することにより計算され る。換言すれば、候補プローブにおける塩基の順序は逆にされ（ＣＴＡＴＡＧか らＧＡＴＡＴＣ）、モして相補的な塩基対は置換される（Ｔの代わりにＡＳＡの 代わりにＴ、　Ｃの代わりに０１及びＧの代わりに０１上記の例ではＧＡＴＡＴ ＣからＣＴＡＴＡＧに変わる）。次ぎに、候補プローブに関する最大ヘアピン長 を表す変数は、その変数がヘアピンの距離を表すときは、ゼロに初期化される。

各オフセットにつき、元の候補プローブと全作成された相補性のプローブは互い に整列させ、そして比較される。それから最長の一致を見つける。もしどれか２ つのマツチが等しい長さを有するなら、その時は最長のヘアピン距離（即ち一致 しているのを引き離す塩基対の数）をもつものを保存する。

ステップ９：ブリバレージョン配列は次ぎに記憶され４９６、最高から最悪の等 級順に表示される４９７゜ステップ１０：次いで、結果として得られた金工Φ候 補プローブを含むＭＰＳＤがスクリーン上に表示される。ステップ１１：最良の ２０マツチもユーザの要望に応じ等級順に印刷または表示される４９７゜ｅ、出 力 Ｈサイトモデルの出力は、上記１（ｄＸｉｖ）項で十分記述されており、また、 図１４−１６で説明されている。Ｈサイトモデルによって作成された２つの出力 ファイルの例を図３４Ａ、　３４Ｂに示す。

４、ミツハシプローブ　−ム　の！■ ミツハシプローブ選択ダイアグラム（１！ＰＳＤ）がＨサイトモデルプログラム によって計算されると（上述の３項及び図３３参照）、このデータを画素フォー マットに変換し図形をプロットする必要がある。このプロセスの概要は図３５に 示されている。

先ず、プログラムは出力（ｘｙ）範囲を計算する５００゜次ぎに、対数目盛りに 変換される５０１０次いで、その値は補間され５０２、ビットマツプが作られる ５０３゜最後に、そのビットマツプはＭＰＳＤのフォーマットでスクリーン上に 表示される５０４（上記１（ｅ）（１）にて議論）。ＭＰＳＤの例を図１４に示 す。

５、　Ｍａｔｃｈｌｎｆｏウ　ン′ウ　の！口Ｐｒｏｂｅｌｎｆｏ　（プローブ 情報）およびＭａｔｃｈｌｎｆｏ　（ｖ　ッチ情報）ウィンドウは１（ｅ）（１ １）節においてきわめて詳細に議論されており、これらのウィンドウの例が図１ ５に示されている。Ｍａｔｃｈｌｎｆｏのウィンドウ部分を作る際に含まれる処 理の概要は図３６のフローチャートに与えられている。先ず、ユーザがＭＰＳＤ のカーソルを動かすと（ＭＰＳＤウィンドウを二重する垂直線のように見える） ５７０、プログラムはカーソル位置の下に示されている候補プローブを更新する ５２１゜次ぎに、候補プローブの位置に基づいて、そのプローブに関する配列５ ２２とヘアピン情報５２３を更新する。この更新された情報は、次いで、Ｍａｔ ｃｈＩｎｆｏウィンドウに示された更新−マツチリスト５２４上に表示される。

ＸＶＩｌ、検坦土ヱ上 本発明は、生物試料に含まれる生物、感染性作用物質又は生物学的成分を検出す る測定キットとして、好ましくは実施されうる。そのようなキットは、当業者に 明らかなように種々の形態をとりうる。

一つの実施態様では、本発明は、生物試料中の特定の種の真菌同定するキットを 含む。そのようなキットは上記したように、少なくとも一つの特異的プローブ及 び一つの共通プローブを含む。好ましい実施態様では、多くの特異的プローブを 含み、それらのプローブは好ましくは一つの又は複数の固体支持体に固定化され ている。もっと好ましい実施態様では、多くの特異的プローブのそれぞれは、異 なる固体支持体に固定化される。例えば、多くのウェルをもつマイクロタイター プレートは、ウェル各々に異なるポリヌクレオチドプローブをもつことができる 。もしそのようなプローブがいろいろな種の真菌のリポソームＲＮＡに特異的な 配列を含むなら、そのキットは生物試料における多くの真菌の存在の試験のため に使用できる。

固体支持体としてマイクロタイターウェルを用いるそのようなキットの例は、図 ６に図解的に示されている。この図では特定の真菌（この場合、Ｃａｎｄｉｄａ 　ａｌｂｉｃａｎｓ）のリポソームＲＮＡの存在は、陽性を示すため黒（示され たウェル５６中で検出される。陰性対照を供するため、ウェル５２はプローブが 何ら固定化されていない。一方、ウェル５４には、試験対象の真菌のリポソーム ＲＮＡに存在する配列に相補的である配列番号１のような共通プローブがその壁 に固定されている。この例におけるウェル５６あるいは他のウェルで十の結果が 得られるとき、ウェル５４はいつでも＋の結果を示すべきであるので、これは陽 性対照となる。

ウェル５４はまた、特異的ポリヌクレオチドプローブで探査される特異的リポソ ームＲＮＡを含まない真菌の存在を検出する手段を提供する。例えば、ウェル５ ６で使われたプローブに相補的な特異配列をもたないムロｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ ａｎｓの変異株が、図６に示されるキットで試験される場合に試料中に存在する ならば、ウェル５６は十の結果を示さないであろう。しかし、その変異株がウェ ル５４で検出される共通配列に変異−ウェル５４の壁に固定化された共通プロー ブへのその配列のハイブリダイゼーションを干渉する変異−を含んでいない限り 、ウェル５４は真菌病原体の存在を示すであろう。

特異的プローブ、共通プローブ及び固体支持体に加え、他の成分を本発明のキッ トに含ませることができる。例えば、キット中のプローブにＤＮＡ又はＲＮＡを ハイブリダイズさせるに好適な緩衝液である。上述したように、共通プローブに 結合させた標識も取り込ませることができる。

別の実施態様においては、先に述べたようなＰＣＲプライマーをキットに含ませ ることができる。そのようなキットは、本発明方法によって同定された一つの共 通プライマーと一つの特異的プライマー、二つの共通プライマー、あるいは二つ の特異的プライマーを含むことができる。本発明のキットの実施態様において、 逆転写酵素、ＴａｑポリメラーゼのようなりＮＡポリメラーゼ、又はｄＮＴＰ類 のような他の成分を含むことができる。

本発明のキットの先の実施態様は、ＰＣＲを同様に伴う本発明方法の実施に適用 できる。この実施態様では、キットは更に逆転写酵素及びポリメラーゼ、好まし くは、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのように５０℃以上の温度でかなりのポリメ ラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、を含む。

ＸＶＩＩＩ　結論 ここで記述された文献は全て、明らかにこの文献によってここに取り込まれた。

この発明は種々の局面の例示的実施態様に言及しながら述べられているけれども 、これらの実施態様は発明を単に例示的に説明することを意図するものであって 、制限することを意図したものではない。したがって、本発明の概観は添付の特 許請求の範囲を参照して決定されるべきものである。

表１　微生物用共通プローブＣＣｏ論−３９２）京りリア′トコ、カス・ネオ７ ｒｋマンスｃｐ■＾２“°゛°°゛°°゛“°°°“、クノテ・イオテ・ス、イ ニティスＣ０ＩＤ＾３°゛゛°゛°°°゛°゛°°°°°。

＊　Ｃ０１ｌ−３９２はＧｅｎＢａｎｋに登録されている１０７個の興なるｒＲ ＮＡ間で同−表■、微生物用共通プローブ（Ｃｏｗ−４１９）本コクノテ°イオ テ゛ス・イミティスｃｏｃｏ＾２３・・・・・・・・・・−・−・・・・・フ” ラストフイセス・テ゛ル７ティテ０イス１ＬＯ１）＾２４°°°゛′°“°“γ ゛°゛゛零Ｃｏ１１−４１９はＧｅｎＢａｎｋに登録されている１２３個の興な るｒＲＮＡ間で同−表ｍ・微生物用共通プローブ（Ｃｏｗ−１２０５）　車Ｃｏ ａ−１２０５ ｆｌ　ＧｅｎＢａｎｋ名配列番号ＡＣＣＧ。ＣＡＡＡＣｒＣＡＣＣＡＣＧクリγ トコッ鳥ス９本オフ虐ルマ７ス。ＰＣＤＡｉ２−＝−−０−０−−−−、、、、 −。

コクンテ゛イオテ１スーイ；ティス。。、。Ａ４３−−−−−＝＝＝−−フ゛ラ ストマイセス・テ゛ルマテ４テ°シス１ＬＯＯＡ＆＆−、、−＝−、、、、、。

零Ｃｏａ−１２０５はＧｅｎ［ｍｎｋに登録されている４２個の興なるｒＲＮＡ 間で同−表■・微生物用共通プローブ（Ｃｏｗ−１５４４）　本Ｃ飾・１５４４ ＄１　ＧｅｎＢａｎｋ名配列番号ＴＣＧ＋ＣＣｔＣＣＣＣＡ＋ＡＣＡＣＣクヮフ ０トコ、カス・本オフォルマノスＣＰＣＤＡ６２−−−−−−−−−−−−１− コクンテ゛イオテ゛ス・イミテイス。。１゜Ａ６３．−９１００．７−−−−− ”！Ｖ　二ｓ！ｙゴカス・カリニ−用プローブ（Ｃａｒｉ−６８５）＊５ｅｑｕ ｅｎｃｅ　Ｃ＠ｒ＋・６８５ 種ＧｅｎＢａｎｋ名配列番号ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣクリア“ト コフカス゛ネオフオルマンスＣＰＣＤＡ８２．Ｔ−ＣＧＩＩ、Ｃ０１，Ｇ−−− −ＡＴコクシテ゛イオテ゛ス°イミテイス　。。ＩＯＡ　８３　Ａ−ＣＴＧＧ□ −−−−０−−Ｇ、Ａフ゛ラストマイセス・テ゛ルマティテ゛イス８Ｌ（Ｘ）Ａ １１４Ａ−ＣＴＧＧＴ−−−−０−１Ｇ−Ａ表■、ニエーモコフシス・ｋリニー 用プローブ　（Ｃａｒｉ−１０５Ｂ）クリア′″トコフ烏ス・本オフ＃ルマンス 　ＣＰｃＤＡ　１０５　−＝−−−０Ｃ０−ＣＬ−−−ＩＡＡｌに一−１３クシ テ１イオテ９ス０イミテイス　Ｃ０１Ｄ＾　１０６　・・・・・・・Ｇ・−Ｃ＾ ・−−Ａ＾＾ＴＴ−Ｔ７＋ラストマイセス吋１ルマテイテ６イスＢＬＯＯ＾＋０ ７−−−−−・・Ｇ・−Ｃ＾・・・Ａ＾＾ＴＴ−一丁表■、　アスヘ６ルキ゛ル ス用プローブ　（八５ｐ−６９３）クリブトコフカス°不オフオルマンス。１． 。Ａ１２１１ＭＣＡＣＡｌ２１ｌ、Ａ−−−−ＣＣＡコクシテ゛イオテ゛ス・イ ミティス　、。、。Ａ　１２９　−−−−−９−−−−−０−ＣＴ、−−−７゛ ラスＦマイセス・テ゛ルマテイテ゛イス８ＬＯＣＩＡＩ３０−Ｃ−１−−−Ａ− Ｇ−Ｃ８−−−−■、　ＧｅｎＢａｎｋで最も相同性の高いｌｆｆｌＪ表Ｘ、７ ’うｘ＞ｔイヤス用プローブ　（Ｂｌａｓｔ−１０４６）クリア゛トコラカス゛ 本ｔ７＋ルマンス　ＣＰＣＤＡ　＋９７　−ＧＴ、ＡＡＡ−−−−−−ＯＡＴ− −−−Ｇコクシテ゛イオテ゛ス”イミテ４ス　Ｃ０ＩＤ＾　１９８　−−−−一 ・Ｃ＾＾・・−ＴＧ＾・・＾・・・７′ラストマイ七スーテ゛ルマテイテ゛イス 　８Ｌ００＾　１９９　・−・・・−ｍ−−・・・−・−・・−−−・＋１．　 Ｇｅｎｔｌｉｎｋで最も相同性の高い配列、ｆｉＸｌ、ｈ７ｆ”　イタ１用フ＋ ｏ−７”　（Ｃａｎｄ−５１３）クリア１トコフカス・本オフォルマンスＣＰＣ ＤＡ３５Ｂ−−−−−−−０−Ｔ−９−−１Ｃ−−−−−−−−−−コクンテ゛ イ倉テ゛ス・イミテイス　、。＋ＤＡ　３５９−−−−−０−９．Ｔ、−−−− Ｃ−０−−−−−０−−ブラストマイセスーテ゛ルマテイテ゛イス　ＢＬＯＤＡ 　３６０　−−−−−−−１−Ｃ−−−−−Ｃ−９−−−−−−−−１１、Ｇｅ ｎＲａｎｋで最も相同性の高い配列表Ｘ（１，ｂ７ｆ’＜夕′用プローブ（Ｃａ ｎｄ−７０１）７久へ１ルＶルスリマに１クス＾５ＩＩＣＩＡ３８６＾１＾・− ・＾・−・・・・＾ＣＧ・丁ＧＭフミ「タス　＾＄１１１１１５１１　３ａ９　 ＾１＾−−−＾−・−・・・＾ＣＧ・ＩＧＡＡＨｍ、ｓりｌテ゛イオテ゛ス用プ ローブ（Ｃｏｃｃ−５５９）クリア゛トコ、カス、本オ７オルマンスＣＰＣＤ＾ ２６６・Ｃ・・＾・−・＾−−−−−・・・コクンテ゛イオテ゛ス、イミティス ｃｏｃｏ＾２６７・−・−・・・・・−一−・・・−−−、ＩＬＯＯＡ　２６６ 　−Ｃ−Ａ−Ｃ−−−−−−−−−−７゛ラストマイセス・テ゛ルマテイＴイス ｎ、　ＧｃｎＢａｎｋで最も相同性の高いＩ’ｌＵ１１表ＸＩＶ、）クシオテ゛ ４Ｘ用プローブ　（Ｃｏｃｃ−１０５０）コクシテ゛イオテ゛ス・イミティス　 Ｃ０ＩＤＡ　２９０−−−−”°°°°°゛°°°”°°°°°。

７”ｔＸ）？４ｔＸ、ｊ”Ｍｆｖｔ’イＸ　”ａＯＡ　２９’　°−＋ＩＴＴ° −ＡＴＧ−Ｇ曲−−−−表ｘｖ、クツー−トコフカス用プローブ　（Ｃｒｙｐ− ６９１）クリ０トコフカス・本オフＩルマンスＣＰＣＤＡ３１２−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−コクンテ゛イオテ゛ス°イミテイス　Ｃ０ＩＤ Ａ　３１３　Ｃ−−−−−−１ニーＣＴ（ｉ−ＡＣ−−−−Ｃ−−７゛ラストフ イヤス拳テ゛ル７テイテ゛イス！ＥＩＬＯＯＡ３１＆ｃ＋＋−−＋−ａ−ｃｃｃ −＾ｃ・−−＋ｃ＋−１１、ＧｃｎＢａｎｋで最も相同性の高い配列表ＸＩ　ｊ ｕｎ共通７ノデセノスブライマ＝（＾５１１３２−２．配列番号７２９）ヒト マウス ラット Ｃ：ｃｈｋｊい１６５９　４３８　・・・・・Ａ・・Ｔ・・・−・・・・・Ｃ・ ・−ウズラ Ｃ：ｑｕｌ　ｊ−Ｌ３７ｓ　４３９　・・・・・＾・・１・・・・・・・・・Ｃ ・・・ノ１ウノ）つへ′工 Ｃ：ｄｒｏｊｕｎ＋２２７４４０−−＾−−−−＝−−ＧＣ−Ｃ＝Ｃ−−−表Ｘ ＩＸ、　ｊｕｎ−１９異的プローブ（Ｂ−１２５８，配列番号７３０）Ｂ＋２５ ８＋５’・３’１ ｃｃｒｌＩ３ａｎｋ名　５ｉＪ１４１号ＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧ表 ＸＸ、Ｃ−ｊｕｎ特異的プローブ（Ｃ２１１１７）Ｃ２＋４７．ＤＮＡ 号７・タイツ・　ＧｅｎＢａｎｋ名　配列番号　ＣＣＡ（にＧ（ＣＡＡＣ＾丁ｃ ｃ＋ｃ表ＸＸＩ　ヒトｊｕｎ−Ｘ°異的プローブ（ＩＩＬＩＭＩ）９６５）表Ｘ Ｘｎ、　ツウ１ｉｕｎ−０特興的プローブ（ＭＵＳＤＩ０６３）表Ｘ１１．Ｇタ ンパク質共通プライマー（ＧＳ−２）Ｇ２・Ｓ ｆｉ＋７１１番号ＡｃｃＡｃｃＡＴＴＩ：ＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣ＾表λλＩＶ 、Ｇタンパク共通プライマー（Ｇ４−＾Ｓ、配列番号７３１）表ＸＸＶ、Ｇ１− １タノハ　ｔ１１ンＩ′、Ｉｌ゛ハ　ヒト　ラフト共通プライマー（Ｇｉ−ｌ） ラット 表ＸＸＶ１．　Ｇ１−２？７八”り特異的、　Ｌ）−ｔブ）共通７°ライ７−　 （Ｇｉ−２）表ＸＸＶｒ１．　Ｇ１−３タンバり特ｙく的、　ヒト−ラフト共通 プライマー（Ｇｉ−３）６１・３ 翫ソリ番号　ＴＣＴＴＣＣＧＡＣＧＡＣ，＾ＧＩＧ＾＾（ＩＡｃ表ｎ■、Ｇｓタ ン八へ特異的、　ヒト−ラフト共通プライマー　（Ｇｓ、配列番号７３２）Ｇｓ ２列番号ｕ＋ＴＣＴＡＴＣＡＧＣＡＴＣｉＣＣＡＡＧｌｌ；ＣＧｓ　成剤ＧＮＰ ＡＳ 表ＸＸＩＸ、ＧＯタンハ”舛、￥異的、ヒト−ラフト共通フライマー（Ｇｏ）Ｇ 。

酉クリ番号　ＣＴＣ，Ｃ＋＋ＩＣＩＣＣＣＡＩＧＡＩＧＣＧラット 特表千７−５０９３６１　（３８） ＦＩＧ、１ Ｕ９３７細胞 ＃１　＃２　ＲＰ　Ｐ　Ｆｒ　（−）り０−７１１１．２＝ＲＮａＳＣ４ｙｂビ ター　調製物＃１＝ＶＣＲ＋Ｐ十Ｒ ＃２＝　ｖ　ＣＲ＋Ｐ Ｒ＝ＲＮａｓｉｎ Ｐ　＝７°０テ（ナーセ′Ｋ Ｆゴ゛　＝）Ｙ−ストトラックσｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ＦＩＧ、ＩＡ ＦＩＧ、ＩＢ ＦＩＧ、ＩＣ １０３ｘｌＯ１０３ｘ　ｌｏ−４１０−３Ｙｏｙｏ−１の希釈率 （ｎ＝６）　（ｎ＝６）　（ｎ＝６）　（ｎ＝６）　（ｎ＝６）５回の実験結果 ｃＤＮＡクローン ｊｕｎ−Ｄ　ｃ−ｊｕｎ　ｊｕｎ−Ｂ マーカー Ｇｏ　Ｏｓ　Ｇ１−３　Ｇ１−２　Ｇ１−１　（０，６Ｘｂ）マーカー Ｇｏ　Ｇｓ　Ｇ１−３　Ｇ１−２　Ｇ１−１　（０，６Ｋｂ）Ｆ工Ｇ、７ ＦＴＧ、７Ａ 固定化オリ丁ヌクレオｆド 固定化オリ〕゛ヌタレオ丹゛ ＦＩＧ、７Ｃ （−）　ｊｕｎ−Ｂ　ｃ　−ｊｕｎ　ｊｕｎ−Ｄ固定化オリコ゛ヌクレオチド′ Ｇ１−１　や＋　や　＋＋　＋　＋。　＋　＋＋　や　＋＋　＋＋＋Ｇ１−２　 ÷　＋　＋＋＋　＋＋　＋　＋＋　＋＋＋　４４４　＋＋◆Ｇ１−３　＋＋◆　 ＋＋＋＋＋÷　＋　＋＋　本　十＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋Ｇｓ　＋＋＋　＋ ＋＋　＋＋＋　＋　＋＋　＋　＋＋　ｃ＋＋　＋＋＋　＋＋＋Ｇｍ　＋＋＋　＋ ＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　＋＋十＋＋＋１　２　３４　 ５６　ｊ８　９１０１ａｎｅＦ工Ｑ、８ Ｇｏ　Ｇｓ　Ｇ１−３　Ｇ１−２　Ｇｉ−ＩＰＫＩ　ＰＫＩ　ＰＫＩ　ＰＫＩ　 ＰＩＣＩＦＩＧ、９ ＩＭ９　Ｊｕｒｋａｔ ＦＩＧ、１０ Ｆ塁６．１１ 士 ＦＩＧ；、１６ ＦＩＧ、１６八 ＦＩＧ、１６Ｂ ＦＩＧ、１７ Ｆｌに−ｔａＡ Ｆｌに、１９ Ｆｌに−２０ Ｆｌに−２１ Ｆｆ（，２２ Ｆｌに−２３八 Ｆ　Ｉ　Ｇ　＋　２３Ｂ Ｅｌに、、＋。

Ｆｌに、２４Ｂ ＦＩＧ−２ｓｈ Ｆ　Ｉ　Ｇ　＋　２５Ｂ Ｆｌに、２Ｇ Ｆｌに、２１１ ＦＩＧ　３０ ＦＩＧ、２９ ＩＣ−ｔ１ Ｆｌに、３２ Ｆｌに−３３八 Ｆ　Ｉ　［；　−３３Ｂ Ｆｌに−３３Ｃ Ｆｌに−３３０ 部分ファイル　、　、　１９０ページのうちの１ｏベーンＡリゴプロープ設Ｚ１ スアー／シ／ プローブ　：ｃ：＼ＩＩＩＴ八Ｃ１１へ＼ＩＩＵＭＩＩＪＵＩＩＸ、ＣＤ５作成 　、ｃ：＼ＩＩＩＴＡＣＩＩＩ＼ＪＵＮＭＩＸ、　ＰｎＰト皇ス位ｒｎ　Ｔｍ　 ローカッ、位置　細　１１１位ｒｎ　ｒＦａＦｌに−３５ ＦＩＧ；−３６ ｒｘｃ、３７ ０−カス　ＨＵＭＢＪＬＩＮＸ　１０４４　ｂｐ　ＤＨＡ塩基カウント起点１９ ５Ａコロ８ｃ３４ｏＧ１４１Ｔ１９−ＤＥＣ−１９９１ＦＩ０．　３８八

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下のステップを含む、ポリヌクレオチドを含む生物試料中の生物、感染性 の作用物質、又は細胞もしくは生物体中の生物学的成分の存在を検出する方法： （ａ）第１ポリヌクレオチドプローブを固体支持体に固定するーここでは、第１ ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列はその生物、感染性の作用物質又 は生物学的成分中の分析対象ポリヌクレオチドに含まれる第１ヌクレオチド配列 に十分に相補的であり、その第１ポリヌクレオチドプローブはその生物、感染性 の作用物質又は生物学的成分中の分析対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 にハイブリダイズできる； （ｂ）試料中に存在するポリヌクレオチドを第１ポリヌクレオチドプローブと接 触させる； （ｃ）分析対象ポリヌクレオチドが試料中に存在すれば、試料中の分析対象ポリ ヌクレオチドを第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる；（ｄ） 試料からの分析対象ポリヌクレオチドが第１ポリヌクレオチドプローブにハイブ リダイズしているならば、その第１ポリヌクレオチドプローブにハイプブダイズ している分析対象ポリヌクレオチドに第２ポリヌクレオチドプローブを接触させ る；ここで、第２ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、その生物、 感染性の作用物質又は生物学的成分の分析対象ポリヌクレオチドに含まれる第２ ヌクレオチド配列に十分に相補的で、第２ポリヌクレオチドプローブは第２ヌク レオチド配列にハイブリダイズできる；（ｅ）分析対象ポリヌクレオチドが第１ ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズしているなら、第１ポリヌクレオチ ドプローブがハイブリダイズしている分析対象ポリヌクレオチドに、第２ポリヌ クレオチドプローブをハイブリダイズさせる；そして、 （ｆ）第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズした分析対象ポリヌクレ オチドの、そのポリヌクレオチドにハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドプ ローブの存在を検出することによって、試料中の先物、感染性の作用物質又は生 物学的成分の存在を定量する。 ２．第２ポリヌクレオチドプローブのＴｍが、第１ポリヌクレオチドプローブの Ｔｍと同じか又はそれより低い請求項１記載の方法。 ３．第２ポリヌクレオチドプローブのＴｍが、約４８℃から約６０℃の範囲であ る請求項１記載の方法。 ４．試料からの分析対象ポリヌクレオチドの第１ポリヌクレオチド配列が、多く の生物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に共通なも のである請求項１記載の方法。 ５．試料からの分析対象ポリヌクレオチドの第１ポリヌクレオチド配列が、特定 の生物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に特異的な ものである請求項１記載の方法。 ６．第１ポリヌクレオチドプローブの配列が、特定な種の真菌に特異的なｒＲＮ Ａ配列に相補的である請求項４記載の方法。 ７．試料からの分析対象ポリヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列が、多くの生 物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に共通なもので ある請求項１記載の方法。 ８．第２ポリヌクレオチドプローブの配列が、多くの種の真菌に共通なｒＲＮＡ 配列に相補的である請求項７記載の方法。 ９．試料からの分析対象ポリヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列が、特定の生 物、感染性の作用物質又は、細胞もしくは生物体の生物学的成分に特異的なもの である請求項１記載の方法。 １０．第２ポリヌクレオチドプローブに標識が結合されている請求項１記載の方 法。 １１．標識が、放射活性物、酵素、酵素基質、特異結合部分、特異結合部分の結 合パートナー、ビオチン、アビジン、核酸染料及び蛍光物質からなる群より選ば れる請求項１０記載の方法。 １２．標識が、エチジウムプロマイド、ｙｏｙｏ−１及びｔｏｔｏ−１からなる 群より選ばれる核酸染料である請求項１１記載の方法。 １３．標識がアルカリホスファターゼを含むものであり、かつ前記ステップ（ｆ ）が、アトフォス（ＡＴＴＯＰＨＯＳ）を加えて生じた蛍光をフルオリメーター を用いて測定することを含む請求項１１記載の方法。 １４　標識が、それから発生する光によって測定され、且つ、ステップ（ｆ）が 標識から発生する光の量を測定することを含む請求項１０記載の方法。 １５．標識から発生する光の量を測定するステップが、光の量をフィルムに記録 させ、そしてデンシトメーターを用いてフィルムの露光度を測定することを含む 請求項１４記載の方法。 １６．固体支持体が、多くのウェルをもつマイクロタイタープレートを含み、そ のウェルの各々に、特異的ポリヌクレオチドプローブが固定されている請求項１ 記載の方法。 １７．第１ポリヌクレオチドプローブが、ＤＮＡを含む請求項１記載の方法。 １８．第１及び第２のポリヌクレオチドプローブが、ＤＮＡを含む請求項１記載 の方法。 １９．第１ポリヌクレオチドプローブにアニールされなかった生物試料が固体支 持体から実質的に全て除かれるように、試料中の分析対象ポリヌクレオチドを第 １ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせたのち固体支持体を洗浄する ステップを更に含む請求項１記載の方法。 ２０．分析対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズしていない第２ポリヌクレオ チドプローブが実質的に全て固体支持体から除かれるように、第２ポリヌクレオ チドプローブを、第１ポリヌクレオチドプローブがハイブリダイズしている試料 中の分析対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせたのち固体支持体を洗浄す るステップを更に含む請求項１記載の方法。 ２１．第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズしているポリヌクレオチ ドが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミックＤＮＡからなる群より選ばれる請求項 １記載の方法。 ２２．第１及び第２ポリヌクレオチドプローブを同定するステップを含む請求項 １記載の方法。 ２３．同定のステップがコンピュータの助けを借りる方法によって行われる請求 項２２記載の方法。 ２４．同定のステップがＨサイトモデルの使用を含む請求項２３記載の方法。 ２５．Ｈサイトモデルを使用した第１ポリヌクレオチドプローブの同定が、以下 のステップを含む請求項２４記載の方法：第１ヌクレオチドプローブの最小融解 温度及びその生物に特異的なヌクレオチド配列を特定する； 任意の核形成部位における塩基対の数に関して最小値を定める核形成しきい値を 特定する； 第１ヌクレオチドプローブについての融解温度（Ｔｍ）及び全ての可能なハイブ リダイゼーション点におけるその生物に特異的な配列を決定する；及び最高のＴ ｍ値を有するヌクレオチドプローブを選択する。 ２６．融解温度が以下の式で決定される請求項２５記載の方法：Ｔｍ＝８１．５ −１６．６（１ｏｇ［Ｎａ］）−０．６３％（ホルムアミド）＋０．４１（％（ Ｇ＋Ｃ））−６００／Ｎ、ここでｌｏｇ［Ｎａ］はナトリウム濃度の対数であり 、０．０６３％（ホルムアミド）はホルムアミドの温度、％（Ｇ＋Ｃ）はマッチ （対合）したＧＣ塩基対のパーセント、Ｎはプローブの長さである。 ２７．Ｈサイトモデルを使用した第２ポリヌクレオチドプローブの同定が、以下 のステップを含む請求項２４記載の方法：第２ヌクレオチドプローブの最小融解 温度及びその生物に特異的なヌクレオチド配列を特定する； 任意の核形成部位における塩基対の数に関して最小値を定める核形成しきい値を 特定する； 第１ヌクレオチドプローブについての融解温度（Ｔｍ）及び全ての可能なハイブ リダイゼーション点におけるその生物に特異的な配列を決定する；及び最高のＴ ｍ値を有するヌクレオチドプローブを選択する。 ２８．融解温度が、以下の式で決定される請求項２７記載の方法：Ｔｍ＝８１． ５−１６．６（１ｏｇ［Ｎａ］）−０．６３％（ホルムアミド）＋０．４１（％ （Ｇ＋Ｃ））−６００／Ｎ、ここで１ｏｇ［Ｎａ］はナトリウム濃度の対数であ り、０．０６３％（ホルムアミド）はホルムアミドの濃度、％（Ｇ＋Ｃ）はマッ チ（対合）したＧＣ塩基対のパーセント、Ｎはプローブの長さである。 ２９．検出しようとする生物又は感染性の作用物質が種々の真菌であり、かつ第 １ポリヌクレオチドプローブが、配列番号８１、１０４、１３１、１３３、１５ ４、１５６、１７６、１９９、２６７、２９０、３１２、３３５、３６４〜３７ ６、及び３９１〜３９２、及びこれらの配列のうち任意の配列に相同的な配列、 並びにこれらの配列のうちの任意の配列にハイブリダイズしうる配列からなる群 より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項１記載 の方法。 ３０．検出しようとする生物又は感染性の作用物質が種々の真菌であり、かつ第 ２ポリヌクレオチドプローブが、配列番号１〜８０のうちの任意の配列に相同的 な配列、並びにこれらの配列のうちの任意の配列にハイブリダイズしうる配列か らなる群より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求 項１記載の方法。 ３１．検出しようとする生物学的成分がｊｕｎがん遺伝子であり、第１ポリヌク レオチドプローブが、配列番号４７３、６００、６０７、６１５、６２２、６３ ７、７３０、７４７、７４８、４８８、５１３、６３０、６３９、及びこれらの 配列のうち任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のもの とハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列を含むポリヌクレオチ ド鎖である請求項１記載の方法。 ３２．検出しようとする生物学的成分がｊｕｎがん遺伝子であり、第２ポリヌク レオチドプローブが、配列番号７２８、７２９、７３３、７３４、７３９、７４ ０、７４１、７４２、７４３、７４４、及びこれらの配列のうち任意のものに相 補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものにハイブリダイズしうる配 列からなる群より選ばれる配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項１記載の 方法。 ３３．検出しようとする生物学的成分がサブスタンスＰレセプターであり、第１ ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５８、及び配列番号７５８に相補的な 配列、並びに配列番号７５８とハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれ る配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項１記載の方法。 ３４．検出しようとする生物学的成分がサブスタンスＰレセプターであり、第１ ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５９、及び配列番号７５９に相補的な 配列並びに配列番号７５９とハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる 配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項１記載の方法。 ３５．検出しようとする生物学的成分がＧ蛋白であり、第１ポリヌクレオチドプ ローブが、配列番号７５１、５５３、６７０、７５２、７５３、５６５、６７８ 、６８６、７５４、５７７、６９７、７０４、７５５、７５６、７３２、６４２ 、６５２、７５７、５９３、７１０、７２１、及びこれらの配列のうち任意のも のに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものとハイブリダイズし うる配列からなる群より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖 である請求項１記載の方法。 ３６．検出しようとする生物学的成分がＧ蛋白であり、第２ポリヌクレオチドプ ローブが、配列番号５２８、７３１、７４９、７５０、及びこれらの配列のうち の任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものとハイブ リダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌク レオチド鎖である請求項１記載の方法。 ３７．以下に示すものを含む、ポリヌクレオチドを含有する生物試料中の生物、 感染性の作用物質、又は細胞もしくは生物体中の生物学的成分の存在を同定する ための固体支持体−ポリヌクレオチド構造物：生物、感染性の作用物質、又は生 物学的成分に特異的な第１ヌクレオチド配列に相補的な配列を含む第１ポリヌク レオチドプローブが固定化された固体支持体； 第１ポリヌクレオチド配列を含む細胞、生物又は感染性の作用物質からの分析対 象ポリヌクレオチドーこの分析対象ポリヌクレオチドは第１ヌクレオチド配列に おいて第１ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズしている；第１ポリヌク レオチドプローブとハイブリダイズしている細胞、生物又は感染性の作用物質か らの分析対象ポリヌクレオチドに存在する第２ポリヌクレオチド配列に相補的な 第２ポリヌクレオチドプローブーこの第２ポリヌクレオチドプローブは第２ポリ ヌクレオチド配列において分析対象ポリヌクレオチドとハイブリダイズしている 。 ３８．第２ポリヌクレオチドプローブが標識を含む請求項３７記載の固体支持体 −ポリヌクレオチド構造物。 ３９．標識が、放射活性物、酵素、酵素基質、特異結合部分、特異結合部分の結 合パートナー、ビオチン、アビジン、核酸染料及び蛍光物質からなる群より選ば れる請求項３８記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４０．第２ポリヌクレオチドプローブが、多くの生物、感染性の作用物質又は、 細胞もしくは生物体の生物学的成分に含まれるポリヌクレオチドに共通なもので ある請求項３７記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４１．第１及び第２ポリヌクレオチドプローブが、遺伝子配列のデータソースを 利用するオリゴヌクレオチドプローブ設計コンピュータシステムーこのコンピュ ータシステムは以下のものを含む−を使用することにより決定される請求項３７ 記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物：遺伝子配列データの誤りを正す入 力手段；プロセッサ； プロセッサに第１オリゴヌクレオチドプローブの決定を指示する命令。 ４２．ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミックＤＮＡからなる 群より選ばれる請求項３７記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４３．第１ポリヌクレオチドプローブが、配列番号８１、１０４、１３１、１３ ３、１５４〜１５６、１７６、１９９、２６７、２９０、３１２、３３５、３６ ４〜３７６、及び３９１〜３９２、及びこれらの配列のうち任意の配列に相同的 な配列、並びにこれらの配列のうちの任意の配列とハイブリダイズしうる配列か らなる群より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求 項３７記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４４．第２ポリヌクレオチドプローブが、配列番号１〜８０、配列番号１〜８０ のうちの任意の配列に相同的な配列、及び前記配列のうちの任意の配列にハイブ リダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌク レオチド鎖である請求項３７記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４５．第１ポリヌクレオチドプローブが、配列番号４７３、６００、６０７、６ １５、６２２、６３７、７３０、７４７、７４８、４８８、５１３、６３０、６ ３９、及びこれらの配列のうち任意の配列に相補的な配列、並びにこれらの配列 のうちの任意の配列とハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列を 含むポリヌクレオチド鎖である請求項３７記載の固体支持体−ポリヌクレオチド 構造物。 ４６．第２ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７２８、７２９、７３３、７ ３４、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、及びこれらの配列の うち任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものにハイ ブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列を含むポリヌクレオチド鎖で ある請求項３７記載の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４７．第１ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５８、及び配列番号７５８ に相補的な配列並びに配列番号７５８とハイブリダイズしうる配列からなる群よ り選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項３７記載 の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４８．第１ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５９、及び配列番号７５９ に相補的な配列並びに配列番号７５９とハイブリダイズしうる配列からなる群よ り選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項３７記載 の固体支持体−ポリヌクレオチド構造物。 ４９．第１ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５１、５５３、６７０、７ ５２、７５３、５６５、６７８、６８６、７５４、５７７、６９７、７０４、７ ５５、７５６、７３２、６４２、６５２、７５７、５９３、７１０、７２１、及 びこれらの配列のうち任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの 任意のものとハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列に相補的な 配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項３７記載の固体支持体−ポリヌクレ オチド構造物。 ５０．第２ポリヌクレオチドプローブが、配列番号５２８、７３１、７４９、７ ５０、及びこれらの配列のうちの任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配 列のうちの任意のものとハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列 に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項３７記載の固体支持体− ポリヌクレオチド構造物。 ５１．以下のものを含む、生物試料中の生物、感染性の作用物質、又は細胞もし くは生物の生物学的成分の存在を同定するためのキット：特異的ポリヌクレオチ ドプローブーこの特異的ポリヌクレオチドプローブは、検出しようとする特定の 生物、感染性の作用物質又は生物学的生物の分析対象ポリヌクレオチドに特異的 な第１ヌクレオチド配列に相補的もしくは相同的である； 生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の分析対象ポリヌクレオチドの第２ヌ クレオチド配列に相補的もしくは相同的な共通ポリヌクレオチドプローブーこの 共通ポリヌクレオチドプローブは数多くの生物、感染性の作用物質又は生物学的 成分に含まれているポリヌクレオチドに相補的である。 ５２．ポリヌクレオチドが固定化されうる固体支持体を含む請求項５１記載のキ ット。 ５３．特異的ポリヌクレオチドプローブが固体支持体に固定化されている請求項 ５２記載のキット。 ５４．固体支持体に多くの特異的ポリヌクレオチドプローブが固定化されており 、そのプローブの各々が異なる生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に特異 的である請求項５３記載のキット。 ５５．固体支持体が、多くのウェルを含み、各々の特異的ポリヌクレオチドプロ ーブが異なるウェルに固定化されている請求項５３記載のキット。 ５６．更に、プローブとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した緩 衝液を含み、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミックＤＮＡから なる群より選ばれる請求項５５記載のキット。 ５７．第２ポリヌクレオチドプローブが標識を有する請求項５１記載のキット。 ５８．標識が、放射活性物、酸素、酵素基質、特異結合部分、特異結合部分の結 合パートナー、ビオチン、アビジン、核酸染料及び蛍光物質からなる群より選ば れる請求項５７記載のキット。 ５９．特異的ポリヌクレオチドプローブが、特定の生物、感染性の作用物質又は 生物学的成分に特異的である配列に相補的もしくは相同的な、第１特異的プライ マーを含み、かつ、種々の生物、感染性の作用物質又は／生物学的成分に特異的 な配列に相補的もしくは相同な第２特異的ポリヌクレオチドプライマーを含む、 請求項５１記載のキット。 ６０．更に、ｄＮＴＰ類、逆転写酵素、ポリメラーゼ、及び逆転写酵素もしくは ポリメラーゼを用いてプライマーにｄＮＴＰ類を添加するのに好適な緩衝液のう ちの一もしくは二以上を含む請求項５９記載のキット。 ６１．５０℃以上の温度で相当のポリメラーゼ活性を保持するＤＮＡポリメラー ゼを含む請求項６０記載のキット。 ６２．更に、ｄＮＴＰ類、逆転写酵素、ポリメラーゼ、及び逆転写酵素もしくは ポリメラーゼを用いてプライマーにｄＮＴＰ類を添加するのに好適な緩衝液のう ちの一もしくは二以上を含む請求項６１記載のキット。 ６３．特異的ポリヌクレオチドプローブが、配列番号８１、１０４、１３１、１ ３３、１５４、１５６、１７６、１９９、２６７、２９０、３１２、３３５、３ ６４〜３７６、及び３９１〜３９２からなる群より選ばれる配列に相補的又は相 同的な配列を含む請求項５１記載のキット。 ６４．共通ポリヌクレオチドプローブが、配列番号１〜８０からなる群より選ば れる配列に相補的又は相同的な配列を含む請求項５１記載のキット。 ６５．特異的ポリヌクレオチドプローブが、配列番号４７３、６００、６０７、 ６１５、６２２、６３７、７３０、７４７、７４８、４８８、５１３、６３０、 ６３９、及びこれらの配列のうち任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配 列のうちの任意のものとハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列 を含むポリヌクレオチド鎖である請求項５１記載のキット。 ６６．共通ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７２８、７２９、７３３、７ ３４、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、及びこれらの配列の うち任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものにハイ ブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列を含むポリヌクレオチド鎖で ある請求項５１記載のキット。 ６７．特異的ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５８、及び配列番号７５ ８に相補的な配列、並びに配列番号７５８とハイブリダイズしうる配列からなる 群より選ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項５１ 記載のキット。 ６８．特異的ポリヌクレオチドが、配列番号７５９、及び配列番号７５９に相補 的な配列、並びに配列番号７５９とハイブリダイズしうる配列からなる群より選 ばれる配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項５１記載のキ ット。 ６９．特異的ポリヌクレオチドプローブが、配列番号７５１、５５３、６７０、 ７５２、７５３、５６５、６７８、６８６、７５４、５７７、６９７、７０４、 ７５５、７５６、７３２、６４２、６５２、７５７、５９３、７１０、７２１、 及びこれらの配列のうち任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配列のうち の任意のものとハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列に相補的 な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項５１記載のキット。 ７０．共通ポリヌクレオチドプローブが、配列番号５２８、７３１、７４９、７ ５０、及びこれらの配列のうちの任意のものに相補的な配列、並びにこれらの配 列のうちの任意のものとハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる配列 に相補的な配列を含むポリヌクレオチド鎖である請求項５１記載のキット。 ７１．ｊｕｎがん遺伝子の検出、及び定量に有用な８又はそれ以上の長さのヌク レオチドの単離オリゴヌクレオチド： このヌクレオチドは特定のｊｕｎがん遺伝子に特異的な配列を含み、その配列は 、配列番号４７３、６００、６０７、６１５、６２２、６３７、７３０、７４７ 、７４８、４８８、５１３、６３０、６３９、及びこれらの配列のうち任意のも のに相補的な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものとハイブリダイズし うる配列からなる群より選ばれる。 ７２．ｊｕｎがん遺伝子の検出及び定量に有用な８又はそれ以上の長さのヌクレ オチドの単離オリゴヌクレオチド： このヌクレオチドは、多くのｊｕｎがん遺伝子に共通な配列を含み、その配列は 、配列番号７２８、７２９、７３３、７３４、７３９、７４０、７４１、７４２ 、７４３、７４４、及びこれらの配列のうち任意のものに相補的な配列、並びに これらの配列のうちの任意のものにハイブリダイズしうる配列からなる群より選 ばれる。 ７３．βレセプターの検出及び定量に有用な８又はそれ以上の長さのヌクレオチ ドの単離オリゴヌクレオチド： この配列は、配列番号７５９及び配列番号７５９に相補的な配列並びに配列番号 ７５９とハイブリダイズしうる配列からなる群より選ばれる。 ７４．サブスタンスＰレセプターの検出及び定量に有用な８又はそれ以上の長さ のヌクレオチドの単離オリゴヌクレオチド：この配列は、配列番号７５８及び配 列番号７５８に相補的な配列並びに配列番号７５８とハイブリダイズしうる配列 からなる群より選ばれる。 ７５．Ｇ蛋白の検出及び定量に有用な８又はそれ以上の長さのヌクレオチドの単 離オリゴヌクレオチド： このヌクレオチドは特定のＧ蛋白に特異的な配列を含み、その配列は、配列番号 ７５１、５５３、６７０、７５２、７５３、５６５、６７８、６８６、７５４、 ５７７、６９７、７０４、７５５、７５６、７３２、６４２、６５２、７５７、 ５９３、７１０、７２１、及びこれらの配列のうち任意のものに相補的な配列、 並びにこれらの配列のうちの任意のものとハイブリダイズしうる配列からなる群 より選ばれる配列に相補的な配列からなる群より選ばれる。 ７６．Ｇ蛋白の検出及び定量に有用な８又はそれ以上の長さのヌクレオチドの単 離オリゴヌクレオチド： このヌクレオチドは多くのＧ蛋白に共通な配列を含み、その配列は、配列番号５ ２８、７３１、７４９、７５０、及びこれらの配列のうちの任意のものに相補的 な配列、並びにこれらの配列のうちの任意のものとハイブリダイズしうる配列か らなる群より選ばれる配列。 ７７．特定の真菌のｒＲＮＡに特異的なポリヌクレオチドの単離セグメント：こ の配列は、配列番号８１、１０４、１３１〜１３３、１５４〜１５６、１７６、 １９９、２６７、２９０、３１２、３３５、３６４〜３７６、及び３９１〜３９ ２、及びこれらの配列のうち任意の配列に相同的な配列からなる群より選ばれる 配列に相補的又は相同的な配列を含む。 ７８．多くの種の真菌に共通な配列にコードされ、又はそれに相補的なポリヌク レオチドの単離セグメント： この配列は、配列番号１〜８０及び前記配列のうちの任意の配列に相同的な配列 からなる群より選ばれる配列に相補的又は相同的である。 ７９．以下のステップを含む、ポリヌクレオチドを含む生物試料における、一又 は二以上の生物、感染性の作用物質又は生物学的成分の存在を検出する方法−こ こで、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、一もしくは二以上の生物、感染性 の作用物質又は生物学的成分の存在を表し、またそれらの少量の存在を示す：（ ａ）ポリヌクレオチドを含有する生物試料を取得する；（ｂ）その試料を、数多 くの生物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共通のヌクレオチド配列に相補 的な配列をもつ第１プライマーに接触させる；（ｃ）第１プライマーに相補的な 、試料中の分析対象ポリヌクレオチド（そのような分析対象ポリヌクレオチドが 存在すれば）に第１プライマーをハイブリダイズさせる； （ｄ）第１プライマーを伸長させる。このとき、第１プライマーを含む相補的ヌ クレオチド鎖と分析対象ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド鎖とを含む二本鎖 ポリヌクレオチドが生じる； （ｅ）相補的ヌクレオチド鎖に含まれる配列に相補的な第２ポリヌクレオチドプ ライマーに、試料を接触させる； （ｆ）相補的ヌクレオチド鎖に第２プライマーをハイブリダイズさせる。 （ｇ）第２プライマーを伸長させて、分析対象ポリヌクレオチドに相同なヌクレ オチド鎖を形成させる； （ｈ）試料に第３ポリヌクレオチドプライマーを接触させる−ここで、第３プラ イマーは、相同的ヌクレオチド鎖に相補的な配列をもち、第３プライマーは、そ の存在が決定されるべき数多くの化物、感染性の作用物質又は生物学的成分に共 通な配列に相補する配列をもつ； （ｉ）第３プライマーを相同的ヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせる；（ｊ） 第３プライマーを伸長させ、二本鎖ポリヌクレオチドを生じさせる；そして （ｋ）第３プライマーの増幅物を検出することによって、試料中の一つ又は二つ 以上の生物、感染性の作用物質又は他物学的成分の存在を決定する。 ８０．ステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｉ）及び（ｊ）を複数回繰 り返して行う請求項７９記載の方法。 ８１．ステップ（ｄ）が逆転写酵素と共に行う伸長を含み、ステップ（ｇ）がＤ ＮＡポリメラーゼと共に行う伸長を含む請求項７９記載の方法。 ８２．ＤＮＡが５０℃以上において相当のポリメラーゼ活性を有する請求項８１ 記載の方法。 ８３．第１プライマーのヌクレオチド配列が、コンピュータの助けを借りる方法 で決定される請求項７９記載の方法。 ８４．コンピュータの助けを借りる方法が、Ｈサイトモデルを用いて第１ヌクレ オチドプローブの配列を決定する請求項８３記載の方法。 ８５．第２プライマーのヌクレオチド配列が、コンピュータの助けを借りる方法 で決定される請求項７９記載の方法。 ８６．コンピュータの助けを借りる方法が、Ｈサイトモデルを用いて第２ヌクレ オチドプローブの配列を決定する請求項８５記載の方法。 ８７．第３プライマーが標識を含み、かつステップ（ｋ）が、標識を付与された プライマーの伸長の検出を含む請求項７９記載の方法。 ８８．標識が、放射活性物、酵素、酵素基質、特異結合部分、特異結合部分の結 合パートナー、ビオチン、アビジン、核酸染料及び蛍光物質からなる群より選ば れる請求項８７記載の方法。 ８９．第３プライマーのヌクレオチド配列が、コンピュータの助けを借りる方法 で決定される請求項７９記載の方法。 ９０．コンピュータの助けを借りる方法が、Ｈサイトモデルを用いて第３プライ マーの配列を決定する請求項８９記載の方法。 ９１．第２プライマーが、その存在を決定するべき多くの生物、感染性の作用物 質又は生物学的成分に共通なヌクレオチド配列を有する請求項７９記載の方法。 ９２．更に以下のステップを含む請求項７９記載の方法：試料に相補的ヌクレオ チド鎖に相補的な配列を有する第４プライマーを接触させ； 第４プライマーを相補的ヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせ；そして、第４プ ライマーを伸長させる。