JPH0563154B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0563154B2 JPH0563154B2 JP62270483A JP27048387A JPH0563154B2 JP H0563154 B2 JPH0563154 B2 JP H0563154B2 JP 62270483 A JP62270483 A JP 62270483A JP 27048387 A JP27048387 A JP 27048387A JP H0563154 B2 JPH0563154 B2 JP H0563154B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- recipient
- producing
- ebv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
コーラーおよびミルスタインのハイブリドーマ
技術は、免疫学および多くの他の分野へのその応
用について大変革をもたらした。マウスおよびラ
ツトにおいて産生したきわめて特異的なモノクロ
ーナル抗体は、実質的に無制限に多量に得られる
最近、ヒトモノクローナル抗体の産生が報告され
ている。ヒトモノクローナル抗体は、特にイン・
ビボの診断および治療において、鼠科またはラツ
ト系で生成したモノクローナル抗体よりすぐれて
いる。これは特にイン・ビボ治療に関してであ
り、なぜならこの場合異種抗血清による感作（増
感）の危険性があるからである。
技術は、免疫学および多くの他の分野へのその応
用について大変革をもたらした。マウスおよびラ
ツトにおいて産生したきわめて特異的なモノクロ
ーナル抗体は、実質的に無制限に多量に得られる
最近、ヒトモノクローナル抗体の産生が報告され
ている。ヒトモノクローナル抗体は、特にイン・
ビボの診断および治療において、鼠科またはラツ
ト系で生成したモノクローナル抗体よりすぐれて
いる。これは特にイン・ビボ治療に関してであ
り、なぜならこの場合異種抗血清による感作（増
感）の危険性があるからである。
更にヒト免疫応答のスペクトルは、非常に制限
されており、したがつてHLA特異性のような細
胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の生
成のために有用である。しかも自己免疫モノクロ
ーナル抗体の分離および、抗原としてのそれらの
使用は、自己抗原または移植された組織抗原への
応答を調節するためのヒトモノクローナル抗−イ
デイオタイプ治療をもたらすであろう。最後に、
有用な診断用モノクローナル抗体を開発するため
に感染性疾患病原体への液性応答が用いられるで
あろう。この刺激的な有利性にもかかわらず、ヒ
トモノクローナル抗体を製造するためのハイブリ
ドーマ技術の一般的な応用は限られている。
されており、したがつてHLA特異性のような細
胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の生
成のために有用である。しかも自己免疫モノクロ
ーナル抗体の分離および、抗原としてのそれらの
使用は、自己抗原または移植された組織抗原への
応答を調節するためのヒトモノクローナル抗−イ
デイオタイプ治療をもたらすであろう。最後に、
有用な診断用モノクローナル抗体を開発するため
に感染性疾患病原体への液性応答が用いられるで
あろう。この刺激的な有利性にもかかわらず、ヒ
トモノクローナル抗体を製造するためのハイブリ
ドーマ技術の一般的な応用は限られている。
ヒトＢ細胞を、NNPハプテン〔スタインニツ
ツら．，Nature（1979）267巻，52ページ〕、TPN
ハプテン〔コズボルら．，J.Immunol.（1977）10
巻181ページ〕、Rh抗原〔コスキミース．，J.
Immunol.（1979）10巻，371ページ，ボイルスト
ンら．，J.Immunol.（1980）12巻，255ページ〕、
連鎖球菌Ａ多糖類〔スタインニツツら．，
Immunohiology（1979）156巻，41ページ〕、破傷
風毒素〔ツラウスキイら．，Science（1978）199
巻，1439〕、リウマトイド関連IgG〔スタインニツ
ツら．，Nature（1980）287巻，443ページ〕およ
びホスホリルコリン〔ヨシエおよびオノ，
Immuno（1980）〕、にするポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を産生する細胞系に形質転換
するためにEBV含有上清が従来から用いられて
いる。更に、細胞融合を用いるヒトハイブリドー
マの生成および該ヒトハイブリドーマによるモノ
クローナル抗体の生成に関する文献として、クロ
ーセら．〔Nature（1980）288巻，488ページ〕オ
ールソンおよびカプラン〔PNAS USA（1980）
77巻，5429ページ〕による論文が挙げられる。バ
ートら〔J.Exp.Med.（1981）154巻，832ページ：
ヒトＢリンパ球のEBV活性化〕、ならびにコズボ
ールおよびロダー〔Immunology（1981）127巻，
1275ページ：破傷風毒素に対するモノクローナル
抗体の確立のためにEBVの使用〕を参照のこと。
ツら．，Nature（1979）267巻，52ページ〕、TPN
ハプテン〔コズボルら．，J.Immunol.（1977）10
巻181ページ〕、Rh抗原〔コスキミース．，J.
Immunol.（1979）10巻，371ページ，ボイルスト
ンら．，J.Immunol.（1980）12巻，255ページ〕、
連鎖球菌Ａ多糖類〔スタインニツツら．，
Immunohiology（1979）156巻，41ページ〕、破傷
風毒素〔ツラウスキイら．，Science（1978）199
巻，1439〕、リウマトイド関連IgG〔スタインニツ
ツら．，Nature（1980）287巻，443ページ〕およ
びホスホリルコリン〔ヨシエおよびオノ，
Immuno（1980）〕、にするポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を産生する細胞系に形質転換
するためにEBV含有上清が従来から用いられて
いる。更に、細胞融合を用いるヒトハイブリドー
マの生成および該ヒトハイブリドーマによるモノ
クローナル抗体の生成に関する文献として、クロ
ーセら．〔Nature（1980）288巻，488ページ〕オ
ールソンおよびカプラン〔PNAS USA（1980）
77巻，5429ページ〕による論文が挙げられる。バ
ートら〔J.Exp.Med.（1981）154巻，832ページ：
ヒトＢリンパ球のEBV活性化〕、ならびにコズボ
ールおよびロダー〔Immunology（1981）127巻，
1275ページ：破傷風毒素に対するモノクローナル
抗体の確立のためにEBVの使用〕を参照のこと。
霊長類モノクローナル抗体の安定な産生のため
の形質転換方法が提供される。
の形質転換方法が提供される。
この方法においては、伝達剤（transferring
agent）としてエプスタイン−バル−ウイルス
（“EBV”）により形質転換された細胞（通常リン
パ球）が使用される。この細胞は、以後伝達細胞
（transferring cell）として記載する。この伝達
細胞は、非融合条件下でイムノグロブリンを生産
することができる細胞（通常Ｂ−リンパ球）と一
緒にされるかまたは同時培養（co−cultivate）
される。イムノグロブリン（“Ig”）を生産するこ
とができる細胞は、伝達細胞との同時培養によつ
て形質転換され、不滅化され（immortalized）、
Igの生産に向けられる。同時培養によつて形質転
換されることができそしてイムノグロブリンの生
産にかかわることができる細胞を受容細胞
（recipient cell）と記載する。伝達細胞および受
容細胞が選択的条件下に同時培養され、それによ
つて形質転換され今や不滅化された受容細胞
（“不滅化Ig産生細胞”）は伝達細胞なしで増殖す
ることができる。これらの不滅化されたIg生産細
胞は、望ましいリガンド特異性に対するイムノグ
ロブリンを生産する細胞の選択のためにスクリー
ン化され、そして次に望ましいクラス（class）
およびアイソタイプ（isotype）のモノクローナ
ルIgを安定に生産する細胞系を確立するためにク
ローン化される。
agent）としてエプスタイン−バル−ウイルス
（“EBV”）により形質転換された細胞（通常リン
パ球）が使用される。この細胞は、以後伝達細胞
（transferring cell）として記載する。この伝達
細胞は、非融合条件下でイムノグロブリンを生産
することができる細胞（通常Ｂ−リンパ球）と一
緒にされるかまたは同時培養（co−cultivate）
される。イムノグロブリン（“Ig”）を生産するこ
とができる細胞は、伝達細胞との同時培養によつ
て形質転換され、不滅化され（immortalized）、
Igの生産に向けられる。同時培養によつて形質転
換されることができそしてイムノグロブリンの生
産にかかわることができる細胞を受容細胞
（recipient cell）と記載する。伝達細胞および受
容細胞が選択的条件下に同時培養され、それによ
つて形質転換され今や不滅化された受容細胞
（“不滅化Ig産生細胞”）は伝達細胞なしで増殖す
ることができる。これらの不滅化されたIg生産細
胞は、望ましいリガンド特異性に対するイムノグ
ロブリンを生産する細胞の選択のためにスクリー
ン化され、そして次に望ましいクラス（class）
およびアイソタイプ（isotype）のモノクローナ
ルIgを安定に生産する細胞系を確立するためにク
ローン化される。
本発明の方法は、種々のＨ鎖（heavy chain）
アイソタイプ（例IgG1−４）を含む、IgA，
IgD，IgE，IgGおよびIgMのような任意のイムノ
グロブリンクラスのモノクローナル抗体の産生の
ために用いられる。モノクローナル抗体を分離し
た後、Fab，Ｆ（ab1）2，Fv，Fd，Fe，Ｋおよび
λL鎖（light chain）のような特異的フラグメン
トを生成するために酵素消化および／又は酸分解
（消化）のような種々の方法で変形する。
アイソタイプ（例IgG1−４）を含む、IgA，
IgD，IgE，IgGおよびIgMのような任意のイムノ
グロブリンクラスのモノクローナル抗体の産生の
ために用いられる。モノクローナル抗体を分離し
た後、Fab，Ｆ（ab1）2，Fv，Fd，Fe，Ｋおよび
λL鎖（light chain）のような特異的フラグメン
トを生成するために酵素消化および／又は酸分解
（消化）のような種々の方法で変形する。
伝達細胞は、EBVのための宿主であるどのよ
うな細胞でもよく、受容細胞の形質転換および不
滅化後、選択的に除去できるように選択すること
ができるものである。好ましくは、伝達細胞およ
び受容細胞の同時培養は、伝達細胞に対する選択
的細胞毒性条件下に行なう。EBV伝達細胞系を
選択する場合に考慮すべきことは、伝達細胞が、
入手可能であり、そして受容細胞がそれに対して
感受性でない細胞毒素に感受性をもつように突然
変異させることができるか否か；EBVのための
宿主であり、そして伝達細胞として機能すること
ができ、受容細胞とともに培地への導入した場合
に受容細胞を形質転換しそして不滅化することが
できるか否かである。
うな細胞でもよく、受容細胞の形質転換および不
滅化後、選択的に除去できるように選択すること
ができるものである。好ましくは、伝達細胞およ
び受容細胞の同時培養は、伝達細胞に対する選択
的細胞毒性条件下に行なう。EBV伝達細胞系を
選択する場合に考慮すべきことは、伝達細胞が、
入手可能であり、そして受容細胞がそれに対して
感受性でない細胞毒素に感受性をもつように突然
変異させることができるか否か；EBVのための
宿主であり、そして伝達細胞として機能すること
ができ、受容細胞とともに培地への導入した場合
に受容細胞を形質転換しそして不滅化することが
できるか否かである。
EBVのための宿主である細胞としては、特に、
ヒト、チンパンジー、モンキー、きぬざるなどを
含む霊長動物の細胞を挙げることができる。これ
らの細胞は、常法によつて、容易にEBVによつ
て形質転換され得る。EBVを含むいろいろの細
胞系、例えばヒトリンパ芽球GM4672、きぬざる
系B95−８などが使用可能である。
ヒト、チンパンジー、モンキー、きぬざるなどを
含む霊長動物の細胞を挙げることができる。これ
らの細胞は、常法によつて、容易にEBVによつ
て形質転換され得る。EBVを含むいろいろの細
胞系、例えばヒトリンパ芽球GM4672、きぬざる
系B95−８などが使用可能である。
伝達細胞が実質的にまつたく存在しないよう
に、不滅化Ig産生細胞を選択的に分離するために
種々の技法が用いられる。この技法は、伝達細胞
と受容細胞との相違にある程度依存する。いくつ
かの例において、細胞はそれらの浮力密度によつ
て分離され、または区別される。いろいろの媒質
（例．パーコール）が遠心分離の間、異なつた密
度の領域を提供するために用いられる。細胞の二
つのグループが表面抗原により識別され得る場
合、伝達細胞に対して選択的な抗体が、補体また
は細胞溶解毒素との組み合わせにおいて有用であ
る。
に、不滅化Ig産生細胞を選択的に分離するために
種々の技法が用いられる。この技法は、伝達細胞
と受容細胞との相違にある程度依存する。いくつ
かの例において、細胞はそれらの浮力密度によつ
て分離され、または区別される。いろいろの媒質
（例．パーコール）が遠心分離の間、異なつた密
度の領域を提供するために用いられる。細胞の二
つのグループが表面抗原により識別され得る場
合、伝達細胞に対して選択的な抗体が、補体また
は細胞溶解毒素との組み合わせにおいて有用であ
る。
多くの場合、選択的細胞毒性剤が使用される。
受容細胞がそれに対して耐性を有する細胞毒性剤
に対して伝達細胞が感受性があるか、または感受
性にされうるかの場合に、選択的細胞毒性剤が使
用される。一般に、伝達細胞を突然変異誘発剤と
接触せしめ、次いで選択的細胞毒性剤に対して感
受性のある細胞を選択することによつて感受性化
が達成される。
受容細胞がそれに対して耐性を有する細胞毒性剤
に対して伝達細胞が感受性があるか、または感受
性にされうるかの場合に、選択的細胞毒性剤が使
用される。一般に、伝達細胞を突然変異誘発剤と
接触せしめ、次いで選択的細胞毒性剤に対して感
受性のある細胞を選択することによつて感受性化
が達成される。
いろいろの選択的細胞毒性が存在するが、しか
し、便利に且つ一般的には、伝達細胞を変異させ
てることにより、HGPRT（ヒポキサンチン−グ
アニンホスホリボシルトランスフエラーゼ）を欠
損しており、それ故にHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）感受性である細胞を
生成せしめる。いろいろの突然変異誘発剤が、
HATに感受性があるHGPRT-細胞の誘導を促進
するために用いられる。一般的にエチルメタンス
ルフオネートまたはＮ−ニトロソグアニジンが用
いられる〔Nature（1975）156巻：495〜497ペー
ジ参照〕。
し、便利に且つ一般的には、伝達細胞を変異させ
てることにより、HGPRT（ヒポキサンチン−グ
アニンホスホリボシルトランスフエラーゼ）を欠
損しており、それ故にHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）感受性である細胞を
生成せしめる。いろいろの突然変異誘発剤が、
HATに感受性があるHGPRT-細胞の誘導を促進
するために用いられる。一般的にエチルメタンス
ルフオネートまたはＮ−ニトロソグアニジンが用
いられる〔Nature（1975）156巻：495〜497ペー
ジ参照〕。
受容細胞、通常は活性化もしくは非活性化Ｂ−
リンパ球は広範囲の材料および宿主から得られる
が、不滅化されたIg産生細胞になることができる
ことが条件である。これは、該細胞が通常EBV
の宿主域内にあることを意味する。Ｂ−リンパ球
は、末梢血液、扁桃、パイエル集腺、脾、および
リンパ腺に由来することがある。個々の選択は形
質転換の目的に依存して異る。一般には、選択
は、注目の決定基に対する所望のイムノグロブリ
ンを生産することができるＢ−リンパ球の入手可
能性に依存する。他の状況において、特別のセツ
トのＢ−リンパ球を形質転換することが目的とな
る。
リンパ球は広範囲の材料および宿主から得られる
が、不滅化されたIg産生細胞になることができる
ことが条件である。これは、該細胞が通常EBV
の宿主域内にあることを意味する。Ｂ−リンパ球
は、末梢血液、扁桃、パイエル集腺、脾、および
リンパ腺に由来することがある。個々の選択は形
質転換の目的に依存して異る。一般には、選択
は、注目の決定基に対する所望のイムノグロブリ
ンを生産することができるＢ−リンパ球の入手可
能性に依存する。他の状況において、特別のセツ
トのＢ−リンパ球を形質転換することが目的とな
る。
受容細胞はハプテン性または抗原性のどちらか
の望ましい免疫原によつてイン・ビボまたはイ
ン・ビトロで免疫感作され得る。注目の決定基部
位は、単純な単量体有機化合物、天然のまたは合
成されたポリペプチドおよびタンパク、多糖類、
核酸または類似物あるいはそれらの組み合わせ内
に存在することができる。化合物は試薬、汚染
物、殺虫剤、夾雑物、細胞構成物、たとえば表面
膜タンパク、細胞質タンパク、核タンパクなど、
酵素、ホルモン、抗生物質などとして機能するこ
とができる。全生物体、または細胞、例えばウイ
ルス、バクテリア、カビ、原生動物、ほ乳類の細
胞などまたはそれらの一部分（例．核）が用いら
れる。
の望ましい免疫原によつてイン・ビボまたはイ
ン・ビトロで免疫感作され得る。注目の決定基部
位は、単純な単量体有機化合物、天然のまたは合
成されたポリペプチドおよびタンパク、多糖類、
核酸または類似物あるいはそれらの組み合わせ内
に存在することができる。化合物は試薬、汚染
物、殺虫剤、夾雑物、細胞構成物、たとえば表面
膜タンパク、細胞質タンパク、核タンパクなど、
酵素、ホルモン、抗生物質などとして機能するこ
とができる。全生物体、または細胞、例えばウイ
ルス、バクテリア、カビ、原生動物、ほ乳類の細
胞などまたはそれらの一部分（例．核）が用いら
れる。
Ｂ−リンパ球は、イン・ビボもしくはイン・ビ
トロで免疫原によつて活性化され、注目のリガン
ドに対する抗体を産生する。扁桃切除、または脾
切除をうけた宿主は、特定の器官のための材料と
して役立ちうる。Ｂ−リンパ球用宿主源は、先に
示したように霊長類であろう。
トロで免疫原によつて活性化され、注目のリガン
ドに対する抗体を産生する。扁桃切除、または脾
切除をうけた宿主は、特定の器官のための材料と
して役立ちうる。Ｂ−リンパ球用宿主源は、先に
示したように霊長類であろう。
一般に、イン・ビボ免疫感作のためには、宿主
は、少なくても一回そしてしばしば器官の除去の
約二週間前に免疫感作される。赤血球および顆粒
球の組織の単一細胞懸濁液を遊離した後、生育可
能な単核細胞を適当な栄養培地に懸濁し、非付着
細胞を付着細胞から分離する。
は、少なくても一回そしてしばしば器官の除去の
約二週間前に免疫感作される。赤血球および顆粒
球の組織の単一細胞懸濁液を遊離した後、生育可
能な単核細胞を適当な栄養培地に懸濁し、非付着
細胞を付着細胞から分離する。
イン・ビトロの免疫感作のためには、受容細胞
源として、たとえば末梢性血白血球（PBL）を
分離し、活性化のために十分な濃度で適当な抗原
を含有するマクロフアージ含有栄養培地に接種す
る。感作のために十分な時間後、一般的に約２〜
４日間後、生育可能な細胞を、死細胞から分離
し、そして受容細胞として用いる。この技法の説
明に関しては、たとえば1981年６月16日出願した
ヨーロツパ特許出願番号44722に開示されており、
参照できる。
源として、たとえば末梢性血白血球（PBL）を
分離し、活性化のために十分な濃度で適当な抗原
を含有するマクロフアージ含有栄養培地に接種す
る。感作のために十分な時間後、一般的に約２〜
４日間後、生育可能な細胞を、死細胞から分離
し、そして受容細胞として用いる。この技法の説
明に関しては、たとえば1981年６月16日出願した
ヨーロツパ特許出願番号44722に開示されており、
参照できる。
受容細胞の形質転換は通常は、機能的生存Ｔ−
細胞の実質的な不存在下に行う。形質転換に対す
るＴ−細胞妨害の除去は、Ｔ−細胞の実質的な除
去またはＴ−細胞の不活性化によつて達成でき
る。
細胞の実質的な不存在下に行う。形質転換に対す
るＴ−細胞妨害の除去は、Ｔ−細胞の実質的な除
去またはＴ−細胞の不活性化によつて達成でき
る。
機能Ｔ−細胞の消耗は、Ｂ−リンパ球受容細胞
の生存を維持する通常の手段によつて達成するこ
とができる。好都合なことには、Ｔ−細胞は、羊
−赤血球とのＥ−ロゼツトの形成、Ｅ−ロゼツト
の培地からの分離によつて除去することができ
る。他の方法としては、Ｔ−細胞を除去するより
もむしろ、Ｔ−細胞を、たとえばサイクロスポリ
ンＡまたは他のＴ−細胞不活性剤によつて不活性
化することができる。このようにして、用いられ
るＢ−リンパ球懸濁から機能的な生存Ｔ−細胞を
減少することができる。
の生存を維持する通常の手段によつて達成するこ
とができる。好都合なことには、Ｔ−細胞は、羊
−赤血球とのＥ−ロゼツトの形成、Ｅ−ロゼツト
の培地からの分離によつて除去することができ
る。他の方法としては、Ｔ−細胞を除去するより
もむしろ、Ｔ−細胞を、たとえばサイクロスポリ
ンＡまたは他のＴ−細胞不活性剤によつて不活性
化することができる。このようにして、用いられ
るＢ−リンパ球懸濁から機能的な生存Ｔ−細胞を
減少することができる。
活性Ｔ−細胞が減少しておりそして適当な栄養
培地中での懸濁液として提供された受容細胞は、
受容細胞群の形質転換のために伝達細胞と同時培
養する。二つのタイプの細胞を、適当な培地中
で、たとえばRPMI1640中で、融合剤（fusogen）
の実質的な不存在下に、一般的に、受容細胞と伝
達細胞との割合を約0.2〜５：１として、通常は
１−３：１として接触させる。二つの細胞群が同
時培養される。所望ならば、細胞に損傷を与えな
いように密着して細胞を接触せしめるに十分な遠
心法のような便利な方法によつて、緊密に接触せ
しめることが可能である。遠心を100〜200×ｇで
室温のもとで１−60分間行うことで通常は十分で
あるが、好ましくは少なくても５分間行う。
培地中での懸濁液として提供された受容細胞は、
受容細胞群の形質転換のために伝達細胞と同時培
養する。二つのタイプの細胞を、適当な培地中
で、たとえばRPMI1640中で、融合剤（fusogen）
の実質的な不存在下に、一般的に、受容細胞と伝
達細胞との割合を約0.2〜５：１として、通常は
１−３：１として接触させる。二つの細胞群が同
時培養される。所望ならば、細胞に損傷を与えな
いように密着して細胞を接触せしめるに十分な遠
心法のような便利な方法によつて、緊密に接触せ
しめることが可能である。遠心を100〜200×ｇで
室温のもとで１−60分間行うことで通常は十分で
あるが、好ましくは少なくても５分間行う。
細胞は、同時培養され、そして伝達細胞を伴わ
ない不滅化されたIg産生細胞が、機械的もしくは
化学的手段によつて得られる。大抵の場合、選択
的に細胞毒性である化学的手段を用いることであ
る。たとえばHAT培地を用いる場合、各々の成
分の濃度範囲は、約10-4−10-5Ｍである。伝達細
胞および受容細胞の各々の細胞濃度は、約104−
105細胞／mlである。温度範囲は一般的には約15
−40℃である。
ない不滅化されたIg産生細胞が、機械的もしくは
化学的手段によつて得られる。大抵の場合、選択
的に細胞毒性である化学的手段を用いることであ
る。たとえばHAT培地を用いる場合、各々の成
分の濃度範囲は、約10-4−10-5Ｍである。伝達細
胞および受容細胞の各々の細胞濃度は、約104−
105細胞／mlである。温度範囲は一般的には約15
−40℃である。
選択的抗体を用いる場合、結合位置に基づく抗
体は、少なくても十分量の補体と共に実質的に過
剰な数の細胞にある。毒素たとえばジフテリア毒
素またはリシン毒素は毒素の非−特異性結合部
分、すなわちＢ−ペプチドのない抗体と結合する
であろう。
体は、少なくても十分量の補体と共に実質的に過
剰な数の細胞にある。毒素たとえばジフテリア毒
素またはリシン毒素は毒素の非−特異性結合部
分、すなわちＢ−ペプチドのない抗体と結合する
であろう。
伝達細胞および受容細胞と接触させたすぐ後
で、細胞懸濁液をマイクロテイター・ウエルにプ
レートする。細胞を成長条件下、たとえば37℃、
６％CO2ふん囲気中で培養し、そして選択的条件
下に維持する。HGPRT-伝達細胞とともに、
HATを栄養培地で保持する。不滅化Ig産生細胞
の出現が見られ、７〜14日間増殖させる。各々の
ウエルにおける細胞の上清をスクリーニングし、
陽性ウエルにおける細胞を限界希釈法条件下にク
ローン化する。
で、細胞懸濁液をマイクロテイター・ウエルにプ
レートする。細胞を成長条件下、たとえば37℃、
６％CO2ふん囲気中で培養し、そして選択的条件
下に維持する。HGPRT-伝達細胞とともに、
HATを栄養培地で保持する。不滅化Ig産生細胞
の出現が見られ、７〜14日間増殖させる。各々の
ウエルにおける細胞の上清をスクリーニングし、
陽性ウエルにおける細胞を限界希釈法条件下にク
ローン化する。
各々の培養マイクロウエルの上清液を、たとえ
ば適当なイムノアツセイ（例．125Ｉ固体相ラジオ
イムノアツセイ）におけるぶどう球菌タンパクＡ
を用いて、イムノグロブリン産生についてテスト
する。この方法は、いくつかのイムノグロブリン
についてのみ検査され、他のイムノグロブリンの
検出に特定のイムノグロブリンに対するFcの抗
体を用いることによつて達成される。望ましいイ
ムノグロブリンを産生する培養菌は、適当な栄養
培地中でクローン化する。
ば適当なイムノアツセイ（例．125Ｉ固体相ラジオ
イムノアツセイ）におけるぶどう球菌タンパクＡ
を用いて、イムノグロブリン産生についてテスト
する。この方法は、いくつかのイムノグロブリン
についてのみ検査され、他のイムノグロブリンの
検出に特定のイムノグロブリンに対するFcの抗
体を用いることによつて達成される。望ましいイ
ムノグロブリンを産生する培養菌は、適当な栄養
培地中でクローン化する。
クローンの成長は、栄養培地、条件化培地と組
み合わせた栄養培地、フイーダー・レイヤーまた
は類似物栄養培地のような、いろいろ培地でなさ
れる。フイーダー・レイヤーには、ひと上皮線維
芽細胞フイーダー細胞、照射したヒト胎児線維芽
細胞、リンパ球、自然に存在するもしくは異質遺
伝的ヒトPBL、マウスリンパ不等細胞または類
似物が含まれる。望ましい抗体産生クローンが確
立された後、不滅化Ig産生細胞を常用の補助剤を
含有する適当な培地を収拾する培養フラスコ中で
増殖させ、そして抗体を上清から採取するか、あ
るいは細胞を、移植を拒絶しない宿主、たとえば
適当な霊長類または免疫系の不十分な宿主たとえ
ばヌード・マウスの腹膜に注入し、腹水を集める
か、または血液中のイムノグロブリンを採取す
る。細胞を十分に成長させ、イムノグロブリンの
生成をもたらす常法が用いられる。
み合わせた栄養培地、フイーダー・レイヤーまた
は類似物栄養培地のような、いろいろ培地でなさ
れる。フイーダー・レイヤーには、ひと上皮線維
芽細胞フイーダー細胞、照射したヒト胎児線維芽
細胞、リンパ球、自然に存在するもしくは異質遺
伝的ヒトPBL、マウスリンパ不等細胞または類
似物が含まれる。望ましい抗体産生クローンが確
立された後、不滅化Ig産生細胞を常用の補助剤を
含有する適当な培地を収拾する培養フラスコ中で
増殖させ、そして抗体を上清から採取するか、あ
るいは細胞を、移植を拒絶しない宿主、たとえば
適当な霊長類または免疫系の不十分な宿主たとえ
ばヌード・マウスの腹膜に注入し、腹水を集める
か、または血液中のイムノグロブリンを採取す
る。細胞を十分に成長させ、イムノグロブリンの
生成をもたらす常法が用いられる。
いくつかの場合において、既知のリガンドに対
する抗体の生成に興味あるのみでなく、診断およ
び／または治療の目的のために、宿主がいかなる
抗体生産しているかを決定することに興味があ
る。多くの場合、宿主、特に、癌、たとえば白血
病およびリンパ腫、自己免疫疾患、感染病および
類似の疾患のような疾患を有する宿主によつて生
成された抗体に興味がある。疾患にかかつている
期間、回復期、および回復後、患者の血液もしく
は血清がスクリーニングされる。Ｂ−リンパ球源
を宿主から得、そして該細胞を本発明に基いて形
質転換して不滅化Ig産生細胞を得る。細胞によつ
て生産されたIgsは適当な抗原を用いてスクリー
ニングされうる。いくつかの例において、記憶細
胞を形質転換することが望ましい。
する抗体の生成に興味あるのみでなく、診断およ
び／または治療の目的のために、宿主がいかなる
抗体生産しているかを決定することに興味があ
る。多くの場合、宿主、特に、癌、たとえば白血
病およびリンパ腫、自己免疫疾患、感染病および
類似の疾患のような疾患を有する宿主によつて生
成された抗体に興味がある。疾患にかかつている
期間、回復期、および回復後、患者の血液もしく
は血清がスクリーニングされる。Ｂ−リンパ球源
を宿主から得、そして該細胞を本発明に基いて形
質転換して不滅化Ig産生細胞を得る。細胞によつ
て生産されたIgsは適当な抗原を用いてスクリー
ニングされうる。いくつかの例において、記憶細
胞を形質転換することが望ましい。
不滅化Ig産生細胞は、望ましい決定基部位に対
する抗体の直接生産以外のいろいろの目的のため
に用いることができる。細胞は、決定基部位に対
して特異的であるため、イムノグロブリンの鎖を
コードする多量のmRNAを生成するであろう。
mRNAはオリゴ−dTカラムを用いて他のRNA
と分別可能である。所望のmRNAの存在は、卵
母細胞を用いる常法により確立することができ
る。
する抗体の直接生産以外のいろいろの目的のため
に用いることができる。細胞は、決定基部位に対
して特異的であるため、イムノグロブリンの鎖を
コードする多量のmRNAを生成するであろう。
mRNAはオリゴ−dTカラムを用いて他のRNA
と分別可能である。所望のmRNAの存在は、卵
母細胞を用いる常法により確立することができ
る。
mRNAは、ss cDNAのための鋳型として用い
られ、このDNAはプライマーおよびDNAポリメ
ラーゼによつてds DNAを提供する。ds cDNA
の混合物は適当なベクターにおけるクローン化に
よつて増幅され、そして増幅されたds cDNAは、
RNA、およびDNAプローブを用いそしてサザン
法に従つてストリンジエント条件下でのハイブリ
ダイゼーシヨンによりＨ鎖またはＬ鎖のどちらか
のFc部分をコードする配列の存在についてスク
リーニングされる。
られ、このDNAはプライマーおよびDNAポリメ
ラーゼによつてds DNAを提供する。ds cDNA
の混合物は適当なベクターにおけるクローン化に
よつて増幅され、そして増幅されたds cDNAは、
RNA、およびDNAプローブを用いそしてサザン
法に従つてストリンジエント条件下でのハイブリ
ダイゼーシヨンによりＨ鎖またはＬ鎖のどちらか
のFc部分をコードする配列の存在についてスク
リーニングされる。
所望のIg鎖をコードするds cDNAが切り出さ
れ、そして適当なエンドヌクレアーゼを用いての
制限酸素処理、プライマー修復、またはイン・ビ
トロ変異誘発によつて変形され、発現ベクターに
挿入でき、しかも単細胞宿主において所望のアミ
ノ酸配列を生成することができるds cDNAが提
供される。ＬおよびＨ鎖を再性条件下
（renaturingcondition）に接触せしめることによ
りグリコシジル置換基をもたないかまたはもつIg
が生成する。
れ、そして適当なエンドヌクレアーゼを用いての
制限酸素処理、プライマー修復、またはイン・ビ
トロ変異誘発によつて変形され、発現ベクターに
挿入でき、しかも単細胞宿主において所望のアミ
ノ酸配列を生成することができるds cDNAが提
供される。ＬおよびＨ鎖を再性条件下
（renaturingcondition）に接触せしめることによ
りグリコシジル置換基をもたないかまたはもつIg
が生成する。
不滅化Ig産生細胞は、イムノグロブリンをコー
ドする遺伝子をもつ染色体源としても用いられ
る。細胞は、所望のイムノグロブリンを産生でき
るハイブリドーマを生成するためにメラノーマ細
胞と融合させうる。便利には、融合材料
（fusogen）は異種細胞であり、このものは次に
所望の抗体を生成し、そしてより下等な脊椎動
物、すなわち霊長類以外の脊椎動物に導入され得
るであろう。
ドする遺伝子をもつ染色体源としても用いられ
る。細胞は、所望のイムノグロブリンを産生でき
るハイブリドーマを生成するためにメラノーマ細
胞と融合させうる。便利には、融合材料
（fusogen）は異種細胞であり、このものは次に
所望の抗体を生成し、そしてより下等な脊椎動
物、すなわち霊長類以外の脊椎動物に導入され得
るであろう。
抗体は、イン・ビボおよびイン・ビトロで、組
織学、細胞学、イムノアツセイ、診断、治療等に
おいて、多様な方法で用いられる。多くの目的の
ために、抗体を共有結合によりまたは非共有結合
により標識、特にシグナルを提供する標識、粒子
および細胞のような広範囲の物質に接合される。
織学、細胞学、イムノアツセイ、診断、治療等に
おいて、多様な方法で用いられる。多くの目的の
ために、抗体を共有結合によりまたは非共有結合
により標識、特にシグナルを提供する標識、粒子
および細胞のような広範囲の物質に接合される。
標識には放射性核種、色素、螢光体、化学ルミ
ネツセンス体、酵素、基質、補因子、天然に存在
する受容体およびリガンド等が含まれる。粒子に
は、磁気粒子、螢光粒子、有孔ラテツクス粒子等
が含まれる。細胞には、羊赤血球、S.アウレウス
（S.aureus）細胞または特別な性質または機能を
もつ他の細胞系が含まれる。
ネツセンス体、酵素、基質、補因子、天然に存在
する受容体およびリガンド等が含まれる。粒子に
は、磁気粒子、螢光粒子、有孔ラテツクス粒子等
が含まれる。細胞には、羊赤血球、S.アウレウス
（S.aureus）細胞または特別な性質または機能を
もつ他の細胞系が含まれる。
Ｂ−リンパ球の直接形質転換に用いられる
EBVの従来の経験に比して、形質転換のより高
い効率が、この発明の細胞−ドライブEBV形質
転換のための伝達細胞を用いて達成され、そして
従来観察されているよりも高い比率の形質転換さ
れた細胞が、IgMではなくIgGを産生する。
EBVの従来の経験に比して、形質転換のより高
い効率が、この発明の細胞−ドライブEBV形質
転換のための伝達細胞を用いて達成され、そして
従来観察されているよりも高い比率の形質転換さ
れた細胞が、IgMではなくIgGを産生する。
次に実施例は、本発明を例示しており、本発明
を制限するものではない。
を制限するものではない。
実施例
ACD抗−凝固剤（アデニン−クエン酸塩−デ
キストロース）を含む採血した新鮮なヒト末梢血
液を滅菌等張食塩水により１：１の割合で室温の
もとで希釈する。希釈された血液（25ml）を滅菌
管中のリンパ球分離媒質（10ml）（LSM、リツト
ン ビオネテツクス）のクツシヨン上に重層す
る。管を室温のもとで、400×ｇで25分間遠心分
離する。細胞のリンパ球／単核細胞画分を界面＋
１／２LSM容積から集める。集めた細胞を無血清
RPMI1640で３倍に希釈し、室温のもとで200×
ｇで10分間遠心分離する。得られた細胞ペレツト
を無血清RPMI1640で３回洗浄し、洗浄された細
胞を、血球計算盤およびトリパンブル−生体色素
の方法でカウントする。
キストロース）を含む採血した新鮮なヒト末梢血
液を滅菌等張食塩水により１：１の割合で室温の
もとで希釈する。希釈された血液（25ml）を滅菌
管中のリンパ球分離媒質（10ml）（LSM、リツト
ン ビオネテツクス）のクツシヨン上に重層す
る。管を室温のもとで、400×ｇで25分間遠心分
離する。細胞のリンパ球／単核細胞画分を界面＋
１／２LSM容積から集める。集めた細胞を無血清
RPMI1640で３倍に希釈し、室温のもとで200×
ｇで10分間遠心分離する。得られた細胞ペレツト
を無血清RPMI1640で３回洗浄し、洗浄された細
胞を、血球計算盤およびトリパンブル−生体色素
の方法でカウントする。
AET−SRBC（アミノエチルイソチオウロニウ
ムブロマイド−羊赤血球）をＥ−ロゼツト化によ
るＴ−細胞の消耗に使用のために準備する。1.25
×７の洗浄されたPBL（２ml）、AET−SRBC（10
％懸濁物）50：１の割合（0.25ml）、および
RPMI1640−15％牛胎児血清（FCS）（22.5ml）
の混合物を準備し、４℃のもとで、200×ｇで５
分間遠心分離する。４℃のもとで２時間インキユ
ベートした後、ペレツトを穏やかに再懸濁し、４
℃のもとで管当り約２mlのLSMで下層にし、４
℃のもとで400×ｇで20分間超心分離する。得ら
れたＴ−細胞が除去されたPBL（Ｅ−PBL）を界
面で集める。Ｅ−PBLを室温で無血清RPMI1640
で３回洗浄し、細胞は血球計算盤およびトリパン
ブルー生体色素を用いてカウントする。
ムブロマイド−羊赤血球）をＥ−ロゼツト化によ
るＴ−細胞の消耗に使用のために準備する。1.25
×７の洗浄されたPBL（２ml）、AET−SRBC（10
％懸濁物）50：１の割合（0.25ml）、および
RPMI1640−15％牛胎児血清（FCS）（22.5ml）
の混合物を準備し、４℃のもとで、200×ｇで５
分間遠心分離する。４℃のもとで２時間インキユ
ベートした後、ペレツトを穏やかに再懸濁し、４
℃のもとで管当り約２mlのLSMで下層にし、４
℃のもとで400×ｇで20分間超心分離する。得ら
れたＴ−細胞が除去されたPBL（Ｅ−PBL）を界
面で集める。Ｅ−PBLを室温で無血清RPMI1640
で３回洗浄し、細胞は血球計算盤およびトリパン
ブルー生体色素を用いてカウントする。
ヒトリンパ芽球細胞（lymphoblastoid cell）
系GM1500（ヒト遺伝突然変異細胞貯蔵所、キヤ
ンデン、ニユージヤージー）（EBVを含有する）
をエチルメタンスルフオネート（シグマ、
300μg／ml）を含む培地で24時間培養する。エチ
ルメタンスルフオネートによる突然変異誘発後、
生き残りの細胞を、プリン同族体、６−チオグア
ニン（6TG）の増加する濃度中に副次培養する。
数カ月後、成長力のある増殖した突然変異細胞系
を確立することができ、HAT補足培地では死滅
し、1A2と名づける。クローン化細胞系1A2は、
1982年３月26日、ATCCに（登録番号CRL−
8119）、保存されている。
系GM1500（ヒト遺伝突然変異細胞貯蔵所、キヤ
ンデン、ニユージヤージー）（EBVを含有する）
をエチルメタンスルフオネート（シグマ、
300μg／ml）を含む培地で24時間培養する。エチ
ルメタンスルフオネートによる突然変異誘発後、
生き残りの細胞を、プリン同族体、６−チオグア
ニン（6TG）の増加する濃度中に副次培養する。
数カ月後、成長力のある増殖した突然変異細胞系
を確立することができ、HAT補足培地では死滅
し、1A2と名づける。クローン化細胞系1A2は、
1982年３月26日、ATCCに（登録番号CRL−
8119）、保存されている。
1A2細胞を対数期培養から採取し、無血清
RPMI1640で一回洗浄する。E-PBLおよび1A2細
胞を２：１の割合で混合し、室温のもとで160×
ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレツトを
RPMI1640−15％FCS、1mMピルビン酸ナトリ
ウム、2mML−グルタミンおよびHAT（Ｈ−１
×10-4Ｍ；Ａ−１×10-5Ｍ；Ｔ−４×10-5Ｍ）の
混合物中に37℃のもとで再懸濁する。最終的な濃
度は、E-PBLについては４×105細胞／ml、そし
て1A2については２×105細胞／mlである。96ウ
エルマイクロタイトプレートのウエルに、200u
入れ、37℃、６％炭酸ガスのもとで培養し、上
記載のように隔日に、RPMI1640−HAT培地を
供給する。10−14日後、細胞系があらわれそして
増殖する。
RPMI1640で一回洗浄する。E-PBLおよび1A2細
胞を２：１の割合で混合し、室温のもとで160×
ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレツトを
RPMI1640−15％FCS、1mMピルビン酸ナトリ
ウム、2mML−グルタミンおよびHAT（Ｈ−１
×10-4Ｍ；Ａ−１×10-5Ｍ；Ｔ−４×10-5Ｍ）の
混合物中に37℃のもとで再懸濁する。最終的な濃
度は、E-PBLについては４×105細胞／ml、そし
て1A2については２×105細胞／mlである。96ウ
エルマイクロタイトプレートのウエルに、200u
入れ、37℃、６％炭酸ガスのもとで培養し、上
記載のように隔日に、RPMI1640−HAT培地を
供給する。10−14日後、細胞系があらわれそして
増殖する。
クローン化細胞系は、正常な二倍体数、すなわ
ち46個の染色体を含むことが見い出された。この
細胞は、フルオレセイン−接合Ｆ（ab1）2抗−ヒト
Igを用いる免疫螢光により検出した場合ヒト表面
イムノグロブリンを有していた。この細胞はま
た、1A2細胞系の場合のように、エプスタイン−
バール核抗原を含むことが見い出された。
ち46個の染色体を含むことが見い出された。この
細胞は、フルオレセイン−接合Ｆ（ab1）2抗−ヒト
Igを用いる免疫螢光により検出した場合ヒト表面
イムノグロブリンを有していた。この細胞はま
た、1A2細胞系の場合のように、エプスタイン−
バール核抗原を含むことが見い出された。
無差別に選択したウエルからの形質転換された
Ｂ−細胞培養物の上清を、沈殿およびドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）によつてイムノグロブリンの存
在について評価した。テストしたすべての上清
は、１種類またはそれ以上のヒトモノクローナル
イムノグロブリンを含んでいた。IgGおよびIgM
の両者の生成が注目された。繰り返しの実験にお
いて、異なるPBLを用いて、この結果は再現さ
れた。IgGの生成は、無差別にテストしたウエル
の大部分から検出された。クローン化Ｂ−細胞系
由来の上清のSDS−PAGE分析は、各々一つのモ
ノクローナルイムノグロブリンを産生することを
示した。
Ｂ−細胞培養物の上清を、沈殿およびドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）によつてイムノグロブリンの存
在について評価した。テストしたすべての上清
は、１種類またはそれ以上のヒトモノクローナル
イムノグロブリンを含んでいた。IgGおよびIgM
の両者の生成が注目された。繰り返しの実験にお
いて、異なるPBLを用いて、この結果は再現さ
れた。IgGの生成は、無差別にテストしたウエル
の大部分から検出された。クローン化Ｂ−細胞系
由来の上清のSDS−PAGE分析は、各々一つのモ
ノクローナルイムノグロブリンを産生することを
示した。
ウエルにつき８×104個のE-PBLがプレートさ
れたから、同時培養についての形質転換体の収率
は80000につき１以上であり、再現された（その
後の結果では、収率が10000につき１またはそれ
より良かつた）。すべての上清はモノクローナル
イムノグロブリンを含有していたが、イムノグロ
ブリンの量は、単一の最初のウエル由来の娘クロ
ーン間で一様ではなかつた。
れたから、同時培養についての形質転換体の収率
は80000につき１以上であり、再現された（その
後の結果では、収率が10000につき１またはそれ
より良かつた）。すべての上清はモノクローナル
イムノグロブリンを含有していたが、イムノグロ
ブリンの量は、単一の最初のウエル由来の娘クロ
ーン間で一様ではなかつた。
ヒトｒ鎖に対して特異的なラジオイムノアツセ
イを用いて、クローン化Ｂ−細胞系の48時間対数
期培養物および４日目のより高い密度の培養物か
らの上清液のIgG量を測定した。48時間で50〜
350ng／mlのIgGが産生され、一方、同じ細胞の
より高い密度の培養物は8μg／mlにまで生産し
た。４カ月以上の培養の後の再検査において、ク
ローン化された形質転換体は、イムノグロブリン
の量またはクラスにおいていかなる変化もなかつ
た。
イを用いて、クローン化Ｂ−細胞系の48時間対数
期培養物および４日目のより高い密度の培養物か
らの上清液のIgG量を測定した。48時間で50〜
350ng／mlのIgGが産生され、一方、同じ細胞の
より高い密度の培養物は8μg／mlにまで生産し
た。４カ月以上の培養の後の再検査において、ク
ローン化された形質転換体は、イムノグロブリン
の量またはクラスにおいていかなる変化もなかつ
た。
EBV含有上清によるヒトＢ−細胞の形質転換
の特性に比較した場合、この発明の細胞駆動法
は、いくつかの明らかな有利な点を有する。第一
に、形質転換体の出現速度がはやい。1A2細胞系
および12種類の異なる正常PBL供与体を用いて
の12個の独立した実験によつて、各々の場合、新
しく生成した形質転換体は10−14日間に75％のコ
ンフルエンシー（confluency）に増殖する。更
に、観察された細胞駆動形質転換の効率は実質的
に一層高い。SDS−PAGE−分析およびこれに続
くクローン化研究から、８×106個のE-PBLにつ
き平均200個の形質転換された細胞系が生じ、こ
れは40000個のE-PBLにつき11個のＢ細胞系に相
当する。単球が消耗されていなかつたので、これ
らの実験における効率は、より高い。更に、
EBV形質転換の1A2の細胞駆動法を用いる場合、
クローンの平均60％がモノクローナルIgGを生成
する。ブラウンおよびミラー〔J.Imm128巻，24
ページ（1982）〕は、正常成熟PBLの形質転換の
ために100倍に濃縮したEBV−含有上清を用いた
場合、三回の試験において、再生したクローンの
16％がIgGを産生することを報告している。
の特性に比較した場合、この発明の細胞駆動法
は、いくつかの明らかな有利な点を有する。第一
に、形質転換体の出現速度がはやい。1A2細胞系
および12種類の異なる正常PBL供与体を用いて
の12個の独立した実験によつて、各々の場合、新
しく生成した形質転換体は10−14日間に75％のコ
ンフルエンシー（confluency）に増殖する。更
に、観察された細胞駆動形質転換の効率は実質的
に一層高い。SDS−PAGE−分析およびこれに続
くクローン化研究から、８×106個のE-PBLにつ
き平均200個の形質転換された細胞系が生じ、こ
れは40000個のE-PBLにつき11個のＢ細胞系に相
当する。単球が消耗されていなかつたので、これ
らの実験における効率は、より高い。更に、
EBV形質転換の1A2の細胞駆動法を用いる場合、
クローンの平均60％がモノクローナルIgGを生成
する。ブラウンおよびミラー〔J.Imm128巻，24
ページ（1982）〕は、正常成熟PBLの形質転換の
ために100倍に濃縮したEBV−含有上清を用いた
場合、三回の試験において、再生したクローンの
16％がIgGを産生することを報告している。
上記の結果からも明らかなように、所定のリガ
ンドまたは決定基部位に対するモノクローナル抗
体の安定な製造のための強力な新規な方法が提供
される。
ンドまたは決定基部位に対するモノクローナル抗
体の安定な製造のための強力な新規な方法が提供
される。
本発明の方法は、当該分野における従来の方法
より有利ないくつかの点を提供する。EBVによ
る形質転換によつて、安定な不滅化細胞が得られ
る。得られた不滅化Ig産生細胞は、注目のイムノ
グロブリンをコードする遺伝子を退行または脱落
しない。目的する不滅化Ig産生細胞が、各親由来
の鎖をもつイムノグロブリンを生成する可能性、
またはハイブリドーマで経験するようにミエロー
マ親細胞由来の鎖で汚染される可能性はない。本
発明に係る細胞は、望ましいイムノグロブリンを
長期間産生する。
より有利ないくつかの点を提供する。EBVによ
る形質転換によつて、安定な不滅化細胞が得られ
る。得られた不滅化Ig産生細胞は、注目のイムノ
グロブリンをコードする遺伝子を退行または脱落
しない。目的する不滅化Ig産生細胞が、各親由来
の鎖をもつイムノグロブリンを生成する可能性、
またはハイブリドーマで経験するようにミエロー
マ親細胞由来の鎖で汚染される可能性はない。本
発明に係る細胞は、望ましいイムノグロブリンを
長期間産生する。
形質転換のためにEBVの使用と比すると本発
明に係る方法は、形質転換される受容細胞の数に
おいてもつと効率が良い。従つて、本発明に係る
方法は、患者のＢ−リンパ球レパートリーのスク
リーンとして、特に免疫系が腫瘍もしくは病原体
の存在によりまたは自己免疫疾患により始動され
ている場合に、用いることが可能である。EBV
形質転換による従来の結果と比較して、高比率の
不滅化Ig産生細胞がIgMよりむしろIgGを産生す
る。IgMは一般的にIgGより同族リガンドに対し
て低い親和性をもち、多くの目的にはIgMは有用
ではない。
明に係る方法は、形質転換される受容細胞の数に
おいてもつと効率が良い。従つて、本発明に係る
方法は、患者のＢ−リンパ球レパートリーのスク
リーンとして、特に免疫系が腫瘍もしくは病原体
の存在によりまたは自己免疫疾患により始動され
ている場合に、用いることが可能である。EBV
形質転換による従来の結果と比較して、高比率の
不滅化Ig産生細胞がIgMよりむしろIgGを産生す
る。IgMは一般的にIgGより同族リガンドに対し
て低い親和性をもち、多くの目的にはIgMは有用
ではない。
本発明に係る方法は、簡単であり、再現性が良
く、安全であり、そして効率が良く、さらに
EBVのための宿主からIgを生成することができ
るいかなる細胞でも使用することができる。
く、安全であり、そして効率が良く、さらに
EBVのための宿主からIgを生成することができ
るいかなる細胞でも使用することができる。
前記のように本発明を実施例および例示に従つ
て具体的に説明したが本発明の範囲はこれらの実
施例および例示に限定するものではない。
て具体的に説明したが本発明の範囲はこれらの実
施例および例示に限定するものではない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 伝達細胞としてEBV形質転換細胞を用いて
受容イムノグロブリン産生細胞を不滅化する方法
において、該伝達細胞および該受容細胞を機能的
Ｔ−細胞の実質的な不在下に同時培養することに
よつて該受容細胞を不滅化イムノグロブリン産生
細胞にし、そして該伝達細胞の実質的な不存在下
で該不滅化イムノグロブリン産生細胞をクローン
化することを特徴とする方法。 ２ 前記同時培養およびクローン化の少なくても
一方を該伝達細胞に対する選択的細胞毒性剤の存
在下に行う特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記伝達細胞がHAT感受性であり、そして
前記選択的細胞毒性剤がHATである特許請求の
範囲第２項記載の方法。 ４ 前記受容細胞を前記同時培養前にリガンドに
より処理する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 前記受容細胞が癌を有する宿主に由来する特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 前記EBV形質転換細胞が1A2と命名された
細胞系（ATCC CRL−8119）である特許請求の
範囲第１項記載の方法。
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| JP58051753A Granted JPS58201723A (ja) | 1982-04-05 | 1983-03-29 | イムノグロブリンの製造方法 |
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