JPH0564128B2 - - Google Patents
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- JPH0564128B2 JPH0564128B2 JP59174351A JP17435184A JPH0564128B2 JP H0564128 B2 JPH0564128 B2 JP H0564128B2 JP 59174351 A JP59174351 A JP 59174351A JP 17435184 A JP17435184 A JP 17435184A JP H0564128 B2 JPH0564128 B2 JP H0564128B2
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- hemoglobin
- polyalkylene glycol
- acid
- molecular weight
- reaction
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、代用血液中に必要な酸素運搬物質と
して使用するヘモグロビン−ポリアルキレングリ
コール結合体の新規製造方法に関する。
して使用するヘモグロビン−ポリアルキレングリ
コール結合体の新規製造方法に関する。
従来の技術
代用血液に使用する酸素運搬物質としてヘモグ
ロビン−ポリアルキレングリコール結合体が血流
内寿命を大幅に延ばすことができる点で優れてお
り（特開昭56−12308号、57−206622号明細書参
照。）、その開発が期待されている。しかし、この
結合体の分子量が低過ぎると非修飾ヘモグロビン
と同様、尿中へ排出され、一方、分子量が高過ぎ
る（30万以上）と粘度の高い溶液を与え細い血管
を流れる際の障害となる。代用血液として使用す
る場合のヘモグロビン−ポリアルキレングリコー
ル結合体の好ましい分子量は８〜30万ダルトンで
ある。
ロビン−ポリアルキレングリコール結合体が血流
内寿命を大幅に延ばすことができる点で優れてお
り（特開昭56−12308号、57−206622号明細書参
照。）、その開発が期待されている。しかし、この
結合体の分子量が低過ぎると非修飾ヘモグロビン
と同様、尿中へ排出され、一方、分子量が高過ぎ
る（30万以上）と粘度の高い溶液を与え細い血管
を流れる際の障害となる。代用血液として使用す
る場合のヘモグロビン−ポリアルキレングリコー
ル結合体の好ましい分子量は８〜30万ダルトンで
ある。
発明が解決しようとする問題点
ヘモグロビン−ポリアルキレングリコール結合
体の分子量はヘモグロビンとポリアルキレングリ
コールの反応時における両者のモル比と濃度によ
つて決定されること、特に、上記の範囲内の分子
量分布を有する前記結合体を製造するにはヘモグ
ロビンの重量濃度を２％以下にする必要があるこ
と、ヘモグロビン濃度をそれ以上高くすると分子
量30万以上の生成物を多量に含む幅広い分子量分
布を有するヘモグロビン−ポリアルキレングリコ
ール結合体が製造されることが見出された。
体の分子量はヘモグロビンとポリアルキレングリ
コールの反応時における両者のモル比と濃度によ
つて決定されること、特に、上記の範囲内の分子
量分布を有する前記結合体を製造するにはヘモグ
ロビンの重量濃度を２％以下にする必要があるこ
と、ヘモグロビン濃度をそれ以上高くすると分子
量30万以上の生成物を多量に含む幅広い分子量分
布を有するヘモグロビン−ポリアルキレングリコ
ール結合体が製造されることが見出された。
一方、反応時におけるヘモグロビン濃度は高い
程一度に多量のヘモグロビン−ポリアルキレング
リコール結合体を製造することができ、その結果
反応容器を含む装置を小型にすることができる。
また、生成物の濃縮も容易になる。
程一度に多量のヘモグロビン−ポリアルキレング
リコール結合体を製造することができ、その結果
反応容器を含む装置を小型にすることができる。
また、生成物の濃縮も容易になる。
一度に多量のヘモグロビン−ポリアルキレング
リコール結合体を製造するために反応時のヘモグ
ロビン濃度を高くしても、分子量分布が８〜30万
の範囲内にあるヘモグロビン−ポリアルキレング
リコール結合体を製造することができ、さらに従
来のものと比べて同等か上質のヘモグロビン−ポ
リアルキレングリコール結合体を与える方法の開
発が望まれる。
リコール結合体を製造するために反応時のヘモグ
ロビン濃度を高くしても、分子量分布が８〜30万
の範囲内にあるヘモグロビン−ポリアルキレング
リコール結合体を製造することができ、さらに従
来のものと比べて同等か上質のヘモグロビン−ポ
リアルキレングリコール結合体を与える方法の開
発が望まれる。
問題点を解決するための手段
本発明者は、反応時のヘモグロビン濃度が高く
ても分子量分布が８〜30万の範囲内であるヘモグ
ロビン−ポリアルキレングリコール結合体を製造
すべく鋭意検討した結果、ヘモグロビンと、両端
にカルボキシル基を有するポリアルキレングリコ
ールとをアミノ酸の存在下に反応せしめた時、反
応時のヘモグロビンの重量濃度が２％を越える場
合であつても得られたヘモグロビン−ポリアルキ
レングリコール結合体の分子量分布が８〜30万の
範囲内にあり、その活性や物性も従来品のものと
何ら劣ることのないことを見出し、この発見に基
づき本発明を完成するに到つた。
ても分子量分布が８〜30万の範囲内であるヘモグ
ロビン−ポリアルキレングリコール結合体を製造
すべく鋭意検討した結果、ヘモグロビンと、両端
にカルボキシル基を有するポリアルキレングリコ
ールとをアミノ酸の存在下に反応せしめた時、反
応時のヘモグロビンの重量濃度が２％を越える場
合であつても得られたヘモグロビン−ポリアルキ
レングリコール結合体の分子量分布が８〜30万の
範囲内にあり、その活性や物性も従来品のものと
何ら劣ることのないことを見出し、この発見に基
づき本発明を完成するに到つた。
本発明に使用するヘモグロビンは、ヒト、ウ
シ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、
ニワトリ等ヘモグロビンを有する動物由来のもの
であればよい。本明細書でいうヘモグロビンと
は、いわゆる異常ヘモグロビン（K.Imai，
Allesteric Effecta in Haemeglebin，
Camdridge University Press，1980参照）ある
いはピリドキサール−リン酸例えば、ピリドキサ
ール−5′−リン酸、２−ノル−２−ホルミルピリ
ドキサール−5′−リン酸、ピリドキサール−硫
酸、例えばピリドキサール−5′−硫酸、グリセリ
ンリン酸類、例えばグリセリン−２，３−ジリン
酸、糖リン酸、例えばグルコース−６−リン酸、
アデノシン−5′−リン酸等のヘモグロビン誘導体
であつてもよい。
シ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、
ニワトリ等ヘモグロビンを有する動物由来のもの
であればよい。本明細書でいうヘモグロビンと
は、いわゆる異常ヘモグロビン（K.Imai，
Allesteric Effecta in Haemeglebin，
Camdridge University Press，1980参照）ある
いはピリドキサール−リン酸例えば、ピリドキサ
ール−5′−リン酸、２−ノル−２−ホルミルピリ
ドキサール−5′−リン酸、ピリドキサール−硫
酸、例えばピリドキサール−5′−硫酸、グリセリ
ンリン酸類、例えばグリセリン−２，３−ジリン
酸、糖リン酸、例えばグルコース−６−リン酸、
アデノシン−5′−リン酸等のヘモグロビン誘導体
であつてもよい。
ヘモグロビンの反応時の濃度は、２〜30％（重
量）程度、好ましくは５〜15％（重量）程度であ
る。
量）程度、好ましくは５〜15％（重量）程度であ
る。
本発明で用いられるポリアルキレングリコール
は、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコールあるいはエチレンオキサイドとプ
ロピレンオキサイドとの共重合体等水溶性の高い
重合物であり、その分子量は300〜20000、製造さ
れる結合体の粘度等の観点から好ましくは750〜
10000の範囲内にあるものである。
は、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコールあるいはエチレンオキサイドとプ
ロピレンオキサイドとの共重合体等水溶性の高い
重合物であり、その分子量は300〜20000、製造さ
れる結合体の粘度等の観点から好ましくは750〜
10000の範囲内にあるものである。
さらにポリアルキレングリコールはカルボキシ
ル基を少なくとも２個有するもの、あるいはさら
にカルボキシル基とＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド、コハク酸イミド、イミダゾール等を脱水縮合
させた、いわゆる活性化エステル誘導体である。
ル基を少なくとも２個有するもの、あるいはさら
にカルボキシル基とＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド、コハク酸イミド、イミダゾール等を脱水縮合
させた、いわゆる活性化エステル誘導体である。
ポリアルキレングリコールの使用量は、ヘモグ
ロビン１モルに対して１〜100モル程度、好まし
くは５〜20モル程度である。
ロビン１モルに対して１〜100モル程度、好まし
くは５〜20モル程度である。
ポリアルキレングリコールにカルボキシル基を
付与する方法としては、アルカンジカルボン酸等
ポリカルボン酸のカルボキシル基を用い、エステ
ル結合によりカルボキシル基を導入する方法、あ
るいはポリアルキレングリコールの水酸基を酸化
しカルボキシル基としてもよい。ポリカルボン酸
の例としては、コハク酸、グルタール酸、アジピ
ン酸等カルボキシル基以外の官能基を有さないジ
カルボン酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸等のカルボキシル基以外の官能基を有し、
かつその官能基が目的の反応を阻害しないように
保護されたもの、またニトリロ三酢酸、トリカル
バリツク酸あるいはエチレンジアミン四酢酸等の
ポリカルボン酸であつてもよい。
付与する方法としては、アルカンジカルボン酸等
ポリカルボン酸のカルボキシル基を用い、エステ
ル結合によりカルボキシル基を導入する方法、あ
るいはポリアルキレングリコールの水酸基を酸化
しカルボキシル基としてもよい。ポリカルボン酸
の例としては、コハク酸、グルタール酸、アジピ
ン酸等カルボキシル基以外の官能基を有さないジ
カルボン酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸等のカルボキシル基以外の官能基を有し、
かつその官能基が目的の反応を阻害しないように
保護されたもの、またニトリロ三酢酸、トリカル
バリツク酸あるいはエチレンジアミン四酢酸等の
ポリカルボン酸であつてもよい。
一方、例えばハロゲン化モノカルボン酸、アミ
ノ基含有モノカルボン酸により、ポリアルキレン
グリコールの水酸基との間で脱ハロゲン化水素を
おこなうことによつて目的とするカルボキシキル
基を含むポリアルキレングリコールを得ることが
できる。また、ポリカルボン酸の無水物とポリア
ルキレングリコールの反応によつても目的とする
物質を得ることができる。
ノ基含有モノカルボン酸により、ポリアルキレン
グリコールの水酸基との間で脱ハロゲン化水素を
おこなうことによつて目的とするカルボキシキル
基を含むポリアルキレングリコールを得ることが
できる。また、ポリカルボン酸の無水物とポリア
ルキレングリコールの反応によつても目的とする
物質を得ることができる。
反応時に存在せしめるアミノ酸は、例えば天然
に存するアミノ酸を使用すればよく、リジン、ア
ルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グリ
シン、フエニルアラニン等の中性アミノ酸、グル
タミン酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸が例
示される。一方、使用するアミノ酸は１種または
２種以上であるが、アミノ酸の使用量はヘモグロ
ビン１モルに対し１〜100モル程度、好ましくは
５〜20モル程度である。
に存するアミノ酸を使用すればよく、リジン、ア
ルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グリ
シン、フエニルアラニン等の中性アミノ酸、グル
タミン酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸が例
示される。一方、使用するアミノ酸は１種または
２種以上であるが、アミノ酸の使用量はヘモグロ
ビン１モルに対し１〜100モル程度、好ましくは
５〜20モル程度である。
前記アミノ酸の存在下に反応せしめる以外は、
ヘモグロビンとポリアルキレングリコールの結合
方式は公知の方法、例えば２，2′−ジクロロベン
ジジン、Ｐ，P′−ジクロロ−ｍ，m′−ジニトロ
フエニクレスルホン、２，４−ジクロルニトロベ
ンゼン等の結合剤を用い得るが、反応の選択性を
考慮すれば下記のような方法をとることが好まし
い。
ヘモグロビンとポリアルキレングリコールの結合
方式は公知の方法、例えば２，2′−ジクロロベン
ジジン、Ｐ，P′−ジクロロ−ｍ，m′−ジニトロ
フエニクレスルホン、２，４−ジクロルニトロベ
ンゼン等の結合剤を用い得るが、反応の選択性を
考慮すれば下記のような方法をとることが好まし
い。
最初にポリアルキレングリコールを高い反応性
をもつ誘導体とし、次いでこれとヘモグロビンと
を反応させる方法がある。
をもつ誘導体とし、次いでこれとヘモグロビンと
を反応させる方法がある。
このようにカルボキシル基を付与されたポリア
ルキレングリコールとヘモグロビンの反応に際し
て、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−
ヒドロキシフタル酸イミド、ｐ−ニトロフエノー
ル、ペンタクロロフエノール等通常のペプチド合
成におけるカルボン酸活性化剤により活性エステ
ルとし、これとヘモグロビンと反応させてアミド
交換することもできるし、塩化チオニン等ハロゲ
ン化剤を作用させてポリアルキレングリコールの
酸ハロゲン化物とし、これとヘモグロビンとを反
応させることもできる。
ルキレングリコールとヘモグロビンの反応に際し
て、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−
ヒドロキシフタル酸イミド、ｐ−ニトロフエノー
ル、ペンタクロロフエノール等通常のペプチド合
成におけるカルボン酸活性化剤により活性エステ
ルとし、これとヘモグロビンと反応させてアミド
交換することもできるし、塩化チオニン等ハロゲ
ン化剤を作用させてポリアルキレングリコールの
酸ハロゲン化物とし、これとヘモグロビンとを反
応させることもできる。
ヘモグロビンとポリアルキレングリコールとを
結合させる反応時に、酸素不存在か酸素低濃度と
するのが好ましい、酸素分圧として０〜30mmHg
程度を選択すればよい。上記酸素濃度以外の反応
条件は、ヘモグロビンの変性を伴わない条件であ
ればいずれであつてもよい。
結合させる反応時に、酸素不存在か酸素低濃度と
するのが好ましい、酸素分圧として０〜30mmHg
程度を選択すればよい。上記酸素濃度以外の反応
条件は、ヘモグロビンの変性を伴わない条件であ
ればいずれであつてもよい。
酸素の濃度を低下させるには、窒素、アルゴ
ン、ヘリウム等の不活性ガスで反応容器中の空気
を置換する方法、容器中の酸素を還元剤
（NaBH4，Na2S2O4等）によつて還元し除去する
方法、ポンプ等で脱ガスしアルゴン等の不活性ガ
スで置換する方法等、公知の方法を採用すること
ができる。
ン、ヘリウム等の不活性ガスで反応容器中の空気
を置換する方法、容器中の酸素を還元剤
（NaBH4，Na2S2O4等）によつて還元し除去する
方法、ポンプ等で脱ガスしアルゴン等の不活性ガ
スで置換する方法等、公知の方法を採用すること
ができる。
実施例
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例 １
期限切れ輸血用血液の赤血球50mlを0.9％の食
塩水50mlで遠心分離機を用いて４℃で４回洗浄し
た。これを同容の水で溶血し、0.4容のトルエン
を加えた後１時間攪拌した。その後8000回転で１
時間遠心分離を行うことによつて膜成分とヘモグ
ロビンを分離した。得られたヘモグロビン溶液を
0.22μmのセルロースアセテート膜（米国ミリポ
ア社製）で膜成分を除き、ヘモグロビン溶液（15
％重量濃度）を得た。
塩水50mlで遠心分離機を用いて４℃で４回洗浄し
た。これを同容の水で溶血し、0.4容のトルエン
を加えた後１時間攪拌した。その後8000回転で１
時間遠心分離を行うことによつて膜成分とヘモグ
ロビンを分離した。得られたヘモグロビン溶液を
0.22μmのセルロースアセテート膜（米国ミリポ
ア社製）で膜成分を除き、ヘモグロビン溶液（15
％重量濃度）を得た。
このヘモグロビン溶液を0.1Mのリン酸緩衝液
（PH＝7.4）に対して透析した後これを同じ0.1M
のリン酸緩衝液（PH＝7.4）で希釈し、６％のヘ
モグロビン溶液を得た。
（PH＝7.4）に対して透析した後これを同じ0.1M
のリン酸緩衝液（PH＝7.4）で希釈し、６％のヘ
モグロビン溶液を得た。
この６％のヘモグロビン溶液100mlにグリシン
104.7mg（ヘモグロビンに対して15倍当量）を加
えた後ポリエチレングリコールスクシンイミジル
スクシネート（分子量3800）3.53g（ヘモグロビン
に対して10倍当量）を加えた。30分後1N水酸化
ナトリウム溶液でPHを7.8にした後さらに30分間
反応させた。
104.7mg（ヘモグロビンに対して15倍当量）を加
えた後ポリエチレングリコールスクシンイミジル
スクシネート（分子量3800）3.53g（ヘモグロビン
に対して10倍当量）を加えた。30分後1N水酸化
ナトリウム溶液でPHを7.8にした後さらに30分間
反応させた。
なおポリエチレングリコールスクシンイミジル
スクシネートは以下のようにして調製した。まず
ポリエチレングリコール（分子量3400）と無水コ
ハク酸を無溶媒で100℃３時間反応させ、ポリエ
チレングリコールのコハク酸エステルを合成し
た。このポリエチレングリコールのコハク酸エス
テルとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドをジメチル
ホルムアミド溶媒中ジシクロヘキシルカーボジイ
ミドの存在下で反応させることによつてポリエチ
レングリコールスクシンイミジルスクシネートを
合成した。
スクシネートは以下のようにして調製した。まず
ポリエチレングリコール（分子量3400）と無水コ
ハク酸を無溶媒で100℃３時間反応させ、ポリエ
チレングリコールのコハク酸エステルを合成し
た。このポリエチレングリコールのコハク酸エス
テルとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドをジメチル
ホルムアミド溶媒中ジシクロヘキシルカーボジイ
ミドの存在下で反応させることによつてポリエチ
レングリコールスクシンイミジルスクシネートを
合成した。
このポリエチレングリコールスクシンイミジル
スクシネートの400MHz1HNMRスペクトルをＤ
化クロロホルム中で測定した結果ポリエチレング
リコールに結合したコハク酸のメチレンプロトン
シグナルのケミカルシフトはテトラメチルシラン
を標準物質として、2.97ppmと2.78ppmでそれぞ
れトリプレツトであつた。またＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドのメチレンプロトンシグナルのケミ
カルシフトは2.85ppmでシングレツトであつた。
スクシネートの400MHz1HNMRスペクトルをＤ
化クロロホルム中で測定した結果ポリエチレング
リコールに結合したコハク酸のメチレンプロトン
シグナルのケミカルシフトはテトラメチルシラン
を標準物質として、2.97ppmと2.78ppmでそれぞ
れトリプレツトであつた。またＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドのメチレンプロトンシグナルのケミ
カルシフトは2.85ppmでシングレツトであつた。
ヘモグロビンとポリエチレングリコールスクシ
ンイミジルスクシネートの反応終了後ゲル過型
高速液体クロマトグラフイーにより生成物の分子
量分布を測定した。カラムは東洋ソーダ製「Ｇ−
3000SW」を用い、溶離液は0.1Mリン酸緩衝液
（PH＝6.8）を使用した。溶離液の流速は1.0ml／
分である。得られたヘモグロビン−ポリエチレン
グリコール結合体の高速液体クロマトグラムを図
１に示した。図１で示されるように得られた結合
体は分子量が30万以上と８万以下の成分の割合は
小さいものであつた。
ンイミジルスクシネートの反応終了後ゲル過型
高速液体クロマトグラフイーにより生成物の分子
量分布を測定した。カラムは東洋ソーダ製「Ｇ−
3000SW」を用い、溶離液は0.1Mリン酸緩衝液
（PH＝6.8）を使用した。溶離液の流速は1.0ml／
分である。得られたヘモグロビン−ポリエチレン
グリコール結合体の高速液体クロマトグラムを図
１に示した。図１で示されるように得られた結合
体は分子量が30万以上と８万以下の成分の割合は
小さいものであつた。
実施例 ２
実施例１で得られたヘモグロビンの0.1Mリン
酸緩衝溶液（ヘモグロビン重量濃度６％PH＝7.4）
100mlにＬ−リジン163.2mg（ヘモグロビンに対し
て12倍モル）を加えた後ポリエチレングリコール
スクシンイミジルスクシネート4.24g（ヘモグロビ
ンに対して12倍モル）を加えた。以下実施例１と
同様にして生成物の分子量分布を測定した。生成
物の高速液体クロマトグラムを図２に示した。実
施例１と同様分子量30万以上と８万以下の成分の
割合は小さかつた。
酸緩衝溶液（ヘモグロビン重量濃度６％PH＝7.4）
100mlにＬ−リジン163.2mg（ヘモグロビンに対し
て12倍モル）を加えた後ポリエチレングリコール
スクシンイミジルスクシネート4.24g（ヘモグロビ
ンに対して12倍モル）を加えた。以下実施例１と
同様にして生成物の分子量分布を測定した。生成
物の高速液体クロマトグラムを図２に示した。実
施例１と同様分子量30万以上と８万以下の成分の
割合は小さかつた。
比較例 １
実施例１で得られたヘモグロビンの0.1Mリン
酸緩衝溶液（ヘモグロビン重量濃度６％PH＝7.4）
100mlにそれぞれアミノ酸を添加することなくポ
リエチレングリコール1.24g（3.5当量）、1.41g（4.0
当量）、1.59g（4.5当量）を加えた。
酸緩衝溶液（ヘモグロビン重量濃度６％PH＝7.4）
100mlにそれぞれアミノ酸を添加することなくポ
リエチレングリコール1.24g（3.5当量）、1.41g（4.0
当量）、1.59g（4.5当量）を加えた。
反応終了後のそれぞれの高速液体クロマトグラ
ムを図３，４および５に示した。いずれの場合も
実施例１および２で得られた結合体よりも分子量
30万以上と８万以下の成分の割合が大きいことが
わかる。
ムを図３，４および５に示した。いずれの場合も
実施例１および２で得られた結合体よりも分子量
30万以上と８万以下の成分の割合が大きいことが
わかる。
従つて、６％ヘモグロビン溶液でアミノ酸を添
加することなく実施例１および２で得られたよう
な分子量分布が８万〜30万であるヘモグロビン−
ポリエチレングリコール結合体を製造することは
不可能であつた。
加することなく実施例１および２で得られたよう
な分子量分布が８万〜30万であるヘモグロビン−
ポリエチレングリコール結合体を製造することは
不可能であつた。
実施例 ３
実施例１と同様にヘモグロビンの0.1Mリン酸
緩衝液（ヘモグロビン重量濃度12％PH＝7.4）100
mlを調製し、Ｌ−アラニン165.7mg（ヘモグロビ
ンに対して10倍モル）を加えた後ポリエチレング
リコールスクシンイミジルスクシネート7.07g（ヘ
モグロビンに対して10倍モル）を加える。以下、
実施例１と同様にして生成物の分子量分布を測定
した。生成物の高速液体クロマトグラムを図６に
示す。この図に示されるようにヘモグロビン重量
濃度が12％になつても６％の時と同様分子量30万
以上と８万以下の成分の割合は小さかつた。
緩衝液（ヘモグロビン重量濃度12％PH＝7.4）100
mlを調製し、Ｌ−アラニン165.7mg（ヘモグロビ
ンに対して10倍モル）を加えた後ポリエチレング
リコールスクシンイミジルスクシネート7.07g（ヘ
モグロビンに対して10倍モル）を加える。以下、
実施例１と同様にして生成物の分子量分布を測定
した。生成物の高速液体クロマトグラムを図６に
示す。この図に示されるようにヘモグロビン重量
濃度が12％になつても６％の時と同様分子量30万
以上と８万以下の成分の割合は小さかつた。
実施例 ４
実施例３と同様にヘモグロビンの0.1Mリン酸
緩衝溶液（ヘモグロビン重量濃度12％PH＝7.4）
100mlにグリシン279.3mg（ヘモグロビンに対して
20倍モル）を加えた後ポリエチレングリコールス
クシンイミジルスクシネート10.6g（ヘモグロビン
に対して15倍モル）を加えた。以下、実施例１と
同様にして生成物の分子量分布を測定した。生成
物の高速液体クロマトグラムを図７に示す。実施
例３と同様分子量30万以上と８万以下の成分の割
合は小さかつた。
緩衝溶液（ヘモグロビン重量濃度12％PH＝7.4）
100mlにグリシン279.3mg（ヘモグロビンに対して
20倍モル）を加えた後ポリエチレングリコールス
クシンイミジルスクシネート10.6g（ヘモグロビン
に対して15倍モル）を加えた。以下、実施例１と
同様にして生成物の分子量分布を測定した。生成
物の高速液体クロマトグラムを図７に示す。実施
例３と同様分子量30万以上と８万以下の成分の割
合は小さかつた。
比較例 ２
実施例３と同様にヘモグロビンの0.1Mリン酸
緩衝液（ヘモグロビン重量濃度12％PH＝7.4）100
mlにアミノ酸を添加することなくポリエチレング
リコールスクシンイミジルスクシネート1.41g（ヘ
モグロビンに対して２倍モル）または2.12g（ヘモ
グロビンに対して３倍モル）を加えた。反応終了
後のそれぞれの高速液体クロマトグラムを図８，
９に示した。比較例１と同様アミノ酸を添加しな
い場合は分子量30万以上と８万以下の成分の割合
が大きいことがわかる。従つて、ヘモグロビンの
重量濃度が12％の場合もアミノ酸を添加すること
なく分子量範囲が10万〜30万のヘモグロビン−ポ
リエチレングリコール結合体を調製することは不
可能であつた。
緩衝液（ヘモグロビン重量濃度12％PH＝7.4）100
mlにアミノ酸を添加することなくポリエチレング
リコールスクシンイミジルスクシネート1.41g（ヘ
モグロビンに対して２倍モル）または2.12g（ヘモ
グロビンに対して３倍モル）を加えた。反応終了
後のそれぞれの高速液体クロマトグラムを図８，
９に示した。比較例１と同様アミノ酸を添加しな
い場合は分子量30万以上と８万以下の成分の割合
が大きいことがわかる。従つて、ヘモグロビンの
重量濃度が12％の場合もアミノ酸を添加すること
なく分子量範囲が10万〜30万のヘモグロビン−ポ
リエチレングリコール結合体を調製することは不
可能であつた。
以上から明らかな如く、本発明により、ヘモグ
ロビンとポリエチレングリコールとの反応をアミ
ノ酸存在下で行うことによつて、高濃度のヘモグ
ロビンを使用しても分子量分布のせまいヘモグロ
ビン−ポリエチレングリコール結合体を製造する
ことが可能になつた。
ロビンとポリエチレングリコールとの反応をアミ
ノ酸存在下で行うことによつて、高濃度のヘモグ
ロビンを使用しても分子量分布のせまいヘモグロ
ビン−ポリエチレングリコール結合体を製造する
ことが可能になつた。
図１〜２，６〜７はそれぞれ実施例１〜４で得
られた結合体の高速液体クロマトグラムを示し、
図３〜５は比較例１で得られた結果を示し、図８
〜９は比較例２で得られた結果を示した。
られた結合体の高速液体クロマトグラムを示し、
図３〜５は比較例１で得られた結果を示し、図８
〜９は比較例２で得られた結果を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヘモグロビンと、両端にカルボキシル基を有
するポリアルキレングリコールとを反応せしめて
ヘモグロビン−ポリアルキレングリコール結合体
を製造する方法において、アミノ酸の存在下に反
応せしめることを特徴とするヘモグロビン−ポリ
アルキレングリコール結合体の製造方法。 ２ アミノ酸が、天然に存するアミノ酸の少なく
とも一種を含有するものである特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ アミノ酸が、ヘモグロビンに対するモル比で
１〜100となるように存在している特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ４ ヘモグロビンの濃度が２〜30％（重量）であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59174351A JPS6153223A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | ヘモグロビン−ポリアルキレングリコ−ル結合体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59174351A JPS6153223A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | ヘモグロビン−ポリアルキレングリコ−ル結合体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6153223A JPS6153223A (ja) | 1986-03-17 |
| JPH0564128B2 true JPH0564128B2 (ja) | 1993-09-14 |
Family
ID=15977118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59174351A Granted JPS6153223A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | ヘモグロビン−ポリアルキレングリコ−ル結合体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6153223A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6667292B1 (en) | 1999-02-08 | 2003-12-23 | Hokkaido University | Nitric monoxide metabolite-polyoxyalkylene-hemoglobin complex |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100316154B1 (ko) * | 1999-03-26 | 2001-12-12 | 노광 | 폴리에틸렌글리콜－헤모글로빈 결합체 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6023084B2 (ja) * | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
| JPS57206622A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Ajinomoto Co Inc | Blood substitute |
| JPS5989629A (ja) * | 1982-11-15 | 1984-05-23 | Ajinomoto Co Inc | 代用血液 |
| JPS59104323A (ja) * | 1982-12-07 | 1984-06-16 | Ajinomoto Co Inc | 代用血液 |
-
1984
- 1984-08-22 JP JP59174351A patent/JPS6153223A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6667292B1 (en) | 1999-02-08 | 2003-12-23 | Hokkaido University | Nitric monoxide metabolite-polyoxyalkylene-hemoglobin complex |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6153223A (ja) | 1986-03-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |