JPH056560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

(イ)産業上の利用分野 この発明は、固定化物及びその製造法に関す
る。さらに詳しくは酵素、抗原、抗体、微生物、
細菌等のペプチド剤含有物質を固定化してなり、
各種分析用のパイオリアクターや合成用バイオリ
アクターとして有用な固定化物に関する。 (ロ)従来技術 最近、酵素等のペプチド剤含有物質をガラス担
体に固定化した固定化物ことに固定化酵素が診断
用や合成用のバイオリアクターとして用いられる
ようになつてきた。これらの固定化物の製造法と
しては、溶融法によつて予め得られたSiO₂系ガ
ラスの表面をアルカリ処理して水酸基を生成さ
せ、これに例えばアミノアルキル基を導入しこれ
に酵素を付加して固定させる方法が知られており
実用化されている。 しかし上記従来の方法ちおいてはガラス表面に
水酸基を生成させる工程が必要であり、それによ
つて生成しうる水酸基の単位面積当りの量は限度
があつて酵素等の固定量を増大し活性の高い固定
化物を得ることが困難であつた。 一方、ガラスの代りに合成高分子例えばナイロ
ン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等を担体
として用いた固定化物も知られているが、これら
は耐熱性、耐薬品性の点で弱く、かつ機械的強度
に問題があつた。 これらの点につき、この発明の発明者らは先
に、金属アルコキシドを加水分解して得られるゲ
ル体を固定化用の担体として用いると、水酸基の
導入工程を行なうことなく高活性でかつ耐久性の
良好な固定化物が得られる事実を見出した。 この発明は、上記知見をさらに発展させること
によりなされたものである。 (ハ)目的 この発明は、従来に比して筒便に作製できかつ
高活性の固定化物を提供することを目的とするも
のである。 (ニ)構成 かくしてこの発明によれば、ペプチド含有物質
が酸素原子を配位子とする有機金属キレート化合
物の加水分解で生成する水酸化金属化合物及び／
又はその縮合物からなるゲル体に固定されてなる
固定化物が提供される。 この発明における有機金属キレート化合物とし
ては、キレート滴定や有機合成の分野で使用され
る種々の含酸素有機金属キレート化合物が包含さ
れ、例えばアルカジオン又はその誘導体の金属キ
レート化合物が挙げられる。より具体的な例とし
ては、２，４−ベンタンジオン（アセチルアセト
ン）、３−フエニル−２，４−ベンタンジオン
（３−フエニルアセチルアセトン）、２，４−ヘキ
サンジオン、２，４（又は３，５）−ヘプタンジオ
ン、２，２，６，６−テトラメチル−３，５−ヘ
プタンジオン）ジピパロイルメタン）等の低級ア
ルカリジオン類の金属キレート化合物が挙げら
れ、キレートされる金属としては、例えばカルシ
ウム、アルミニウム、チタン、亜鉛、鉄、ジルコ
ニウム、カリウム等が挙げられる。これらのう
ち、通常、アセチルアセトンアルミニウム、アセ
チルアセトンチタン、を用いるのが好適である。 この発明の固定化物を得るに当つて、まず上記
有機金属キレート化合物は加水分解によつてゲル
体とされる。この加水分解は有機金属キレート化
合物に水を接触させることにより行なわれ、通
常、該キレート化合物の有機溶媒溶液と水とを混
和することによつて行なうのが適している。この
有機溶媒としては敷親水性でかつ発揮性の用材を
用いるのが適しており、例えばメタノール、エタ
ノール等の低級アルコール類が挙げられる。 水との接触により、有機金属キレート化合物は
徐々に加水分解を始める。加水分解が進行してい
る間、混和物を５〜45℃程度の温度下に保持して
副生する低級アルコールを逸散させることが、所
望のゲル体を効率よく得る点で適している。ただ
し副生するアルコールが常温下で自然揮散する場
合には、とくに加温する必要はない。 加水分解が進行することにより対応する水酸化
金属化合物が生成し、通常、１分〜12時間程度で
水酸化金属化合物及び／又はその低縮合物からな
るゲル体が得られる。このゲル体は攪拌下分散粒
状に形成させてもよい。このゲル体はガラス様の
不安定なものであり、通常充分な乾燥（50〜200
℃程度）を行なつて単離した後適当な大きさに粉
砕して固定化物の担体として用いる。場合によつ
ては、そのまゝ又は適当な形状に成形して用いて
もよい。ただしかゝるゲル体の作製は、適当な支
持体（例えばガラス管や金属管、ガラス粒等）に
加水分解進行中の有機金属キレート化合物を塗布
し、そこで膜状となるように行なうことができ
る。かゝる支持体を含む膜状のゲル体も固定化用
の担体として好適に用いられ、ゲル体の造膜とは
かゝる態様を意味するものである。 例えば、有機金属キレート化合物としてアセチ
ルアセトンアルミニウム〔Al
（CH₃COCH₂COCH₃）₃〕を用いた際にはガラス
様のゲル体が得られるがその組成はAl（OH）₃又
はその低縮合物〔Al（OH）₃系ゲル〕からなるた
め、従来のSiO₂系ガラスにアルカリ処理により
導入された水酸基に比して非常に多数の水酸基を
それ自身有している。従つて従来の担体に比して
多量の酸素等を固定化できるものである。もちろ
ん他の同様な有機金属キレート化合物についても
同様である。 なお、上記加水分解の際、少量の鉱酸を添加す
ることにより加水分解速度を促進することができ
るが、ことにその系中にフツ化水素酸を少量添加
することによりこの水酸基の活性やゲル体自体の
多孔度がより向上し、より多量な酸素等が固定化
しうる事実も見出された。この際のフツ化水素酸
の添加量は、有機金属キレート化合物１モル化合
物に対するモル比として表わせば0.1〜1.0モルが
適切である。上記水酸基の活性度の向上効果は、
主としてゲル中の金属元素に直接結合されたフツ
素原子の効果によるものと考えられる。 かくして得られたゲル体はガラス様でありかつ
顕微鏡的に多孔質のものであり、酸素等のペプチ
ド含有物質の固定化に好適に用いられる。 ペプチド含有物質の上記ゲル体への固定化は通
常シランカツプリング剤を用いることによる行な
う。 このシランカツプリング剤とは、アミノ基、チ
オール基、エポキシ基などの官能性基を有する当
該分野で公知のシラン誘導体が適用でき、具体的
にはγ−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ
−タロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルト
リエトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルト
リメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ
−アミノプロピルトリメトキシシラン等が使用さ
れる。かようなシランカツプリング剤との反応
は、当該分野で公知の条件下で行なわれる。例え
ばγ−アミノプロピルトリエトキシシランを用い
場合、このカツプリング剤を水に溶解して約10％
水溶液としかつpHを３〜５に調整した後、この
溶液に充分に乾燥された前記ゲル体を加えるか又
は造膜されたゲル体に接触保持させ、加温下混合
して数時間処理した後水洗し未反応のカツプリン
グ剤を除去することにより得られる。 上記、シランカツプリング剤を導入したゲル体
は、それ自身従来のガラスに導入したものに比し
て担体として多くのカツプリング基を有してお
り、酸素当の反応活性が高く固定化酵素用担体や
カラム充填材として有用なものである。 このようにして処理されたゲル体に公知の方法
で酵素、抗原、抗体、微生物、細菌等のペプチド
含有物質が固定化される。例えば、カツプリング
剤としてγ−アミノプロピルトリエトキシシラン
を用いアミノアルキル基を水酸基にエステル結合
で多数導入したゲル体を用いる場合、上記アミノ
アルキル基にタルアルデヒドを用いてアルデヒド
基をするシツフベースを導入し、これに酵素等を
接触させてアルデヒド基と酵素等のアミノ基間で
さらにシツフベースを形成させて結合することに
より固定化を行なうことができ、これ以外にもア
ミノアルキル基をジアゾ化して芳香族アミノ基を
導入しこれに酵素等を固定化してもよく、またカ
ルジイミドを用いてアミノアルキル基と酵素等と
の間に直接ペプチド結合を行ない固定化を行なつ
てもよく酵素等の種類に応じて適宜選択すればよ
い。他のカツプリング剤使用時にも同様に直接又
は適宜変換したカツプリング基によつて酵素等を
固定化することができる。 ただし、固定化はプロモシアン（BrCN）によ
つてCN基を仲介してOH基に酵素等を固定化す
ることによりシランカツプリング剤を用いずに行
なうこともできる。 固定化用の酵素としては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、同様に抗原、抗体、微生物、細菌
を固定化することもできる。 このようにして得られた固定化ゲル体（固定化
物）は従来のガラス担体を用いた固定化物と同様
に、種々の形態で診断用や合成用のバイオリアク
ターとして有用であり、さらね従来の固定化物に
比して担体当りの酵素等の固定量は多くバイオリ
アクターとしての能力が増大されたものである。
また、用いる有機金属キレート化合物も金属アル
コキシド類に比して溶媒溶解性が酔いため、製造
時の操作もより筒便であり有利である。 (ホ)実施例 （担体の製造−工程１） アセチルアセトンアルミニウム〔Al
（CH₃COCH₂COCH₃）₃〕８ｇにメタノール40ml
を加え、80℃下、１時間水浴槽中で攪拌して均一
に溶解させた。このアセチルアセトンアルミニウ
ム溶液に水40mlを加えて混合した後、25℃下、開
放下で保持して加水分解を進行させつゝ副生する
アルコール及び溶媒のメタノールを揮散させ、５
時間後に白色で塊状のゲル体が得られた。このゲ
ル体を約500℃で５分間乾燥させてAl（OH）₃系ゲ
ル体を得た。 （アミノアルキル化−工程２） 工程１で得られたゲル体を乳鉢で粉砕し、ふる
いを通して100〜200メツシユのビーズを得た。 5wtのγ−アミノプロピルトリエトキシシラン
水溶液を5N塩酸でpH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し上記ビーズ状ゲル体を１ｇ投入し、さら
にpH3.5になるように調整した。この混合物を、
攪拌機、温度計、ジムロートを付設した四ツ口フ
ラスコに入れウオーターバスで温度を75℃に保
ち、激しく攪拌させながら３時間反応を行なつ
た。反応終了後、ビーズを吸引メンプランフイル
ターに移し、１の蒸溜水で未反応のγ−アミノ
プロピルトリエトキシシランを除去した後、デシ
ケーターで乾燥させてアミノアルキル化ゲル体を
得た。このアミノアルキル化ゲル体はデシケータ
ー内で保存する。 （酸素の固定化−工程３） 上記アミノアルキル化ゲル体（ビーズ状）を
各々二官能性のグルタルアルデヒド（25wt％）
のリン酸塩緩衝溶液（pH7.0）に浸漬し、アスピ
レーターで減圧させつつ約30分攪拌下反応させ
た。続いてさらに約30分常圧で攪拌下反応させ
た。反応温度は25℃であつた。これをpH7.0のリ
ン酸塩緩衝溶液で充分に洗浄し、乾燥させた。こ
の処理によりゲル体にアルデヒド基を有するシツ
フベースが導入される。 得られたゲル体を１mg／ml（グルコースオキシ
ダーゼ／pH7.0のリン酸塩緩衝溶液）中に浸漬
し、25℃下まず30分減圧下で緩やかに攪拌して反
応を行ない、続いて60分常圧下で緩やかに攪拌し
て固定化反応を行なつた。この処理によりグルコ
ースオキシダーゼのアミノ基が反応に関与し、担
体（ゲル体）のアルデヒド基とさらにシツフベー
スを形成し固定化される。このようにしてこの発
明のグルコースオキシダーゼ（1000IU）固定化
物（ビーズ）が得られた。 （活性試験） 上記固定化物の固定化度合を従来と比較するた
めボルタンメトリー法により活性試験を行なつ
た。まず0.1wt％のβ−Ｄ（＋）グルコース溶液
（pH7.0のリン酸塩緩衝溶液10mlを、上記この発
明の固定化ビーズ１ｇを入れたビーカーに注入し
15分間緩やかに攪拌して反応させ、反応液から９
mlを採取して５％ヨウ化カリウム溶液１mlを添加
した。この操作により、酵素反応により発生した
過酸化水素でI^-がI₂（aq）に酸化される。このI₂
をボルタンメトリー法により還元し、還元波を測
定することによりI₂量が定量でき、ひいては固定
化ビーズにおける酵素の固定化の程度すなわち活
性の程度がわかる。 従来のガラスを担体とする固定化ビーズとこの
発明の固定化ビーズとのボルタンメトリー法によ
る結果を表１に示す。なお、比較例はElectro−
Nucleonics社製のAminopropyl CPGのビーズを
用いた。

【表】 秒である。
このようにこの発明の固定化物は、従来のガラ
スを担体とするものに比して２倍の活性を示し、
明らかに酵素活性が高いことが判る。 (ヘ)効果 以上述べたごとく、この発明の固定化物は、高
温加熱処理工程を要しないエル体を担体としかつ
固定化に当つて水酸基を導入する工程を必要とし
ないため、従来に比して大幅にコストを低減で
き、また水系媒体中で処理できる点有利であり、
さらに家庭科物も従来のものに比して活性の高い
ものが得られ、工業上極めて有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペプチド含有物質が、酸素原子を配位子とす
   る有機金属キレート化合物の加水分解で生成する
   水酸化金属化合物及び／又はその縮合物からなる
   ゲル体に固定化されてなる固定化物。 ２ 酸素原子を配位子とする有機金属キレート化
   合物の一種又は二種以上を加水分解してゲル体を
   得、この粉砕物又は粒状物を担体としてこれにカ
   ツプリング剤を用いてペプチド剤含有物質を固定
   化することを特徴とする固定化物の製造法。 ３ 酸素原子を配位子とする有機金属キレート化
   合物の一種又は二種以上の溶液を、支持体に塗布
   し、そこで加水分解させてゲル体膜を造膜し、こ
   のゲル体膜を担体としてこれにカツプリング剤を
   用いてペプチド含有化合物を固定化することを特
   徴とする固定化物の製造法。