JPH05500977A - 液体酵素洗剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 液体酵素洗剤組成物 技術分野 本発明は、液体酵素洗剤組成物およびその組成物内で使用するための安定化され た液体の形態にある酵素洗剤添加剤に関する。本発明は、又特に液体酵素洗剤又 は液体酵素洗剤添加剤の調製において、酵素の溶解性を増加する方法にも関する 。

背景技術 酵素は、洗浄力を改善するために液体洗剤中に通常配合される。酵素と共に最も 普通に用いられる洗剤酵素は、プロテアーゼ、主にアルカリ性プロテアーゼ、例 えばズブチリシン力ルスベルク（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ） である。従来技術では、液体酵素洗剤の製剤化、特に保存中の酵素の安定性の改 良を広範囲に扱っている。最近の一例は、ヨーロッパ特許３５２．２４４である 。

一般に、酵素は保存中に相分離を防止し更に酵素活性を洗浄中に直ちに得ること ができるように液体洗剤中に完全に溶解されるべきである。

本発明者らは、ある液体洗剤中で、酵素は完全に溶解しておらず、沈殿し得るこ とを見出した。

本発明の目的は、改善された酵素溶解性を有する液体酵素洗剤組成物、その組成 物内で使用される酵素洗剤添加剤および酵素活性の重大な損失なしで酵素の溶解 性を改善する方法を提供するこｇにある。

発明の開示 驚くべきことに、本発明者等は酵素内の遊離の第一アミノ基を化学的に改変する ことにより、酵素活性を保持したま一酵素活性を改良し得ることを見出した。

アルデヒドが酵素内の第一アミノ基と反応し、更にグルタルアルデヒドを用いた 酵素の処理が、酵素の固定化のため例えば水不溶性酵素製品の製造のために広く 用いられていることは公知である（例えば米国特許３，９８°０．５２１、特公 昭５０−０３７２７４）。また、以下の内容も西ドイツ公開特許２，９１９，６ ２２より公知である。すなわち、水不溶性製品は、プロテアーゼをアルデヒド基 金有多１１類、例えばジアルデヒド澱粉で処理することによって得られる。更に 、以下の内容も公知である。すなわち、Ｊ、ボウドラント等、Ｂｉｏｔｅｃｈ、 　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｒｇ、、　ＸＶＩ［、１７１９−３４（１９７６）から公知 である。すなわち、典型的な洗剤用酵素のアルデヒド処理は、酵素蛋白質の一部 を不溶性部分に変換する。英国特許工、２８０．４９７は、例えばグルタルアル デヒドを用いて酵素を処理し次いで不溶性残留物を除去し、粉末洗剤の溶液に添 加した場合酵素の安定性を改善する技術を開示する。しかし、従来技術において 、そのような酵素の処理は、その可溶性を増加するために使用できることは何ら 示唆していない。

従って、本発明は、液体酵素洗剤組成物および安定化された液体の形態にある酵 素洗剤添加剤を提供するものであり、これらは各々は、化学的に改変された第一 アミノ基を含む酵素がそれらの中に溶解されて含まれていることを特徴とする。

更に、本発明は第一アミノ基を含有する酵素の溶解性を増加する方法を提供する ものであり、この方法は該第−アミノ基の全て又は一部を化学的に改変すること を含んでなる。

発明の詳細な説明 群！ 未該アミノ基に加えて、大抵の酵素は特に大抵の洗剤用酵素は、遊離第一アミノ （−ＮＨ，）基を有するリシンを含有する。本発明は、いかなる酵素でも改変す るために用いることができるが、但し、該酵素は、遊離の第一アミノ基を含有す る必要があり、好ましくは１個の分子光たり少なくとも２個、最も好ましくは少 なくとも４個の遊離アミノ基を有する必要がある。典型的には、酵素は分子量２ ０，０００〜１゜ｏ、ｏｏｏ、特に２０，０００〜６０，０００および等電点７ 〜１２を有する。酵素はプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダー ゼ、又はセルラーゼ、特にズブチリン（アルカリ性バシラスブロテアーゼ、例え ば、ズブチリン力ルスベルク、Ｂ６　リチニホルミス由来（例えば、アルカラー ゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ、登録商標）、ノボノルディスク社の製品）、サビナーゼ （Ｓａｖｉｎａｓｅ、登録商標、ノボノルディスク社の製品、米国特許３，７２ ３，２５０に従って好アルカリ性バシラス産生）又は突然変異ズプチリン、例え ばＷＯ３９１０６２７９又はデンマーク特許０５４１／９０に記載されるズブチ リシンである。ズブチリシン　カルスベルクは、分子量２７，０００、および等 電点約８．３を有し、更に分子は１０個のアミノ基（Ｎ−末端および９個のりシ ン基）を含有する。本発明の洗剤は、典型的に１ｋｇ当たり改変された酵素２〜 ４０μ５ｏｌｅを含有する。

化ヱ負改変 本発明によれば、酵素は、第一アミノ基に作用する任意の方法により、特にアル デヒドとの反応により、アシル化により又はアルキル化によって改変することが できる。

酵素は、０．１〜５ｍＭの濃度で水性溶液中で好ましく処理される。処理すべき 酵素は、好ましくは、他の蛍白質および第一アミノ基を有する他の化合物を相当 には含まない。何故なら、それらは反応により改変試剤を妨害し得るからである 。

一般に、改変試剤の量は、第一アミノ基当たり０．１〜３個の反応基、好ましく は０．２〜２個、最も好ましくは０．４〜１．４個を含有する。

単官能性反応剤を用いる場合、過剰の反応剤、例えば理論量の１〜５倍を用いる ことが好ましい。

二官能性（又は、多官能性）反応剤を用いる場合、溶解性を改善するため、好ま しくは、分子間反応によりオリゴマーの形成を最少化することが好ましい。オリ ゴマーの形成は、比較的低濃度の酵素、例えば０．１〜１ｍＭを用いる、および ／又は本質的に化学量論的な量又はそれよりも少ない量、例えば化学量論的量の １０〜１００％の二官能性／多官能性反応剤を用いることによって最少化できる 。もしも、処理後オリゴマーが沈殿する場合、この沈殿物は、（例えば遠心分離 により）除去され、大部分単量体から成る改質酵素を得ることができる。

アルデヒド処理は、脂肪族もしくは芳香族モノアルデヒド又はジアルデヒド、例 えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又はＯ−フタルアルデヒドを用いて 行うことができる。

処理は、好ましくはｐＨ５〜１０でかつ０〜７０°Ｃ１好都合には室温近くの温 度で行なわれる。酵素およびアルデヒドの混合物は、反応が本質的に完結するま で（安定ｐＨによって示される）、典型的には０．５〜８時間放置されるべきで ある。

アシル化は、モノカルボン酸又はジカルボン酸のアルデヒド、例えば酢酸、プロ ピオン酸、酪酸、吉草酸、カピリル酸、アレイン酸、又はコハク酸のアルデヒド を用いることができる。

第一アミノ基のアルキル化は、アルデヒド、例えば上記のアルデヒドを用い例え ば還元的処理により達成できる。

迭五垂■■ 本発明の酵素洗剤添加剤は、保存安定性を改善するため酵素安定化剤を含有する 。多くのこのような酵素は当業者に公知であり、例えばポリオール例えばプロピ レングリコールであり、例えば米国特許４，５４３，３３３又は米国特許４゜４ ９７．８９７に従って２０〜７０％量で典型的には用いら洗Ｍ 本発明は、未改質酵素の安定性を越える濃度で酵素を配合することが望まれるよ うな場合、液体洗剤の製剤化に特に適用できる。

本発明は、特に水分含量２０〜５０％（以下、全ての％は重量基準である）、特 に４０〜５０％を有する均質製液体洗剤に関する。洗剤のｐＨは、６〜１０．５ 、特に７〜９である。

洗剤は、４〜２５％のＣＩＯ〜ＣＩ６アルキルもしくはアルケニルスクシネート 、特に５〜１５％のスクシネートを含有できる。更に、洗剤は他のビルダー、例 えば０．５〜６％のシトレートを含有できる。カチオンは、ナトリウム、カリウ ム、アンモニウム又は七ノー、ジーもしくはトリエタノール−アンモニウムであ ってよい。

洗剤は、更に５〜３０％、特に１０〜２０％のジアルキルスルホスクシネート、 アルキルスルフェート、アルキルエトキシスルフェート、脂肪酸石けん又はこれ らの２種又はそれ以上の組合を含有できる。これらの各々の場合、アルキル基は 、直鎖Ｃ１゜〜Ｃ１ｌ＋であり、カチオンはナトリウム、カリウム、アンモニウ ム又は七ノー、ジー又はトリエタノール−アンモニウムであってヨイ。

洗剤は又、３〜３５％、特に５〜１５％の非イオン性界面活性剤、例えばポリエ トキシル化アルコール又はアルキルフェノールを含有できる。

洗剤は、２〜２０％、特に２〜１０％の溶剤、例えばＣＩ〜Ｃ４アルコールもし くはポリオール、例えばエタノール、又はグリセロール又は２種以上の溶剤の組 合を含有できる。

溶剤は、更に０．５〜５％の１種又はそれ以上の電解質、例えばナトリウムもし くはカリウムのボレート、カーボネート、ホルメート又はクロリドである。

本発明に係る洗剤の特定の例は、１２〜１６μｍｏｌｅ／ｋｇ。

例えば１５μｍｏｌｅ／ｋｇの本発明に係る改質酵素を含ましめ次いで所望によ りドデセニル−スクシネートの代りにドデシル−スクシネートを用いることによ り、ヨーロッパ特許２００゜２６３、同２１２，７２３および同２２３，３０６ に記載される組成物から得られる。

実施例 例１ フタルジアルデヒドを、酵素（アルカラーゼ）の溶液に添加し、６３　ｍｇ／　 ｇ　（２，３μｍｏｔｅ／　ｇ　）の酵素および１■／μ（７，５μ５ｏｌｅ／ 　ｇ　）のアルデヒド、すなわち１個の第一アミノ基当たり０．６５個のアルデ ヒド基の割合を含有する水性系を調製した。系は又、２５％のプロピレングリセ ロール、０．２％のカルシウムイオンおよび１．８％のホルメートイオンを含有 した。ｐＨを１０に調整し、次いでフタルアルデヒドを酵素溶液と約５時間反応 させた。しかる後、溶液を濾過し、ｐＨを５．５に調整した。

フタルアルデヒドとの処理前並びに処理およびｐＨ調整後のプロテアーゼ活性を 測定することによって、検知し得る活性の損失は見出されなかった。

０．６％のこの溶液を、商業的液体洗剤（「アリエル（Ａｒｉｅｌ）（バッチ２ ７９Ａ４２）、ブロクター　アンド　ガンベル（デンマーク国）社製）に添加し た。２５°Ｃおよび３５°Ｃで６週間保存後、洗剤中での酵素の析出は認められ なかった。対照として、アルデヒドで処理しないアルカラーゼを洗剤に添加した （アルデヒド処理酵素に添加した場合と同じ量の活性酵素）。３５℃で４日次い で２５℃で１週間後、針状形の酵素の析出が観察された。

例２ 例１と同様に操作した。但し、フタルジアルデヒドを１０μ５ｏｌｅ／ｇのフタ ルアルデヒド、すなわちモル比０．８７と交換した。洗剤添加後、系を４週間観 察したが、酵素の析出は２５°Ｃでも３５°Ｃでも認められなかった。

例３ グルタルアルデヒドを酵素（アルカラーゼ）溶液に添加し、８７　ｍｇ／　ｇ　 （３，２μｍｏｌｅ／　ｇ　）の酵素および１．１６ｇ／ｇ（１１，６μｍｏｌ ｅ／　ｇ　）のアルデヒド、すなわち、１個の第一アミノ基当たり０．７３個の アルデヒド基の割合を含有する水性溶液を得た。処理中、ｐＨを７．５に保った 。塩基の消費が止むと処理が完了した。次いで、溶液を濾過した。

２５％のプロピレングリコール、０．２％のＣａ、１．８％のホルーメトを含有 し、ｐＨ５，５の製剤を調製した。０．６％のこの製剤を例１における如く同じ 洗剤に添加し、次いで３５°Ｃおよび２５°Ｃで３週間保存したが、結晶性酵素 の析出は認められなかった。

グルタルアルデヒド処理アルカラーゼの分子量壱、未処理アルカラーゼと共して ５ＤＳ−ＰＡＰＥにより測定した。２種の酵素の分子量ははヌ゛同じ２７．００ ０であることが判明した。

例４ グルタルアルデヒドを酵素（アルカラーゼ）溶液に添加し、６０　ｍｇ／　ｇ　 （２，２ｕｒａｏｘｅ／　ｇ　）の酵素および０．９０　ｍｇ／　ｇ（９，０μ ｍｏｌｅ／　ｇ　）のアルデヒド、すなわち、１個の第一アミノ基当たり０．８ ２個のアルデヒド基の割合を含有する水性溶液を得た。処理中、ｐＨを７．５に 保った。塩基の消費が止むと処理が完了した。

次の組成を有する製剤を用いた： 直鎖アルキルスルホネート（ＮＡＮＳＡ　１１６９／Ｐ）　９．６５％アルコー ル　エトキシレート（Ｄｏｂａｎｏｌ　２５−７）　１０．００％２−ドデセニ ル　コハク酸ＦＭ水物１３．６０％クエン酸　０．８５％ オレイン酸　３．６５％ ジエチレントリアミン　ペンタメチレン　リン酸　０．８０％ココナツツ　アル キルスルフェート　ＴＥＡ塩　３．３０％エタノール、９６％　３．００％ １．２−プロパンジオール　１．７０％モノエタノールアミン　０．５０％ ギ酸ナトリウム　０．９５％ 塩化カルシウム（Ｃａ　ＣＩｚ　、２　Ｈｚ　Ｏ）　０．０６％Ｎ　ａ　ＯＨ４ ，１５％ 水　バランス〜１００％ の通りである： Ｉ：次の成分を上記順序で混合する：　ＬＡＳ、１．２−２プロパンジオール、 エタノール、コ・ンコナ・ン゛ンアルキルスルフエートＴＥＡ塩およびモノエタ ノールアミン、次いで、ＮａＯＨおよび２−ドデシルコハク酸無水物を同時に添 加した。

水２分の１、アルコールエトキシレート。

■：残りの半分の水、ギ酸ナトリウム、塩化カルシウム、ホスホネートおよびク エン酸を混合する。

１［１：Ｉ＋ＩＩ＋オレイン酸を混合する。

０．６％のアルデヒド処理酵素を洗剤に添加した。対照として、０．６％の未処 理酵素を同酵素に添加した。

３５°Ｃで３日後、針状最沈澱物の対照洗剤中に観察された。

アルデヒド処理アルカラーゼを配合した洗剤中では、沈Ｒ物は認められなかった 。

制御した温度で保存中、種々の時間の残留酵素活性を測定することにより保存安 定性を測定した。改質酵素を有する洗剤および対照酵素間で差異は認められなか った。

比較洗浄試験では、改質酵素および対照酵素は蛋白質の汚れの除去に対しはＮ′ 同等に有効であった。

例５ １ｇのプロテアーゼ（アルカラーゼ）を、２５Ｉｄの０．１Ｍボレート緩衝液（ ｐＨ７）に０°Ｃで溶解した。アセトンに溶解した１００■／−の無水コハク酸 溶液７００ａｌを少しずつ添加した（理論的には、−ＮＨ２リシン基１個に対し ２．１当量のアルデヒド）。無水コハク酸の各々を添加後、ｐＨを２ＭＮａＯＨ を用いて７に調整した。もはや遊離の酵素が検出されなくなったら、反応混合物 を水に対して透析した。次いで混合物を凍結乾燥した。

１ｇ当たり５５．５５■の改質酵素、２５％のプロピレングリコール、０．２％ のカルシウム、１．８％のギ酸を含有する安定化液体、製剤をｐＨ５，５で調製 した。０．６％の製剤を例１および例４で記載した洗剤に添加した。

無水コハク酸は用いずに同様の方法で酵素を処理して対照製剤を作成した。０． ８％の対照洗剤を洗剤に添加した。

対照洗剤中に、針状最沈澱物が３５°Ｃで１０日間保存後２５°Ｃで１力月保存 後に認められた。本発明に係る改質酵素を有する洗剤中には、沈澱物は認められ なかった。

例６ ５５．５■の純粋な酵素（アルカラーゼ）、２５％のプロピレングリコール、０ ．２％のカルシウムおよび１．８％のギ酸を含有する１０ｇの酵素保存溶液をｐ ）Ｉｓ、２からｐＨ８，０に調整した。２００ｍＭのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ３ＣＮ溶液 ２ｇを添加した。３７％ＨＣＨＯ溶液７３．９７■を部分的に分けて添加した（ １モルのリシンアミノ基当たり５モル当量のＨＣＨＯに対応する）。

反応を室温で２時間行った。ギ酸を用いｐＨを５．２に調整した。

手順中、酵素活性は失われなかった。８０℃１ｇのこの製剤を、例１および例４ で記載した製剤１’Ｏｇに添加した。対照として、８０■の酵素保存溶液を同洗 剤Ｌｏｇに添加した。

１週間後、針状形酵素が対照洗剤中で認められた。一方、本発明に係る改質酵素 を有する洗剤中には沈澱物は認められなかった。

例７ ５５．５■の純粋な酵素（アルカラーゼ）、２５％のプロピレングリコール、０ ．２％のカルシウムおよび１．８％のギ酸を含有するＬｏｇの酵素保存溶液をｐ Ｈ５，２からｐｌ（８，０に調整した。２００ｍＭのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ３ＣＮ溶液 １ｇを添加した。５０％のグルタルアルデヒド溶液３３．３３■を部分的に分け て添加した（１モルのリシンアミノ基当たり０．９１モル当量のグルタルアルデ ヒドに対応する）。反応を室温で２時間行った。

ギ酸を用いｐＨを５．２に調整した。手順中、酵素活性は失われなかった。８０ ■のこの製剤を、例１で記載した洗剤Ｌｏｇに添加した。対照として、８０■の 酵素保存溶液を同洗剤１０ｇに添加した。

３週間後、針状形酵素が対照洗剤中で認められた。一方、本発明に係る改質酵素 を有する洗剤中には沈澱物は認められなかった。

例８ グルタルアルデヒドを酵素（サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）；登録商標）溶液 に添加し、４５　ｍｇ／　ｇ　（１，６μｍｏｌｅ／ｇ）のサビナーゼ（Ｓａｖ ｉｎａｓｅＨ登録商標）および０．３２■／　ｇ　（３，２μｍｏｌｅ／　ｇ　 ）のアルデヒド、すなわち、（１個の第一アミノ基当たり０．３３個のアルデヒ ド分子の割合）を含有する水性溶液を得た。溶液は、又３５％のプロピレングリ コール、０．７％のＣａ←および２％のホルメートを含有していた。ｐＨを８． ０に調整し、次いで溶液を室温で５時間放置して反応せしめた。　− ０，２％の処理サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ；登録商標）を、例１における洗 剤と本質的に同じ組成澄明な洗剤に添加したとき、わずかなもやが３５°Ｃで１ 週間後に観察された。

一方、未処理の酵素は、わずかな沈殿物を生ぜしめた（同じ処方、用量および保 存条件）。４°Ｃで４週間保存したら、同様の傾向が認められた。処理酵素は、 洗剤中にわずかなもやをもたらしたが、−古来処理の酵素は著るしい沈殿物をも たらした。

国際調査報告 国際調査報告 ＰＣＴ／ＤＫ　９０１００２６３

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．化学的に改変した第一アミノ基を含有する酵素をその中に溶解して含んでな ることを特徴とする、液体酵素洗剤組成物。
2. ２．未改変酵素の溶解性を超える濃度で改変した酵素を含んでなる、請求の範囲 第１項記載の液体洗剤組成物。
3. ３．改変したアルカリ性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ、好ましく は改変したズブチリシン　カルスベルクを含んでなる、請求の範囲第１項又は第 ２項記載の液体洗剤。
4. ４．酵素が、アルデヒド、好ましくはグルタルアルデヒドを用いて処理すること により改変されている、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の液体洗剤。
5. ５．酵素が、好ましくは無水コハク酸を用いてアシル化することにより改変され ている、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の液体洗剤。
6. ６．酵素が、アシル化により、好ましくは還元アルデヒド処理により、最も好ま しくは還元アルデヒド処理により改変されている請求の範囲第１〜３項のいずれ かに記載の液体洗剤。
7. ７．単量改質酵素を含んでなる、請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の液体 洗剤。
8. ８．化学的に改変された第一アミノ基を有する酵素をその中に溶解して含んでな る、安定化された液体の形態にある酵素洗剤用添加剤。
9. ９．改変されたアルカリ性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ、好まし くは改変されたズブチリシン　カルスベルクを含んでなる、請求の範囲第８項記 載の洗剤用添加剤。
10. １０．酵素がアルデヒド、好ましくはグルタルアルデヒドを用いた処理により改 変されている、請求の範囲第８項又は第９項記載の洗剤用添加剤。
11. １１．酵素が、好ましくは無水コハク酸を用いたアシル化により改変されている 、請求の範囲第８項又は第９項記載の洗剤用添加剤。
12. １２．酵素か、アルキル化、好ましくは還元的アルデヒド処理、最も好ましくは 還元的アルデヒド処理により改変されている、請求の範囲第８項又は第９項記載 の洗剤用添加剤。
13. １３．酵素が、ポリオール、好ましくはプロピレングリコールにより、更に好ま しくは１０〜４０重量％の量で安定化されている、請求の範囲第８〜１２項のい ずれかに記載の洗剤用添加剤。
14. １４．遊離第一アミノ基を含有する酵素の溶解性を増加する方法であって、該第 一アミノ基の一部又は全てを化学的に改変する、前記方法。
15. １５．酵素がアルカリ性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼ、好ましく は改変されたズブチリシン　カルスベルクである請求の範囲第１４項記載の方法 。
16. １６．酵素を、１個の酵素分子当たり、１〜３０個、好ましくは２〜２０個、更 に最も好ましくは４〜１４個の反応性基で処理する請求の範囲第１４項又は第１ ５項に記載の方法。
17. １７．酵素をアルデヒド、好ましくはグルタルアルデヒドを用いて処理する改変 を含んでなる、請求の範囲第１４〜１６項のいずれかに記載の方法。
18. １８．酵素に対する改変試剤のモル比が第一アミノ基当たり０．１〜５個の反応 性基に相当する、請求の範囲第１４〜１７項のいずれかに記載の方法。
19. １９．酵素を、好ましくは無水コハク酸によるアシル化により改変する、請求の 範囲第１４項又は第１５項記載の方法。
20. ２０．酵素を、アルキル化、好ましくは還元的アルデヒド処理、最も好ましくは 還元的アルデヒド処理により改変する、請求の範囲第１４項又は第１５項記載の 方法。
21. ２１．液体酵素洗剤又は酵素洗剤用添加剤を安定化された液体の形態で調製する 、請求の範囲第１４〜２０項のいずれかに記載の方法。