JPH0566103B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特定の細胞に対して親和性を有する
物質（以下、有親和性物質と称する）と、高分子
体を用いて細胞を分離、採取する方法に関する。

（従来の技術） 極めて複雑な生体内の細胞混合物の中から、目
的の細胞だけを、できる限り純粋に、しかも機能
を損なわずに分離することは、医学、細胞学の基
礎的研究に不可欠であり、また、臨床的にも、す
なわち、各種疾患の診断、治療の面においても極
めて有用である。

たとえば、組織培養研究においては、生体から
取り出した臓器、器官、組織などを体外に取り出
し、目的に応じて、器官または組織のまま、もし
くは、これらから目的の細胞を単離して培養し、
これら器官、組織、細胞の性質、相互作用等を研
究することが行なわれている。特定の細胞の機能
を研究する目的には、解析の困難な多細胞系で実
験を行なうよりも、単一の種類の細胞だけの系を
用いて実験を行なうのが望ましいが、通常、細胞
は多種類の細胞の混合物として得られ、目的の細
胞だけを単離するのは容易ではなく、他の細胞の
混入をいかに抑えるかが、重要な問題となつてい
る。したがつて、目的の細胞だけを確実に単離す
る技術が確立すれば、非常に有用な手段となる。

また、免疫担当細胞であるリンパ球には、その
起源、抗原性、細胞膜表面形質、機能を異にする
Ｔ細胞（胸腺由来リンパ球）とＢ細胞（骨髄由来
リンパ球）という２つの亜集団が存在し、Ｔ細胞
はさらに、その機能からヘルパーＴ細胞、サプレ
ツサーＴ細胞、キラーＴ細胞等、数種類の亜群に
分類されている。これら免疫担当細胞群を選択的
に分離し、量的、質的に把握することができれ
ば、原発性免疫不全症や自己免疫疾患あるいはリ
ンパ系悪性腫瘍の診断、治療に対する有益な知見
を得ることができる。

また、臓器移植の際に重要である組織適合性検
査において、HLAタイピングに先立つて、予め
リンパ球をＴ細胞・Ｂ細胞に分けておいたほうが
良い場合があり、臨床検査の分野においても重要
性が認められる。

これらのリンパ球亜集団または亜群の分離につ
いては、螢光色素で標識した抗体を用いてリンパ
球を染色し、フルオレセンス・アククテイベイテ
ツド・セルソーター（米国ベクトン・デイキンソ
ン・アンド・カンパニー社製）に代表される、セ
ルソーター付フローサイトメーターにより、螢光
標識された細胞を分別する方法が最近注目されて
いる。しかしながら、この方法は、装置が高価な
こと、多数の細胞を分離するためには長時間を要
すること、などの問題点をかかえている。

また、従来より蛋白質の分離精製等に用いられ
てきたアフイニテイー・クロマトグラフイーの技
術を細胞に応用し、アガロースビーズなどの担体
に抗体等を化学結合させ、その抗体等の持つ特異
性によつて細胞を分離する細胞アフイニテイー・
クロマトグラフイーが知られている。しかし、こ
れまで用いられてきた担体では、細胞の非特異的
粘着が避けられず、細胞の純度、回収率等の点で
問題があるとされている。また、抗体は共有結合
によつて担体に結合されなければならず、そのた
めの官能基を担体に導入する必要があり、高度の
技術を要求されるか、あるいは官能基の導入され
た担体を購入しなければならず、非常に高価なも
のになるといつた欠点も有している。

これに対し、パンニング法は、抗体を物理的に
プラステイツク・シヤーレ等に吸着させて分離を
行なう方法であり、簡便な方法であるが、細胞分
離の成否がピペツト操作の強弱によつて大きく左
右され、安定した結果を得るのが難しく、また、
純度を上げるためには回収率を犠牲にしなければ
ならないといつた欠点を有している。

（発明が解決しようとする問題点） 前記のように、従来の方法においては、それぞ
れの欠点を有しており、細胞を高純度に採取でき
る適切な細胞の分離法の出現が望まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、かかる細胞分離の現状をふま
え、細胞を高純度に採取することを目的として、
各種細胞の粘着現象について詳細な検討を加えた
結果、驚くべきことに、塩基性官能基を含有する
重合体を用い、特定の細胞群または特定の細胞群
に付着させたマーカーに対して有親和性物質を重
合体表面に物理的に吸着させて分離を行なうと、
従来の方法に比べ、極めて良好な分離を行なうこ
とが可能であること、さらには、PHかつ、または
イオン強度を変化させ、あるいはマーカーと拮抗
するもしくは有親和性物質と親和性を有する物質
を共存させて吸脱着反応を行なうことにより、良
好な分離が行なえることを見い出し、本発明を完
成するに至つた。

すなわち、本発明は、特定の細胞群または特定
の細胞群に付着させたマーカーに対して親和性を
有する物質を表面に物理的に吸着させた重合体を
用いて細胞の分離を行うに際し、重合体に塩基性
官能基を含有する重合体を用いることにより、細
胞の非特異的吸着を抑制することを特徴とする細
胞の分離方法に関する。

本発明の塩基性官能基を含有する重合体とは、
主鎖または側鎖に塩基性の官能基を有する重合体
である。

重合体は、線状重合体、グラフト重合体、架橋
重合体などの重合形態を問わないし、また、単独
重合体であるか、２つ以上の共重合体であるかも
問わない。

塩基性官能基は、pKaが4.0以上の含窒素官能
基あるいは４級アンモニウム基であることが好ま
しい。このような塩基性官能基の例を挙げるなら
ば（モノマー単位として表現するのが通常であ
る）、アリルアミン、ジアリルアミン、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジアリルピペラ
ジン、Ｎ，Ｎ−ジアリルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジア
リルメラミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノスチ
レン、ビニルベンジルアミン、ビニルフエネチル
アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルビニルフエネチルアミ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルビニルフエネチルアミン、
Ｎ−プロピルビニルフエネチルアミン、ビニルピ
リジン、２−メチル−５−ビニルピリジン、２−
エチル−５−ビニルピリジン、２−ビニルキノリ
ン、２−ビニルイミダゾール、４−ビニルイミダ
ゾール、ビニルピラゾリン、ビニルピラジン、４
−ビニルピリミジン、ビニルアミン、ビニルカル
バゾール、エチレンイミン、Ｎ−フエニルエチレ
ンイミン、１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−２−
スチレンおよびそのオリゴマー、ポリアミンマク
ロマーなどである。

これらの中でもジエチルアミノエチルスチレン
や、１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−２−スチレ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−N′−エチレンジアミン
およびそのオリゴマー、ポリアミンマクロマーな
どは好ましい例である。

これらを４級化したアンモニウム基であつても
よい。

このような塩基性官能基の量は、その官能基の
窒素含量として換算すると0.05〜15重量％である
ことが好ましく、より好ましくは0.10〜５重量％
である。

さらに、本発明の重合体は、ミクロドメイン構
造を有することが好ましい。ミクロドメイン構造
とは、重合体表面において重合体組成物がミクロ
に相分離している状態の構造をさしていう。一般
に、このようなミクロドメイン構造は、球状構
造、棒状構造、層状構造に便宜的に分類されてい
るが、現実的には、完全な球状や、直線状の棒状
ではありえない場合が多い。表面構造に限れば、
島状および帯状である構造が代表的である。ミク
ロドメインの平均長とは、島状構造のものについ
ては島の平均径を、帯状構造については帯の平均
長をさして言うものとする。この平均長として
は、100Å〜100μが好ましく、さらに好ましくは
0.01〜1μである。

このようなミクロドメイン構造を形成する手法
としては、該高分子体を適当な溶剤を用いて一度
溶解させた後、溶媒を留去させる方法や、さらに
は重合時に適切な溶剤の条件下に重合させる手法
などにより達成することができる。

ミクロドメインの大きさは、一般にアミノ基の
量や、重合体中における繰り返し単位のブロツク
性、さらには、グラフト体にあつては側鎖長など
によつて任意に変化させうるものである。

本発明の重合体中には、塩基性官能基を含有す
ることが要件であるが、これ以外に重合体につい
ては特に制限はない。

重合体を製造するには、単量体によるラジカル
重合、アニオン重合などを始めとする付加重量、
開環重合、脱ハロゲン化水素による重合、縮合反
応などを用いることができる。さらには、ポリマ
ー反応による方法も採用できる。例えば、所定の
原料ポリマーに既知の方法でアミノ化するなどの
方法をとることができる。グラフトポリマーを製
造する場合には、マクロマーと他のモノマーの共
重合によつて得ることもできるし、高分子原料に
グラフト反応を行なうことも可能である。

次に、この高分子体を用いて細胞を分離採取す
る方法について説明する。

本発明における高分子体は、重合体単独で用い
てもよいが、ガラス粒子や他の水に不溶性の重合
体粒子、繊維などにコーテイングして用いること
が好ましい。中でも30〜500μ程度の球状粒子に
コーテイングしたものを用いることが好ましい。

本発明の特定の細胞群または特定の細胞群に付
着せしめたマーカーに対して有親和性物質とは、
それ自身が特定の細胞群に対して結合能力を有す
るか、または細胞に適当な処理を施してマーカー
を付着せしめた場合に、細胞そのものに対しては
結合能力を持たないが、細胞に付着させた該マー
カーに対して結合能力を有する物質を言う。これ
ら有親和性物質は、その結合活性が、重合体表面
との物理的吸着によつて失なわれないものであれ
ば、天然物、人工合成物を問わず、いずれのもの
でもよいが、細胞に損傷を与えないものが好まし
く、さらに活性化を起こさないものが、より好ま
しい。

有親和性物質を重合体表面に結合させるには、
物理的吸着法により行なう。すなわち、該不溶性
固体を上記有親和性物質を含む培養液もしくは緩
衝液に浸し、１時間以上、好ましくは12時間以上
静置する。静置温度は有親和性物質が変性しない
温度であればいずれでもよく、４℃から室温（18
〜25℃）の範囲が好ましい。

このような方法で結合できる有親和性物質の例
を挙げるならば、抗血清、精製抗体、モノクロー
ナル抗体、抗体成分〔Fab、Ｆ（ab′）₂、Fcなど〕、
補体、プロテインＡ、ビオチン、アビジン、免疫
複合体、精製抗原、レクチン、リンフオカイン、
ホルモン、細胞表面レセプター、ウイルス、結合
組織由来の蛋白質などである。ここでレクチンと
は、動植物あるいは細菌で見いだされる免疫学的
産物ではない糖結合性蛋白質で、結合価が２価以
上で動植物細胞を凝集し、多糖類や複合糖質を沈
降させ、その結合特異性が単糖やオリゴ糖を用い
た阻止試験で規定できるものをいう。また、リン
フオカインとは、狭義のリンフオカイン、モノカ
イン等を含む血球、主にリンパ球や単球から放出
される種々の生理活性を持つた可溶性因子をい
う。いずれも非常に多くの物質を含む。

前述の有親和性物質と、有親和性物質により分
離される細胞の組合せの例を挙げるならば、抗Ig
抗体によるＢ細胞の分離などのほか、プロテイン
ＡによるＢ細胞のような細胞表面にIgGを持つ細
胞の分離、レクチンの一種であるピーナツアグル
チニンによるサプレツサーＴ細胞の分離、アビジ
ンによる予め表面をピチオン化した細胞の分離、
免疫複合体によるFcレセプターを持つ細胞、例
えばマクロフアージの分離、リンフオカインによ
るそのリンフオカインのレセプターを持つ細胞の
分離、例えば、インターロイキン２による活性化
Ｔ細胞の分離、レクチンによる例えばコンカナバ
リンＡによる腫瘍細胞の分離、抗原による抗原特
異的リンパ球の分離などである。

重合体表面に物理的に吸着させるこれら有親和
性物質の量は、有親和性物質の種類により異なる
が、多くの場合、0.05μｇ／cm²程度の微量でも十
分な効果が得られる。

細胞を分離するに先立ち、目的の細胞の含まれ
た組織または組織片、もしくは血液、細胞混合液
等から、酵素処理、撹拌など各々に適した方法に
より、細胞浮遊液を調製する。細胞を浮遊させる
液としては、生理的浸透圧を有する培養液、緩衝
液等が用いられるが、Ca⁺²、Mg⁺²等２価の陽イ
オンを含まないことが好ましい。

また本発明による分離を行なう前に、遠心分
離、比重遠心分離等の方法により、目的の細胞の
含有率をあらかじめ上げておくことが可能な場合
は、さらに精度の良い分離を行なうことができ
る。

原料となるこれらの細胞混合液から、目的の細
胞を分離するには、有親和性物質を重合体表面に
物理吸着により結合させた物（以下、分離材と称
する）をバツチ的に細胞浮遊液に浸漬させる方法
もあるが、カラム内に充填し、クロマト的に分離
する方法を取ることが好ましい。

細胞濃度を10³〜10⁵個／mm³程度に調製し、この
浮遊液を、あらかじめ培養液もしくは緩衝液で過
剰・未結合の有親和性物質を洗い流すことによ
り、適切化した分離材が湿潤状態で充填されたカ
ラムに注入し、カラム出口より流出細胞浮遊液を
採取することにより行なう。

また、PHおよびイオン強度の相違による吸着性
の差異を利用して、PHかつ、またはイオン強度を
変化させること、あるいはマーカーと拮抗する、
もしくは有親和性物質と親和性を有する物質を共
存させることにより、吸脱着反応を行なうことも
できる。PHおよびイオン強度を変化させること
は、多くの場合、細胞に致命的な影響を与える
が、本発明による分離は極めて短時間のうちに、
しかも細胞の代謝を止めるに十分な低温において
実行できるため、重篤な影響を与えることなく細
胞を回収することができる。分離に要する時間は
典型的な場合、10分程度である。

（発明の効果） 本発明の特徴の１つは、従来よりよく知られた
２つの方法、細胞アフイニテイークロマトグラフ
イーとパンニング法の両者の長所を併せ持ち、か
つ両者の短所を克服している点にある。すなわ
ち、極めて簡便な方法で有親和性物質を導入でき
る点で細胞アフイニテイークロマトグラフイーよ
り優れ、かつ十分な結合の安定性と分離能を実現
した点でパンニング法より優れ、かつ上記両者に
おいては避けられなかつた非特異吸着を抑制する
ことによつて分離の精度を向上させた点におい
て、両者の短所を克服した。

（実施例） 以下に実施例を示すが、これらは本発明の範囲
を制限するものではない。

参考例 １ Ｎ，Ｎ−ジエチル−N′−（ｐ−ビニルフエネチ
ル）エチレンジアミンをテトラヒドロフラン中、
リチウムジイソプロピルアミドを触媒として重付
加反応を行なわせることにより、数平均分子量が
5000のマクロマーを合成した。このマクロマーと
２−ヒドロキシエチルメタクリレートを共重合さ
せることにより、共重合体を合成した。共重合体
のマクロマー含量は２重量％であつた。（＃01） 実施例 １ ＃01のポリマー40mgを20mlのエタノールに溶解
させ、これに硫酸と水で順次洗浄した48〜60メツ
シユのガラスビーズ20ｇを浸漬させた。これを室
温で１時間撹拌した後、窒素雰囲気下で過し、
乾燥させた。このようにして調製したポリマーの
コーテイングされたガラスビーズ１ｇを、内径３
mm、長さ10cmの塩化ビニールチユーブに、リン酸
緩衝液を用いて充填し、0.04mg／mlのヤギ抗ラツ
トIgG−リン酸緩衝液を満たして置換し、４℃で
16時間静置した。

静置後、このカラムに室温にしたハンクス液５
mlを１分間かけて流し、次いで室温にした、ラツ
ト腸間膜リンパ節より採取したリンパ球を１×
10⁴個／mm³の濃度（Ｔ細胞65.0％）でハンクス液
に浮遊させたサンプルを、カラム上部より0.4
ml／mmの速度で3.5分間流下させ、カラム下部よ
り流出してくるサンプルを採取した。この採取液
中の細胞濃度の螢光標識法により、Ｂ／Ｔ細胞
各々の濃度を測定した。

この結果、Ｔ細胞は定量的にカラムを通過して
回収され、Ｂ細胞のみが選択的に30％カラム内に
保持された。ここでいうＢ細胞とはsIgG陽性の
細胞を、Ｔ細胞とはsIgG陰性の細胞をさす。

実施例 ２ 実施例１と同様の方法で、＃01のポリマーがコ
ーテイングされたガラスビーズを調製した。この
ガラスビーズ２ｇを、内径３mm、長さ20cmの塩化
ビニールチユーブに、リン酸緩衝液を用いて充填
し、0.05mg／mlのヤギ抗マウスIgG抗体〔Ｆ
（ab′）₂成分〕−リン酸緩衝液を満たして置換し、
４℃で16時間静置した。静置後、このカラムに４
℃にしたハンクス液５mlを１分間かけて流し、次
いで、BALB／ｃマウス脾臓より採取した白血
球（リンパ球85％を含む）を１×10⁴／mm³の濃度
でハンクス液（２％ウシ胎児血清添加）に浮遊さ
せ、４℃にしたサンプルを、カラム上部より0.2
ml／mmの速度で５分間流下させ、次いで、４℃に
したハンクス液を同速度で12分間流下させ、この
間カラム下部より流出してくる液を採取した。こ
の採取液中のリンパ球数と、フローサイトメータ
ーを用いて解析したsIgG陽性細胞の割合とから、
sIgG陽性細胞の通過率を算定した。

この結果、採取液中のリンパ球に占めるsIgG
陽性細胞の割合は1.5％、通過率1.0％であり、一
方、sIgG陰性細胞の通過率は96.3％であつた。

なお、フローサイトメーターを用いてsIgG陽
性細胞を解析する際は、１次抗体としてヤギ抗マ
ウスIgG抗体〔Ｆ（ab′）₂成分〕を、２次抗体とし
てFITC標識ウサギ抗ヤギIgG〔Ｈ＆Ｌ鎖特異静；
Ｆ（ab′）₂成分〕を用いた。

参考例 ２ 参考例１と同様にしてマクロマー含量0.8重量
％の、マクロマーと２−ヒドロキシエチルメタク
リレートの共重合体を合成した。（＃02） 実施例１と同様にして＃02のポリマーでコーテ
イングしたガラスビーズを作成した。このガラス
ビーズ１ｇを、内径３mm、長さ10cmの塩化ビニル
製チユーブに充填し、カラムを作成した。

カラムを牛胎児血清５％を含むハンクス液30ml
により0.3ml／分で洗浄した。次にラツト腸間膜
リンパ節よりリンパ球を採取し、該牛胎児血清加
ハンクス液にて１×10⁷細胞／mlに調製した細胞
浮遊液を、カラムに0.4ml／分で５分間流した。
この後、再度該牛胎児血清加ハンクス液をカラム
に0.4ml／分で５分間流した。カラムより流出し
た細胞浮遊液およびそれに続く牛胎児血清加ハン
クス液を全て回収し、溶出液とした。

カラムからの溶出液中の総リンパ球数を顕微鏡
下で血球計数板を用いて測定したところ、カラム
に流したリンパ球の98.0％が回収できた。

一方、＃02のポリマーでコーテイングしていな
いガラスビーズにて同様の試験をしたところ、回
収できたリンパ球は81.2％であり、非特異吸着が
みられた。

このことより＃02のポリマーでコーテイングし
たガラスビーズは、リンパ球を非特異的に吸着し
ないことがわかつた。

実施例 ３ 参考例２と同様にして、＃02のポリマーでコー
テイングしたガラスビーズを充填したカラムを作
成した。このカラムにウサギ抗ヤギIgG抗体10μ
ｇ／ml含むダルベツコのリン酸緩衝液
（Dulbecco′s PBS（−））を満たし、４℃で18時
間静置して抗体結合カラムを得た。

一方、ラツト腸間膜リンパ節より採取したリン
パ球浮遊液１×10⁸細胞／mlに、ヤギ抗ラツトイ
ムノグロブリンズ抗体10μｇ／mlを加えて牛胎児
血清５％を含むハンクス液反応液中で室温で１時
間、時々振りまぜながら反応させた。この液を牛
胎児血清５％を含むハンクス液で洗滌した後、リ
ンパ球浮遊液１×10⁷細胞／mlに調製し、参考例
２と同様にして抗体結合カラムに流した。この
後、再度該牛胎児血清加ハンクス液をカラムに
0.4ml／分で10分間流した。カラムより流出した
細胞浮遊液およびそれに続く牛胎児血清加ハンク
ス液を全て回収し、溶出液とした。Ｂ／Ｔ細胞
各々の数は、蛍光標識抗ラツト・イムノグロブリ
ンズ抗体を用いた蛍光標識法によつて、イムノグ
ロブリン陽性細胞（Ｂ細胞）とイムノグロブリン
陰性細胞（Ｔ細胞）をそれぞれ測定することによ
つて求めた。添加した細胞数に対する回収できた
細胞数の割合を回収率とした。

Ｔ細胞の回収率は92.7％であり、ほとんど全て
のＴ細胞が回収でき、非特異吸着はなかつた。こ
れに対してＢ細胞の回収率は68.4％とＴ細胞の回
収率に比べてはるかに低かつた。このように＃02
のポリマーとヤギ抗ラツト・イムノグロブリンズ
抗体とを表面に持つビーズによつて、非特異吸着
がなく、特異的にＢ細胞のみを分離できた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 特定の細胞群または特定の細胞群に付着させ
   たマーカーに対して親和性を有する物質を表面に
   物理的に吸着させた重合体を用いて細胞の分離を
   行うに際し、重合体に塩基性官能基を含有する重
   合体を用いることにより、細胞の非特異的吸着を
   抑制することを特徴とする細胞の分離方法。