JPH0568231B2

JPH0568231B2 -

Info

Publication number: JPH0568231B2
Application number: JP61152111A
Authority: JP
Inventors: Noritsugu Yabe; Muneaki Iizuka; Isao Yamane
Original assignee: Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1986-06-28
Filing date: 1986-06-28
Publication date: 1993-09-28
Also published as: JPS637780A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は鉄イオンをキレート剤により安定化し
て細胞に供給する方法に関するものである。［従来の技術］例えば、動物細胞を生体から切り離していわゆ
る試験管内で培養するためには、当該細胞をよく
吟味された栄養分（アミノ酸、ビタミン、糖、電
解質など）を含む等張緩衝液より構成される培地
−これらはイーグルのMEM、RPMI1640、ハム
のF12培地などとしてなじみのものである−に適
当量の動物血清を加えた培養液が必要である。このとき、血清は細胞の生育や増殖などにとつ
て必要な栄養環境をつくる役目の他に、各種の細
胞増殖因子や脂溶性ビタミン、脂質成分など或は
種々の金属元素の細胞内補給と言う重要な任務を
司つている。すなわち血清の存在によつて、初め
て細胞の培養が可能となつたわけである。しかしながら血清は動物の繁殖環境、飼料の種
類、健康状態、採血時期或は産地などによつてそ
の品質に大きな変動があることは周知の事実であ
り、細胞培養を行なうに当つては綿密な予備培養
試験のもと高品質の血清を入手することとなる。
これらの血清の選別には手間がかかるが、血清の
適否は培養の成否に直結し且つ培養液の原価の中
で血清の占める割合が８割以上を占めるほど高価
なのでおろそかにはできない。この様に、手間と費用をかけた血清添加培地で
も、培地細胞から産業的或は医学的重要な活性因
子を抽出・精製する際は、血清成分の存在は邪魔
物となり、これらの血清成分の除去操作が必要と
なる。そこで血清を添加せず化学的に合成された成分
のみで構成された、いわゆる無血清培地の開発が
要望されて久しい。しかしながら、これ迄に公表された無血清培地
は、化学的に構成成分が解明されていない血清ア
ルブミン分画を含んでいたり、血清より分離した
トランスフエリン蛋白を必須因子として添加して
いるのが実状である。以下にこれ迄公表されてきた無血清培地の代表
例を参考として表示する。 (i) CITTL培地〔ダルフレアー（F.J.Darfler）、
インセル（P.A.Insel）等、1982年〕基礎培地−ダルベツコ変法イーグル培地＋ハム
のF12培地（１：１）添加物−カゼイン、インスリン、テストステロ
ン、リノール酸 (ii) SFFD培地（H.ムカラミ等、1982年）基礎培地−ダルベツコ変法イーグル培地＋ハム
のF12培地（１：１）添加物−インスリン、トランスフエリン、エタ
ノールアミン、セレン (iii) KSLM培地（T.カワモト等、1983年）基礎培地−RPMI1640＋ダルベツコ変法イーグ
ル培地＋ハムのF12培地（２：１：１）添加物−インスリン、トランスフエリン、低比
重リポ蛋白、遊離脂肪酸不含牛血清アルブミン、
オレイン酸、エタノールアミン、２−メルカプト
エタノール、セレン、ヘペス血清添加培地の性能が血清の品質に影響を受け
る事は前述の通りであるが、無血清培地にアルブ
ミンを添加する場合にもアルブミン中に含まれる
夾雑成分（アルブミンは生体内で多くの重要な元
素類と機能的に結合していると言われている。）
が培地性能に与える影響は少なくない。更に、これら培地性能の変動要因を生む血清或
は血清アルブミンを除去した場合でも無血清培地
の微量添加因子としてトランスフエリンは必要と
されていた。トランスフエリンは、細胞にとつて
必須元素である鉄と結合し、細胞内に取り込む役
割を果すことが証明され、高価な血清蛋白成分で
あるにも拘らず無血清培地に使われ続けてきた。［発明が解決しようとする問題点］このように動物細胞の培養において鉄の供給は
不可欠であるため、従来は血清或は血清成分とし
てアルブミン画分や高価なトランスフエリンを合
成培地に添加していたので、培養液のコストが高
くなり或は量的な制限を受けていた。又、培養液から目的の成分を抽出する場合は、
これらの添加蛋白質が不純物となりめんどうな除
去操作が必要となる。例えば、従来の無血清培地に添加されるトラン
スフエリンは、通常ヒト血清より工業的に分離・
精製され、高価なものであり、培養液１ミリツト
ルに対し概略５〜10mg使用され、培養液原価の約
20〜40％を占る。動物細胞による物質生産を考え
るとき、トランスフエリン蛋白の一部或は全部の
安価な化学合成物質で代替することは、培養液の
原価低減のみならず、生産物の精製においてもメ
リツトは大きい。又、ワクチンウイルス増殖に供される細胞の培
養においては蛋白成分が少ないほどワクチン接種
時の副作用（アナフイラキシーなど）は少ないと
言われているのでワクチン製造における安全性へ
の寄与も大きい。更に医学、生物学或は農学など細胞培養に関連
する研究分野で、いま最も注目されているテーマ
は生物の癌化及び老化の発生メカニズムの解析で
あろう。従来の血清を必要とする培地はもとよ
り、アルブミンやトランスフエリン等の血清成分
は少なからず抗癌、老化に関与する因子を含んで
いるとみなされているので、血清成分を含まない
培養系の提供は新らしい研究の進展を約束するも
のとして貢献度は大きい。更に又、臨床医学的には胃潰瘍等に起因する或
は遺伝的素因による貧血や金属元素欠如疾患の病
体解明に役立つほか、治療法に対しても新らしい
方法論を提供するものとなろう。他方、トランスフエリンを介さない鉄の細胞内
への取り込みは、実験的には２価鉄を細胞に素早
く接触させることで可能である事は証明されてい
る。しかしながら、２価鉄は通常用いられる動物細
胞培養用培地の液性（中性〜弱アルカリ性）では
直ちに酸化され、水酸化第２鉄として沈殿し、産
業上実用的ではない。本発明は、トランスフエリンを含まない無血清
培地において、鉄をより安定な３価鉄として処方
し、同時に鉄を適当にキレート結合する化学合成
物を添加することにより細胞培養を可能とするも
ので、蛋白成分であるトランスフエリンの一部或
は全部を代替しようとするものである。［問題点を解決するための手段］すなわち、本発明の目的は、細胞が必要とする
不溶化しやすい鉄元素を、安定な形で細胞内に供
給することにある。従来、誤飲した毒性を有する重金属類を解毒す
る目的でキレート剤を投与し、体内に於て安定な
錯体を形成させて排泄させる方法が知られてい
る。即ち、この様なキレート剤は体内の臓器や組
織に不溶化し、沈着した重金属を可溶化させ、対
外に出す作用がある訳である。本発明者等はこの様なキレート剤のもつ解毒作
用の意味をとらえ、鋭意研究の結果、或種のキレ
ート剤は沈殿を形成し易い金属元素を錯体として
安定化することにより、細胞に積極的に供給し得
るという事を初めて細胞培養の分野において確立
したのである。即ち、本発明は鉄をキレート剤により安定化し
て細胞に供給することを特徴とする細胞への鉄供
給法法かかるものである。ここで、細胞内に取り込まれる鉄は主として３
価鉄イオンであるが、細胞は２価鉄イオンも取り
込み可能である。従つて、無機又は有機の第２鉄塩或は無機又は
有機の第１鉄塩を鉄源として使用することができ
る。これらの鉄源は培養細胞に悪影響を与えない
ものであればいずれも使用可能であるが、例えば
塩化第２鉄、硫酸第１鉄などの可溶性のものが好
ましい。しかしながら、培養液或は体液のPHは中性乃至
アルカリ性であるため、２価鉄イオンは３価鉄イ
オンに酸化され、更に水酸化第２鉄となつて沈殿
し易い。キレート剤は中性乃至弱アルカリ性で３価鉄イ
オンと安定な錯体を形成するものを使用する。２
価鉄イオンよりも３価鉄イオンとより安定な錯体
を形成するものが好ましい。しかし、３価鉄との
結合力が強すぎると３価鉄イオンを細胞へ供給す
る際の妨げとなるので、３価鉄イオンとのキレー
ト安定度定数（logk_ML）が15以下のものを使用す
る。例えば、エチレンジアミン二プロピオン酸塩
酸塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二
酢酸などが及びその塩が挙げられる。鉄の供給対象となる細胞は動物又は植物由来の
細胞のいずれでもよく、鉄依存性の細胞にはすべ
て適用可能である。培地の処方としては種々の処方のものが使用可
能であり、例えば後記実施例に示した処方が適当
である。又、市販の基礎培地も使用することがで
きる。基礎培地としては一般的な無血清合成培地例え
ばイーグルMEM、RPMI1640、ダルベツコ変法
イーグル培地、ハムのF12等を単独で或は二種以
上を混合して使用することができる。以上において、培養液１当りの鉄イオンの濃
度は0.05〜10ｍＭが適当であり、キレート剤の濃
度は0.1〜15ｍＭが適当である。本質的にはトランスフエリンやアルブミン画
分、血清等は添加不要であるが、少量のトランス
フエリンを必要に応じて添加してもよい。次に、本発明の無血清合成培地の調製方法を述
べる。先ず、２倍濃度の無血清合成倍地（増殖因子と
して、例えばインスリン、エタノールアミン、セ
レン、上皮性成長因子、トリヨードサイロニンな
どを含有する。）を調製しておく。別途0.2〜30ｍ
Ｍのキレート剤溶液を調製すると共に鉄化合物溶
液を調製し、先ずキレー剤溶液に鉄化合物溶液を
加えて錯体を形成させる。しかる後前記２倍濃度
の無血清合成培地と錯体溶液を等量混合する。前もつて当該金属類とキレート剤を結合させて
おく事が重要で、この前処理をしないでそれぞれ
単独に培地の他の成分と混合するならば効果は半
滅する。鉄を例として調製方法を示す。２価鉄或は３価
鉄の無機塩0.2〜２ｇを１となる様に0.01規定
の酸塩で溶解し、このうち１容を99容のキレート
剤溶液に加える。こうして調製した錯体溶液と２
倍濃度の無血清合成培地を等量混合して目的とす
るトランスフエリンを含まない培養液を得る。或
は必要があれば適宜トランスフエリンを補給して
もよい。又は錯体溶液を予め準備しておき、これ
に他の培地成分を順次添加して所望の無血清合成
培地を処方しても勿論さしつかえない。最終的に得られた培養液は当然のことながら
過滅菌して無菌的に保存する。なお、合成培地に補添されるインスリン、セレ
ン、エタノールアミン、上皮性成長因子、トリヨ
ードサイロニンなどは細胞の増殖性を向上させる
のに寄与するもので、既に公知の物質であり、無
血清培養での必須成分の一部を構成するものであ
る。［作用］この様にして調製したアルブミン及びトランス
フエリンを含まないか、微量のトラスフエリンを
含む無血清合成培地を用いて、ハイブリドーマな
どのリンパ球系細胞や線維芽細胞などの間質系細
胞もしくは腎細胞などの上皮系細胞の培養を行な
うと、以下の試験例の如く良好な培養結果が得ら
れた。試験例１予め血清及びキレート剤などを添加していない
培地（例えばイーグルMEMとRPMI1640培地の
１：１の混合）で２日間、マウスハイブリドーマ
C_2a−E₁細胞を37℃の５％炭酸ガス孵卵器でで前
培養し細胞周期を停止させた後、後記実施例１、
２、３の各培地及び実施例１、２、３の処方より
塩化第二鉄を除きトランスフエリンを添加した培
地及び対照としてキレート剤を添加しない培地の
各１mlを12穴培養プレートに同一培地を３穴宛分
注し、前培養しておいたC_2a−E₁細胞の５×10⁴個
を播き、３日間37℃の５％炭酸ガス孵卵器で本培
養した。それぞれの培地の細胞増殖支持能力は増
殖してきた生細胞数をかぞえその多寡で判定し
た。その結果を表−１に示す。

【表】トランスフエリンによる鉄の細胞内供給（これ
は通常血清の添加によつてまかなえられる）の代
りにキレート剤を使用することで細胞の増殖が行
なわれること明らかである。しかし、トランスフ
エリンやキレート剤を添加せずに鉄のみの補給で
は、細胞周期の再回転は起こらない。これによつ
てキレート剤として使用した化合物の有効生が明
らかである。試験例２後記実施例１の培地、及びこの処方より塩化第
２鉄を除去した培地、或はこれらの鉄添加もしく
は鉄不含培地に鉄をまだ結合させていないアポト
ランスフエリンもしくは鉄イオンを飽和結合した
ホロトランスフエリンなどを更に添加した培地、
又はキレート剤を含んでいない無血清培地を準備
し、これらの各々の培地でのハイブリドーマ
（C_2a−E₁）の増殖支持能を試験例１の実施要領を
準じて行い判定した。その結果を第１図に示す。遊離の鉄或はホロトランスフエリンの存在下で
はキレート剤により細胞の増殖性を著しく向上さ
せる。無血清無アルブミン培養条件下においては
トランスフエリンの濃度はこれまで知られている
無血清培地の処方では通常５mg／以上、平均的
には10mg／で使用されている。第１図より明ら
かなように、キレート剤を添加することにより、
常量な10分の１程度のトランスフエリンがあれ
ば、あとは３価鉄の補給によつて細胞の増殖が改
善される。これは鉄トランスフエリン結合体（ホ
ロ型）が細胞表面の受容体を介して細胞内に取り
込まれ、鉄は細胞内に、トランスフエリンはアポ
型となつて細胞外にはき出され再度培養液中と３
価鉄イオンと結合して細胞の増殖及び代謝に利用
される。いわゆるトランスフエリン周期をキレー
ト剤が円滑に行わせているためである。すなわ
ち、キレート剤による鉄錯体はトランスフエリン
の不在在下においても細胞の増殖を支持し、かつ
トランスフエリンの存在下であつては、トランス
フエリン周期の回転を促進させ鉄の利用効率を著
しく改善するものである。試験例３後記実施例３の培地１mlにマウスハイブリドー
マC_2a−E₁細胞を５×10⁴個播き、３日間37℃５％
炭素ガス孵卵器で培養したのち、再び５×10⁴の
細胞数にもどし新鮮な実施例３の培地で培養をつ
くり返す継代培養を行なつた。その結果を第２図
に示す。トランスフエリンの不在在下において鉄錯体の
添加により細胞が継代培養できる。このことはほ
ぼ完全にトランスフエリンの必要生（従来の知
見）を根底からくつがえすものである。試験例４トランスフエリンの代りに塩化第二鉄（６水
塩）80mg／と下記表−２に示すキレート剤を表
−２に示す濃度に添加し、マウスハイブリドーマ
C_2a−E₁細胞を用いて前記試験例１の実施要領に
準じて行い判定した。その結果を表−２に示す。

【表】３価鉄イオンとのキレート安定度定数が15.87
以上のキレート剤は、３価鉄イオンとの結合力が
強すぎるため、錯体として安定化された鉄イオン
を細胞が利用することができず、細胞は増殖しな
い。以上の結果からキレート剤の３価鉄イオンの
キレート安定度定数は15以下が好ましいことがわ
かる。試験例５後記実施例３の培地及びこの培地の処方中塩化
第二鉄の代りにトランスフエリンを添加した培
地、対照として実施例３の培地よりイミノ二酢酸
を除去した培地を用いてNLFK細胞（ネコ腎細
胞）の増殖支持能を試験例１の実施要領に準じて
行なつた。但しこの細胞は基質接着性細胞なので
細胞計測にあたつてはトリプリン処理によつて器
壁より細胞をはがして行なつた。結果を表−３に
示す。

【表】接着性の細胞でもリンパ球系細胞（浮遊細胞）
と同様なキレート剤による効果を認めた。即ちこ
のようなキレート剤の作用は培養細胞一般へとそ
の使用を拡大できることを示唆するのものであ
る。試験例６実施例３の培地及び対照としてトランスフエリ
ンを添加した培地の１mlにマウスハイリドーマ細
胞R₂−Pt−E4−OB細胞（P3U−１ミエローマ由
来抗犬パルボウイルス抗体を産生）の５×10⁴個
を播き３日間37℃の５％炭酸ガス孵卵器で培養す
る。その後、その培養上清の抗体価を酵素免疫測
定法を用いて半定量した。その結果を第３図に示
す。キレート剤を用いた無トランスフエリン培養に
おいてもトランスフエリン添加培養と同等の抗体
生産が認められた。これは、将来治療用にモノク
ローナル抗体を用いる場合、精製時でのトランス
フエリンの混入を減じ、純度の高い抗体を得るこ
とができること示すものである。試験例７後記実施例３の培地及び対照として10％牛胎児
血清添加のイーグルMEM培地に１×10⁵個の
NLFK細胞と、10^4.8TCJD₅₀／ml単位の犬パルボ
ウイルスを共に播き８日間37℃の５％炭酸ガス孵
卵器で培養し、その培養上清のウイルス量を測定
した。その結果を第４図に示す。従来法の血清培養と同程度或はそれ以上のウイ
ルス収量を認めた。ワクチン製造用の腎細胞への
鉄錯体の適用は、ウイルス精製の簡素化を可能に
するものであり、ワクチン製造の産業分野におい
ても有用なものである。試験例８実施例４、５の各培地及びこれらの処方から鉄
及びキレート剤を除いた培地、或は対照として10
％牛血清添加のイーグルMEMをそれぞれ3.5cm直
径の培養皿に1.5mlに分注し、これに正常ヒト線
維芽細胞を２×10⁴個播き、５日間37℃の５％炭
酸ガス孵卵器７％酸素ガス及び88％窒素ガスで培
養する。そののち、トリプシンで培養皿壁より細
胞をはがし、増殖細胞数を数えた。その結果を第
５図に示す。従来は、この種の正常細胞ではトランスフエリ
ン不在在下においては細胞が器壁にはりついて、
しかも培養環境の酸化還元電位が還元側に傾して
いる２価鉄（硫酸第一鉄）を加えた直後のみに増
殖することが知らている。しかし、ここに示され
たように、前もつて培養液に処方として３価鉄を
錯体として加えておくだけで増殖し、これまで知
られていなかつた事が新しく判明した。無アルブ
ミン無トランスフエリン培地での正常の細胞のこ
のような新しい発想に基づく培養法はとりわけ、
細胞内代謝機能の発現制御に関する研究のみなら
ず抗癌、老化の機構解明に体しても新規の研究方
法論を提供するものである。［実施例］以下、本発明を実施例により更に具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。実施例１下記諸成分を２回蒸溜水に溶解し、Ａ液とす
る。諸成分量Ｌ−アルギニン 193.846mg／Ｌ−アルギニン塩酸 152.246 Ｌ−アスパラギン（１水塩） 85.052 Ｌ−アスパラギン酸 19.384 Ｌ−シスチン２塩酸 63.000 Ｌ−シスチン塩酸（１水塩） 30.464 Ｌ−グルタミン酸 19.384 Ｌ−グルタミン 890.770 グルタチオン 0.970 グリシン 19.692 Ｌ−チロシン 54.260 Ｌ−ヒスチジン 14.538 Ｌ−ヒスチジン塩酸（１水塩） 40.748 Ｌ−ヒドロキシプロリン 19.384 Ｌ−イソロイシン 98.912 Ｌ−ロイシン 98.912 Ｌ−リジン塩酸 109.594 Ｌ−メチオニン 29.092 Ｌ−フエニルアラニン 45.586 Ｌ−プロリン 29.384 Ｌ−セリン 59.076 Ｌ−スレオニン 95.954 Ｌ−トリプロフアン 14.548 Ｌ−バリン 94.014 ビオチン 0.218 パントテン酸カルシウム 1.212 コリン塩酸 52.908 重酒石酸コリン 1.746 葉酸 1.940 ｉ−イノシトール 35.864 ニコチン酸アミド 1.940 パラアミノ安息香酸 0.970 塩酸ピリトキシン 0.970 塩酸ピリドキサール 0.970 リボフラビン 0.290 塩酸チアミン 1.940 シアノコバラミン 0.00734 モノエタノールアミン 40.000 牛インシユリン 20.000 プトレシン２塩酸 0.025 ピルビン酸ナトリウム 220.000 チミジン 0.025 ヒポキサンチン 0.050 亜セレン酸ナトリウム 0.0034 グルコース 3908.674 塩化ナトリウム 12412.778 塩化カリウム 775.778 塩化カルシウム 194.042 硝酸カルシウム 67.362 硝酸マグネシウム 138.014 リン酸一水素ナトリウム 776.354 リン酸二水素ナトリウム 111.574 炭酸水素ナトリウム 2800.000 硫酸カナマイシン 60.000 カナマイシン 58.212 フエノールレツド 10.688 次に4.436ｇのエチレンジアミン二プロピオン
酸塩酸塩を800mlの２回蒸留水に溶解し、水酸化
ナトリウムを用いてPHを7.2〜7.4に調整する（Ｂ
液）。塩化第二鉄の0.2〜20ｇを（この量は培養に
供する細胞によつて適宜加減してよい）１の
0.01規定程度の塩酸に溶解する（Ｃ液）。Ｂ液の
99容とＣ液の１容を混合してＤ液とする。Ａ液の
１容とＤ液の１容を混合して所望の無血清培地を
得る。実施例２実施例１におけるエチレンジアミン二プロピオ
ン酸塩酸塩の代わりにヒドロキシエチルイミノ二
酢酸2.283ｇを用いてＢ液を調製した、実施例１
に準じて無血清合成培地を調製した。実施例３実施例１におけるエチレンジアミン二プロピオ
ン酸塩酸塩の代わりにイミノ二酢酸2.128ｇを用
いてＢ液を調製し、実施例１に準じて無血清合成
培地を調製した。実施例４下記諸成分を２回蒸溜水に溶解し、Ｅ液とす
る。諸成分量（mg／）イーグルMEM 18800 アミノ酸Ｌ−アスパラギン酸 26.6 Ｌ−グルタミン 58.4 グリシン 15.0 Ｌ−グルタミン酸 0.3 Ｌ−プロリン 7.0 Ｌ−セリン 21.0 ビタミン、ホルモン葉酸 0.001 トリヨードサイロニン 0.0004 マウス上皮性成長因子 0.02 インスリン 2.0 ビタミンB₁₂ 0.04 ビオチン 0.04 その他有機酸塩プトレシン塩酸 0.04 ピルビン酸ナトリウム 220.0 塩化コリン 32.0 チミジン 0.14 ヒポキサンチン 0.48 微量元素硫酸銅（５水塩） 0.00001 硫酸マンガン（７水塩） 0.0000048 モリブデン酸アンモニウム（１水塩） 0.0024 塩化ニツケル（６水塩） 0.000024 メタバナジン酸アンモニウム 0.000106 亜セレン酸 0.00078 緩衝剤炭酸水素ナトリウム 2800 水酸化ナトリウム 300 次に0.16ｇの硫酸第一鉄もしくは、0.2ｇの塩
酸第二鉄を１の0.01規定程度の塩酸に溶解する
（Ｇ液）。実施例１におけるＢ液と99容とＦ液の１
容を混合し（Ｈ液）、これにＧ液を１／1000容添
加してＩ液を得る。Ｅ液の１容とＩ液の１容を混
合して所望の無血清合成培地とする。実施例５実施例１のＢ液にエチレンジアミン二プロピオ
ン酸塩酸塩の代わりにイミノ二酢酸2.283ｇを用
いてＢ液を調製し、実施例４に準じて無血清合成
培地を調製した。以上調製された無血清合成培地は低蛋白吸着性
のメンブランフイルター（孔径0.22μｍ、米国ミ
リポア社のGV膜として入手できる）を用いて
過減菌し、無菌状態を保ち冷暗所にて貯蔵する。［発明の効果］以上説明したように、本発明の細胞への鉄供給
方法によれば、培養細胞の増殖に不可欠であり且
つ重要な作用を果す鉄イオンを安定な錯体とした
ので、血清、アルブミン画分、トランスフエリン
等の蛋白成分を介することなく、鉄イオンを細胞
内に取り込み可能とし利用し得るようにすること
ができる。従つて、細胞は増殖し継代培養も可能
となる。又、本発明に用いた無血清合成培地によれば、
鉄化合物をキレート剤により安定な錯体としたの
で、鉄が不溶化することなく細胞内に取り込まれ
て利用され、細胞が増殖し、継代培養が可能とな
る。従つて、従来適合検査の必要であつた血清、
アルブミン画分、或は高価なトランスフエリンを
本質的には添加する必要がなくなり、安価に且つ
品質の安定した培地を大量に供給することができ
る。更に、トランスフエリンを添加する場合でも
従来の10分の１程度でよい。更に又、トランスフエリン等の血清蛋白質を全
く含まない完全無血清合成培地により細胞培養が
可能となるため、細胞生産物の分離・精製、使用
の際に手間が省けるとともに、新らしい発想に基
づく培養法により新規な研究方法論の展開が期待
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞の増殖支持能におけるキレート
剤、塩化第二鉄（６水塩）、アポトランスフエリ
ン、ホロトランスフエリンの効果を比較した図、
第２図は本発明による継代培養における細胞増殖
状態を示す線図、第３図は本発明により培養した
細胞の培養生産物量と鉄添加量との関係を示す
図、第４図は本発明により培養した犬パルボウイ
ルスの培養上清中のウイルス量の比較図、第５図
は本発明による正常ヒト線維芽細胞の培養細胞数
比較図である。

Claims

【特許請求の範囲】１鉄をキレート剤により安定化して細胞に供給
することを特徴とする細胞への鉄供給方法。２鉄が３価及び／又は２価の鉄イオンである特
許請求の範囲第１項記載の細胞への鉄供給方法。３キレート剤が中性乃至弱アルカリ性で少なく
とも２価鉄イオンよりも３価鉄イオンとより安定
な錯体を形成するキレート剤である特許請求の範
囲第１項記載の細胞への鉄供給方法。４キレート剤が３価鉄イオンとのキレート安定
度定数が15以下のキレート剤である特許請求の範
囲第１項記載の細胞への鉄供給方法。５キレート剤がエチレンジアミン二プロピオン
酸塩酸塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミ
ノ二酢酸のいずれかである特許請求の範囲第１項
記載の細胞への鉄供給方法。６キレート剤の濃度が0.1〜15ｍＭである特許
請求の範囲第１項記載の細胞への鉄供給方法。７細胞が動物細胞、植物細胞のいずれかである
特許請求の範囲第１項記載の細胞への鉄供給方
法。８合成培地内において鉄を細胞に供給する方法
である特許請求の範囲第１項記載の細胞への鉄供
給方法。９合成培地が無血清合成培地、トランスフエリ
ン非添加無血清合成培地、トランスフエリン少量
添加無血清合成培地のいずれかである特許請求の
範囲第８項記載の細胞への鉄供給方法。